特許 5818325 血液凝固測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5818325

(24)【登録日】2015年10月9日

(45)【発行日】2015年11月18日

(54)【発明の名称】血液凝固測定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20151029BHJP

   G01N 33/86 20060101ALI20151029BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20151029BHJP

   G01N 21/27 20060101ALI20151029BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 595

   G01N33/86

   G01N37/00 101

   G01N21/27 C

【請求項の数】4

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2012-183015(P2012-183015)

(22)【出願日】2012年8月22日

(65)【公開番号】特開2014-41041(P2014-41041A)

(43)【公開日】2014年3月6日

【審査請求日】2014年8月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】000004226

【氏名又は名称】日本電信電話株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100064621

【弁理士】

【氏名又は名称】山川 政樹

(74)【代理人】

【識別番号】100098394

【弁理士】

【氏名又は名称】山川 茂樹

(74)【代理人】

【識別番号】100153006

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 勇三

(72)【発明者】

【氏名】井上 鈴代

(72)【発明者】

【氏名】林 勝義

(72)【発明者】

【氏名】瀬山 倫子

(72)【発明者】

【氏名】岩崎 弦

(72)【発明者】

【氏名】堀内 勉

(72)【発明者】

【氏名】為近 恵美

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−２３２１３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−１４４５８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５２８５０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−００４７５２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血漿を含む検体と、接触因子を活性化する第１化学物質が溶解した第１水溶液と、カルシウムイオンを供給する第２化学物質が溶解した第２水溶液とを混合することで、前記検体の血液凝固能を判定する血液凝固測定方法において、
少なくとも前記第２水溶液は独立し、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して前記流路を流れる状態に前記検体，前記第１水溶液，および前記第２水溶液を前記流路に導入する第１工程と、
前記流路を流れる流体の流速を測定する第２工程と、
測定された流速から前記検体における血液凝固能を判定する第３工程と
を少なくとも備え、
前記第１工程では、前記検体，前記第１水溶液，および前記第２水溶液を、少なくとも前記第１水溶液を２番目に導入する状態で各々個別に前記流路の一端より導入し、前記検体，前記第１水溶液，および前記第２水溶液が前記流路の延在方向に直列に配列して隣り合う各々が接触して流れる状態とする
ことを特徴とする血液凝固測定方法。

【請求項2】

請求項１記載の血液凝固測定方法において、
前記第１化学物質は、エラグ酸，カオリン，セライトより選択されたものであることを特徴とする血液凝固測定方法。

【請求項3】

請求項１または２記載の血液凝固測定方法において、
前記第２化学物質は、塩化カルシウムであることを特徴とする血液凝固測定方法。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の血液凝固測定方法において、
前記流速は、表面プラズモン共鳴に基づく流速測定により測定することを特徴とする血液凝固測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液や血漿の凝固能を測定する血液凝固測定方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

血液凝固活性（血液凝固能）は、例えば、経口で投与される抗凝血薬療法の監視に用いられる指標などを得るための重要な項目である。例えば、脳梗塞や心筋梗塞を代表とする各種血管梗塞の手術後の患者は、血栓再発防止として血液を凝固させないヘパリン等の抗凝固剤を投与する。抗凝固剤は、患者の体調（薬理代謝）や食環境に依存する日動状態によって投与量を調整する必要がある。

【0003】

もし薬剤の投与量が最適値よりも少ない場合、血栓が再発する恐れがあり、一方で、最適値よりも多い場合は日々体内で起きている内出血を止血することができない副作用が生じる。このため、患者は自身の血液凝固状態を把握するために１週間に１回程度で通院し、血液凝固活性の状態を検査している。また、外科手術後の傷口の止血として凝固剤を投与する場合があり、現在の止血度合いを監視するために、治療とは別に冗長の入院期間が必要となる。従って、血液凝固活性の状態が、より簡便に測定できる技術が求められている。

【0004】

ここで、血漿中における血液凝固の過程には、外因性血液凝固と内因性血液凝固の２つが存在する。この中で、内因性血液凝固は、血管内皮細胞下組織に接する際に受ける負電荷作用などを、凝固活性を上げる因子とし、初期にはプレカリクレインと高分子量キニノゲンが第ＸＩＩ因子を活性化することで内因性凝固反応が開始される。この後、血液凝固の過程に従い各種血液凝固因子の情報伝達を経由した後、最終的に可溶化状態であるフィブリノゲンを切断・架橋することで不溶化の重合フィブリンを生成し、血栓が形成される。

