特許 5900515 構造化照明装置、構造化照明顕微鏡装置、構造化照明方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5900515

(24)【登録日】2016年3月18日

(45)【発行日】2016年4月6日

(54)【発明の名称】構造化照明装置、構造化照明顕微鏡装置、構造化照明方法

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/06 20060101AFI20160324BHJP

   G01N 21/01 20060101ALI20160324BHJP

   G01N 21/17 20060101ALI20160324BHJP

   G01N 21/27 20060101ALI20160324BHJP

   G02B 21/00 20060101ALI20160324BHJP

【ＦＩ】

   G02B21/06

   G01N21/01 D

   G01N21/17 N

   G01N21/27 A

   G02B21/00

【請求項の数】31

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2013-554252(P2013-554252)

(86)(22)【出願日】2013年1月17日

(86)【国際出願番号】JP2013000207

(87)【国際公開番号】WO2013108626

(87)【国際公開日】20130725

【審査請求日】2014年7月11日

(31)【優先権主張番号】特願2012-8100(P2012-8100)

(32)【優先日】2012年1月18日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2012-238077(P2012-238077)

(32)【優先日】2012年10月29日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000004112

【氏名又は名称】株式会社ニコン

(74)【代理人】

【識別番号】100072718

【弁理士】

【氏名又は名称】古谷 史旺

(74)【代理人】

【識別番号】100116001

【弁理士】

【氏名又は名称】森 俊秀

(72)【発明者】

【氏名】大内 由美子

(72)【発明者】

【氏名】▲高▼砂 和浩

(72)【発明者】

【氏名】中山 浩明

【審査官】 越河 勉

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１３５８１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−０９８２１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０６３６６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０４３３８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００６−２６８００４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−２４２１８９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０２Ｂ ２１／０６

Ｇ０１Ｎ ２１／０１

Ｇ０１Ｎ ２１／１７

Ｇ０１Ｎ ２１／２７

Ｇ０２Ｂ ２１／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

光源からの射出光束を少なくとも２つの分岐光束に分岐する分岐手段と、
前記２つの分岐光束を対物レンズの瞳面の互いに異なる位置へそれぞれ集光させて、前記２つの分岐光束を互いに干渉させ、その干渉縞で標本を照明する照明光学系と、
前記照明光学系の光軸から、前記２つの分岐光束が前記瞳面に形成する２つの集光点までの高さを、調整する調整手段と、
を備えたことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項2】

請求項１に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、
前記２つの分岐光束の波長に応じた偏向角で前記２つの分岐光束を偏向する光学部材を含む
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項3】

請求項１又は請求項２に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、
前記２つの分岐光束の一方である第１光束の光路を偏向するための第１反射面と、前記第１反射面で偏向した前記第１光束の光路の方向を元の方向に戻すための第２反射面と、
前記２つの分岐光束の他方である第２光束の光路を偏向するための第３反射面と、前記第３反射面で偏向した前記第２光束の光路の方向を元の方向に戻すための第４反射面とを備え、
前記１反射面及び前記第３反射面の位置関係と、前記第２反射面及び前記第４反射面の位置関係との少なくとも一方は、可変である
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項4】

請求項１又は請求項２に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、
複数のレンズ群からなる変倍光学系であり、
前記複数のレンズ群の配置は、
前記分岐手段が前記２つの分岐光束に与える偏向角に応じて設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項5】

請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記２つの集光点の光軸方向の位置を調整するための位置調整手段を更に備えた
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項6】

請求項１〜請求項５の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、
前記２つの集光点の位置関係を前記光軸に関して対称な関係に保つ
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項7】

請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記分岐手段は、
回折光学素子である
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項8】

請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記高さは、所定範囲内の値に調整される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項9】

請求項８に記載の構造化照明装置において、
前記所定範囲とは、
前記２つの分岐光束が前記標本の表面近傍にエバネッセント場を生成可能な範囲のことである
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項10】

請求項８又は請求項９に記載の構造化照明装置において、
前記高さは、
ユーザからの指示に応じて前記所定範囲内で微調整される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項11】

請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記光源は、
前記射出光束の波長を切り替え可能であり、
前記高さは、
前記波長の切り替えに拘わらず所定値に調整される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項12】

請求項１〜請求項３、請求項５の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記２つの集光点の位置を光軸の周りの複数の回転位置の間で切り替える切替手段を更に備え、
前記調整手段は、
前記複数の回転位置毎に用意されている
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項13】

請求項１〜請求項３、請求項５の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記２つの集光点の位置を光軸周りの複数の回転位置の間で切り替える第１切替手段と、
前記調整手段の位置を前記複数の回転位置の間で切り替える第２切替手段と、
を更に備えたことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項14】

請求項１〜請求項１３の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記干渉縞の位相をシフトさせる位相シフト手段を更に備えた
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項15】

請求項１〜請求項１４の何れか一項に記載の構造化照明装置と、
前記干渉縞で変調された前記標本からの観察光束を光検出器に結像する結像光学系と、
を備えたことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。

【請求項16】

請求項１又は請求項２に記載の構造化照明装置において、
前記分岐手段は、回折光学素子であり、
前記調整手段は、
前記光軸から、前記２つの分岐光束が前記瞳面に形成する２つの集光点までの高さを、波長の異なる少なくとも２種類の前記射出光束の間で略一致させる
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項17】

請求項１６に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、前記２つの分岐光束の各々を偏向する部材であり、
前記調整手段が前記２種類の射出光束に与える偏向角度の差は、前記回折光学素子が前記２種類の射出光束に与える回折角度の差を相殺する値に設定されている
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項18】

請求項１６又は請求項１７に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段の配置先は、前記２つの分岐光束が空間的に分離した箇所である
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項19】

請求項１８に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、前記２つの分岐光束が互いに離れながら進行する箇所に配置された屈折部材を備え、
前記屈折部材の光軸方向の厚さは、前記光軸から離れるほど大きく設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項20】

請求項１８に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、前記２つの分岐光束が互いに近づきながら進行する箇所に配置された屈折部材を備え、
前記屈折部材の光軸方向の厚さは、前記光軸から離れるほど小さく設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項21】

請求項１９に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、前記屈折部材の前側又は後側へ配置され、かつ前記屈折部材より分散の弱い補助屈折部材を更に備え、
前記補助屈折部材の光軸方向の厚さは、前記光軸から離れるほど小さく設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項22】

請求項２０に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、前記屈折部材の前側又は後側へ配置され、かつ前記屈折部材より分散の弱い補助屈折部材を更に備え、
前記補助屈折部材の光軸方向の厚さは、前記光軸から離れるほど大きく設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項23】

請求項１８に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、回折光学面を備え、
前記調整手段における前記回折光学面の構造周期は、前記射出光束を分岐する前記回折光学素子の構造周期と同程度に設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項24】

請求項２３に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、前記２つの分岐光束が互いに離れながら進行する箇所に配置された屈折部材を備え、
前記屈折部材の表面には、前記回折光学面が形成され、前記屈折部材の光軸方向の厚さは、前記光軸から離れるほど大きく設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項25】

請求項２３に記載の構造化照明装置において、
前記調整手段は、前記２つの分岐光束が互いに近づきながら進行する箇所に配置された屈折部材を備え、
前記屈折部材の表面には、前記回折光学面が形成され、前記屈折部材の光軸方向の厚さは、前記光軸から離れるほど小さく設定される
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項26】

請求項１６〜請求項２５の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記光源は、
前記２種類の射出光束を同時又は順次に出射する
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項27】

請求項１６〜請求項２６の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記２つの集光点の位置を光軸周りの複数の回転位置の間で切り替える切替手段を更に備え、
前記調整手段は、
前記複数の回転位置毎に用意されている
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項28】

請求項１６〜請求項２６の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記２つの集光点の位置を光軸周りの複数の回転位置の間で切り替える第１切替手段と、
前記調整手段の位置を前記複数の回転位置の間で切り替える第２切替手段と、
を更に備えたことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項29】

請求項１６〜請求項２８の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
前記干渉縞の位相をシフトさせる位相シフト手段を更に備えた
ことを特徴とする構造化照明装置。

【請求項30】

請求項１６〜請求項２９の何れか一項に記載の構造化照明装置と、
前記干渉縞で変調された前記標本からの観察光束を光検出器に結像する結像光学系と、
を備えたことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。

【請求項31】

請求項３０に記載の構造化照明顕微鏡装置において、
前記光検出器が生成した画像に基づき前記標本の復調像を演算する演算手段を更に備えた
ことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、構造化照明装置、構造化照明顕微鏡装置、構造化照明方法に関する。

【背景技術】

【0002】

試料（標本）の観察や計測の分野では、対物レンズの性能を超えた解像度を達成するために、空間変調された照明光（構造化照明光）により標本を照明して画像（変調画像）を取得し、その変調画像に含まれる変調成分を除去（復調）することにより、標本の超解像画像（復調画像）を生成する構造化照明顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。

【0003】

特に、下記特許文献１に開示された構造化照明顕微鏡では、光源から射出した光束を回折格子等により複数の光束に分岐し、それらの光束を標本の近傍で互いに干渉させることで干渉縞を形成し、これを構造化照明光としている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国発行特許発明第６２３９９０９号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、構造化照明顕微鏡においても、他の顕微鏡と同様、光源波長を切り替えたいという要求が生じ得るが、光源波長を切り替えると超解像効果（非変調時の解像力を基準とした変調時の解像力の割合）が変動する虞のあることが判明した。

【0006】

本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、超解像効果を調整又は制御することの可能な構造化照明装置、構造化照明顕微鏡装置、構造化照明方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の構造化照明装置の一例は、光源からの射出光束を少なくとも２つの分岐光束に分岐する分岐手段と、前記２つの分岐光束を対物レンズの瞳面の互いに異なる位置へそれぞれ集光させて、前記２つの分岐光束を互いに干渉させ、その干渉縞で標本を照明する照明光学系と、前記照明光学系の光軸から、前記２つの分岐光束が前記瞳面に形成する２つの集光点までの高さを、調整する調整手段とを備える。

【0008】

また、本発明の構造化照明顕微鏡装置の一例は、本発明の構造化照明装置と、前記干渉縞で変調された前記標本からの観察光束を光検出器に結像する結像光学系とを備える。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。

【図2】回折格子１３を説明する図である。

【図3】１／２波長板１７の機能を説明する図である。

【図4】光束選択部材１８の機能を説明する図である。

【図5】１／２波長板１７及び光束選択部材１８の機能を説明する図である。

【図6】光束選択部材１８の形状を説明する図である。

【図7】並進機構１５Ａの機能を説明する図である。

【図8】間隔調整部２００を備えない照明光学系１０の光路を示す図である。

【図9】第１実施形態の間隔調整部２００を備えた照明光学系１０の光路を示す図である。

【図10】楔状部材２０３、２０３’とプリズム２０１、２０２、２０１’、２０２’との関係を示す図である。

【図11】第１実施形態における間隔調整部２００の一例を光軸方向から見た図である。

【図12】第１実施形態における間隔調整部２００の変形例を説明する図である。

【図13】構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭとして使用する場合に使用される光束選択部材１８’を説明する図である。

