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特許5852866ポリフェノールのメチル化方法、及びそれを用いたメチル化ポリフェノールの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5852866
(24)【登録日】2015年12月11日
(45)【発行日】2016年2月3日
(54)【発明の名称】ポリフェノールのメチル化方法、及びそれを用いたメチル化ポリフェノールの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 17/06 20060101AFI20160114BHJP
C12R 1/645 20060101ALN20160114BHJP
【ＦＩ】
C12P17/06
C12P17/06
C12R1:645
【請求項の数】9
【全頁数】34
(21)【出願番号】特願2011-263985(P2011-263985)
(22)【出願日】2011年12月1日
(65)【公開番号】特開2013-116055(P2013-116055A)
(43)【公開日】2013年6月13日
【審査請求日】2014年11月20日
(73)【特許権者】
【識別番号】000006116
【氏名又は名称】森永製菓株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】一色国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】柳江 高次
(72)【発明者】
【氏名】木下 洋輔
(72)【発明者】
【氏名】佐野 翔子
(72)【発明者】
【氏名】西村 栄作
(72)【発明者】
【氏名】栗田 郁子
(72)【発明者】
【氏名】木藤 圭次郎
(72)【発明者】
【氏名】中橋 かおり
(72)【発明者】
【氏名】岡田 英樹
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 嘉一
【審査官】
上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】
特開平３−２３２４９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００６−１４１２４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Applied and Environmental Microbiology，２００９年，Vol.75, No.9，p.2765-2774
【文献】
Journal of Biological Chemistry ，１９９９年，Vol.274, No.31，p.21665-21672
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｐ １７／０６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＣＡＳＲＥＡＣＴ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリフェノールを含有する培地でSchizosaccharomyces属酵母を培養する工程を含む、ポリフェノールのメチル化方法。
【請求項2】
前記ポリフェノールが、フェノール酸、フラボノイド、またはスチルベンであることを特徴とする、請求項１に記載のメチル化方法。
【請求項3】
前記ポリフェノールが、エピガロカテキンガレート、ケルセチン、ゲニステイン、エピカテキン、ルテオリン、ナリンゲリン、レスベラトロール、ピセアタンノール、没食子酸であることを特徴とする、請求項１または２に記載のメチル化方法。
【請求項4】
前記ポリフェノールが、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）または没食子酸であることを特徴とする、請求項３に記載のメチル化方法。
【請求項5】
前記酵母が、Schizosaccharomyces pombe又はSchizosaccharomyces octosporusであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のメチル化方法。
【請求項6】
メチル化ポリフェノールの製造方法であって、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のメチル化方法によって、ポリフェノールをメチル化する工程を含む製造方法。
請求項１〜５のいずれか１項に記載のメチル化方法によって、ポリフェノールをメチル化する工程を含む製造方法。
【請求項7】
前記メチル化ポリフェノールが、（−）−エピガロカテキン−３−（３−Ｏ−メチル）ガレートまたは（−）−エピガロカテキン−３−（４−Ｏ−メチル）ガレートであって、前記ポリフェノールが、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）であることを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【請求項8】