【0005】

上述した内因性凝固因子による血液凝固能を測定する検査方法として、一般にＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間：Activated Partial Thromboplastin Time）検査法が用いられている（非特許文献１参照）。この検査方法では、血液が凝固するタンパク質（トロンボモジュリンやエラグ酸）およびカルシウムイオンを、凝固反応を誘因させる物質として血漿に混合し、混合開始から凝固完了までの時間（凝固点）を測定し、標準血漿の結果と比較して遅延時間を見積もっている。

【0006】

例えば、誘因物質としてエラグ酸などの負電荷を帯びた生体物質を血漿サンプルに反応させて第ＸＩＩ因子を十分活性状態にした後、塩化カルシウムを添加し、この結果生成される最終産物である不溶化フィブリンの生成量を物理的に測定する。あるいは、各種血液凝固因子を合成基質法などで測定する。これらの検査は、病院内の大型分析装置を用いて実施されている。

【0007】

検査によって得られるＡＰＴＴが標準値よりも延長される場合、例えば、血友病などの血液凝固因子の異常、肝炎・肝硬変などの血液凝固因子を生産する肝機能の障害が主に考えられる。また、ビタミンＫ欠乏症や骨髄腫などによっても血液が固まるまでの時間は長くなる。このように、ＡＰＴＴによって、様々な病態異常を発見することが可能である。また、前述した抗凝固剤の投与量の最適値も、ＡＰＴＴによって判断できる。

【0008】

ＡＰＴＴを物理的に測定する方法として、撹拌抵抗式，光散乱方式，熱伝導式，水晶振動子式などが発明されているが、現在一般には、撹拌抵抗および光散乱方式が多く用いられている。撹拌抵抗式の場合、サンプル（検体）を活性化剤と一緒に導入してフィンで撹拌し、フィンの抵抗の上昇から凝固時間を得る方法である。また、光散乱方式は、試験用容器内で、血漿に凝固活性化を促す成分を含む試薬を混合し、容器に対して光を入射し、入射した光の散乱光量変化を測定して凝固時間を得る方法である。散乱光から凝固時間を得るためには、散乱光量をこのまま利用する方法、散乱光量の微分値を利用する方法、あるいは散乱光量がある一定値に達するまでの時間を求める方法がある（特許文献１参照）。

【0009】

また、発明者らは、マイクロ流路を備える測定チップを使った表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定法を用いた流速測定によるＡＰＴＴ測定を提案している（特許文献２参照）。この測定では、まず、エラグ酸および塩化カルシウムなどの凝固活性化剤を対象となる血漿に混合した血漿サンプルを測定直前に調製する。次に、緩衝液を満たしてあるマイクロ流路に調製した血漿サンプルを導入する。このようにして導入した血漿サンプルが緩衝液と共に移送されるときの流速を測定し、測定された流速より凝固時間を求めている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開平０６−０２７１１５号公報

【特許文献2】ＷＯ２００９／０９０９８５

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】藤巻 道雄、福武 勝幸 編集、「血液凝固検査ハンドブック」、１６３−１６６頁、株式会社宇宙堂八木書店発行。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

しかしながら、現在一般に用いられているＡＰＴＴ検査は、あまり高い再現性が得られないという問題が指摘されている。再現性が得られない要因として、ＡＰＴＴにおいては、刺激対象のトリガー物質が凝固の過程のより初期の段階で作用しているため、混合試料の活性を均一にすることが難しい点が挙げられる。

【0013】

従来のＡＰＴＴ測定では、ある程度おおきな体積の容器内で各試薬を混合した後の試料を測定しているが、混合している容器内で反応ムラが発生し、測定点によって結果に誤差が生じる恐れがある。また時間測定を行うため、検体，エラグ酸，および塩化カルシウムとより多くの試薬を混合するＡＰＴＴでは、混合の順番などによって装置手技依存のタイムラグが発生するため、測定者や装置間で発生する検査誤差が問題となっている。