【図14】間隔調整部２００の別の変形例を説明する図である。

【図15】第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。

【図16】間隔調整部２００を備えない照明光学系１０の光路を示す図である。

【図17】第２実施形態の間隔調整部２００を備えた照明光学系１０の光路を示す図である。

【図18】第２実施形態における間隔調整部２００の一例を光軸方向から見た図である。

【図19】第３実施形態の間隔調整部２００を説明する図である。

【図20】第４実施形態の間隔調整部２００を説明する図である。

【図21】第５実施形態における構造化照明顕微鏡の概略構成図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として構造化照明顕微鏡装置を説明する。

【0011】

図１は、構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。ここでは、構造化照明顕微鏡装置１を、蛍光性を有した試料（標本）５の表面の極めて薄い層を観察する全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy）として使用する場合を説明する。

【0012】

先ず、構造化照明顕微鏡装置１の構成を説明する。

【0013】

図１に示すとおり構造化照明顕微鏡装置１には、レーザユニット１００と、光ファイバ１１と、照明光学系１０と、結像光学系３０と、撮像素子３５と、制御装置３９と、画像記憶・演算装置４０と、画像表示装置４５とが備えられる。なお、照明光学系１０は落射型であり、結像光学系３０の対物レンズ６及びダイクロイックミラー７を利用して標本５の照明を行う。

【0014】

レーザユニット１００には、第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３１、１０３２、ミラー１０５、ダイクロイックミラー１０６、レンズ１０７が備えられる。第１レーザ光源１０１及び第２レーザ光源１０２の各々は可干渉光源であって、互いの出射波長は異なる。ここでは、第１レーザ光源１０１の波長λ１は、第２レーザ光源１０２の波長λ２よりも長いと仮定する（λ１＞λ２）。これらの第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３１、１０３２は、それぞれ制御装置３９によって駆動される。

【0015】

光ファイバ１１は、レーザユニット１００から射出したレーザ光を導光するために、例えば、偏波面保存型のシングルモードファイバによって構成される。この光ファイバ１１の出射端の光軸ＡＺ方向の位置は、位置調整機構１１Ａによって調節可能である。この位置調整機構１１Ａは、制御装置３９によって駆動される。

【0016】

照明光学系１０には、光ファイバ１１の出射端側から順に、コレクタレンズ１２と、偏光板２３と、光束分岐部１５と、集光レンズ１６と、間隔調整部２００と、光束選択部２４と、レンズ２５と、視野絞り２６と、フィールドレンズ２７と、励起フィルタ２８と、ダイクロイックミラー７と、対物レンズ６とが配置される。

【0017】

光束分岐部１５には、回折光学素子（回折格子）１３と、並進機構１５Ａとが備えられ、間隔調整部２００には、複数のプリズム（詳細は後述）と、調整機構２００Ａとが備えられ、光束選択部２４には、１／２波長板１７と、光束選択部材１８と、回動機構２４Ａとが備えられる。なお、並進機構１５Ａ、調整機構２００Ａ、回動機構２４Ａは、制御装置３９によって駆動される。

【0018】

結像光学系３０には、標本５の側から順に、対物レンズ６と、ダイクロイックミラー７と、バリアフィルタ３１と、第２対物レンズ３２とが配置される。

【0019】

標本５は、例えば、平行平板状のガラス表面に滴下された培養液であって、その培養液におけるガラス界面の近傍には、蛍光性を有した細胞（蛍光色素で染色された細胞）が存在している。この細胞には、波長λ１の光によって励起される第１蛍光領域と、波長λ２の光によって励起される第２蛍光領域との双方が発現している。

【0020】

対物レンズ６は、全反射蛍光観察を可能とするために、液浸型（油浸型）の対物レンズとして構成される。つまり、対物レンズ６と標本５のガラスとの間隙は、浸液（油）で満たされている。

【0021】

撮像素子３５は、ＣＣＤやＣＭＯＳ等からなる二次元の撮像素子である。撮像素子３５は、制御装置３９によって駆動されると、その撮像面３６に形成された像を撮像し、画像を生成する。この画像は、制御装置３９を介して画像記憶・演算装置４０へと取り込まれる。

【0022】

制御装置３９は、レーザユニット１００、位置調整機構１１Ａ、並進機構１５Ａ、調整機構２００Ａ、回動機構２４Ａ、撮像素子３５を駆動制御する。

【0023】

画像記憶・演算装置４０は、制御装置３９を介して与えられた画像に対して演算を施し、演算後の画像を不図示の内部メモリに格納すると共に、画像表示装置４５へ送出する。

【0024】

次に、構造化照明顕微鏡装置１におけるレーザ光の振る舞いを説明する。

【0025】

第１レーザ光源１０１から射出した波長λ１のレーザ光（第１レーザ光）は、シャッタ１０３１を介してミラー１０５へ入射すると、ミラー１０５を反射し、ダイクロイックミラー１０６へ入射する。一方、第２レーザ光源１０２から射出した波長λ２のレーザ光（第２レーザ光）は、シャッタ１０３２を介してダイクロイックミラー１０６へ入射し、第１レーザ光と統合される。ダイクロイックミラー１０６から射出した第１レーザ光及び第２レーザ光は、レンズ１０７を介して光ファイバ１１の入射端に入射する。

【0026】

なお、制御装置３９は、レーザユニット１００のシャッタ１０３１、１０３２を制御することにより、光ファイバ１１の入射端に入射するレーザ光の波長（＝光源波長）を、長い波長λ１と短い波長λ２との間で切り替えることができる。

【0027】

光ファイバ１１の入射端に入射したレーザ光は、光ファイバ１１の内部を伝搬して光ファイバ１１の出射端に点光源を生成する。その点光源から射出したレーザ光は、コレクタレンズ１２によって平行光束に変換され、偏光板２３を介して回折格子１３へ入射すると、各次数の回折光束に分岐される。これら各次数の回折光束は、集光レンズ１６によって瞳共役面６Ａ’の互いに異なる位置に集光される。

【0028】

ここで、瞳共役面６Ａ’は、集光レンズ１６の焦点位置（後ろ側焦点位置）であって、後述する対物レンズ６の瞳６Ａ（±１次回折光が集光する位置）に対してフィールドレンズ２７、レンズ２５を介して共役な位置のことである。但し、ここでいう「共役な位置」の概念には、当業者が対物レンズ６、フィールドレンズ２７、レンズ２５の収差、ビネッティング等の設計上必要な事項を考慮して決定した位置も含まれるものとする。

【0029】

また、光ファイバ１１から射出したレーザ光は基本的に直線偏光しているので、偏光板２３は、省略することも可能であるが、余分な偏光成分を確実にカットするために有効である。また、レーザ光の利用効率を高めるため、偏光板２３の軸は、光ファイバ１１から射出したレーザ光の偏光方向に一致していることが望ましい。

【0030】

瞳共役面６Ａ’に向かった各次数の回折光束は、瞳共役面６Ａ’の近傍に配置された間隔調整部２００を介して、同じく瞳共役面６Ａ’の近傍に配置された光束選択部２４へ入射する。

【0031】

ここで、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、ＴＩＲＦＭ（全反射蛍光顕微鏡）として利用されるので、光束選択部２４は、入射した各次数の回折光束のうち、１対の回折光束のみ（ここでは±１次回折光束のみ）を選択的に通過させるものとする。

【0032】

光束選択部２４を通過した±１次回折光束は、レンズ２５によって視野絞り２６付近で回折格子１３と共役な面を形成した後に、フィールドレンズ２７により収束光に変換され、さらに励起フィルタ２８を経てからダイクロイックミラー７で反射し、対物レンズ６の瞳面６Ａ上の互いに異なる位置に集光される。

【0033】

瞳面６Ａ上に集光した±１次回折光束の各々は、対物レンズ６の先端から射出される際には平行光束となり、標本５の表面で互いに干渉し、干渉縞を形成する。この干渉縞が、構造化照明光として使用される。

【0034】

ここで、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、ＴＩＲＦＭ（全反射蛍光顕微鏡）として利用されるので、標本５の表面に入射する際の±１次回折光束の入射角度は、エバネッセント場の生成条件（全反射条件）を満たしている。以下、全反射条件を「ＴＩＲＦ条件」と称す。

【0035】

ＴＩＲＦ条件を満たすためには、瞳面６Ａにおける±１次回折光束の集光点は、瞳面６Ａの最外周に位置する所定の輪帯状領域に位置している必要がある。前述した間隔調整部２００は、瞳面６Ａにおける１対の回折光束の集光点の間隔を調整し、両者の集光点を所定の輪帯状領域に収めるために設けられたものである（詳細は後述）。この調整の結果、標本５の表面近傍には、干渉縞によるエバネッセント場が生起する。

【0036】

このような干渉縞により標本５を照明すると、干渉縞の周期構造と標本５上の蛍光領域の周期構造との差に相当するモアレ縞が現れるが、このモアレ縞においては、蛍光領域の高周波数の構造が元の周波数より低周波数側にシフトしているため、この構造を示す蛍光は、元の角度よりも小さい角度で対物レンズ６へ向かうことになる。よって、干渉縞により標本５を照明すると、蛍光領域の高周波数の構造情報までもが対物レンズ６によって伝達される。

【0037】

標本５の表面近傍（エバネッセント場）で発生した蛍光は、対物レンズ６に入射すると、対物レンズ６で平行光に変換された後、ダイクロイックミラー７及びバリアフィルタ３１を透過し、第２対物レンズ３２を介して撮像素子３５の撮像面３６上に標本５の変調像を形成する。

【0038】

この変調像は、撮像素子３５により画像化され、蛍光領域の変調画像が生成される。その変調画像は、制御装置３９を介して画像記憶・演算装置４０へと取り込まれる。さらに、取り込まれた変調画像には、画像記憶・演算装置４０において公知の復調演算が施され、復調画像（超解像画像）が生成される。そして、この超解像画像は、画像記憶・演算装置４０の内部メモリ（図示せず）に記憶されるとともに、画像表示装置４５へと送出される。なお、公知の復調演算としては、例えば、米国特許８１１５８０６号明細書に開示された方法が用いられる。

【0039】

次に、回折格子１３を詳しく説明する。

【0040】

図２（Ａ）は、回折格子１３を光軸ＡＺ方向から見た図であり、図２（Ｂ）は、±１次回折光束が瞳共役面に形成する集光点の位置関係を示す図である。なお、図２（Ａ）は模式図であるため、図２（Ａ）に示した回折格子１３の構造周期は実際の構造周期と同じとは限らない。