前記メチル化ポリフェノールが、３−Ｏ−メチルガレート、４−Ｏ−メチルガレート、または３，４−Ｏ−メチルガレートであって、前記ポリフェノールが、没食子酸であることを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【請求項9】
メチル化ポリフェノールのメチル化の位置を決定する方法であって、
請求項６に記載の製造方法によって、メチル化ポリフェノールを製造する工程と、
製造されたメチル化ポリフェノールのどの位置がメチル化されているかを決定する工程と、
を含む決定方法。
請求項６に記載の製造方法によって、メチル化ポリフェノールを製造する工程と、
製造されたメチル化ポリフェノールのどの位置がメチル化されているかを決定する工程と、
を含む決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリフェノールのメチル化方法、及びそれを用いたメチル化ポリフェノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、ポリフェノールの生理活性が話題になり、健康増進作用を有する様々な効能が見つかっている。特に、“べにふうき”などに豊富に含まれる茶メチル化カテキンは、強い抗アレルギー作用を有するとして注目を浴びている。 しかし、これまで、茶メチル化カテキンは、ほとんどが天然の茶葉から抽出されたものであり、人工的に合成した報告は、茶カテキンメチル化酵素（ＣＯＭＴ：Catechol O-methyltransferase）を用いたものだけであった（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２００７−３０６８０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、安価で効率の良いポリフェノールのメチル化方法、及びそれを用いたメチル化ポリフェノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の一実施態様は、ポリフェノールを含有する培地でSchizosaccharomyces属酵母を培養する工程を含む、ポリフェノールのメチル化方法である。前記ポリフェノールは、フェノール酸、フラボノイド、またはスチルベンであってもよく、エピガロカテキンガレート、ケルセチン、ゲニステイン、エピカテキン、ルテオリン、ナリンゲリン、レスベラトロール、ピセアタンノール、没食子酸であってもよいが、特に、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートまたは没食子酸であることが好ましい。また、前記酵母が、Schizosaccharomyces pombe又はSchizosaccharomyces octosporusであってもよい。
【0006】
本発明の他の一実施態様は、メチル化ポリフェノールの製造方法であって、上記いずれかのメチル化方法によって、ポリフェノールをメチル化する工程を含む。前記メチル化ポリフェノールが、（−）−エピガロカテキン−３−（３−Ｏ−メチル）ガレート（ＥＧＣｇ−３”Ｍｅ）または（−）−エピガロカテキン−３−（４−Ｏ−メチル）ガレート（ＥＧＣｇ−４”Ｍｅ）であって、前記ポリフェノールが、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）であってもよく、前記メチル化ポリフェノールが、３−Ｏ−メチルガレート、４−Ｏ−メチルガレート、または４，５−Ｏ−メチルガレートであって、前記ポリフェノールが、没食子酸であってもよい。
【0007】
本発明のさらなる一実施態様は、メチル化ポリフェノールの特定方法であって、上記いずれかの製造方法によってメチル化ポリフェノールを製造する工程と、製造されたメチル化ポリフェノールのどの位置がメチル化されているかを決定する工程と、を含む。
【発明の効果】
【0008】
本発明によって、安価で効率の良いポリフェノールのメチル化方法、及びそれを用いたメチル化ポリフェノールの製造方法を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図3-1】図３−１〜図３−１１は、本発明の一実施例において、酵母としてSchizosaccharomyces pombeを使用し、様々なポリフェノールをメチル化したときに得られたクロマトグラム。四角く囲った数字は、産生されたメチル化体のピーク（菌のみのサンプルのLC/MS（SIRモード）クロマトグラムに比べて増加したピーク）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【0011】
本発明のポリフェノールのメチル化方法は、ポリフェノールを含有する培地でSchizosaccharomyces属酵母を培養する工程を含む。
【0012】
メチル化するポリフェノールは、特に限定されず、（１）クロロゲン酸、カフェ酸、没食子酸などのフェノール酸、（２）レスベラトロール、ピセアタンノールなどのスチルベン（誘導体を含む）（３）フラボノール（ケルセチン、ルチンなど）、フラボン（アピゲニン、ルテオリンなど）、イソフラボン（ダイゼイン、ゲニステインなど）、フラバノン（ナリンゲニン、ナリンジンなど）、フラバノール（カテキン）（ＥＧＣｇ、ＥＣなど）、アントシアニジン（シアニジンなど）などのフラボノイド、または（４）セサミンやピノレシノールなどのリグナンのほか、これらの異性体や配糖体を例示できる。図１に、代表的な基質の構造式を示す。