【0014】

また、特許文献２のＳＰＲ測定法を用いた流速測定によるＡＰＴＴの測定では、上述した従来のＡＰＴＴ検査に倣い、例えば、検体，エラグ酸，および塩化カルシウムを混合した検査対象の試料を測定対象としており、前述同様に、流路内で凝固反応のムラが発生しやすいという問題が発生する。

【0015】

また、通常、ＡＰＴＴは３０秒前後であり、１００％を超える高活性血漿が対象の場合、血漿と凝固活性化剤とを混合してから流路内に導入するまでの間に凝固が進行し、流路に導入した直後に凝固反応により粘度が増加し、流速測定が困難になる場合が発生する。この粘度の増加は、緩衝液などで血漿を希釈した試料を用いて測定することである程度は解決できる。しかしながら、このように希釈して測定すると、ＣＶ（変動係数：Coefficient of Variation）が低下し、バラツキが増加して測定の精度が低下する。

【0016】

以上に説明したように、従来では、内因性凝固因子による血液凝固能が、簡便な方法で正確に測定できないという問題があった。

【0017】

本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、簡便な方法で正確に内因性凝固因子による血液凝固能が測定できるようにすることを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0018】

本発明に係る血液凝固測定方法は、血漿を含む検体と、接触因子を活性化する第１化学物質が溶解した第１水溶液と、カルシウムイオンを供給する第２化学物質が溶解した第２水溶液とを混合することで、検体の血液凝固能を判定する血液凝固測定方法において、少なくとも第２水溶液は独立し、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に検体，第１水溶液，および第２水溶液を流路に導入する第１工程と、流路を流れる流体の流速を測定する第２工程と、測定された流速から検体における血液凝固能を判定する第３工程とを少なくとも備える。

【0019】

上記血液凝固測定方法において、第１工程では、検体，第１水溶液，および第２水溶液を、少なくとも第１水溶液を２番目に導入する状態で各々個別に流路の一端より導入し、検体，第１水溶液，および第２水溶液が流路の延在方向に直列に配列して隣り合う各々が接触して流れる状態とする。

【0020】

上記血液凝固測定方法において、第１化学物質は、エラグ酸，カオリン，セライトより選択されたものであればよい。

【0021】

上記血液凝固測定方法において、第２化学物質は、塩化カルシウムであればよい。また、流速は、表面プラズモン共鳴に基づく流速測定により測定するとよい。

【発明の効果】

【0022】

以上説明したことにより、本発明によれば、簡便な方法で正確に内因性凝固因子による血液凝固能が測定できるようになるという優れた効果が得られる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、本発明の実施の形態における血液凝固測定方法を説明するためのフローチャートである。

【図2】図２は、本発明の実施の形態における血液凝固測定方法を説明するための説明図である。

【図3】図３は、本発明の実施の形態における血液凝固測定方法を実施する装置の構成を示す断面図（ａ），（ｂ）、および平面図（ｃ）である。

【図4】図４は、本発明の実施の形態における血液凝固測定方法の実施に用いる測定チップ４００の構成を示す断面図（ａ）、および平面図（ｂ）である

【図5】図５は、表面プラズモン共鳴測定装置５００の構成を示す構成図である。

【図6】図６は、表面プラズモン共鳴測定における流速の算出について説明する説明図である。

【図7】図７は、標準血漿を用いた実験により得られたＳＰＲ屈折率分布の結果を示す特性図である。

【図8】図８は、１００％活性血漿と３３％活性血漿から得られた各々の屈折率分布から流速を求めた結果を示す特性図である。

【図9】図９は、本発明の実施の形態における他の血液凝固測定方法を説明するための説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における血液凝固測定方法を説明するためのフローチャートである。

【0025】

まず、ステップＳ１０１で、血液など血漿を含む検体と、接触因子を活性化する第１化学物質が溶解している第１水溶液とを混合した混合液を作製する。検体に第１化学物質を混合して混合液としてもよい。

【0026】

次に、ステップＳ１０２で、作製した混合液を凝固活性化する第２化学物質が溶解している第２水溶液および混合液を流路に導入し、第２水溶液と混合液とが流路の延在方向に直列に配列して接触した状態で流れる状態とする（第１工程）。