【0041】

図２（Ａ）に示すように、回折格子１３は、照明光学系１０の光軸ＡＺと垂直な面内において互いに異なる複数方向にかけて周期構造を有した回折格子である。この回折格子１３の材質は、例えばガラスである。ここでは、回折格子１３は、１２０°ずつ異なる第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３の各々にかけて周期構造を有した３方向回折格子であって、それら周期構造の周期（ピッチ）は共通であると仮定する。

【0042】

なお、回折格子１３の周期構造は、濃度（透過率）を利用して形成された濃度型の周期構造、または段差（位相差）を利用して形成された位相型の周期構造の何れであってもよいが、位相型の周期構造の方が＋１次回折光の回折効率が高いという点で好ましい。

【0043】

このような回折格子１３に入射した平行光束は、第１方向Ｖ_１にかけて分岐した第１回折光束群と、第２方向Ｖ_２にかけて分岐した第２回折光束群と、第３方向Ｖ_３にかけて分岐した第３回折光束群とに変換される。

【0044】

第１回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸ＡＺに関して対称な方向に進行する。

【0045】

同様に、第２回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸ＡＺに関して対称な方向に進行する。

【0046】

同様に、第３回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸ＡＺに関して対称な方向に進行する。

【0047】

これら第１回折光束群の±１次回折光束、第２回折光束群の±１次回折光束、第３回折光束群の±１次回折光束は、前述した集光レンズ１６により、瞳共役面内の互いに異なる位置に集光される。

【0048】

そして、図２（Ｂ）に示すように、第１回折光束群の±１次回折光束の集光点１４ｄ、１４ｇは、光軸ＡＺに関して対称であり、集光点１４ｄ、１４ｇの配列方向は第１方向Ｖ_１に対応している。

【0049】

光ファイバ１１から射出されるレーザ光の波長をλ、回折格子１３のピッチをＰ、レンズ１６の焦点距離をｆｃとすると、光軸ＡＺから集光点１４ｄ、１４ｇまでの距離Ｄは下記の式で表される。

【0050】

Ｄ＝２ｆｃλ／Ｐ
したがって、レーザ光の波長を変更すると、集光点１４ｄ、１４ｇの位置にずれが生じる。

【0051】

また、第２回折光束群の±１次回折光束の集光点１４ｃ、１４ｆは、光軸ＡＺに関して対称であり、集光点１４ｃ、１４ｆの配列方向は、第２方向Ｖ_２に対応している。なお、第２回折光束群の集光点１４ｃ、１４ｆから光軸ＡＺまでの距離は、第１回折光束群の集光点１４ｄ、１４ｇのから光軸ＡＺまでの距離と同じである。

【0052】

また、第３回折光束群の±１次回折光束の集光点１４ｂ、１４ｅは、光軸ＡＺに関して対称であり、集光点１４ｂ、１４ｅの配列方向は、第３方向Ｖ_３に対応している。なお、第３光束群の集光点１４ｂ、１４ｅから光軸ＡＺまでの距離は、第１回折光束群の集光点１４ｄ、１４ｇから光軸ＡＺまでの距離と同じである。

【0053】

なお、ここでいう「集光点」とは、最大強度の８割以上の強度を有する領域の重心位置のことである。そのため、照明光学系１０は、完全な集光点が形成されるまで光束を集光する必要はない。

【0054】

そして、以上の回折格子１３は、ピエゾモータ等からなる並進機構１５Ａ（図１参照）によって並進移動が可能である。並進機構１５Ａによる回折格子１３の並進移動の方向は、照明光学系１０の光軸ＡＺと垂直な方向であって、前述した第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３の各々に対して非垂直な方向である。この方向に回折格子１３が並進移動すると、干渉縞の位相がシフトする（詳細は後述。）。

【0055】

次に、１／２波長版１７及び光束選択部材１８の機能を詳しく説明する。

【0056】

図３は、１／２波長板１７の機能を説明する図であり、図４は、光束選択部材１８の機能を説明する図である。

【0057】

図３に示すとおり、１／２波長板１７は、入射した各次数の回折光束の偏光方向を設定する波長板であって、図４に示すとおり、光束選択部材１８は、第１〜第３回折光束群のうち何れか１群の±１次回折光束のみを選択的に通過させるマスクである。

【0058】

そして、これらの１／２波長版１７及び光束選択部材１８は、回動機構２４Ａ（図１参照）によって光軸ＡＺの周りに回動可能である。回動機構２４Ａは、光束選択部材１８を回動させることにより、選択される±１次回折光束を第１〜第３回折光束群の間で切り替えると共に、光束選択部材１８に連動して１／２波長板１７を光軸ＡＺの周りに回動させることにより、選択された±１次回折光束が標本５に入射するときの偏光方向をＳ偏光に保つ。

【0059】

つまり、１／２波長板１７及び光束選択部材１８は、干渉縞の状態を保ちつつ、干渉縞の方向を切り替える。以下、縞の状態を保つための条件を具体的に説明する。

【0060】

先ず、１／２波長板１７の進相軸の向きは、選択される±１次回折光束の分岐方向（第１方向Ｖ_１〜第３方向Ｖ_３のいずれか）と、その±１次回折光束の偏光方向とが垂直となるように設定される必要がある。なお、ここでいう1／２波長板１７の進相軸とは、その軸の方向に偏光した光が１／２波長板１７を通過するときの位相遅延量が最小となるような方向のことである。

【0061】

また、光束選択部材１８の開口パターンは、同一の回折光束群に属する±１次回折光束の一方及び他方を個別に通過させる第１の開口部１９及び第２の開口部２０からなり、これら第１の開口部１９と第２の開口部２０との各々の光軸ＡＺ周りの長さは、前述した方向に直線偏光した回折光束が通過できるような長さに設定されている。よって、第１の開口部１９及び第２の開口部２０の各々の形状は、部分輪帯状に近い形状である。

【0062】

ここで、図３（Ａ）に示すように、１／２波長板１７の進相軸の方向が偏光板２３の軸の方向と平行になるときの１／２波長板１７の回転位置を、１／２波長板１７の回転位置の基準とする（以下、「第１の基準位置」と称する。）。

【0063】

また、光束選択部材１８の光束選択方向（＝選択される±１次回折光束の分岐方向）が、偏光板２３の軸の方向と垂直になるときの光束選択部材１８の回転位置を、光束選択部材１８の回転位置の基準とする（以下、「第２の基準位置」と称する。）。

【0064】

このとき、図３（Ｂ）に示すように、１／２波長板１７の第１基準位置からの回転量は、光束選択部材１８の第２基準位置からの回転量の２分の１に制御されるべきである。すなわち、１／２波長板１７の第１基準位置からの回転量がθ／２であるときには、光束選択部材１８の第２基準位置からの回転量は、θに設定されるべきである。

【0065】

そこで、回動機構２４Ａ（図１参照）は、第１回折光束群の±１次回折光束（分岐方向は第１方向Ｖ_１）を選択するために、図４（Ａ）に示すように、光束選択部材１８の光束選択方向を第２の基準位置から右方に回転角θ_１だけ回転させた場合、１／２波長板１７の進相軸の方向を、第１の基準位置から右方に回転角θ_１／２だけ回転させる。

【0066】

このとき、１／２波長板１７を通過する前における各次数の回折光束の偏光方向は、図４（Ａ）中に破線両矢印で示すとおり、偏光板２３の軸の方向と平行となっているのに対し、１／２波長板１７を通過した後における各次数の回折光束の偏光方向は、右方に回転角θ_１だけ回転するので、選択された±１次回折光束の偏光方向は、図４（Ａ）に実線両矢印で示すとおり、それら±１次回折光束の分岐方向（第１方向Ｖ_１）に対して垂直となる。

【0067】

換言すると、１／２波長板１７の進相軸の方向は、光束選択部材１８により選択される±１次回折光束の分岐方向（＝第１方向Ｖ_１）に応じた方向であって、１／２波長板１７へ入射する±１次回折光束が有していた偏光方向（＝偏光板２３の軸方向）と、１／２波長板１７から射出する±１次回折光束が有するべき偏光方向（＝第１方向Ｖ_１に垂直）とが成す角度の２等分線方向に、設定される。

【0068】

また、回動機構２４Ａ（図１参照）は、第２回折光束群の±１次回折光束（分岐方向は第２方向Ｖ_２）を選択するために、図４（Ｂ）に示すように、光束選択部材１８の光束選択方向を第２の基準位置から右方に回転角θ_２だけ回転させた場合、１／２波長板１７の進相軸の方向を、第１の基準位置から右方に回転角θ_２／２だけ回転させる。

【0069】

このとき、１／２波長板１７を通過する前における各次数の回折光束の偏光方向は、図４（Ｂ）中に破線両矢線で示すとおり、偏光板２３の軸の方向と平行となっているのに対し、１／２波長板１７を通過した後における各次数の回折光束の偏光方向は、右方に回転角θ_２だけ回転するので、選択された±１次回折光束の偏光方向は、図４（Ｂ）に実線両矢印で示すとおり、それら±１次回折光束の分岐方向（第２方向Ｖ_２）に対して垂直となる。

【0070】

換言すると、１／２波長板１７の進相軸の方向は、光束選択部材１８により選択される±１次回折光束の分岐方向（＝第２方向Ｖ_２）に応じた方向であって、１／２波長板１７へ入射する±１次回折光束が有していた偏光方向（偏光板２３の軸方向）と、１／２波長板１７から射出する±１次回折光束が有するべき偏光方向（第２方向Ｖ_２に垂直）とが成す角度の２等分線方向に、設定される。

【0071】

また、回動機構２４Ａ（図１参照）は、第３回折光束群の±１次回折光束（分岐方向は第３方向Ｖ_３）を選択するために、図４（Ｃ）に示すように、光束選択部材１８の光束選択方向を第２の基準位置から左方（標本側から見て。以下同じ）に回転角θ_３だけ回転させた場合、１／２波長板１７の進相軸の方向を、第１の基準位置から左方に回転角θ_３／２だけ回転させる。

【0072】

このとき、１／２波長板１７を通過する前における各次数の回折光束の偏光方向は、図４（Ｃ）中に破線両矢線で示すとおり、偏光板２３の軸の方向と平行となっているのに対し、１／２波長板１７を通過した後における各次数の回折光束の偏光方向は、左方に回転角θ_３だけ回転するので、選択された±１次回折光束の偏光方向は、図４（Ｃ）に実両矢印で示すとおり、それら±１次回折光束の分岐方向（第３方向Ｖ_３）に対して垂直となる。

【0073】

換言すると、１／２波長板１７の進相軸の方向は、光束選択部材１８により選択される±１次回折光束の分岐方向（＝第３方向Ｖ_３）に応じた方向であって、１／２波長板１７へ入射する±１次回折光束が有していた偏光方向（＝偏光板２３の軸方向）と、１／２波長板１７から射出する±１次回折光束が有するべき偏光方向（＝第３方向Ｖ_３に垂直）とが成す角度の２等分線方向に、設定される。