【0013】
酵母は、Schizosaccharomyces属であれば、特に限定されず、Schizosaccharomyces pombe、Schizosaccharomyces japonicus、Schizosaccharomyces octosporus、Schizosaccharomyces cryophilusなどを例示できる。各種における系統も特に限定されず、Schizosaccharomyces pombeでは、RIB5313、RIB5314、RIB5301、NBRC1628など、Schizosaccharomyces octosporusでは、NBRC10373、NBRC0360などを例示できる。
【0014】
培地は、酵母培養用培地であれば特に限定されず、例えば、ＹＰＤ培地、ＹＮＢ培地、ＹＣＢ培地、ＹＭ培地などが例示できる。
【0015】
酵母を培養する際、ポリフェノールは、培地作製時に添加しても、培地を作製後に添加しても、培地に酵母を接種後に添加しても、培地中で、酵母をある程度増やしてから添加してもよい。添加するポリフェノールは、精製したポリフェノールであってもよいが、ポリフェノールを含む抽出物であってもよい。例えば、クロロゲン酸やカフェ酸を含むコーヒー豆（生又は炒ったもの）、ケセルチンやルチンを含む蕎麦やそば茶、ルテオリンを含むエゴマやシソ、イソフラボンを含む大豆、フラバノールを含む緑茶、シアニジンを含む黒豆や赤色液果類果実、リグナンを含むゴマや亜麻、などの粉砕物やエキスであっても良い。ポリフェノールの培地中の濃度は特に限定されず、当業者が適宜、容易に選択できるが、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬがより好ましく、０．１〜１ｍｇ／ｍＬが最も好ましい。
【0016】
ポリフェノールを含有する培地でSchizosaccharomyces属酵母を培養する培養条件は、特に限定されず、当業者に慣用されるものであればよいが、例えば、２５〜３０℃で、振とうしてもしなくても良く、８時間〜９６時間、またはそれ以上の時間にわたり、培養する。
【0017】
このようにして、ポリフェノールを含有する培地でSchizosaccharomyces属酵母を培養することによってポリフェノールをメチル化し、メチル化ポリフェノール、好ましくはフェノール性水酸基（−ＯＨ）がメチル化（−ＯＣＨ３）されたメチル化ポリフェノールを製造することができる。そして、製造したメチル化ポリフェノールは、Schizosaccharomyces属酵母を培養した培地から、周知技術を用いて回収することができる。回収方法は特に限定されず、例えば、ヘキサンで脱脂処理後、酢酸エチルで抽出し、酢酸エチルを蒸発させ、メタノール、エタノール、水、アセトニトリル、アセトン、又はそれらの混合物などの溶媒で溶解させることができる。
【0018】
得られたメチル化ポリフェノールについて、どの位置がメチル化されているかを決定することにより、メチル化ポリフェノールを特定することができる。メチル化の位置の決定は、当業者にとって周知の様々な方法で行うことができる。例えば、既に同定されているメチル化ポリフェノールを比較標品として、比較分析すれば良い。比較分析方法としては、ＬＣ／ＭＳや、ＨＰＬＣを用いることができる。
【実施例】
【0019】
[実施例１] 様々な酵母株を用いて（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）をメチル化し、分析標品と比較した。
【0020】
（１）使用した基質【化1】
【0021】
（２）使用した酵母株Schizosaccharomyces pombe RIB5313
Schizosaccharomyces pombe RIB5314
Schizosaccharomyces pombe RIB5301
Schizosaccharomyces pombe NBRC1628
Schizosaccharomyces octosporus NBRC10373
Schizosaccharomyces octosporus NBRC0360
Saccharomyces cerevisiae RIB1001
Saccharomyces bayanus RIB3001
Saccharomyces oviformis RIB3031
Kluyveromyces marxianus RIB2011
【0022】
（３）サンプルの調製各酵母株の１５％ グリセロールストック溶液（ＯＤ６６０＝１）を、１５％ グリセロール溶液で１０−２〜１０−４に希釈し、１００ｍＬのＹＰＤ培地に接種した。３０℃、６０〜８０時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、酵母を回収した。次に、Buffered Peptone Water（メルク製）（１０％ Ｄ−グルコース−１０ｍＭ アスコルビン酸−１ｍｇ／ｍＬ ＥＧＣｇ含有、ＨＣｌにてｐＨ５．０に調整）を用い、ＯＤ６６０＝０．８に希釈し、３０℃、２４〜９６時間、１８０ｒｐｍで振とう培養した。各培養時間に６ｍＬずつ培養液を回収し、３５００ｒｐｍで３０分間遠心した。得られた上層のうち５ｍＬを回収し、５ｍＬのヘキサンを添加後、２分間ボルテックスして遠心した。上層を除去し、このヘキサン脱脂処理を、もう１度行なった。そして、１Ｎ ＨＣｌを３００μＬ添加してｐＨを下げた後、５ｍＬの酢酸エチルを添加して、２分間ボルテックスして遠心した。得られた上層（酢酸エチル層）を回収し、酢酸エチルでの抽出操作をさらに２回繰り返した。エバポレーターにて酢酸エチルを蒸発させて沈殿を乾固し、１ｍＬの１００％メタノールに再溶解した。１ｃｍのｓｅｐ−ｐａｋを通した後、０．２μｍのフィルターを通してろ過し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳのための分析サンプルとした。