【0027】

例えば、図２の（ａ）に示すような、流路２０４を備える装置を用いればよい。この装置は、透明な基板２０１と、基板２０１の測定領域に形成された表面プラズモン共鳴測定を行うための金属層２０２と、基板２０１の上に配置された流路基板２０３とを備え、基板２０１と流路基板２０３との間に流路２０４が形成されている。

【0028】

図２の（ａ），図３の（ａ）に示すように、流路２０４に、第２水溶液２１１を満たし、図２の（ｂ），（ｃ），図３の（ｂ）に示すように、第２水溶液２１１が満たされている流路２０４の一端の導入口２０５より混合液２１２を導入し、流路２０４の他端の排出口２０６より、一定の圧力（負圧）で第２水溶液２１１を牽引すればよい。排出口２０６に負圧機構３０１を接続し、第２水溶液２１１を吸引すればよい。このようにすることで、流路２０４内で他端側（排出口２０６側）に第２水溶液２１１が存在し、一端側（導入口２０５側）に混合液２１２が存在し、第２水溶液２１１の終端と混合液２１２の先端とが接触する状態で、これらが流路２０４内を他端の方向に輸送される状態となる。

【0029】

ここで、接触している接触領域２１３では、混合液２１２に第２水溶液２１１が添加されることになり、接触領域２１３では、検体，第１化学物質，および第２化学物質が混合した状態となり、凝固反応が起こり得る状態となっている。このため、上述したように、第２水溶液２１１と混合液２１２が配列して流路２０４に流れる状態として接触領域２１３が形成された時点より、接触領域２１３では、凝固反応が開始されることになる。

【0030】

次に、ステップＳ１０３で、図２の（ｂ）に例示するように、混合液２１２の先端と第２水溶液２１１の終端とが接触して接触領域２１３を形成し、これらが図２の（ｂ），図２の（ｃ）に示すように流路２０４内を輸送されている状態で、流路２０４内の流体の流速を測定する（第２工程）。図３の（ｃ）に示す流路２０４内の所定の測定領域３０２において流速を測定する。この流速の測定においては、接触領域２１３が測定領域３０２を通過しているときの速度（流速）を測定すればよい。例えば、流速は、よく知られた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく流速測定により測定すればよい（特許文献２参照）。

【0031】

例えば、測定領域３０２を接触領域２１３が通過するときのＳＰＲ屈折率を時系列的に測定領域３０２の全域で測定し、時間および測定位置に対するＳＲＰ屈折率変化の分布図を作成する。この分布図の中で、屈折率変化の大きな点が、接触領域に対応する。従って、作成したＳＰＲ屈折率分布図を用いて屈折率変化の大きな点（接触領域）の推移をプロットし、プロットの状態（形状，方向きなど）から流速を求める。

【0032】

次に、ステップＳ１０４で、測定により求められた流速から検体における血液凝固能を判定する（第３工程）。例えば、標準血漿を用いた同様の測定を予め行って標準値を得ておき、標準値と測定結果とを比較することで、検体におけるＡＰＴＴの遅延時間（血液凝固能）を見積もることができる。

【0033】

流路２０４の他端で第２水溶液２１１を牽引している速度（量）を一定としている状態では、流路２０４内で流体の粘度上昇を招く凝固反応が起きない状態に比較し、接触領域で凝固反応が起きて粘度が上昇すれば、測定される流速は遅いものとなる。従って、例えば、標準血漿を用いた測定による標準値より測定される流速が早い場合、検体における内因性血液凝固に異常があるものと判断できる。

【0034】

ここで、内因性血液凝固では、凝固の過程が比較的多いため、凝固の反応が完全に起こらない状態で、接触領域２１３が測定領域３０２を通過する場合も発生する。この場合、流路の断面積、牽引の条件、流路２０４の長さなどを適宜に設定変更し、接触領域２１３において凝固反応が完全に起きる状態で測定がなされるようにすればよい。例えば、導入口２０５から測定領域３０２までの距離をより長くすれば、接触領域２１３が測定領域３０２に到達した時点で、凝固反応が完全に起きている状態（十分な活性状態）が得られる。