【0074】

したがって、回動機構２４Ａは、１／２波長板１７及び光束選択部材１８をギア比２：１で連動すればよい。

【0075】

図５は、以上説明した１／２波長板１７及び光束選択部材１８の機能を説明する図である。なお、図５において円形枠で囲まれた両矢線は、光束の偏光方向を示し、四角枠で囲まれた両矢線は、光学素子の軸方向を示している。

【0076】

なお、以上の説明では、標本５に入射する±１次回折光束をＳ偏光に保つために回動可能な１／２波長板１７を使用したが、回動可能な１／２波長板１７の代わりに固定配置された液晶素子を使用し、その液晶素子を１／２波長板１７として機能させてもよい。液晶素子の配向を電気的に制御すれば、液晶素子の屈折率異方性を制御することができるので、１／２波長板としての進相軸を光軸ＡＺ周りに回転させることができる。因みに、標本５に入射する±１次回折光束をＳ偏光に保つための方法は他にもある（後述）。

【0077】

また、図６に示すように、光束選択部材１８の外周部には、複数の（図６に示す例では６個の）切り欠き２１が形成されており、回動機構２４Ａ（図１参照）には、これらの切り欠き２１を検出するためのタイミングセンサ２２が備えられている。これによって、回動機構２４Ａは、光束選択部材１８の回動位置、ひいては１／２波長板１７の回動位置を検知することができる。

【0078】

次に、並進機構１５Ａ（図１参照）の機能を詳しく説明する。

【0079】

図７は、並進機構１５Ａの機能を説明する図である。

【0080】

先ず、上述した復調演算を可能とするためには、例えば、同一の標本５かつ同一方向の干渉縞に関する変調画像であって、干渉縞の位相の異なる３枚以上の変調画像が使用される。なぜなら、構造化照明顕微鏡装置１が生成する変調画像には、標本５の蛍光領域の構造のうち、干渉縞により空間周波数の変調された構造情報である０次変調成分、＋１次変調成分、−１次変調成分が含まれており、それら３つの未知パラメータを復調演算で既知とするためには、複数数の変調画像が必要だからである。

【0081】

そこで、並進機構１５Ａは、干渉縞の位相をシフトするために、図７（Ａ）に示すように、照明光学系１０の光軸ＡＺと垂直な方向であって、前述した第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３の全てに対して非垂直な方向（ｘ方向）にかけて回折格子１３をシフトさせる。

【0082】

但し、干渉縞の位相を所望のシフト量φだけシフトさせるのに必要な回折格子１３のシフト量Ｌは、光束選択部２４による光束選択方向が第１方向Ｖ_１であるときと、第２方向Ｖ_２であるときと、第３方向Ｖ_３であるときとでは、同じとは限らない。

【0083】

図７（Ｂ）に示すとおり、回折格子１３の第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３の各々の構造周期（ピッチ）をＰとおき、回折格子１３のシフト方向（ｘ方向）と第１方向Ｖ_１とのなす角をθ_１とおき、回折格子１３のシフト方向（ｘ方向）と第２方向Ｖ_２とのなす角をθ_２とおき、回折格子１３のシフト方向（ｘ方向）と第３方向Ｖ_３とのなす角をθ_３とおくと、光束選択方向が第１方向Ｖ_１であるときに必要な回折格子１３のｘ方向のシフト量Ｌ_１は、Ｌ_１＝φ×Ｐ／（４π×｜ｃｏｓθ_１｜）で表され、光束選択方向が第２方向Ｖ_２であるときに必要な回折格子１３のｘ方向のシフト量Ｌ_２は、Ｌ_２＝φ×Ｐ／（４π×｜ｃｏｓθ_２｜）で表され、光束選択方向が第３方向Ｖ_３であるときに必要な回折格子１３のｘ方向のシフト量Ｌ_３は、Ｌ_３＝φ×Ｐ／（４π×｜ｃｏｓθ_３｜）で表される。

【0084】

すなわち、干渉縞の位相シフト量を所望の値φとするために必要な回折格子１３のｘ方向のシフト量Ｌは、波長選択方向（第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３の何れか）とｘ方向とのなす角θにより式（１）のとおり表される。

【0085】

Ｌ＝φ×Ｐ／（４π×｜ｃｏｓθ｜） …（１）
因みに、構造化照明光の縞の位相シフト量φを２πとするために必要な回折格子１３のｘ方向のシフト量Ｌは、Ｐ／（２×｜ｃｏｓθ｜）となる。これは、回折格子１３の半周期に相当する量である。つまり、回折格子１３を半周期分シフトさせるだけで、構造化照明光の位相を１周期分シフトできる（なぜなら、±１次回折光からなる構造化照明光の縞ピッチは、回折格子１３の構造周期の２倍に相当する。）。

【0086】

次に、間隔調整部２００を詳しく説明する。

【0087】

図８は、間隔調整部２００が備えられなかった場合の照明光学系１０の光路を示しており、図９は、間隔調整部２００が備えられた場合の照明光学系１０の光路を示している。図８、図９における（Ａ）は、光源波長が長い波長λ１であった場合を示しており、図８、図９における（Ｂ）は、光源波長が短い波長λ２であった場合を示している。なお、図８、図９では、励起フィルタ２８及びダイクロイックミラー７の図示は省略した。

【0088】

図８（Ａ）→図８（Ｂ）に示すとおり、光源波長が長い波長λ１から短い波長λ２へ切り替わると、回折格子１３から射出する±１次回折光束の回折角度（分岐量）が小さくなるため、間隔調整部２００が仮に備えられなかった場合は、図８（Ａ）、（Ｂ）の左端に示すとおり瞳面６Ａにおける±１次回折光束それぞれの集光点の光軸ＡＺからの高さが変化してしまう。なお、ここでは、光軸ＡＺから光線までの距離を単に「高さ」と称す。

【0089】

このように集光点の高さが波長λ１、λ２の間で変化してしまうと、波長λ１、λ２の間で超解像効果が変化してしまう。超解像効果とは、非変調時の解像力（一様照明光による解像力）を基準とした変調時の解像力（構造化照明光による解像力）の割合のことであって、（超解像効果）＝（構造化照明光による解像力）／（一様照明光による解像力）＝（瞳径＋集光点間の距離）／（瞳径）が成り立つ。よって、対物レンズ６の瞳半径に対する集光点の高さの割合が大きいほど、超解像効果は高くなる。

【0090】

そこで、図９に示すとおり、間隔調整部２００には、集光レンズ１６の側から入射した±１次回折光束の一方（ここでは＋１次回折光束とする。）の光路の方向を偏向するためのプリズム２０２（ここではその偏向方向を光軸ＡＺから離れる方向とする。）と、プリズム２０２にて偏向した＋１次回折光束を反射し、その＋１次回折光束の光路の方向を、元の方向（プリズム２０２へ入射する際の光路と同じ方向）に戻すためのプリズム２０１とが備えられる。

【0091】

また、図９に示すとおり、間隔調整部２００には、集光レンズ１６の側から入射する±１次回折光束の他方（ここでは−１次回折光束）の光路の方向を偏向するためのプリズム２０２’（ここではその偏向方向を光軸ＡＺから離れる方向とする。）と、プリズム２０２’にて偏向した−１次回折光束を反射し、その−１次回折光束の光路の方向を、元の方向（プリズム２０２’へ入射する際の光路と同じ方向）に戻すためのプリズム２０１’とが備えられる。

【0092】

なお、本実施形態の構造化照明光に使用される回折光束は、前述したとり次数が共通の回折光束（±１次回折光束）であり、その±１次回折光束の光路は、光軸ＡＺに関して対称な関係に保たれる必要がある。

【0093】

よって、間隔調整部２００の上流側のプリズム２０２、２０２’の反射面の配置関係は、光軸ＡＺに関して対称な関係に保たれ、下流側のプリズム２０１、２０１’の反射面の配置関係は、光軸ＡＺに関して対称な関係に保たれる。

【0094】

そして、間隔調整部２００の上流側のプリズム２０２、２０２’は、図９（Ａ）→図９（Ｂ）に示すとおり、互いの位置関係を光軸ＡＺに関して対称な関係に保ちつつ、互いの間隔を変化させることが可能である。

【0095】

したがって、図９（Ａ）、（Ｂ）に示すとおり、光源波長に応じてプリズム２０２、２０２’の間隔を調整すれば、瞳面６Ａにおける±１次回折光束の集光点の間隔を、一定に保つことができる。これによって、超解像効果も一定に保たれる。

【0096】

また、図８に示すとおり、間隔調整部２００が備えられなかった場合は、瞳面６Ａにおける±１次回折光束の集光点は、所定の輪帯状領域（エバネッセント場の生成条件を満たすＴＩＲＦ領域）に収まっているとは限らない。

【0097】

よって、図９に示すとおり、間隔調整部２００の下流側のプリズム２０１、２０１’の間隔は、±１次回折光束が瞳面６Ａに形成する集光点が所定の輪帯状領域（エバネッセント場の生成条件を満たすＴＩＲＦ領域）に収まるような最適値に保たれる。これによって、エバネッセント場の生成条件（ＴＩＲＦ条件）が維持される。

【0098】

また、このような間隔調整部２００によれば、±１次回折光束の回折角度（分岐量）が小さかったとしても、瞳面６Ａにおける±１次回折光束の集光点の間隔を適正値にすることができるので、回折格子１３の構造ピッチに対する自由度が高い。

【0099】

したがって、本実施形態では、回折格子１３として、構造ピッチの粗い安価な回折格子（製造が容易な回折格子）を使用することが可能である。

【0100】

また、上述した制御装置３９は、瞳面６Ａにおける集光点の間隔が最適値に保たれるよう、光源波長の切り替えに応じてプリズム２０２、２０２’の間隔を自動的に切り替えることが望ましい。なお、制御装置３９によるプリズム２０２、２０２’の間隔の切り替えは、間隔調整部２００の調整機構２００Ａを介して行われる。

【0101】

但し、プリズム２０２、２０２’の間隔が変化すると、±１次回折光束の光路長も変化するため、±１次回折光束の集光点が瞳面６Ａの前側又は後側へとずれる可能性がある。そこで、上述した制御装置３９は、プリズム２０２、２０２’の間隔と、光ファイバ１１の出射端の光軸ＡＺ方向の位置とを連動させることにより、このような集光点のズレを補償することが望ましい。なお、制御装置３９による出射端の位置の調整は、位置調整機構１１Ａ（図１を参照。）を介して行われる。

【0102】

以下、間隔調整部２００の調整機構２００Ａの具体例を説明する。

【0103】

図１０は、間隔調整部２００の調整機構２００Ａの具体例を示す図である。図１０に示す調整機構２００Ａは、プリズム２０１、２０２の間隙の一部（光路を妨げない位置）に対して挿脱される楔状部材２０３と、プリズム２０１’、２０２’の間隙の一部（光路を妨げない位置）に対して挿脱される楔状部材２０３’とを備える。