【0023】
（４）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの条件システム：ＬＣ部はWaters Alliance 2695；ＭＳ部はWaters Quattro micro
カラム：Mightysil RP-18GP 150-4.6(3 um)（関東化学(株)）
カラム温度：４０℃
流速：０．４ｍＬ／分
溶離液：Ａ液はアセトニトリル；Ｂ液は０．１％ギ酸溶液
グラディエント：Ａ１０％（０−１分）→Ａ３０％（４０−４１分）→Ａ９０％（４５分）→Ａ１０％（５０→６０分）
モード：ＭＲＭ (Multiple Reaction Monitoring)
比較分析標品：EGCg-3"Me, EGCg-4"Me（いずれも長良サイエンス(株)）
【0024】
（５）結果各Schizosaccharomyces属の酵母で得られたクロマトグラムを図２に示す。
検出された親イオンのm/zは、４７１．１、フラグメントイオンのm/zは、１８２．８、１２５．０、３０５．０であって、分析標品と比較した結果、式（ＩＩ）に示す（−）−エピガロカテキン−３−（３−Ｏ−メチル）ガレート（ＥＧＣｇ−３”Ｍｅ）及び式（ＩＩＩ）に示す（−）−エピガロカテキン−３−（４−Ｏ−メチル）ガレート（ＥＧＣｇ−４”Ｍｅ）が実際に合成されていた。
【化2】
【化3】
【0025】
得られた化合物の量（濃度（ug/mL））を表１に示す。【表1】
【0026】
このように、Schizosaccharomyces属の酵母を用いた場合、ＥＧＣｇのフェノール性水酸基がメチル化され、ＥＧＣｇ−３”Ｍｅ及び式ＥＧＣｇ−４”Ｍｅが合成されたが、他の属の酵母（SaccharomycesやKluyveromyces）を用いた場合、メチル化カテキンは合成されなかった。 なお、基質を添加しなかった陰性対照実験でも、メチル化カテキンは合成されなかった。
【0027】
さらに、培養時間ごとの、得られた化合物の量（濃度（ug/mL））を２度測定し、その結果（平均値）を表２に示す。 【表2】
【0028】
[実施例２] 酵母としてSchizosaccharomyces pombeを使用し、様々なポリフェノールを基質としてメチル化を行なった。 （１）使用した基質
没食子酸
ケルセチン
ルテオリン
ゲニステイン
ナリンゲニン
レスベラトロール
ピセアタンノール
（以上の化合物の構造式は図１参照）
【0029】
【化4】
【化5】
【化6】
【0030】
（２）使用した酵母株Schizosaccharomyces pombe RIB5313
（３）サンプルの調製
[実施例１]と同様に行なった。
ただし、Buffered Peptone Waterに含有させた基質の濃度は、没食子酸が１ｍｇ／ｍＬ、緑茶エキス（三栄源ＦＦＩ）が２ｍｇ／ｍＬ、その他は１００μｇ／ｍＬとした。
（４）ＬＣ／ＭＳの条件
システム：ＬＣ部はWaters Alliance 2695；ＭＳ部はWaters Quattro micro
カラム：Mightysil RP-18GP 150-4.6(3 um)（関東化学(株)）
カラム温度：４０℃
流速：０．４ｍＬ／分
溶離液：Ａ液はアセトニトリル；Ｂ液は０．１％ギ酸溶液
グラディエント：Ａ１０％（０−１分）→Ａ３０％（４０−４１分）→Ａ９０％（４５分）→Ａ１０％（５０→６０分）
モード：ＳＩＲ （Selected Ion Recording）
親イオンのm/z： 表３参照
【0031】
（５）結果各ポリフェノールで得られたクロマトグラムを図３に示す。また、基質のm/z及び得られたメチル化体のm/zを表３に示す。
【表3】
【0032】
[実施例３] 酵母としてSchizosaccharomyces pombeを使用して没食子酸をメチル化し、分析標品と比較した。 （１）使用した基質
没食子酸
（２）使用した酵母株
Schizosaccharomyces pombe RIB5313
（３）サンプルの調製
[実施例２]と同様に行なった。
（４）ＬＣ／ＭＳの条件
[実施例２]と同様に行なった。
比較分析標品：3-O-methyl GA, 4-O-methyl GA, 3,4-O-methyl GA
（５）結果
分析標品（メチル化没食子酸）と比較したクロマトグラムを図４に示す。
基質イオンのm/zとして169.01、生産物イオンのm/zとして、モノメチル化体の183.0及びジメチル化体の197.04が得られ、それぞれ３−Ｏ−メチルガレート、４−Ｏ−メチルガレート及び３，４−Ｏ−メチルガレートの各ピークに一致していた。このように、没食子酸を用いた場合、没食子酸のフェノール性水酸基がメチル化され、式（ＶＩＩ）に示す３−Ｏ−メチルガレート、式（ＶＩＩＩ）に示す４−Ｏ−メチルガレート、及び式（ＩＸ）に示す３，４−Ｏ−メチルガレートが実際に合成された。
【0033】
【化7】
【化8】
【化9】