【0035】

［実施例］
以下、実施例を用いてより詳細に説明する。まず、測定に用いた測定チップ４００について説明する。測定チップ４００は、図４に示すように、透明なプラスチックからなる基板４０１と、膜厚５０ｎｍ程度のＡｕ薄膜４０２と、流路基板４０３とから構成されている。プラスチックは、ＳＰＲ測定に用いるＳＰＲ装置の測定面が構成されているプリズムと同じ屈折率を持つものから構成すればよい。例えば、三井化学株式会社製のアペル（登録商標）から基板４０１を構成すればよい。Ａｕ薄膜４０２は、例えば、スパッタリング法により形成すればよい。

【0036】

また、流路基板４０３は、流路４０４となる溝部，導入口４０５，および排出口４０６を備える。例えば、エポキシ樹脂（ＳＵ−８フォトレジスト）で鋳型を形成し、この鋳型を用いてＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）から流路基板４０３を成型すればよい。流路４０４は、流路長１０ｍｍ、流路幅０．５ｍｍ、流路高さは７５μｍ程度とする。また、導入口４０５，排出口４０６の孔径は、０．８ｍｍとし、高さは０．２５ｍｍとした。流路基板４０３と基板４０１とは個別に作製し、最後に、流路４０４が測定領域に重なるように測定チップ４００を組み立てた。

【0037】

次に、測定について説明する。まず、測定チップ４００の流路４０４内に０．０２Ｍの塩化カルシウム溶液を充填した。塩化カルシウムは、カルシウムイオンを供給する第２化学物質であり、塩化カルシウム溶液が第２水溶液に対応する。次に、図５に示すように、測定チップ４００を、表面プラズモン共鳴測定装置（ＳＰＲ）５００の測定面５０４に設置する。プリズム５０３の測定面５０４と、測定チップ４００の基板４０１との間には、マッチングオイルを配置し、光源５０１からの光の光軸に、検出領域が重なるように測定チップ４００を載置する。この初期状態において測定されるＳＰＲ角度を初期状態とした。

【0038】

内因性血液凝固の接触因子活性化血漿（混合液）は、血液凝固用標準血漿を３７℃で１分間加熱した後、第１化学物質として同量のＡＰＴＴ試薬（コアグピアＡＰＴＴ、積水化学工業株式会社製）を加えて再度３７℃で４分間加熱することで調製した。ベースライン取得のため、塩化カルシウム溶液を充填してある初期状態でのＳＰＲ角度分布を３０秒間測定した後、上述した混合液（３μリットル）を、ＳＰＲ装置５００の測定面５０４上にマウントしてある測定チップ４００の導入口４０５より導入した。また、排出口４０６から、充填されている塩化カルシウム溶液を定圧牽引（吸引）した。

【0039】

これにより混合液と塩化カルシウム液とが、流路４０４の延在方向に直列に配列し、接触領域で接触した状態で流れる状態となる。また、前述したように、接触領域では、凝固反応が開始されることになる。なお、混合液における血漿の活性調整は、オーレンベロナール緩衝液（シスメックス）による希釈で行うことができる。例えば、１００％活性の標準血漿に対して緩衝液で２倍に希釈した場合の混合液では、凝固活性が５０％となる。

【0040】

この測定では、光源５０１から出射された光を入射側レンズ５０２で集光してプリズム５０３に入射させ、プリズム５０３の測定面５０４に密着させている測定チップ４００の検出領域の金属層に照射する。測定チップ４００の検出領域にはＡｕ薄膜４０２が形成されており、このＡｕ薄膜４０２表面を測定対象の流体が流れていく状態で、Ａｕ薄膜４０２の裏面に、測定チップ４００の基板４０１を透過してきた集光光が照射される。このようにして照射された集光光は、Ａｕ薄膜４０２の裏面で反射し、いわゆるＣＣＤイメージセンサなどの撮像素子よりなる光検出領域５０５で強度（光強度）が測定される。この測定において、例えば、Ａｕ薄膜４０２表面におけるエバネッセント波と表面プラズモン波との共鳴が起こる角度では、反射率が低くなる谷が観測される。

