【図1】キメラ蛋白質塗布・結合紙片の風乾後の耐乾燥性能（室温保存）評価操作手順を示す。各工程は、以下の通りである。（Ａ）キメラ蛋白質の水溶液を、パンチで切り抜いた円形濾紙片へ滴下し、キメラ蛋白質を濾紙へ結合させる。（a-1）濾紙片を乾燥させる。（a-2）濾紙片を、室温で保存する。（Ｂ）バッファーを添加する。（b）これにより、濾紙片を湿潤化する。（Ｃ）ルシフェリン水溶液を濾紙片を含むバッファーへ添加する。（c）得られた湿潤濾紙片について、ルシフェラーゼの活性測定をする。

【図2】CBD-BAF結合紙片の室温乾燥保存性能を示す。（Ａ）室温で乾燥保存したCBD-BAF-Ym3結合紙片（濾紙）を、バッファー及びルシフェリン水溶液で反応した例を示す。（ａ）明視野像、（ｂ）マージ像、及び（ｃ）化学発光像をそれぞれ示す。明視野像（a）において、濾紙片中心の円形領域は、CBD-BAF-Ym3の塗布領域を示す。マージ像（b）と化学発光像（c）において、CBD-BAFの塗布領域で緑色の発光が認められた。（Ｂ）保存期間を通じた、発光強度の測定結果を示す（N=5）。横軸は、濾紙片の室温乾燥状態での保存期間（週）を示す。縦軸は、測定した発光強度（x10⁸ RLU）を示す。乾燥状態の濾紙は、室温27℃で保存した。

【図3】hCBD-eBAF-Ym3結合紙片の長期間の室温乾燥保存性能を示す。（Ａ）hCBD-eBAF-Ym3の構造の模式図を示す。Ｎ末端側から順に、セルロース及び／又はキチン結合ドメインであるhCBD及び発光ドメインであるeBAF-Ym3を有する。（Ｂ）保存期間を通じた、発光強度の測定結果を示す（N=5）。横軸は、濾紙片の室温乾燥状態での保存期間（週）を示す。縦軸は、測定した発光強度（RLU）を示す。乾燥状態の濾紙は、室温22〜27℃で保存した。なお、保存期間52週は、保存期間1年間を示す。

【図4】プロテアーゼ認識配列を有するhCBD-eBAF-R₃結合紙片の長期間の室温乾燥保存性能を示す。（Ａ）hCBD-eBAF-R₃の構造の模式図を示す。Ｎ末端側から順に、セルロース及び／又はキチン結合ドメインであるhCBD、プロテアーゼ認識配列であるHRV-3C切断配列を導入したリンカー、及び発光ドメインであるeBAF-R₃を有する。（Ｂ）保存期間を通じた、発光強度の測定結果を示す（N=3）。横軸は、濾紙片の室温乾燥状態での保存期間（週）を示す。縦軸は、測定した発光強度（RLU）を示す。乾燥状態の濾紙は、室温22〜26℃で保存した。なお、保存期間52週は、保存期間1年間を示す。

【図5】プロテアーゼ認識配列を有するhCBD-eBAF-R₄結合紙片の長期間の室温乾燥保存性能を示す。（Ａ）hCBD-eBAF-R₄の構造の模式図を示す。Ｎ末端側から順に、セルロース及び／又はキチン結合ドメインであるhCBD、プロテアーゼ認識配列であるHRV-3C切断配列を導入したリンカー、及び発光ドメインであるeBAF-R₄を有する。（Ｂ）保存期間を通じた、発光強度の測定結果を示す（N=3）。横軸は、濾紙片の室温乾燥状態での保存期間（週）を示す。縦軸は、測定した発光強度（RLU）を示す。乾燥状態の濾紙は、室温26℃で保存した。なお、保存期間52週は、保存期間1年間を示す。

【図6】プロテアーゼ活性検出モデル系の実施例の手順を示す。（Ａ）（a-1）キメラ蛋白質水溶液を濾紙片へ滴下し、濾紙へ結合させる。これを乾燥させ（i）キメラ蛋白質結合濾紙片（i）を作製した。（a-2）反応バッファー（ii）を加えてこれを十分湿潤させた後、バッファーを除去し、プロテアーゼを含むバッファー溶液（iii）を改めて添加した。（a-3）得られた試料を4℃にて64時間静置し、プロテアーゼ反応を行なった。（Ｂ）（b-1）反応前の状態を模式的に示す。バッファー中で、キメラ蛋白質結合濾紙（紙片）は微量遠心チューブの底に沈む。バッファー中には、プロテアーゼ（p）が存在する。（b-2）定温静置により、反応を進行させる。（b-3）反応後の状態を模式的に示す。プロテアーゼにより切断されたBAF部分は、水層中へ遊離する。（b-4）反応後の試料の上清を分取又は分離し、発光（又は蛍光）を測定する。

