特許 5871212 アジュバント活性を有する新規核酸およびその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5871212

(24)【登録日】2016年1月22日

(45)【発行日】2016年3月1日

(54)【発明の名称】アジュバント活性を有する新規核酸およびその利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160216BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20160216BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20160216BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20160216BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160216BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160216BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   A61K31/713

   A61P37/04

   A61K39/39

   A61P43/00 107

   A61P43/00 105

   A61P35/00

【請求項の数】12

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2012-526535(P2012-526535)

(86)(22)【出願日】2011年7月27日

(86)【国際出願番号】JP2011067143

(87)【国際公開番号】WO2012014945

(87)【国際公開日】20120202

【審査請求日】2014年7月18日

(31)【優先権主張番号】特願2010-169407(P2010-169407)

(32)【優先日】2010年7月28日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】瀬谷 司

(72)【発明者】

【氏名】松本 美佐子

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０６５７５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Immunol.，２００８年，Vol.181, No.8，pp.5522-5529

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡと、ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡとを、少なくとも含むことを特徴とする核酸であって、前記一本鎖ＤＮＡが、配列番号１〜４、１１〜１４のいずれかに示される塩基配列またはその５塩基以上の長さを有する部分配列からなり、前記ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡが、配列番号５〜７、１５〜２０のいずれかに示される塩基配列およびその相補配列からなるＲＮＡであることを特徴とする核酸。

【請求項2】

前記一本鎖ＤＮＡが、１５塩基以上の長さを有することを特徴とする請求項１に記載の核酸。

【請求項3】

前記一本鎖ＤＮＡを構成するヌクレオチドの全部または一部が、ホスホロチオエート修飾されていることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸。

【請求項4】

前記一本鎖ＤＮＡと、前記二本鎖ＲＮＡとが、リンカー配列を介して連結していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸。

【請求項5】

前記一本鎖ＤＮＡと、前記二本鎖ＲＮＡとが、直接連結していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれかに記載の核酸を含有する医薬組成物。

【請求項7】

請求項１〜５のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有するＩＦＮ−β発現促進剤。

【請求項8】

請求項１〜５のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有するＮＫ細胞活性化剤。

【請求項9】

請求項１〜５のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有する細胞障害性Ｔ細胞誘導剤。

【請求項10】

請求項１〜５のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有する免疫賦活化剤。

【請求項11】

請求項１〜５のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有するワクチンアジュバント剤。

【請求項12】

請求項１〜５のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有する癌治療薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アジュバント活性を有する新規核酸および当該核酸を含有する医薬組成物、ＩＦＮ−β発現促進剤、ＮＫ細胞活性化剤、細胞障害性Ｔ細胞誘導剤、免疫賦活化剤、ワクチンアジュバント剤および癌治療薬に関するものである。

【背景技術】

【0002】

癌の治療法の一つに、患者自身の癌細胞に対する免疫力を亢進させて癌の退縮を誘導する、いわゆる癌免疫療法がある。この癌免疫療法は、癌抗原としてペプチドワクチンを投与する方法が主流であるが、有効率を上げる方法として、癌抗原の投与と同時に、樹状細胞を活性化させるアジュバントを同時投与する方法が提唱されている。

【0003】

本発明者らは、癌免疫療法に用いるアジュバントについて研究を進めており、麻疹ウイルス由来のｄｉＲＮＡ（defective interference RNA）が、アジュバントの機能を有することを見出し、特許文献１で開示している。具体的には、当該ｄｉＲＮＡは、ヒト細胞に対してＩＦＮ−β発現を誘導し、ＮＫ細胞のＮＫ活性を増強させ、Ｂ１６メラノーマ細胞を移植した担癌マウスに対して癌抗原エピトープと共に投与すると顕著な癌の退縮効果を示したことを開示している。しかし、細胞外の当該ｄｉＲＮＡは、エンドソーム上のＴＬＲ３（Ｔｏｌｌ様受容体３、Toll‐like receptor 3）に到達しないので、細胞外に投与した場合にはアジュバント活性が十分でないという問題が見出された。一方、ＴＬＲ３の合成リガンドとして広く知られているポリＩＣは、細胞外に投与しても強いアジュバント活性を有するが、サイトカインの過剰産生（サイトカインストーム）等の副作用の懸念があり、臨床応用ができないという問題を有している。

【0004】

他方、本発明者らは、ポリＩＣのＴＬＲ３を介したＩＦＮ−β発現誘導を阻害するオリゴＤＮＡを見出し、当該オリゴＤＮＡは、ポリＩＣと共通のレセプターを介して細胞内に取り込まれ、取り込まれたオリゴＤＮＡの一部がＴＬＲ３に局在することを報告している（非特許文献１）。しかし、非特許文献１には当該オリゴＤＮＡが他の核酸を連結してエンドソーム上のＴＬＲ３に送達できることを示唆する記載はなく、非特許文献１に記載のオリゴＤＮＡが、特許文献１に記載のステムループ構造を有するｄｉＲＮＡを連結して、エンドソーム上のＴＬＲ３に送達可能か否かは予測できるものではなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２００８／０６５７５２号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】The Journal of Immunology, 2008, 181: 5522-5529