【0041】

このような表面プラズモン共鳴測定においては、例えば、ＣＣＤイメージセンサのｘ方向の１ライン毎に屈折率を反映したデータが観測されている。このため、検出領域の流路４０４を、混合液と塩化カルシウム溶液との接触領域が進行していくと、前述したように屈折率変化が起こり、ＣＣＤイメージセンサのライン毎にどのタイミングで接触領域進行による屈折率変化が起こったかが記録される。このように、測定チップ４００の流路４０４内を流れる接触領域の時系列的な屈折率変化の測定の中で、屈折率変化の起こった時点（時刻）を読み取るようにすればよい。

【0042】

例えば、図６の（ａ）に示すように、ＣＣＤイメージセンサのＹライン毎に記録されている屈折率変化の時間変化から、屈折率のステップ変化が起こった時刻を読み取る。図６の（ｂ）に示すように、表面プラズモン共鳴角度に相当する最も光が吸収されたピクセル強度をカラープロファイルで表示することで、上述した読み取りの状態をより視覚的に表す。また、図６の（ｃ）に示すように、上述した読み取りにおけるｘライン毎の時間変化をカラープロファイルの変化で表すようにしてもよい。図６の（ｃ）に示す矢印で示される傾きが、流速となる。Ｙラインのピクセルに対応する流路４０４上の実距離（約１０μｍ）を代入して計算し、傾きである流速はμｍ／ｓｅｃの単位で記述される。なお、図６では、カラープロファイルをグレースケールで簡略化して示している。

【0043】

このようにして得られる接触領域の流速は、例えば、流速とＡＰＴＴとの関係を示す検量線から、ＡＰＴＴに変換することができる。例えば、血漿活性化能およびＡＰＴＴが既知の複数の標準血漿を用いて上述同様の測定により複数の流速を求め、これらの結果より検量線を作製しておけばよい。

【0044】

実際に測定した結果（ＳＰＲ屈折率分布）について図７に示す。血漿サンプルとして、ＡＰＴＴ測定用標準血漿Ｉ（１００％活性）および標準血漿ＩＩ（３３％活性）を測定実験に用いた。また、標準血漿Ｉに対してオーレンベロナール緩衝液を用いて希釈することで活性が５０％の血漿サンプルおよび活性が７５％の血漿サンプルを調製し、測定実験に用いた。図７に示すように、活性状態によって液−液界面（接触領域）の通過状態が変化する様子がわかる。また、図７の（ｄ）に示すように、１００％活性では、下流に行くに従って、凝固反応の進行による増粘の影響に伴い流速が大きく変化していく様子が観測された。

【0045】

１００％活性血漿と３３％活性血漿から得られた各々の屈折率分布から流速を求めた結果を図８に示す。１００％活性血漿（１００％active）の方が、３３％活性血漿（３３％active）に比較して、再現性良く流速が遅い結果が得られ、従来のＡＰＴＴの時間遅延と相関があった。これらの屈折率分布図および流速をデータベース化し、参照することにより、活性の不明な血漿を検体とした場合の活性能を測定することが可能となる。

【0046】

以上に説明したように、本発明では、少なくとも第２水溶液は独立し、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に検体，第１水溶液，および第２水溶液を流路に導入し、この状態で測定される流速から検体における血液凝固能を判定するようにしたところに特徴がある。なお、検体は、血漿を含むものであり、例えば血漿そのものでもよくまた、血液でもよい。ただし、全血の場合は、血球などを除去しておく。また、第１水溶液は、接触因子を活性化する第１化学物質が溶解したものであり、第２水溶液は、カルシウムイオンを供給する第２化学物質が溶解したものである。

【0047】

この方法によれば、少なくとも第２水溶液は、上述したように流路中で接触することで形成される接触領域で他の第１水溶液および検体と混合する状態となるので、検体，第１水溶液，および第２水溶液の全てが混合して血液凝固反応が起き得る領域が、接触領域に制限されるようになる。この結果、凝固反応のムラが抑制された状態で流速が測定できるようになるので、流速の測定という簡便な測定方法により、正確に内因性凝固因子による血液凝固能が測定できるようになる。