【0104】

このうち一方の楔状部材２０３は、プリズム２０１、２０２の間隙に対して標本側から挿入され、楔状部材２０３の光軸ＡＺと垂直な方向の厚さは、標本側ほど厚く設定されている。

【0105】

また、他方の楔状部材２０３’は、プリズム２０１’、２０２’の間隙に対して標本側から挿入され、楔状部材２０３’の光軸ＡＺと垂直な方向の厚さは、標本側ほど厚く設定されている。

【0106】

よって、楔状部材２０３、２０３’の各々の挿入量が多いほど、上流側のプリズム２０２、２０２’の間隔は狭まり、楔状部材２０３、２０３’の各々の挿入量が少ないほど、上流側のプリズム２０２、２０２’の間隔は広がる。

【0107】

なお、図示省略したが、この調整機構２００Ａには、楔状部材２０３、２０３’の移動方向を光軸ＡＺ方向に制限する不図示のガイド部材や、プリズム２０２、２０２’の移動方向を光軸ＡＺと垂直な方向に制限する不図示のガイド部材や、プリズム２０１、２０１’を固定する不図示の固定部材なども備えられる。

【0108】

また、楔状部材２０３の移動方向及び移動量と、楔状部材２０３’の移動方向及び移動量とは、互いに共通であるので、これらの楔状部材２０３、２０３’は、互いに共通の部材で構成されてもよい。或いは、これらの楔状部材２０３、２０３’は、互いに固定されていてもよい。

【0109】

ところで、本実施形態では、干渉縞の方向を上述した３方向（第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３）の間で切り替える。それに対応するため、間隔調整部２００も、以上のプリズム群（プリズム２０１、２０２、２０１’、２０２’）及び調整機構２００Ａを、図１１に示すとおり上述した３方向（第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３）の各々について予め用意している。

【0110】

なお、図１１に示すのは、間隔調整部２００の一例を光源側から見た図である。この例では、プリズム群（プリズム２０１、２０２、２０１’、２０２’）が３群配置されており、そのうち１群は、分岐方向が第１方向Ｖ_１である±１次回折光束を導光するためのプリズム群であり、他の１群は、分岐方向が第２方向Ｖ_２である±１次回折光束を導光するためのプリズム群であり、残りの１群は、分岐方向が第３方向Ｖ_３である±１次回折光束を導光するためのプリズム群である。

【0111】

また、この例では、各方向の楔状部材が共通の部材（符号２０３）で構成されている。また、図１１の符号２０４で示す部材は、各方向のプリズム２０１、２０１’を固定するための固定部材である。

【0112】

［第１実施形態の変形例］
なお、第１実施形態では、図１に示したとおり同一の瞳共役面６Ａ’の近傍に間隔調整部２００と光束選択部２４との双方を配置したが、照明光学系１０に対してリレー光学系を挿入することで瞳共役面の数を増やし、互いに異なる２つの瞳共役面の一方の近傍及び他方の近傍に対して間隔調整部２００及び光束選択部２４を個別に配置してもよい。

【0113】

但し、その場合も、光束選択部２４の挿入先は、間隔調整部２００の挿入先よりも下流側であることが望ましい。なぜなら、光束選択部２４の配置先を間隔調整部２００の配置先よりも下流側にしておけば、光束選択部材１８に対する±１次回折光束の入射位置が間隔調整部２００の作用により不変となるため、光束選択部材１８の開口部のサイズを最小限とすることができるからである。

【0114】

また、第１実施形態では、光源波長の数の切り替え数を２としたが、３以上に拡張してもよい。その場合、間隔調整部２００におけるプリズム２０２、２０２’の間隔の可変ステップ数を３以上とすればよい。

【0115】

また、第１実施形態の間隔調整部２００は、プリズム群（プリズム２０１、２０２、２０１’、２０２’）を３方向（第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３）の各々について予め用意したが、１方向についてのみ用意すると共に、それらのプリズム群（プリズム２０１、２０２、２０１’、２０２’）の全体を光軸ＡＺの周りに回動させる機構を、更に備えてもよい。

【0116】

その場合、上述した制御装置３９は、そのプリズム群（プリズム２０１、２０２、２０１’、２０２’）の回動位置を、光束選択部材１８の回動位置に連動させればよい。

【0117】

また、第１実施形態の間隔調整部２００は、図９に矢印で示したとおり、下流側に配置されたプリズム（プリズム２０１、２０１’）と、上流側に配置されたプリズム（プリズム２０２、２０２’）のうち、後者の間隔のみを可変としたが、それに加えて、図１２に矢印で示すとおり、下流側に配置されたプリズム（プリズム２０１、２０１’）の間隔を可変としてもよい。

【0118】

但し、その場合であっても、瞳面６Ａの最外周の輪帯状領域（エバネッセント場の生成条件を満たすための領域）から±１次回折光束の集光点が外れないよう、プリズム２０１、２０１’の間隔の調整範囲を制限することが望ましい。

【0119】

このようにすれば、エバネッセント場の生成条件（ＴＩＲＦ条件）を維持しながら、エバネッセント場の深さ（＝標本５に対するエバネッセント光の浸み出し量）を微調整することができる。具体的には、プリズム２０１、２０１’の間隔が微調整されれば、図１２の左端に矢印で示すとおり、±１次回折光束の集光点の間隔が微調整されるので、標本５の表面に入射する±１次回折光束の入射角度が微調整され、エバネッセント場の深さが微調整される。

【0120】

また、上述した制御装置３９は、この微調整をユーザからの指示に応じて行うことが望ましい。これによってユーザは、エバネッセント場の深さを自由に調整することが可能となる。

【0121】

また、第１実施形態では光源波長を可変としたが、光源波長が不変である場合には、回折格子１３から射出する±１次回折光束の回折角度（分岐量）が不変となるので、上流側のプリズム（プリズム２０２、２０２’）の間隔を不変とし、下流側のプリズム（プリズム２０１、２０１’）の間隔のみを可変としてもよい。

【0122】

また、第１実施形態の図９、図１２では、プリズム２０１、２０１’の各々における回折光束の（主光線の）偏向角度を約９０°としたが、９０°から外れた角度としてもよいことは言うまでもない。同様に、図９、図１２では、プリズム２０２、２０２’の各々における回折光束の（主光線の）偏向角度を９０°としたが、９０°から外れた角度としてもよいことは言うまでもない。

【0123】

また、第１実施形態では、光源からの射出光束を分岐する手段として、分岐方向の異なる複数の回折光束群を同時に生成する回折格子１３（図２（Ａ）参照）を使用したが、分岐方向が共通の回折光束群を１群のみ生成する回折格子（１方向回折格子）を使用してもよい。但し、その場合は、構造化照明光の縞方向を切り替えるために、１方向回折格子を光軸ＡＺの周りに回動させる機構が備えられる。

【0124】

また、その場合は、回動可能な光束選択部材１８の代わりに、非回動の０次光カットマスクを使用してもよい。０次光カットマスクは、２次以降の高次回折光束の光路となり得る領域にマスク部を配し、かつ、±１次回折光束の光路となり得る領域に開口部を配し、かつ、０次回折光束の光路となる領域にマスク部を配したマスクである。

【0125】

また、第１実施形態では、間隔調整部２００の配置先を瞳共役面の近傍としたが、構造化照明光に寄与する回折光束の光路が互いに分離されている箇所（０次回折光束と＋１次回折光束と−１次回折光束とが空間的に分離されている箇所）であれば、瞳共役面から多少離れた箇所としてもよい。但し、瞳共役面に近い方がプリズムで反射すべき回折光束の断面が小さくなるので、プリズムのサイズを小さくしてプリズムの可動範囲を確保することが容易となる。

【0126】

また、第１実施形態では、標本５に入射する±１次回折光束をＳ偏光に保つために、光軸ＡＺの周りを回動可能な１／２波長板１７を使用したが、固定配置された１／４波長板と光軸ＡＺの周りを回動可能な１／４波長板とを使用してもよい。但し、その場合は、第１の基準位置を基準とした１／４波長板の回転位置は、第２の基準位置を基準とした光束選択部材１８の回転位置と同じに設定される。

【0127】

また、第１実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１が全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）として利用される場合を説明したが、構造化照明顕微鏡装置１を３次元構造化照明顕微鏡装置（３Ｄ−ＳＩＭ：3D-Structured Illumination Microscopy）として利用することもできる。

【0128】

但し、構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭとして使用する場合は、回折格子１３で発生した０次回折光束を瞳共役面６Ａ’にてカットせずに±１次回折光と共に標本５へ入射させる必要がある。そのためには、例えば、図６に示した光束選択部材１８の代わりに、図１３に示すような光束選択部材１８’を使用すればよい。この光束選択部材１８’は、図６に示した光束選択部材１８において、０次回折光束を通過するための開口部２９を設けたものである。

【0129】

なお、この開口部２９の形成先は、光軸ＡＺの近傍であって、この開口部２９の形状は、例えば円形である。このような光束選択部材１８’によると、±１次回折光束だけでなく０次回折光束をも干渉縞に寄与させることができる。

【0130】

このように、３つの回折光束の干渉（３光束干渉）によって生成される干渉縞は、標本５の面方向だけでなく、標本５の深さ方向にも空間変調されている。よって、この干渉縞によると、標本５の深さ方向にも超解像効果を得ることが可能となる。

【0131】

但し、構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭとして使用する場合、間隔調整部２００の外形は、０次回折光束の光路を妨げないよう適切に整えられるものとする。

【0132】

そして、この３次元構造化照明顕微鏡装置においては、間隔調整部２００がプリズム２０２、２０２’の間隔を光源波長に応じて調整すれば、超解像効果を一定に保つことができる。

【0133】

また、この３次元構造化照明顕微鏡装置においては、間隔調整部２００がプリズム２０１、２０１’の間隔を調整すれば、超解像効果を調整することができる。

【0134】

また、第１実施形態では、回折格子１３における±１次回折光束の回折角度（分岐量）が比較的小さい場合を想定し、図９、図１２に示すとおり、それら±１次回折光束の光路の間隔を広げる機能を間隔調整部２００へ付与したが、回折格子１３における±１次回折光束の回折角度（分岐量）が比較的大きい場合には、図１４に示すとおり、それら±１次回折光束の光路の間隔を狭める機能を間隔調整部２００へ付与すればよい。

【0135】

その場合、上流側のプリズム２０２、２０２’による±１次回折光束の偏向方向は、光軸ＡＺから離れる方向ではなく、光軸ＡＺに近づく方向となるので、上流側のプリズム２０２、２０２’の方が、下流側のプリズム２０１、２０１’よりも内側（光軸ＡＺに近い側）に位置する。

【0136】

また、第１実施形態の間隔調整部２００は、プリズム群（プリズム２０１、２０２、２０１’、２０２’）を使用したが、それらプリズムの一部又は全部の代わりに反射鏡を使用してもよいことは言うまでもない。