【図7】プロテアーゼ活性検出モデル系の実施例の結果を示す。（Ａ）モデル系の機構を模式的に示す。（a-1）キメラ蛋白質が濾紙に結合した状態を、模式的に示す。キメラ蛋白質は、Ｎ末端側から順に、セルロース及び／又はキチン結合ドメインであるhCBD、プロテアーゼ認識配列であるHRV-3C切断配列を導入したリンカー、及び発光ドメインであるBAFを有する。HRV-3C切断配列は、LEVLFQ/GP（/は、切断部位を示す。）である。（a-2）HRV-3Cプロテアーゼの作用によりキメラ蛋白質は切断され、BAF部分は水層へ遊離する。（Ｂ）回収した上清（水層）の化学発光測定結果を示す。縦軸は、測定した相対発光強度（RLU）を示す。切断酵素（HRV-3Cプロテアーゼ）を添加した試料（+）の水層は、切断酵素を添加しない試料（-）の水層に対して、3000倍の発光が測定された。（Ｃ）SDS-PAGE電気泳動の結果を示す。試料は、左から切断酵素（プロテアーゼ）を添加しない試料（-）の水層、切断酵素を添加した試料（+）の水層、及びhCBD-HRV3Cs-eBAF-Ym3精製標品（hCBD-BAF、コントロール）である。検出されたバンドは、（i）hCBD-BAF、（ii）切断され濾紙から水層中へ遊離したBAF部分、及び（iii）HRV-3C酵素をそれぞれ示す。（Ｄ）水層のBAFのGFP蛍光を示す。左は切断酵素（プロテアーゼ）を添加しない試料の水層、右は切断酵素を添加した試料の水層である。

【図8】キチン結合ドメインの配列の例を示す。（Ａ）Pyrococcus furiosus由来のキチン結合ドメイン２（chBD2）のアミノ酸配列およびこれをコードする塩基配列の例を示す。（Ｂ）chBD2のアミノ酸配列において、Glu(E279)がThr(T)に及びAsp(D281)がAsn(N)に置換されたChBD2(TN)のアミノ酸配列およびこれをコードする塩基配列の例を示す。

【図9】プロテアーゼ認識配列を有するキメラ蛋白質結合キチン素材の長期間の室温乾燥保存性能を示す。（Ａ）カニ甲羅に由来するキチン素材に、hCBD-eBAF-Ym3、hCBD-eBAF-R₃及びhCBD-eBAF-R₄の各々のキメラ蛋白質を塗布した。図９Ａは、各種キメラ蛋白質を塗布した領域を各々示す。（Ｂ）（b-1）3日間保存した発光蛋白質−キチンハイブリッド素材の蛍光灯下での明視野像を示す。（b-2）3日間保存した該ハイブリッド素材の、励起光照射による蛍光像を示す。（b-3）10か月保存した後の蛍光像を示す。

【図10】プロテアーゼ認識配列を有するhCBD-RLuc結合紙片の長期間の室温乾燥保存性能を示す。（Ａ）hCBD-RLucの構造の模式図を示す。Ｎ末端側から順に、セルロース及び／又はキチン結合ドメインであるhCBD、プロテアーゼ認識配列であるHRV-3C切断配列を導入したリンカー、及び発光ドメインであるRLucを有する。（Ｂ）保存期間を通じた、発光強度の測定結果を示す（N=3）。横軸は、濾紙片の室温乾燥状態での保存期間（週）を示す。縦軸は、測定した発光強度（RLU）を示す。乾燥状態の濾紙は、室温26℃で保存した。

【図11】eBAF-Ym3の発光スペクトル及びhCBD-eBAF-Ym3結合キチン素材の、ルシフェリン（発光基質）添加時の化学発光活性を示す（緑色）。キチンには、カニ甲羅に由来するキチン素材を用いた。（Ａ）eBAF-Ym3の発光スペクトルを示す。横軸は、発光波長（Wavelength(nm)）を示す。縦軸は、測定した相対発光強度（Relative Intensity）を示す。（Ｂ）hCBD-eBAF-Ym3結合キチンハイブリッド素材の一例について、（b-1）明視野像、（b-2）化学発光像、及び（b-3）重ね合わせ像（解説図）を示す。（b-3）において、矢印でhCBD-eBAF-Ym3を塗布した領域を指し示す。

【図12】eBAF-R_３の発光スペクトル及びhCBD-eBAF-R₃結合キチン素材の、ルシフェリン（発光基質）添加時の化学発光活性を示す。（オレンジ色）キチンには、カニ甲羅に由来するキチン素材を用いた。（Ａ）eBAF-R_３の発光スペクトルを示す。横軸は、発光波長（Wavelength(nm)）を示す。縦軸は、測定した相対発光強度（Relative Intensity）を示す。（Ｂ）hCBD-eBAF-R₃結合キチンハイブリッド素材の一例について、（b-1）明視野像、（b-2）化学発光像及び（b-3）重ね合わせ像を示す。

【図13】eBAF-R₄の発光スペクトル及びhCBD-eBAF-R₄結合キチン素材の、ルシフェリン（発光基質）添加時の化学発光活性を示す（白色）。キチンには、カニ甲羅に由来するキチン素材を用いた。（Ａ）eBAF-R₄の発光スペクトルを示す。横軸は、発光波長（Wavelength(nm)）を示す。縦軸は、測定した相対発光強度（Relative Intensity）を示す。（Ｂ）hCBD-eBAF-R₄結合キチンハイブリッド素材の一例について、（b-1）明視野像、（b-2）化学発光像、及び（b-3）重ね合わせ像を示す。

【図14】hCBD-eBAF-Ym3結合キチンハイブリッド素材の発光。キチン素材として、セミの抜け殻を用いた。（Ａ）hCBD-eBAF-Ym3結合素材とコントロールとの対比を示す。（a-1）明視野像及び（a-2）化学発光像を示す。左がhCBD-eBAF-Ym3結合キチン素材、右がバッファーのみを含む容器（コントロール）を示す。（Ｂ）hCBD-eBAF-Ym3を結合したセミの抜け殻の全体像を示す。（b-1）明視野像及び（b-2）化学発光像を示す。