【0048】

これにより、例えば、検体における凝固過程途中に異常因子が存在する場合など、ＡＰＴＴ延長原因因子の把握が、従来よりも容易となる。また、マイクロ流路を用いることで、検体や試薬の量をマイクロリットルスケールでごく少量とすることができ、また、装置も簡便な構成でよいため、検査装置の小型化が容易である。

【0049】

ここで、上述したように、「少なくとも第２水溶液は独立し、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に検体，第１水溶液，および第２水溶液を流路に導入」するために、前述した実施の形態では、まず、検体に第１水溶液を混合した混合液を作製し、この混合液を第２水溶液が満たされている流路に導入し、第２水溶液と混合液とが流路の延在方向に直列に配列して接触した状態で流れる状態としている。

【0050】

このようにすることで、検体，第１水溶液，および第２水溶液の全てが混合して血液凝固反応が起き得る領域は、第２水溶液と混合液とが接触した接触領域に限定されるようになる。

【0051】

また、次に示すようにすることで、「少なくとも第２水溶液は独立し、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に検体，第１水溶液，および第２水溶液を流路に導入」し、検体，第１水溶液，および第２水溶液の全てが混合して血液凝固反応が起き得る領域を限定してもよい。

【0052】

まず、図９の（ａ）に示すように、第１工程では、検体９０２，第１水溶液９０３，および第２水溶液９０４を、少なくとも第１水溶液９０３を２番目に導入する状態で各々個別に流路９０１の一端より導入し、検体９０２，第１水溶液９０３，および第２水溶液９０４が流路９０１の延在方向に直列に配列して隣り合う各々が接触して流れる状態とする（第１工程）。例えば、流路９０１に緩衝液９０５が満たされている状態で、流路９０１の一端（図９では左側）より、第２水溶液９０４，第１水溶液９０３，検体９０２の順に導入すればよい。この場合、第２水溶液９０４に加え、第１水溶液９０３および検体９０２も、独立して流路９０１の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路９０１を流れる状態となる。

【0053】

次に、流路９０１の他端（図９では左側）より緩衝液９０５を吸引することで、緩衝液９０５を牽引する。これにより、図９の（ｂ）に示すように、検体９０２，第１水溶液９０３，および第２水溶液９０４は、流路９０１の他端側に輸送される。この輸送の過程で、検体９０２と第１水溶液９０３との接触領域９１１では、検体９０２と第１水溶液９０３とが混合する。また、第１水溶液９０３と第２水溶液９０４との接触領域９１２では、第１水溶液９０３と第２水溶液９０４とが混合する。

【0054】

引き続き牽引すると、図９の（ｃ）に示すように、各部分は、さらに流路９０１の他端側に輸送される。この輸送の過程で、接触領域９１１および接触領域９１２は輸送方向に拡散し、接触領域９１１と接触領域９１２とが接触する混合領域９１３が形成されるようになる。前述したように、接触領域９１１は、検体９０２と第１水溶液９０３とが混合しており、接触領域９１２は、第１水溶液９０３と第２水溶液９０４とが混合している。このため、混合領域９１３では、検体９０２，第１水溶液９０３，および第２水溶液９０４が混合した状態となり、凝固反応が起こりえる状態となる。このようにすることでも、凝固反応が起こりえる領域を混合領域９１３に限定されるようになり、凝固反応のムラが抑制できるようになる。

【0055】

なお、このようにする場合、第１水溶液９０３が、中央に配列された状態とすることが重要である。上述では、進行方向に第２水溶液９０４，第１水溶液９０３，検体９０２の順で配列させたが、進行方向に検体９０２，第１水溶液９０３，第２水溶液９０４の順で配列させてもよい。また、接触領域９１１と接触領域９１２とが混合する混合領域９１３が形成されやすくするためには、第１水溶液９０３の導入量を余り多くしない方がよい。第１水溶液９０３の導入量は、流路９０１において、導入初期に上記配列の状態が維持できる最小の量とすればよい。

【0056】

なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、第１化学物質は、エラグ酸，カオリン，セライトより選択されたものであればよい。

【符号の説明】

【0057】

２０１…基板、２０２…金属層、２０３…流路基板、２０４…流路、２０５…導入口、２０６…排出口、２１１…第２水溶液、２１２…混合液、２１３…接触領域。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図8】

【図6】

【図7】

【図9】