【0137】

また、第１実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１をＴＩＲＦ−ＳＩＭとして使用する際に、干渉縞に寄与する回折光束として、＋１次回折光束と−１次回折光束との組み合わせを使用したが、他の組み合わせを使用してもよいことは言うまでもない。

【0138】

また、第１実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭとして使用する際に、干渉縞に寄与する回折光束として、＋１次回折光束と−１次回折光束と０次回折光束との組み合わせを使用したが、他の組み合わせを使用してもよいことは言うまでもない。

【0139】

また、以上の説明では、対物レンズ６の交換について言及しなかったが、瞳面サイズの異なる複数の対物レンズの間で対物レンズ６が切り替わる場合には、対物レンズ６の切り替えに応じて調整機構２００Ａを駆動することにより、超解像効果を維持することが望ましい。

【0140】

［第１実施形態の作用効果］
以上、第１実施形態の構造化照明装置は、光源（１００）からの射出光束を少なくとも２つの分岐光束に分岐する分岐手段（１３）と、前記２つの分岐光束を対物レンズ（６）の瞳面（６Ａ）の互いに異なる位置へそれぞれ集光させることで前記２つの分岐光束を前記対物レンズ（６）の物体側で互いに干渉させ、その干渉縞で標本（５）を照明する照明光学系（１０）と、前記照明光学系（１０）の光軸（ＡＺ）から、前記２つの分岐光束が前記瞳面（６Ａ）に形成する２つの集光点までの高さを、調整又は制御する調整手段（２００）とを備え、前記調整手段（２００）は、前記２つの分岐光束の波長に応じた偏向角で前記２つの分岐光束を偏向する光学部材（２０１、２０２、２０１’、２０２’）を含む。

【0141】

そして、前記調整手段（２００）は、前記２つの分岐光束の一方である第１光束の光路を偏向するための第１反射面（２０２）と、前記第１反射面（２０２）で偏向した前記第１光束の光路の方向を元の方向に戻すための第２反射面（２０１）と、前記２つの分岐光束の他方である第２光束の光路を偏向するための第３反射面（２０２’）と、前記第３反射面（２０２’）で偏向した前記第２光束の光路の方向を元の方向に戻すための第４反射面（２０１’）とを備え、前記１反射面（２０２）及び前記第３反射面（２０２’）の位置関係と、前記第２反射面（２０１）及び前記第４反射面（２０１’）の位置関係との少なくとも一方は、可変である。

【0142】

したがって、第１実施形態の構造化照明装置は、構造化照明顕微鏡装置（１）の超解像効果を調整又は制御することが可能である。

【0143】

なお、第１実施形態の構造化照明装置は、前記２つの集光点の光軸（ＡＺ）方向の位置を調整するための位置調整手段（１１Ａ）を更に備える。

【0144】

したがって、第１実施形態の構造化照明装置は、前記超解像効果の調整時に発生し得るフォーカスズレにも対処できる。

【0145】

また、前記調整手段（２００）は、前記２つの集光点の位置関係を光軸（ＡＺ）に関して対称な関係に保つ。

【0146】

したがって、第１実施形態の構造化照明装置は、前記超解像効果の調整時に発生し得る干渉縞の品質低下を防ぐことができる。

【0147】

また、前記分岐手段（１３）は、回折光学素子である。

【0148】

このように、前記分岐手段（１３）として回折光学素子を使用すると、前記２つの分岐光束の分岐量が波長に依存してしまうので、前記２つの集光点の光軸（ＡＺ）からの高さが波長に依存する、つまり、超解像効果が波長に依存する虞があった。しかし、第１実施形態の構造化照明装置は、前記調整手段（２００）を備えるので、超解像効果の波長依存性を抑えることが可能である。

【0149】

また、前記高さは、所定範囲内の値に調整され、前記所定範囲は、前記２つの分岐光束が前記標本の表面近傍にエバネッセント場を生成可能な範囲のことである。

【0150】

したがって、第１実施形態の構造化照明装置は、超解像効果の調整時に発生し得るＴＩＲＦ条件の崩れを防止することができる。

【0151】

また、前記高さは、ユーザからの指示に応じて前記所定範囲内で微調整される。

【0152】

したがって、ユーザは、ＴＩＲＦ条件が崩れない範囲内で自由に超解像効果を調節することができる。

【0153】

また、前記光源（１００）は、前記射出光束の波長を切り替え可能であり、前記高さは、前記波長の切り替えに拘らず所定値に調整される。

【0154】

したがって、第１実施形態の構造化照明装置は、超解像効果の波長依存性を確実に抑えることができる。

【0155】

また、第１実施形態の構造化照明装置は、前記２つの集光点の位置を光軸（ＡＺ）の周りの複数の回転位置の間で切り替える切替手段（１８）を更に備え、前記調整手段（２００）は、前記複数の回転位置毎に用意されている。

【0156】

或いは、第１実施形態の構造化照明装置は、前記２つの集光点の位置を光軸（ＡＺ）周りの複数の回転位置の間で切り替える第１切替手段（１８）と、前記調整手段（２００）の位置を前記複数の回転位置の間で切り替える第２切替手段とを更に備える。

【0157】

また、第１実施形態の構造化照明装置は、前記干渉縞の位相をシフトさせる位相シフト手段（１５Ａ）を更に備える。

【0158】

したがって、第１実施形態の構造化照明装置は、標本（５）に投影される干渉縞の方向及び位相を切り替えることが可能である。

【0159】

また、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、以上説明した何れかの構造化照明装置と、前記干渉縞で変調された前記標本（５）からの観察光束を光検出器（３５）に結像する結像光学系（３０）とを備える。

【0160】

したがって、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、前記標本（５）の変調像を画像化することができる。

【0161】

また、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、前記光検出器（３５）が生成した画像に基づき前記標本（５）の復調像を演算する演算手段（４０）を更に備える。

【0162】

したがって、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、前記標本（５）の超解像画像を取得することができる。

【0163】

［第２実施形態］
以下、本発明の第２実施形態として構造化照明顕微鏡装置を説明する。

【0164】

先ず、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置の構成を説明する。第１実施形態との主な相違点は、間隔調整部２００の構成及び配置先である。

【0165】

なお、本実施形態の間隔調整部２００によると、２種類の波長による同時観察が可能となるので、ここでは同時観察を行うための装置の構成例を説明する。

【0166】

図１５に示すとおり本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１には、レーザユニット１００と、光ファイバ１１と、照明光学系１０と、結像光学系３０と、第１撮像素子３５１と、第２撮像素子３５２と、制御装置３９と、画像記憶・演算装置４０と、画像表示装置４５とが備えられる。なお、照明光学系１０は落射型であり、結像光学系３０の対物レンズ６及びダイクロイックミラー７を利用して標本５の照明を行う。

【0167】

レーザユニット１００には、第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３１、１０３２、ミラー１０５、ダイクロイックミラー１０６、レンズ１０７が備えられる。第１レーザ光源１０１及び第２レーザ光源１０２の各々は可干渉光源であって、互いの出射波長は異なる。ここでは、第１レーザ光源１０１の波長λ１は、第２レーザ光源１０２の波長λ２よりも長いと仮定する（λ１＞λ２）。これらの第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３１、１０３２は、それぞれ制御装置３９によって駆動される。

【0168】

光ファイバ１１は、レーザユニット１００から射出したレーザ光を導光するために、例えば、偏波面保存型のシングルモードファイバによって構成される。この光ファイバ１１の出射端の光軸ＡＺ方向の位置は、位置調整機構１１Ａによって調節可能である。この位置調整機構１１Ａは、制御装置３９によって駆動される。

【0169】

照明光学系１０には、光ファイバ１１の出射端側から順に、コレクタレンズ１２と、偏光板２３と、光束分岐部１５と、間隔調整部２００と、集光レンズ１６と、光束選択部２４と、レンズ２５と、視野絞り２６と、フィールドレンズ２７と、励起フィルタ２８と、ダイクロイックミラー７と、対物レンズ６とが配置される。

【0170】

光束分岐部１５には、第１実施形態と同様の回折光学素子（回折格子）１３と、第１実施形態と同様の並進機構１５Ａとが備えられ、間隔調整部２００には、複数のプリズム（詳細は後述）が備えられ、光束選択部２４には、第１実施形態と同様の１／２波長板１７と、第１実施形態と同様の光束選択部材１８と、第１実施形態と同様の回動機構２４Ａとが備えられる。なお、並進機構１５Ａ、回動機構２４Ａは、制御装置３９によって第１実施形態と同様に駆動される。

【0171】

結像光学系３０には、標本５の側から順に、対物レンズ６と、ダイクロイックミラー７と、バリアフィルタ３１と、第２対物レンズ３２と、第２ダイクロイックミラー３５と、が配置される。

【0172】

標本５は、例えば、平行平板状のガラス表面に滴下された培養液であって、その培養液におけるガラス界面の近傍には、蛍光性を有した細胞（蛍光色素で染色された細胞）が存在している。この細胞には、波長λ１の光によって励起される第１蛍光領域と、波長λ２の光によって励起される第２蛍光領域との双方が発現している。

【0173】

なお、第１蛍光領域は、波長λ１の光に応じて中心波長λ１’の第１蛍光を発生させ、第２蛍光領域は、波長λ２の光に応じて中心波長λ２’の第２蛍光を発生させる。

【0174】

対物レンズ６は、全反射蛍光観察を可能とするために、液浸型（油浸型）の対物レンズとして構成される。つまり、対物レンズ６と標本５のガラスとの間隙は、浸液（油）で満たされている。

【0175】

第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の各々は、ＣＣＤやＣＭＯＳ等からなる二次元の撮像素子である。第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の各々は、制御装置３９によって駆動されると、第１撮像素子３５１の撮像面３６１、第２撮像素子３５２の撮像面３６２の各々に形成された像を撮像し、画像を生成する。これら第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２の各々が生成した画像は、制御装置３９を介して画像記憶・演算装置４０へと取り込まれる。

【0176】

制御装置３９は、レーザユニット１００、位置調整機構１１Ａ、並進機構１５Ａ、回動機構２４Ａ、第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２を駆動制御する。

【0177】

画像記憶・演算装置４０は、制御装置３９を介して与えられた画像に対して演算を施し、演算後の画像を不図示の内部メモリに格納すると共に、画像表示装置４５へ送出する。

【0178】

次に、構造化照明顕微鏡装置１におけるレーザ光の振る舞いを説明する。

【0179】

第１レーザ光源１０１から射出した波長λ１のレーザ光（第１レーザ光）は、シャッタ１０３１を介してミラー１０５へ入射すると、ミラー１０５を反射し、ダイクロイックミラー１０６へ入射する。一方、第２レーザ光源１０２から射出した波長λ２のレーザ光（第２レーザ光）は、シャッタ１０３２を介してダイクロイックミラー１０６へ入射し、第１レーザ光と統合される。ダイクロイックミラー１０６から射出した第１レーザ光及び第２レーザ光は、レンズ１０７を介して光ファイバ１１の入射端に入射する。