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、副作用が少なく、エンドソーム上のＴＬＲ３に到達可能であり、強いアジュバント活性を有する核酸を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡと、ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡとを、少なくとも含むことを特徴とする核酸。
［２］前記一本鎖ＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかである前記［１］に記載の核酸。
（ａ）ＴＬＲ９リガンド活性を有するＢタイプまたはＣタイプのＣｐＧ−ＤＮＡ
（ｂ）上記（ａ）においてＣｐＧをＧｐＣに変換したＤＮＡ
（ｃ）上記（ｂ）においてＧｐＣをＴｐＣに変換したＤＮＡ
（ｄ）上記（ｂ）においてＧｐＣをＣｐＣに変換したＤＮＡ
［３］前記一本鎖ＤＮＡが、配列番号１〜４、１１〜１４のいずれかに示される塩基配列またはその部分配列からなることを特徴とする前記［２］に記載の核酸。
［４］前記一本鎖ＤＮＡが、１５塩基以上の長さを有することを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の核酸。
［５］前記一本鎖ＤＮＡを構成するヌクレオチドの全部または一部が、ホスホロチオエート修飾されていることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸。
［６］ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ配列を有することを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の核酸。
［７］前記ＲＮＡウイルスが、麻疹ウイルス、センダイウイルス、ＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルスおよびロタウイルスから選択されることを特徴とする前記［６］に記載の核酸。
［８］ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡが、配列番号５〜７、１５〜２０のいずれかに示される塩基配列およびその相補配列からなるＲＮＡであることを特徴とする前記［７］に記載の核酸。
［９］ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡが、４０〜２００塩基対の長さを有することを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載の核酸。
［１０］前記一本鎖ＤＮＡと、前記二本鎖ＲＮＡとが、リンカー配列を介して連結していることを特徴とする前記［１］〜［９］のいずれかに記載の核酸。
［１１］前記一本鎖ＤＮＡと、前記二本鎖ＲＮＡとが、直接連結していることを特徴とする前記［１］〜［９］のいずれかに記載の核酸。
［１２］前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸を含有する医薬組成物。
［１３］前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有するＩＦＮ−β発現促進剤。
［１４］前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有するＮＫ細胞活性化剤。
［１５］前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有する細胞障害性Ｔ細胞誘導剤。
［１６］前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有する免疫賦活化剤。
［１７］前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有するワクチンアジュバント剤。
［１８］前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸を有効成分として含有する癌治療薬。
［１９］哺乳動物に対して、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸の有効量を投与することを特徴とする癌の治療方法。
［２０］癌治療薬を製造するための、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸の使用。
［２１］癌の治療に使用するための、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の核酸。

【発明の効果】

【0009】

本発明により、副作用が少なく、エンドソーム上のＴＬＲ３に到達可能であり、強いアジュバント活性を有する核酸を提供することができる。本発明の核酸は、ＩＦＮ−β発現促進し、ＮＫ細胞活性化し、細胞障害性Ｔ細胞誘導することができるので、免疫賦活化剤、ワクチンアジュバント剤として有用性が高い。また、単独投与で強い腫瘍退縮効果を奏するため、癌治療薬として有用である。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明の核酸によるＩＦＮ−βプロモーター活性化を、ＦＣＳを含まない培地を用いて評価した結果を示す図である。

【図2】本発明の核酸によるＩＦＮ−βプロモーター活性化を、ＦＣＳを含む培地を用いて評価した結果を示す図である。

【図3】本発明の核酸による移植担癌の退縮効果を評価した試験（１回目）の結果を示す図であり、（ａ）は蒸留水（ＤＷ）投与群、（ｂ）はポリＩＣ投与群、（ｃ）は核酸２投与群、（ｄ）は核酸３投与群の結果である。

【図4】本発明の核酸による移植担癌の退縮効果を評価した試験（２回目）の結果を示す図であり、（ａ）は蒸留水（ＤＷ）投与群、（ｂ）はポリＩＣ投与群、（ｃ）は核酸１投与群、（ｄ）は核酸２投与群、（ｅ）は核酸１のエンドソーム移行配列（核酸１ＯＤＮ）投与群の結果である。

【図5】本発明の核酸において二本鎖ＲＮＡの長さがＩＦＮ−βプロモーター活性化に及ぼす影響を評価した結果を示す図である。

【図6(A)】本発明の核酸においてエンドソーム移行配列（一本鎖ＤＮＡ）の塩基配列がＩＦＮ−βプロモーター活性化に及ぼす影響を、ＦＣＳを含む培地を用いて評価した結果を示す図である。

【図6(B)】本発明の核酸においてエンドソーム移行配列（一本鎖ＤＮＡ）の塩基配列がＩＦＮ−βプロモーター活性化に及ぼす影響を、ＦＣＳを含まない培地を用いて評価した結果を示す図である。

【図7】本発明の核酸においてエンドソーム移行配列（一本鎖ＤＮＡ）の長さがＩＦＮ−βプロモーター活性化に及ぼす影響を、ＦＣＳを含まない培地を用いて評価した結果を示す図である。

【図8(A)】本発明の核酸によるＲＩＧ−Ｉ／ＭＤＡ５経路によるＩＦＮ−βプロモーター活性化を、ＦＣＳを含む培地を用いて評価した結果を示す図である。

【図8(B)】本発明の核酸によるＲＩＧ−Ｉ／ＭＤＡ５経路によるＩＦＮ−βプロモーター活性化を、ＦＣＳを含む培地を用いて評価した結果を示す図である。

【図9(A)】本発明の核酸によるＩＬ−６産生を、野生型マウスおよびＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウス由来の脾臓樹状細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す図である。

【図9(B)】本発明の核酸によるＴＮＦ−α産生を、野生型マウスおよびＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウス由来の脾臓樹状細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す図である。

【図9(C)】本発明の核酸によるＩＦＮ−β産生を、野生型マウスおよびＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウス由来の脾臓樹状細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す図である。

【図10(A)】本発明の核酸によるＩＬ−６産生を、野生型マウスおよびＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウス由来の骨髄樹状細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す図である。

【図10(B)】本発明の核酸によるＴＮＦ−α産生を、野生型マウスおよびＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウス由来の骨髄樹状細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す図である。

【図11(A)】本発明の核酸によるｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン産生の評価において、核酸２によるＴＮＦ−α産生の結果を示す図である。

【図11(B)】本発明の核酸によるｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン産生の評価において、核酸２によるＩＬ−６産生の結果を示す図である。

【図11(C)】本発明の核酸によるｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン産生の評価において、核酸２２、核酸２３によるＴＮＦ−α産生の結果を示す図である。

【図11(D)】本発明の核酸によるｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン産生の評価において、核酸２２、核酸２３によるＩＬ−６産生の結果を示す図である。

【図11(E)】本発明の核酸によるｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン産生の評価において、核酸２２、核酸２３によるＩＬ−１０産生の結果を示す図である。

【図12】本発明の核酸による移植担癌の退縮効果の評価において、Ｂ１６メラノーマ担癌野生型マウスに対する退縮効果の結果を示す図である。

【図13】本発明の核酸による移植担癌の退縮効果の評価において、ＥＬ４担癌野生型マウスに対する退縮効果の結果を示す図である。

【図14(A)】本発明の核酸による移植担癌の退縮効果の評価において、Ｂ１６メラノーマ担癌野生型マウスに対する退縮効果の結果を示す図である。

【図14(A)】本発明の核酸による移植担癌の退縮効果の評価において、Ｂ１６メラノーマ担癌ＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウスに対する退縮効果の結果を示す図である。