【0180】

なお、制御装置３９は、レーザユニット１００のシャッタ１０３１、１０３２を制御することにより、光ファイバ１１の入射端に入射するレーザ光の波長（＝光源波長）を、長い波長λ１と短い波長λ２との間で切り替えたり、光源波長を長い波長λ１と短い波長λ２との双方に設定したりすることができる。

【0181】

光ファイバ１１の入射端に入射したレーザ光は、光ファイバ１１の内部を伝搬して光ファイバ１１の出射端に点光源を生成する。その点光源から射出したレーザ光は、コレクタレンズ１２によって平行光束に変換され、偏光板２３を介して回折格子１３へ入射すると、各次数の回折光束に分岐される。これら各次数の回折光束は、間隔調整部２００を介して集光レンズ１６に入射すると、集光レンズ１６によって瞳共役面６Ａ’の互いに異なる位置に集光される。

【0182】

ここで、瞳共役面６Ａ’は、集光レンズ１６の焦点位置（後ろ側焦点位置）であって、後述する対物レンズ６の瞳６Ａ（±１次回折光が集光する位置）に対してフィールドレンズ２７、レンズ２５を介して共役な位置のことである。但し、ここでいう「共役な位置」の概念には、当業者が対物レンズ６、フィールドレンズ２７、レンズ２５の収差、ビネッティング等の設計上必要な事項を考慮して決定した位置も含まれるものとする。

【0183】

なお、光ファイバ１１から射出したレーザ光は基本的に直線偏光しているので、偏光板２３は、省略することも可能であるが、余分な偏光成分を確実にカットするために有効である。また、レーザ光の利用効率を高めるため、偏光板２３の軸は、光ファイバ１１から射出したレーザ光の偏光方向に一致していることが望ましい。

【0184】

瞳共役面６Ａ’に向かった各次数の回折光束は、瞳共役面６Ａ’の近傍に配置された光束選択部２４へ入射する。

【0185】

ここで、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、ＴＩＲＦＭ（全反射蛍光顕微鏡）として利用されるので、光束選択部２４は、入射した各次数の回折光束のうち、１対の回折光束のみ（ここでは±１次回折光束のみ）を選択的に通過させるものとする。

【0186】

光束選択部２４を通過した±１次回折光束は、レンズ２５によって視野絞り２６付近で回折格子１３と共役な面を形成した後に、フィールドレンズ２７により収束光に変換され、さらに励起フィルタ２８を経てからダイクロイックミラー７で反射し、対物レンズ６の瞳面６Ａ上の互いに異なる位置に集光される。

【0187】

瞳面６Ａ上に集光した±１次回折光束の各々は、対物レンズ６の先端から射出される際には平行光束となり、標本５の表面で互いに干渉し、干渉縞を形成する。この干渉縞が、構造化照明光として使用される。

【0188】

また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、ＴＩＲＦＭ（全反射蛍光顕微鏡）として利用されるので、標本５の表面に入射する際の入射角度は、エバネッセント場の生成条件（全反射条件）を満たしている。以下、全反射条件を「ＴＩＲＦ条件」と称す。

【0189】

ＴＩＲＦ条件を満たすためには、瞳面６Ａにおける±１次回折光束の集光点は、瞳面６Ａの最外周に位置する所定の輪帯状領域に位置している必要がある。前述した間隔調整部２００は、瞳面６Ａにおける１対の回折光束の集光点の間隔を調整し、両者の集光点を所定の輪帯状領域に収めるために設けられたものである（詳細は後述）。この調整の結果、標本５の表面近傍には、干渉縞によるエバネッセント場が生起する。

【0190】

このような干渉縞により標本５を照明すると、干渉縞の周期構造と標本５上の蛍光領域の周期構造との差に相当するモアレ縞が現れるが、このモアレ縞においては、蛍光領域の高周波数の構造が元の周波数より低周波数側にシフトしているため、この構造を示す蛍光は、元の角度よりも小さい角度で対物レンズ６へ向かうことになる。よって、干渉縞により標本５を照明すると、蛍光領域の高周波数の構造情報までもが対物レンズ６によって伝達される。

【0191】

標本５の表面近傍（エバネッセント場）で発生した蛍光は、対物レンズ６に入射すると、対物レンズ６で平行光に変換された後、ダイクロイックミラー７及びバリアフィルタ３１を透過し、第２ダイクロイックミラー３５へ入射する。第２ダイクロイックミラー３５へ入射した波長λ１’の第１蛍光は、第２ダイクロイックミラー３５を反射し、第２ダイクロイックミラー３５へ入射した波長λ２’の第２蛍光は、第２ダイクロイックミラー３５を透過する。

【0192】

第２ダイクロイックミラー３５を反射した第１蛍光は、第１撮像素子３５１の撮像面３６１上に第１蛍光領域の変調像を形成し、第２ダイクロイックミラー３５を透過した第２蛍光は、第２撮像素子３５２の撮像面３６２上に第２蛍光領域の変調像を形成する。

【0193】

撮像面３６１に形成された第１蛍光領域の変調像、撮像面３６２に形成された第２蛍光領域の変調像は、第１撮像素子３５１、第２撮像素子３５２によって個別に画像化され、第１蛍光領域の変調画像と、第２蛍光領域の変調画像とが生成される。

【0194】

第１蛍光領域の変調画像と、第２蛍光領域の変調画像とは、制御装置３９を介して画像記憶・演算装置４０へと取り込まれる。さらに、取り込まれた第１蛍光領域の変調画像と、第２蛍光領域の変調画像との各々には、画像記憶・演算装置４０において公知の復調演算が施され、第１蛍光領域の復調画像（超解像画像）と、第２蛍光領域の復調画像（超解像画像）とが生成される。そして、これらの超解像画像は、画像記憶・演算装置４０の内部メモリ（図示せず）に記憶されるとともに、画像表示装置４５へと送出される。なお、公知の復調演算としては、例えば、米国特許８１１５８０６号明細書に開示された方法が用いられる。

【0195】

次に、本実施形態の間隔調整部２００を詳しく説明する。

【0196】

図１６は、間隔調整部２００が備えられなかった場合の照明光学系１０の光路を示しており、図１７は、間隔調整部２００が備えられた場合の照明光学系１０の光路を示している。図１６、図１７における（Ａ）は、光源波長が長い波長λ１であった場合を示しており、図１６、図１７における（Ｂ）は、光源波長が短い波長λ２であった場合を示している。なお、図１６、図１７では、励起フィルタ２８及びダイクロイックミラー７の図示は省略した。

【0197】

光源波長が長い波長λ１である場合と光源波長が短い波長λ２である場合を比較すると、回折格子１３から射出する±１次回折光束の回折角度（分岐量）が異なるため、図１６（Ａ）、図１６（Ｂ）に示すとおり間隔調整部２００が仮に備えられないと、瞳面６Ａにおける±１次回折光束の集光点の高さが異なる（±１次回折光束の集光点の間隔が異なる。）。なお、ここでは、光軸ＡＺから光線までの距離を単に「高さ」と称す。

【0198】

このように集光点の高さが波長λ１、λ２の間で異なると、超解像効果も波長λ１、λ２の間で異なる。超解像効果とは、非変調時の解像力（一様照明光による解像力）を基準とした変調時の解像力（構造化照明光による解像力）の割合のことであって、対物レンズ６の瞳半径に対する集光点の高さの割合が大きいほど、超解像効果は高くなる。

【0199】

また、集光点の高さが波長λ１、λ２の間で異なると、波長λ１、λ２の双方の集光点をＴＩＲＦ領域に収めることができない虞がある。ＴＩＲＦ領域とは、瞳面６Ａの最外周に位置する所定の輪帯状領域であって、このＴＩＲＦ領域に集光点を収めなければＴＩＲＦ条件を満すことができないので、全反射観察ができなくなる。

【0200】

そこで、本実施形態では、図１７に示すような間隔調整部２００（図１７参照）を採用する。

【0201】

先ず、間隔調整部２００の配置先は、回折格子１３から瞳面６Ａまでの光路のうち、０次回折光束と＋１次回折光束と−１次回折光束とが空間的に分離されている箇所であって、瞳面６Ａ又は瞳共役面６Ａ’から外れた箇所である。因みに、間隔調整部２００の配置先が瞳面６Ａ又は瞳共役面６Ａ’に近過ぎると、間隔調整部２００の機能を十分に発揮させることができなくなる。

【0202】

また、間隔調整部２００の配置先は、＋１次回折光束と−１次回折光束との各々が集光光束又は発散光束となっている箇所（集光レンズ１６とレンズ２５との間、フィールドレンズ２７と瞳面６Ａとの間）よりも、＋１次回折光束と−１次回折光束との各々が平行光束となっている箇所（回折格子１３と集光レンズ１６との間、レンズ２５とフィールドレンズ２７との間）である方が望ましい。その方が間隔調整部２００の設計が容易になるからである。

【0203】

また、間隔調整部２００の配置先は、＋１次回折光束と−１次回折光束とが互いに離れながら進行する箇所（回折格子１３と集光レンズ１６との間、視野絞り２６とフィールドレンズ２７との間）であっても、＋１次回折光束と−１次回折光束とが互いに近づきながら進行する箇所（レンズ２５と視野絞り２６との間）であっても構わない。配置先をどちらにするかは、照明光学系１０内の配置スペースに応じて適切に選択されればよい。

【0204】

ここでは、間隔調整部２００の配置先を、図１７に示すとおり回折格子１３と集光レンズ１６との間と仮定する。この配置先は、＋１次回折光束と−１次回折光束との各々が平行光束となり、かつ、＋１次回折光束と−１次回折光束とが互いに離れながら進行する箇所である。

【0205】

さて、間隔調整部２００には、＋１次回折光束の単独光路へ挿入される屈折部材（プリズム）２０１と、−１次回折光束の単独光路へ挿入される屈折部材（プリズム）２０１’とが備えられる。プリズム２０１の材質とプリズム２０１’の材質とは互いに等しく、プリズム２０１の形状とプリズム２０１’の形状との関係は光軸ＡＺに関して対称である。よって、光軸ＡＺに関する＋１次回折光束と−１次回折光束との対称性が間隔調整部２００の配置によって崩れる虞はない。

【0206】

また、１対のプリズム２０１、２０１’の各々の光軸ＡＺ方向の厚さは、光軸ＡＺから離れるほど大きく設定されている。この場合、互いに離れながら進行する＋１次回折光束と−１次回折光束とは、両者の乖離量が更に大きくなるような方向（光軸ＡＺから離れる方向）へと偏向される。

【0207】

この場合、集光レンズ１６に向かう±１次回折光束の角度は、大きくなる。波長λ１、波長λ２の間では角度の拡大量に差異はあるものの、光線の角度は波長λ１、λ２の双方について拡大される。なお、ここでは、光線が光軸ＡＺと成す角度を単に「角度」と称す。