【図15】本発明の核酸による移植担癌の退縮効果の評価において、Ｂ１６メラノーマ担癌野生型マウスに対し、ｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション試薬を用いて本発明の核酸を腫瘍近傍に皮下投与した場合の退縮効果の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

〔本発明の核酸〕
本発明の核酸は、樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡと、ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡとを、少なくとも含む核酸であればよい。
樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡは特に限定されず、樹状細胞の外部から細胞内に取り込まれ、エンドソームに達することができるものであればよい。好ましい前記一本鎖ＤＮＡとして、以下の（ａ）〜（ｄ）が挙げられる。
（ａ）ＴＬＲ９リガンド活性を有するＢタイプまたはＣタイプのＣｐＧ−ＤＮＡ
（ｂ）上記（ａ）においてＣｐＧをＧｐＣに変換したＤＮＡ
（ｃ）上記（ｂ）においてＧｐＣをＴｐＣに変換したＤＮＡ
（ｄ）上記（ｂ）においてＧｐＣをＣｐＣに変換したＤＮＡ
ＣｐＧ−ＤＮＡは、細菌やウイルスの遺伝子に特有のＣｐＧモチーフを有するＤＮＡである。ＢタイプのＣｐＧ−ＤＮＡはＢ細胞の反応を強く誘導する作用を有し、ＣタイプのＴＬＲ９リガンドはＢタイプの作用とＡタイプの作用（ＮＫ細胞や形質細胞様樹状細胞の反応を強く誘導）を併せ持つ。上記（ａ）に該当する一本鎖ＤＮＡとしては、例えば、ＯＤＮ ２００６、ＯＤＮ Ｍ３６２、ＯＤＮ ２３９５、ＯＤＮ １６６８、ＯＤＮ １８２６、ＯＤＮ ２００７（いずれも製品名、InvivoGen社製）などが挙げられる。また、上記（ａ）においてＣｐＧをＧｐＣに変換したＤＮＡも樹状細胞のエンドソームに送達されることが、本発明者らにより確認されている。さらに、上記（ｂ）においてＧｐＣをＴｐＣまたはＣｐＣに変換したＤＮＡもエンドソームに送達されることが、本発明者らにより確認されている。

【0012】

樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡとして好ましくは、表１に記載の配列番号１〜４に示される塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡが挙げられる。

【表1】

【0013】

さらに、配列番号２においてＧｐＣをＴｐＣに変換したＤＮＡ（配列番号１１）、ＧｐＣをＣｐＣに変換したＤＮＡ（配列番号１２）、配列番号４においてＧｐＣをＴｐＣに変換したＤＮＡ（配列番号１３）、ＧｐＣをＣｐＣに変換したＤＮＡ（配列番号１４）なども、樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡとして好ましく使用することができる。

【0014】

樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡの長さは特に限定されず、５塩基以上であれば目的の効果を奏することが確認されている。好ましくは約１５塩基以上である。上限も特に限定されないが、約２５塩基程度の長さがあれば、目的の効果を奏すると考えられる。したがって、樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡの長さとしては、約５〜３０塩基が好ましく、約１５〜２５塩基がより好ましい。例えば、配列番号１〜４、１１〜１４のいずれかに示される塩基配列の一部（部分配列）からなるＤＮＡであって、５塩基以上、好ましくは１５塩基以上の長さを有する一本鎖ＤＮＡを好適に用いることができる。

【0015】

樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡは、ホスホロチオエート修飾（「Ｓ化修飾」とも称される）されていることが好ましい。ホスホロチオエート修飾は前記一本鎖ＤＮＡの一部でもよく、全部でもよい。全部がホスホロチオエート修飾されていることがより好ましい。ホスホロチオエート修飾により、ヌクレアーゼ耐性を示すとともに、エンドソームへの送達性が向上する。

【0016】

ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡは、ＴＬＲ３活性化能を有する限り限定されないが、ＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ配列を有することが好ましい。ＲＮＡウイルスは特に限定されず、マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルスのいずれであってもよい。具体的には、麻疹ウイルス、センダイウイルス、ＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルスなどが挙げられ、好ましくは、マイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスの麻疹ウイルス、センダイウイルスおよびＲＳウイルスであり、より好ましくは、麻疹ウイルス、センダイウイルスおよびＲＳウイルスのワクチン株である。

【0017】

ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡの長さは特に限定されないが、約４０塩基対以上が好ましく、約６０塩基対以上がより好ましく、約９０塩基対がさらに好ましい。上限も特に限定されないが、約１５０塩基対程度の長さがあれば、目的の効果を奏すると考えられる。したがって、ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡの長さとしては、約４０〜２００塩基対が好ましく、約６０〜１８０塩基対がより好ましく、約９０〜１５０塩基対がさらに好ましい。

【0018】

ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡとして好ましくは、配列番号５〜７、１５〜２０に示される塩基配列およびその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡが挙げられる。配列番号５〜７、１５〜２０に示される塩基配列は、馴化麻疹ウイルス株であるＥｄｍｏｎｓｔｏｎ（ＥＤ）株由来のｄｉＲＮＡの塩基配列（配列番号８）の一部を有している。配列番号５に示される塩基配列は、配列番号８の第１０１７位〜第１０７４位の塩基配列である。配列番号６に示される塩基配列は、配列番号８の第１０７７位〜第１１５２位の５’末端にシトシンを３個付加した塩基配列である。配列番号７に示される塩基配列は、配列番号８の第１０１７位〜第１１５２位の５’末端にシトシンを３個付加した塩基配列である。配列番号１５に示される塩基配列は、配列番号８の第１０７７位〜第１１５２位の３’末端にシトシンを３個付加した塩基配列である。配列番号１６に示される塩基配列は、配列番号８の第１０１７位〜第１１５２位の３’末端にシトシンを３個付加した塩基配列である。配列番号１７に示される塩基配列は、配列番号８の第１０５７位〜第１１５２位の３’末端にシトシンを３個付加した塩基配列である。配列番号１８に示される塩基配列は、配列番号８の第１０４６位〜第１１５２位の３’末端にシトシンを３個付加した塩基配列である。配列番号１９に示される塩基配列は、配列番号８の第１０３７位〜第１１５２位の３’末端にシトシンを３個付加した塩基配列である。配列番号２０に示される塩基配列は、配列番号８の第１０１７位〜第１０８９位の塩基配列である。

【0019】

本発明の核酸は、樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡおよびＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡのみからなる核酸でもよく、これら以外の核酸（以下「他の核酸」という。）を含むものでもよい。一本鎖ＤＮＡは二本鎖ＲＮＡのいずれの鎖に連結していてもよい。一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＲＮＡは、直接連結していてもよく、他の核酸を介して連結していてもよい。また、ＤＮＡの３’側がＲＮＡの５’側と結合していてもよく、ＤＮＡの５’側がＲＮＡの３’側と結合していてもよいが、ＤＮＡの３’側がＲＮＡの５’側と結合していることが好ましい。

【0020】

本発明の核酸が、樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡ、ＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡ、およびこれら以外の核酸（以下「他の核酸」という。）からなる場合、他の核酸は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡでもよく、一本鎖または二本鎖ＲＮＡでもよく、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドでもよい。好ましくは二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドである。樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡとＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡとが直接連結している場合、他の核酸は、いずれか一方の末端に連結していてもよく、両末端にそれぞれ連結していてもよいが、ＤＮＡの３’側またはＲＮＡの３’側に連結していることが好ましい。また、本発明の核酸の機能を損なわない限りにおいて、他の核酸の長さ（塩基数）は限定されない。

【0021】

また、樹状細胞のエンドソームに送達される一本鎖ＤＮＡおよびＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡは、他の核酸を介して連結していてもよい。すなわち、リンカー配列を介して連結していてもよい。リンカー配列は一本鎖または二本鎖ＤＮＡでもよく、一本鎖または二本鎖ＲＮＡでもよく、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドでもよい。好ましくは二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドである。また、本発明の核酸の機能を損なわない限りにおいて、リンカー配列の長さ（塩基数）は限定されない。リンカー配列以外に、いずれか一方の末端または両末端に、さらに他の核酸を連結していてもよい。この場合、ＲＮＡの３’側に他の核酸を連結していることが好ましい。

【0022】

本発明の核酸の作製方法は特に限定されず、公知の方法を用いて作製することができる。例えば、一般的な核酸の化学合成法を好ましく用いることができる。また、ＲＮＡ鎖は、公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法を好ましく用いることができる。具体的には、ＤＮＡとＲＮＡとが連結した鎖と、ＲＮＡの相補鎖を別々に合成し、その後、適切な条件で二本鎖化することにより、本発明の核酸を作製できる。本発明の核酸が他の核酸を含む場合も、同様に作製することができる。

【0023】

〔本発明の核酸の用途〕
本発明の核酸は、樹状細胞のエンドソームに送達され、ＴＬＲ３を活性化することができるので、種々の免疫反応を増強することができる。具体的には、ＩＦＮ−β発現を促進し、ＮＫ細胞を活性化し、細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができる。したがって、本発明は、上記本発明の核酸を有効成分として含有するＩＦＮ−β発現促進剤、ＮＫ細胞活性化剤、細胞障害性Ｔ細胞誘導剤、免疫賦活化剤、ワクチンアジュバント剤を提供する。また、癌細胞を皮下に移植して腫瘍を形成させたマウスに対して本発明の核酸を単独で投与したところ、腫瘍を退縮させることができたことから、上記本発明の核酸は、癌治療に有用であることが明らかとなった。したがって、本発明は、上記本発明の核酸を有効成分として含有する癌治療薬を提供する。

【0024】

さらに、本発明の核酸を有効成分とする上記の各医薬は、副作用が少ない点で非常に有用である。ＴＬＲ３の合成リガンドであるポリＩＣは、ＴＬＲ３以外に細胞内ＲＮＡセンサーであるＲＩＧ／ＭＤＡ５を活性化するためサイトカインストームを引き起こすと考えられるが、本発明の核酸に含まれるＴＬＲ３活性化能を有する二本鎖ＲＮＡは、ポリＩＣと異なり、ＴＬＲ３下流のＴＩＣＡＭ−１を介するシグナル伝達系を選択的に活性化するので、サイトカインストームを引き起こす懸念がないからである。

【0025】

本発明の医薬組成物は、上記本発明の核酸および薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤、注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。

【0026】

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。

【0027】

このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。なお、本発明の医薬組成物をワクチンアジュバント剤として投与する場合は、ワクチンとして作用する抗原と共に投与することを要する。
本発明の医薬組成物の投与量、投与頻度は、投与目的、投与対象の年齢、体重、性別、既往歴、投与方法などを考慮して、適宜設定することができる。

【実施例】

【0028】

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0029】

〔実施例１：核酸の合成（１）〕
表２に示す１０種類の核酸を、株式会社ジーンデザインまたは筑波技術産業総合研究所に委託して合成した。すなわち、ＲＮＡ部分の化学合成にはｔＢＤＭＳ ＲＮＡ ａｍｉｄｉｔｅを、ＤＮＡ部分の化学合成には一般的なＤＮＡ ａｍｉｄｉｔｅを、Ｓ化（ホスホロチオエート）部分はＰＡＤＳを使用した。合成方法は固相担体を用いたホスホロアミダイト法（Scaringe, S. A.et al, ;J Am Chem 1998;120:11820-11821）を基本とし、最適化したパラメーターを用いて実行した。合成機は長鎖合成に至適化されたｎｓ−８核酸合成機（ジーンデザイン製）を用いた。合成完了後、一般的な方法を用いて塩基部分および２’位に存在する保護基を除去し、逆相ＨＰＬＣにて精製を行った後脱塩し、各一本鎖を得た。各一本鎖を適切な濃度に調整し、終濃度４．１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および８．３ｍＭのＮａＣｌを二本鎖化溶液として加え、最適化した温度条件で加温した後、−１℃／ｍｉｎの温度グラジエントを用い３０℃まで徐冷することにより、二本鎖化を達成し、凍結乾燥することで目的の核酸を得た。二本鎖化は１２％の非変性ゲル電気泳動を用い、一本鎖ＲＮＡの泳動位置および二本鎖マーカーの泳動位置から相対評価した。また、表２に示す１０種類の核酸のうちの一部は、Ｔ７ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（EPICENTRE）を用いて合成したｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ＲＮＡを用いて二本鎖ＲＮＡを調製した。

【0030】

【表2】

【0031】

〔実施例２：ＩＦＮ−βプロモーター活性化の評価〕
ＨＥＫ２９３細胞（2×10⁵cells/well）を２４ｗｅｌｌの培養プレートに播種した。ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Roche Diagnostics）を用いて、ヒトＴＬＲ３発現ベクター（100ng/well）を、レポータープラスミドｐ−１２５（100ng/well）および内部コントロールベクターであるｐｈＲＬ−ＴＫ（5ng/well、Promega）と共に、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。レポータープラスミドｐ−１２５は、ヒトＩＦＮ−βプロモーター（-125〜+19）を含むものであり、東京大学の谷口博士から分与を受けた。また、ヒトＴＬＲ３を発現させないコントロール細胞も同時に作製した。トランスフェクションに供するトータルＤＮＡ量は、空ベクターを添加することによりいずれも５００ｎｇ／ｗｅｌｌとした。培地には加熱不活化した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質を含むダルベッコ改変イーグル培地−低グルコース（Invitrogen）を用いた。

【0032】

トランスフェクションから２４時間後に、ＦＣＳを含まない培地またはＦＣＳを含む培地に交換し、１０μｇ／ｍＬとなるように核酸を添加してさらに６時間培養した。被験核酸として、表２に記載の核酸８、核酸１０およびＦＩＴＣ標識した核酸８、核酸８のエンドソーム移行配列、核酸１０のエンドソーム移行配列、核酸８および１０の二本鎖ＲＮＡ部分を用いた。陽性対照にはポリＩＣを用いた。細胞を洗浄した後、溶解バッファー（Promega）を用いて細胞を溶解し、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Promega）を用いてホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を定量した。ホタルルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性で標準化し、相対的な誘導強度として表した。なお、すべてのアッセイはトリプリケートで行った。

【0033】

ＦＣＳを含まない培地を用いて行った結果を図１に示した。図１から明らかなように、ＴＬＲ３発現細胞に対して核酸８、核酸１０を添加した場合、ポリＩＣを添加した場合より強い誘導強度を示した。また、ＦＩＴＣ標識は、誘導強度に影響を及ぼさなかった。一方、核酸８のエンドソーム移行配列（図中、核酸８ＯＤＮ）、核酸１０のエンドソーム移行配列（図中、核酸１０ＯＤＮ）、核酸８および１０の二本鎖ＲＮＡ部分（図中、二本鎖ＲＮＡ）を添加した場合は、効果を示さなかった。この結果から、本願発明の核酸（核酸８、核酸１０）は、ＴＬＲ３を介してＩＦＮ−βプロモーターを活性化することが明らかとなった。

【0034】

ＦＣＳを含む培地を用いて行った結果を図２に示した。ＦＣＳにはＲＮａｓｅが混入しているため活性の低下が懸念されたが、多少の低下傾向が認められたものの、図１に示した結果と同様に、核酸８および核酸１０は、ＴＬＲ３発現細胞のＩＦＮ−βプロモーターを活性化した。

【0035】

〔実施例３：移植担癌の退縮効果（１）〕
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの側腹部皮下にＢ１６メラノーマ細胞（Ｂ１６Ｄ８）を６×１０^５ｃｅｌｌｓ／２００μＬ移植し、腫瘍の大きさ（縦×横×0.4）を経時的に測定した。細胞移植後１２日目に被験物質または対照物質を腹腔内投与し、腫瘍の退縮効果を評価した。なお、Ｂ１６メラノーマ細胞はＭＨＣクラスＩ分子を発現していないため、キラーＴ細胞の活性化が誘導されず、樹状細胞のＴＬＲ３を介したシグナルによって増強されたＮＫ細胞の活性によってのみＢ１６メラノーマ腫瘍が退縮する。

【0036】

試験は２回行った。１回目の試験では、被験物質として表２に記載の核酸２および核酸３を用いた。２回目の試験では、被験物質として表２に記載の核酸１、核酸４、ならびに核酸１のエンドソーム移行配列（核酸４のエンドソーム移行配列も同じ）を用いた。両試験とも陰性対照群には蒸留水（ＤＷ）を、陽性対照群にはポリＩＣを投与した。核酸の投与量は１５０μｇ／匹とした。

【0037】

１回目の試験結果を図３（ａ）〜（ｄ）に示した。（ａ）は蒸留水（ＤＷ）投与群（３匹）、（ｂ）はポリＩＣ投与群（２匹）、（ｃ）は核酸２投与群（３匹）、（ｄ）は核酸３投与群（３匹）の結果である。図３（ａ）〜（ｄ）から明らかなように、本願発明の核酸（核酸２、核酸３）は、ポリＩＣ投与群と同等の腫瘍退縮効果を示した。

【0038】

２回目の試験結果を図４（ａ）〜（ｅ）に示した。（ａ）は蒸留水（ＤＷ）投与群（２匹）、（ｂ）はポリＩＣ投与群（３匹）、（ｃ）は核酸１投与群（３匹）、（ｄ）は核酸２投与群（３匹）、（ｅ）は核酸１のエンドソーム移行配列（核酸１ＯＤＮ）投与群（３匹）の結果である。図４（ａ）〜（ｅ）から明らかなように、本願発明の核酸（核酸１、核酸４）は、ポリＩＣ投与群より劣るものの、蒸留水（ＤＷ）投与群と比較して顕著な腫瘍退縮効果を示した。一方、（ｅ）核酸１のエンドソーム移行配列のみの投与では、腫瘍退縮効果は認められなかった。

【0039】

〔実施例４：核酸の合成（２）〕
表３および表４に示す２１種類の核酸を、株式会社ジーンデザインまたは筑波技術産業総合研究所に委託して合成した。合成方法は、実施例１と同様である。

【0040】

【表3】

【0041】

【表4】

【0042】

〔実施例５：ＩＦＮ−βプロモーター活性化〕
レポータープラスミドｐ−１２５がトランスフェクションされ、かつヒトＴＬＲ３を発現するＨＥＫ２９３細胞、およびレポータープラスミドｐ−１２５がトランスフェクションされ、ヒトＴＬＲ３を発現しないＨＥＫ２９３細胞を用いて以下の実験を行った（実施例２参照）。

【0043】

（１）二本鎖ＲＮＡの長さによるＩＦＮ−βプロモーター活性化能の検討
実施例２と同様に、各種ベクターのトランスフェクションから２４時間後にＦＣＳを含まない培地に交換し、１０μｇ／ｍＬとなるように被験核酸を添加してさらに６時間培養した。細胞を洗浄した後、溶解バッファー（Promega）を用いて細胞を溶解し、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Promega）を用いて、実施例２と同様にルシフェラーゼ活性を定量した。被験核酸として、表３および表４に記載の核酸１１（二本鎖ＲＮＡ：７９塩基対）、核酸１２（二本鎖ＲＮＡ：９９塩基対）、核酸１３（二本鎖ＲＮＡ：１１０塩基対）、核酸１４（二本鎖ＲＮＡ：１１９塩基対）、核酸１９（二本鎖ＲＮＡ：９９塩基対）、核酸２０（二本鎖ＲＮＡ：１１０塩基対）、核酸２１（二本鎖ＲＮＡ：１１９塩基対）および核酸２２（二本鎖ＲＮＡ：１３９塩基対）を用いた。陽性対照にはポリＩＣを用いた。

【0044】

結果を図５に示した。図５から明らかなように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴＬＲ３依存的ＩＦＮ−βプロモーター活性化には、約９０塩基対以上の長さの二本鎖ＲＮＡが必要であることが示された。

【0045】

（２）エンドソーム移行配列の塩基配列によるＩＦＮ−βプロモーター活性化能の検討
実施例２と同様に、各種ベクターのトランスフェクションから２４時間後にＦＣＳを含まない培地またはＦＣＳを含む培地に交換し、１０μｇ／ｍＬとなるように被験核酸を添加してさらに６時間培養した。細胞を洗浄した後、溶解バッファー（Promega）を用いて細胞を溶解し、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Promega）を用いて、実施例２と同様にルシフェラーゼ活性を定量した。被験核酸として、表３および表４に記載の核酸１６（一本鎖ＤＮＡの塩基配列：配列番号４）、核酸２２（一本鎖ＤＮＡの塩基配列：配列番号２）、核酸２６（一本鎖ＤＮＡの塩基配列：配列番号１１）および核酸２７（一本鎖ＤＮＡの塩基配列：配列番号１４）を用いた。陽性対照にはポリＩＣを用いた。また、エンドソーム移行配列のみ（配列番号４の一本鎖ＤＮＡ（図中ＤＮＡ４）、配列番号１１の一本鎖ＤＮＡ（図中ＤＮＡ１１）、配列番号１４の一本鎖ＤＮＡ（図中ＤＮＡ１４））も使用した。

【0046】

結果を図６（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）はＦＣＳを含む培地を用いた結果、（Ｂ）はＦＣＳを含まない培地を用いた結果である。いずれの培地においても、配列番号２のＧｐＣをＴｐＣに変換した一本鎖ＤＮＡ（配列番号１１）を有する核酸２６、配列番号４のＧｐＣをＣｐＣに変換した一本鎖ＤＮＡ（配列番号１４）を有する核酸２７は、ＴＬＲ３依存的ＩＦＮ−βプロモーター活性化能を有することが示された。一方、エンドソーム移行配列（一本鎖ＤＮＡ）のみではＩＦＮ−βプロモーターを活性化させなかった。

【0047】

（３）エンドソーム移行配列の長さによるＩＦＮ−βプロモーター活性化能の検討
実施例２と同様に、各種ベクターのトランスフェクションから２４時間後にＦＣＳを含まない培地に交換し、１０μｇ／ｍＬとなるように被験核酸を添加してさらに６時間培養した。細胞を洗浄した後、溶解バッファー（Promega）を用いて細胞を溶解し、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Promega）を用いて、実施例２と同様にルシフェラーゼ活性を定量した。被験核酸として、表４に記載の核酸２８（一本鎖ＤＮＡの長さ：５塩基）、核酸２９（一本鎖ＤＮＡの長さ：１０塩基）、核酸３０（一本鎖ＤＮＡの長さ：１５塩基）、核酸３１（一本鎖ＤＮＡの長さ：２０塩基）および核酸２２（一本鎖ＤＮＡの長さ：２５塩基）を用いた。陽性対照にはポリＩＣを用いた。

【0048】

結果を図７に示した。図７から明らかなように、エンドソーム移行配列（一本鎖ＤＮＡ）の長さが５塩基でもｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴＬＲ３依存的ＩＦＮ−βプロモーター活性化能を有するが、エンドソーム移行配列（一本鎖ＤＮＡ）の長さが１５塩基以上であることが好ましく、２０塩基以上であることがより好ましいことが示された。

【0049】

（４）ＲＩＧ−Ｉ／ＭＤＡ５経路によるＩＦＮ−βプロモーター活性化能の検討
レポータープラスミドｐ−１２５がトランスフェクションされ、かつヒトＴＬＲ３を発現しないＨＥＫ２９３細胞（２４ｗｅｌｌプレート）に、被験核酸を１μｇ／ｗｅｌｌとなるようＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Invitrogen）で導入し、ＦＣＳを含む培地で２４時間培養した。細胞を洗浄した後、溶解バッファー（Promega）を用いて細胞を溶解し、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Promega）を用いて、実施例２と同様にルシフェラーゼ活性を定量した。実験は２回行った。１回目の実験では、被験核酸として、表２および表３に記載の核酸１、核酸２、核酸３、核酸７、核酸１１、核酸１５、核酸１６および核酸１７、ならびに配列番号３の一本鎖ＤＮＡ（図中ＤＮＡ３）、配列番号５とその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ（図中ｄｓＲＮＡ５）および配列番号１６とその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ（図中ｄｓＲＮＡ１６）を用いた。陽性対照にはポリＩＣを用いた。２回目の実験では、被験核酸として表４に記載の核酸２８（一本鎖ＤＮＡの長さ：５塩基）、核酸２９（一本鎖ＤＮＡの長さ：１０塩基）、核酸３０（一本鎖ＤＮＡの長さ：１５塩基）、核酸３１（一本鎖ＤＮＡの長さ：２０塩基）および核酸２２（一本鎖ＤＮＡの長さ：２５塩基）、ならびに配列番号１６とその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ（図中ｄｓＲＮＡ１６）を用いた。陽性対照にはポリＩＣを使用した。

【0050】

結果を図８（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）は１回目の実験結果、（Ｂ）は２回目の実験結果である。図８（Ａ）、（Ｂ）から明らかなように、二本鎖ＲＮＡはＲＩＧ−Ｉ／ＭＤＡ５経路活性化するが、５塩基以上のエンドソーム移行配列（一本鎖ＤＮＡ）が結合した二本鎖ＲＮＡは、ＲＩＧ−Ｉ／ＭＤＡ５経路活性化しないことが明らかとなった。

【0051】

〔実施例６：ＴＩＣＡＭ−１依存的サイトカイン産生〕
（１）脾臓から単離した樹状細胞（脾臓ＤＣ）におけるサイトカイン産生
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型：ＷＴ）およびＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウス（ＴＩＣＡＭ−１ ＫＯ、発明者らが作製）からそれぞれ脾臓を摘出し、コラゲナーゼ処理を行った。フィルターを通過させ、溶血後、培地で洗浄し、ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｃ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いたＭＡＣＳ ｓｙｓｔｅｍ（miltenyi biotech）でＣＤ１１ｃ陽性細胞を単離し、脾臓ＤＣとした。
脾臓ＤＣを５×１０^５個／５００μｌ培地／ウェルとなるように２４ウェルプレートに分注し、被験核酸（５０μｇ／ｍｌ）を添加して２４時間培養した。培地には、１０％ＦＣＳ、抗生物質、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび５５μＭ ２−ＭＥを含有するＲＰＭＩ１６４０を使用した。２４時間後、培養上精を回収し、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの産生量をＢＤ ＣＢＡ ｋｉｔを用いて測定した。被験核酸として、表４に記載の核酸２３および核酸２５を用いた。陽性対照にはポリＩＣを用いた。

【0052】

結果を図９（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に示した。（Ａ）はＩＬ−６の結果、（Ｂ）はＴＮＦ−αの結果、（Ｃ）はＩＦＮ−βの結果である。核酸２３および核酸２５で処理した野生型マウス由来の脾臓ＤＣは、いずれのサイトカインも産生したが、核酸２３および核酸２５で処理したＴＩＣＡＭ−１ ＫＯマウス由来の脾臓ＤＣは、いずれのサイトカインもほとんど産生しなかった。この結果から、本発明の核酸は、ＴＩＣＡＭ−１を介するシグナル伝達で効果を発揮することが示された。

【0053】

（２）骨髄から単離した樹状細胞（ＢＭＤＣ）におけるサイトカイン産生
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型：ＷＴ）およびＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウス（ＴＩＣＡＭ−１ ＫＯ）の大腿骨から骨髄液を採取し、溶血後、リコンビナントｍｕｒｉｎｅ ＧＭ−ＣＳＦ（final 10ng/ml, Peprotech社）を添加した培養液（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ／２−ＭＥ／ＨＥＰＥＳ）に懸濁して、１×１０^６個／ｍｌ／ウェルとなるように２４ウェルプレートに分注し、３７℃で培養した。２日おきにｒｍＧＭ−ＣＳＦ（10ng/ml）を含む新鮮な培養液で培地交換し、６日目に浮遊細胞を回収してＢＭＤＣとした。
得られたＢＭＤＣを１×１０^５個／２００μｌのＡＩＭ無血清培地（GIBCO社）／ウェルとなるように９６ウェル丸底プレートに分注し、被験核酸（１０μｇ／ｍｌ）を添加して２４時間培養した。２４時間後、培養上精を回収し、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生量をＢＤ ＣＢＡ ｋｉｔを用いて測定した。被験核酸として、表２に記載の核酸１および核酸２を用いた。陽性対照にはポリＩＣを用いた。

【0054】

結果を図１０（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）はＩＬ−６の結果、（Ｂ）はＴＮＦ−αの結果である。ＴＩＣＡＭ−１ ＫＯマウス由来のＢＭＤＣのサイトカイン産生量は、野生型マウス由来のＢＭＤＣのサイトカイン産生量より顕著に抑制されていた。この結果から、本発明の核酸は、ＴＩＣＡＭ−１を介するシグナル伝達で効果を発揮することが示された。

【0055】

〔実施例７：ＮＫ活性増強効果〕
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから脾臓をとりだし、メッシュを用いて破砕し、１５ｍｌチューブに回収した。溶血後、培養液で洗浄し、ａｎｔｉ−ＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いたＭＡＣＳ ｓｙｓｔｅｍ（miltenyi biotech）でＤＸ５陽性ＮＫ細胞を単離した。
実施例６（２）で単離したＢＭＤＣ（単離から６日目の細胞）を、１×１０^５個／２００μｌのＡＩＭ無血清培地（GIBCO社）／ウェルとなるように９６ウェル丸底プレートに播種し、被験核酸（１０μｇ／ｍｌ）を添加して４時間プレ刺激した。その後、単離した上記ＮＫ細胞（ＤＸ５陽性細胞）を、２×１０^５個／ウェルに調整して２４時間３７℃にて共培養した。２４時間後、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ（eBioscience）で測定した。

【0056】

結果を表５に示した。本発明の核酸はＢＭＤＣのエンドソームに送達され、ＴＬＲ３を活性化することを介して、ＮＫ細胞を活性化し、ＩＦＮ−γの産生を亢進させることが示された。

【0057】

【表5】

【0058】

〔実施例８：ｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン産生〕
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８〜１２週齢、メス）に被験核酸（５０μｇ）を腹腔内投与した。投与１、３、６時間後に麻酔下で採血し、血清中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０をＢＤ ＣＢＡ ｋｉｔで測定した。被験核酸として、表２に記載の核酸２、表４に記載の核酸２２、核酸２３を用いた。対照核酸としてエンドソーム移行配列のみ（配列番号１の一本鎖ＤＮＡ（図中ＤＮＡ１））を用いた。陽性対照としてポリＩＣ（２００μｇ）を用いた。

【0059】

結果を図１１（Ａ）〜（Ｅ）に示した。（Ａ）は核酸２によるＴＮＦ−αの結果、（Ｂ）は核酸２によるＩＬ−６の結果、（Ｃ）は核酸２２、核酸２３によるＴＮＦ−αの結果、（Ｄ）は核酸２２、核酸２３によるＩＬ−６の結果、（Ｅ）は核酸２２、核酸２３によるＩＬ−１０の結果である。本発明の核酸は、陽性対照のポリＩＣと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカイン産生量が顕著に少ないことが示された。この結果から、本発明の核酸は、生体に投与した際にサイトカインストーム等の副作用の懸念がなく、安全性が高いと考えられた。

【0060】

〔実施例９：移植担癌の退縮効果（２）〕
（１）Ｂ１６メラノーマ担癌野生型マウスに対する効果
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの側腹部皮下にＢ１６メラノーマ細胞（Ｂ１６Ｄ８）を６×１０^５ｃｅｌｌｓ／２００μＬ移植し、腫瘍の大きさ（縦×横×0.4）を経時的に測定した。細胞移植後１２日目に被験物質または対照物質を腹腔内投与し、腫瘍の退縮効果を評価した。被験物質として表４に記載の核酸２２を用いた。陰性対照群には蒸留水（ＤＷ）を、陽性対照群にはポリＩＣを投与した。核酸の投与量は１５０μｇ／匹とした。なお、Ｂ１６メラノーマ細胞はＭＨＣクラスＩ分子を発現していないため、キラーＴ細胞の活性化が誘導されず、樹状細胞のＴＬＲ３を介したシグナルによって増強されたＮＫ細胞の活性によってのみＢ１６メラノーマ腫瘍が退縮する。
結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、核酸２２はポリＩＣと同等の腫瘍退縮効果を示した。

【0061】

（２）ＥＬ４担癌野生型マウスに対する効果
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの側腹部皮下にＥＬ４細胞（マウスリンパ腫細胞）を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／２００μＬ移植し、腫瘍の大きさ（縦×横×0.4）を経時的に測定した。細胞移植後７日目および１１日目に被験物質または対照物質を腹腔内投与し、腫瘍の退縮効果を評価した。被験物質として表４に記載の核酸２４および核酸２５を用いた。陰性対照群には蒸留水（ＤＷ）を、陽性対照群にはポリＩＣを投与した。核酸の投与量は２００μｇ／匹とした。なお、ＥＬ４担癌マウスは、ＣＴＬ依存的な抗腫瘍効果を評価する系である。
結果を図１３に示した。図１３から明らかなように、核酸２４および核酸２５は、いずれもポリＩＣより劣るものの、蒸留水（ＤＷ）投与と比較して顕著な腫瘍退縮効果を示した。

【0062】

（３）Ｂ１６メラノーマ担癌ＴＩＣＡＭ−１ ＫＯマウスに対する効果
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型：ＷＴ）およびＴＩＣＡＭ−１ノックアウトマウス（ＴＩＣＡＭ−１ ＫＯ）の側腹部皮下にそれぞれＢ１６メラノーマ細胞（Ｂ１６Ｄ８）を６×１０^５ｃｅｌｌｓ／２００μＬ移植し、腫瘍の大きさ（縦×横×0.4）を経時的に測定した。細胞移植後１１日目に被験物質または対照物質を腹腔内投与し、腫瘍の退縮効果を評価した。被験物質として表４に記載の核酸２５を用いた。対照物質として蒸留水（ＤＷ）を投与した。核酸の投与量は２５０μｇ／匹とした。
結果を図１４（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）は野生型マウスの結果、（Ｂ）はＴＩＣＡＭ−１ ＫＯマウスの結果である。核酸２５は、野生型マウスにおいて蒸留水（ＤＷ）投与と比較して顕著な腫瘍退縮効果を示したが、ＴＩＣＡＭ−１ ＫＯマウスにおいては、腫瘍退縮効果を示さなかった。この結果から、本発明の核酸は、ＴＩＣＡＭ−１を介するシグナル伝達で効果を発揮することが示された。

【0063】

（４）ｉｎ ｖｉｖｏ ｊｅｔＰＥＩを用いた核酸投与による移植担癌退縮効果
ｉｎ ｖｉｖｏ ｊｅｔＰＥＩ（フナコシ）はｉｎ ｖｉｖｏ用のトランスフェクション試薬である。これを用いて、本発明の核酸を腫瘍近傍に皮下投与して移植担癌退縮効果を評価した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの側腹部皮下にＢ１６メラノーマ細胞（Ｂ１６Ｄ８）を６×１０^５ｃｅｌｌｓ／２００μＬ移植し、腫瘍の大きさ（縦×横×0.4）を経時的に測定した。細胞移植後１２日目に被験物質または対照物質を皮下投与し、腫瘍の退縮効果を評価した。被験物質として表４に記載の核酸２５を用いた。陰性対照群には蒸留水（ＤＷ）を、陽性対照群にはポリＩＣを投与した。核酸の投与量は５０μｇ／匹とした。核酸投与用の溶液は、以下のとおり調製した。Ａ液（１０％グルコース：５０μｌ、核酸（５０μｇ）、ＤＷ（DNase, RNase-free, Ambion）を加えて１００μｌとする）およびＢ液（１０％グルコース：５０μｌ、ＤＷ（DNase, RNase-free, Ambion）：４３μｌ、ｉｎ ｖｉｖｏ ｊｅｔＰＥＩ：７μｌ）を調製し、Ａ液とＢ液を混合してゆるやかに撹拌後、室温で１５分インキュベートした。得られた核酸溶液を腫瘍近傍２カ所に１００μｌずつ皮下投与した。
結果を図１５に示した。図１５から明らかなように、核酸２５はポリＩＣより劣るものの、蒸留水（ＤＷ）投与と比較して顕著な腫瘍退縮効果を示した。

【0064】

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6(A)】

【図6(B)】

【図7】

【図8(A)】

【図8(B)】

【図9(A)】

【図9(B)】

【図9(C)】

【図10(A)】

【図10(B)】

【図11(A)】

【図11(B)】

【図11(C)】

【図11(D)】

【図11(E)】

【図12】

【図13】

【図14(A)】

【図14(B)】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]