【0208】

したがって、１対のプリズム２０１、２０１’には、瞳共役面６Ａ’における集光点の高さ（ひいては瞳面６Ａにおける集光点の高さ）が拡大される方向に±１次回折光束を偏向する機能がある。

【0209】

ここで、１対のプリズム２０１、２０１’の各々の材質は、例えばガラスであって、ガラスの屈折率は、長い波長λ１の光に対する値よりも、短い波長λ２に対する値の方が大きい。このため、１対のプリズム２０１、２０１’による偏向角度は、長い波長λ１に対する値（図１７（Ａ）参照）よりも、短い波長λ２に対する値（図１７（Ｂ）参照）の方が大きくなる。

【0210】

この場合、回折格子１３から小角度で射出した短い波長λ２の光線の角度は、回折格子１３から大角度で射出した長い波長λ１の光線の角度に近づく。

【0211】

したがって、１対のプリズム２０１、２０１’は、瞳共役面６Ａ’における集光点の高さ（ひいては瞳面６Ａにおける集光点の高さ）を、波長λ１、λ２の間で近づけることができる。

【0212】

なお、１対のプリズム２０１、２０１’の各々の材質としては、波長λ１、λ２に対する分散がなるべく高いもの（高分散ガラス）が使用されていることが望ましい。このようにすれば、１対のプリズム２０１、２０１’が波長λ１、λ２に与える偏向角度の差を大きくすることができる。

【0213】

これを利用し、本実施形態では、１対のプリズム２０１、２０１’が波長λ１、λ２に与える偏向角度の差は、回折格子１３が波長λ１、λ２に与えた回折角度の差が相殺されるような値に設定される。

【0214】

この場合、回折格子１３から小角度で射出した短い波長λ２の光線の角度は、回折格子１３から大角度で射出した長い波長λ１の光線の角度と一致するので、瞳共役面６Ａ’における集光点の高さ（ひいては瞳面６Ａにおける集光点の高さ）は、波長λ１、λ２の間で共通となる。

【0215】

したがって、本実施形態では、波長λ１、λ２の間で超解像効果が共通になる。

【0216】

しかも、本実施形態では、１対のプリズム２０１、２０１’が波長λ１、λ２の双方に与える偏向角度の程度は、瞳面６Ａにおける集光点がＴＩＲＦ領域に収まるような値に設定されている。

【0217】

したがって、本実施形態では、全反射観察を波長λ１、λ２の双方で実施することができる。

【0218】

なお、本実施形態において、１対のプリズム２０１、２０１’の各々の姿勢は、１対のプリズム２０１、２０１’の各々に入射する光線の入射角度が０°近傍となるように設定されることが望ましい。このようにすれば、１対のプリズム２０１、２０１’による光線の偏向角度を大きくすることができるので、１対のプリズム２０１、２０１’の各々として頂角の小さいプリズムを使用することができる。

【0219】

また、本実施形態のように、１対のプリズム２０１、２０１’が光線に与える偏向角度を大きくすれば、回折格子１３が光線に与える回折角度（分岐量）が仮に小さかったとしても、瞳面６Ａにおける集光点の高さを大きくすることができるので、回折格子１３として構造周期の粗い回折格子を使用することができる。

【0220】

また、本実施形態では、間隔調整部２００の配置先を光束選択部材１８の配置先より上流側としたので、光束選択部材１８に対する光線の入射位置が波長λ１、λ２の間で不変となる。よって、本実施形態では、光束選択部材１８に形成される開口部１９、２０の高さ方向のサイズを最小限に抑えることができる。

【0221】

ところで、本実施形態では、干渉縞の方向を上述した３方向（第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３）の間で切り替える。それに対応するため、間隔調整部２００も、前述した１対のプリズム２０１、２０１’を、図１８に示すとおり上述した３方向（第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３）の各々について予め用意しているものとする。

【0222】

なお、図１８に示すのは、間隔調整部２００の一例を光源側から見た図である。この例では、１対のプリズム２０１、２０１’が３方向（第１方向Ｖ_１、第２方向Ｖ_２、第３方向Ｖ_３）の各々に亘って配置されており、そのうち或る１対のプリズムは、分岐方向が第１方向Ｖ_１である±１次回折光束を導光するためのプリズムであり、他の１対のプリズムは、分岐方向が第２方向Ｖ_２である±１次回折光束を導光するためのプリズムであり、残りの１対のプリズムは、分岐方向が第３方向Ｖ_３である±１次回折光束を導光するためのプリズムである。

【0223】

［第２実施形態の変形例］
なお、第２実施形態では、間隔調整部２００の配置先を、図１５に示したとおり回折格子１３と集光レンズ１６との間にしたが、視野絞り２６とフィールドレンズ２７との間にしてもよい。

【0224】

但し、その場合は、間隔調整部２００の配置先が光束選択部材１８の配置先より下流側となるので、光束選択部材１８に対する±１次回折光束の入射位置が波長λ１、λ２の間でずれてしまう。

【0225】

よって、その場合は、光束選択部材１８の開口部１９、２０の高さ方向のサイズを大きめにしておく必要がある。

【0226】

また、第２実施形態では、間隔調整部２００の配置先を、＋１次回折光束と−１次回折光束と互いに離れながら進行する箇所としたが、＋１次回折光束と−１次回折光束とが互いに近づきながら進行する箇所（レンズ２５と視野絞り２６との間）としてもよい。

【0227】

但し、その場合、１対のプリズム２０１、２０１’の各々の光軸ＡＺ方向の厚さは、光軸ＡＺから離れるほど小さく設定される。つまり、その場合は、１対のプリズム２０１、２０１’の形状が反転する。このような１対のプリズム２０１、２０１’は、互いに近づきながら進行する＋１次回折光束と−１次回折光束とを、両者の乖離量が更に小さくなるような方向（光軸ＡＺに近づく方向）へと偏向する。

【0228】

また、第２実施形態の間隔調整部２００は、干渉縞の方向の切り替えに対処するために、１対のプリズム２０１、２０１’を３組み備えたが（図１８を参照。）、これらのプリズムの一部又は全部を共通の部材で構成してもよい。例えば、全てのプリズムを１つのリング状部材で構成してもよい。

【0229】

また、第２実施形態の間隔調整部２００は、干渉縞の方向の切り替えに対処するために、１対のプリズム２０１、２０１’を３組み備えたが（図１８を参照。）、１対のプリズム２０１、２０１’を１組みだけ備えると共に、その１対のプリズム２０１、２０１’の全体を光軸ＡＺの周りに回動させる機構を更に備えてもよい。

【0230】

その場合、上述した制御装置３９は、１対のプリズム２０１、２０１’の回動位置を、光束選択部材１８の回動位置に連動させればよい。

【0231】

また、第２実施形態では、光源からの射出光束を分岐する手段として、分岐方向の異なる複数の回折光束群を同時に生成する回折格子１３（図２（Ａ）参照）を使用したが、分岐方向が共通の回折光束群を１群のみ生成する回折格子（１方向回折格子）を使用してもよい。但し、その場合は、干渉縞の方向を切り替えるために、１方向回折格子を光軸ＡＺの周りに回動させる機構が備えられる。

【0232】

また、その場合は、回動可能な光束選択部材１８の代わりに、非回動の０次光カットマスクを使用してもよい。０次光カットマスクは、２次以降の高次回折光束の光路となり得る領域にマスク部を配し、かつ、±１次回折光束の光路となり得る領域に開口部を配し、かつ、０次回折光束の光路となる領域にマスク部を配したマスクである。

【0233】

また、第２実施形態では、標本５に入射する±１次回折光束をＳ偏光に保つために、光軸ＡＺの周りを回動可能な１／２波長板１７を使用したが、固定配置した１／４波長板と光軸ＡＺの周りを回動可能な１／４波長板とを使用してもよい。但し、その場合は、第１の基準位置を基準とした１／４波長板の回転位置は、第２の基準位置を基準とした光束選択部材１８の回転位置と同じに設定される。

【0234】

また、第２実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１が全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）として利用される場合を説明したが、構造化照明顕微鏡装置１を３次元構造化照明顕微鏡装置（３Ｄ−ＳＩＭ：3D-Structured Illumination Microscopy）として利用することもできる。

【0235】

但し、構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭとして使用する場合は、回折格子１３で発生した０次回折光束を瞳共役面６Ａ’にてカットせずに±１次回折光と共に標本５へ入射させる必要がある。そのためには、例えば、図６に示した光束選択部材１８の代わりに、図１３に示すような光束選択部材１８’を使用すればよい。この光束選択部材１８’は、図６に示した光束選択部材１８において、０次回折光束を通過するための開口部２９を設けたものである。

【0236】

なお、この開口部２９の形成先は、光軸ＡＺの近傍であって、この開口部２９の形状は、例えば円形である。このような光束選択部材１８’によると、±１次回折光束だけでなく０次回折光束をも干渉縞に寄与させることができる。

【0237】

このように、３つの回折光束の干渉（３光束干渉）によって生成される干渉縞は、標本５の面方向だけでなく、標本５の深さ方向にも空間変調されている。よって、この干渉縞によると、標本５の深さ方向にも超解像効果を得ることが可能となる。

【0238】

但し、構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭとして使用する場合、１対のプリズム２０１、２０１’の外形は、０次回折光束の光路を妨げないよう適切に整えられるものとする。なお、回折格子１３から射出する０次回折光束の角度は、波長λ１、λ２の何れであってもゼロとなるので、０次回折光束の光路にプリズムを配置する必要は無い。

【0239】

また、第２実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１をＴＩＲＦ−ＳＩＭとして使用する際に、干渉縞に寄与する回折光束として、＋１次回折光束と−１次回折光束との組み合わせを使用したが、他の組み合わせを使用してもよいことは言うまでもない。

【0240】

また、第２実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１を３Ｄ−ＳＩＭとして使用する際に、干渉縞に寄与する回折光束として、＋１次回折光束と−１次回折光束と０次回折光束との組み合わせを使用したが、他の組み合わせを使用してもよいことは言うまでもない。

【0241】

また、第２実施形態では、光源波長の数を「２」とし、撮像素子の個数を「２」としたので、２種類の蛍光を同時励起して２種類の蛍光変調像を同時に撮像することができる。しかし、第２実施形態では、撮像素子の個数を１とし、２種類の蛍光を順次に励起して２種類の蛍光変調像を順次に撮像することにしても構わない。

【0242】

また、第２実施形態では、光源波長の数を「２」としたが、３以上に拡張してもよいことは言うまでもない。

【0243】

また、第２実施形態では、間隔調整部２００を１つしか備えなかったが、瞳面サイズの異なる複数の対物レンズの間で対物レンズ６が切り替わる場合には、間隔調整部２００を対物レンズ毎に用意し、対物レンズ６の切り替えに応じて間隔調整部２００を切り替えればよい。

【0244】

［第２実施形態の作用効果］
以上、第２実施形態の構造化照明装置は、光源（１００）からの射出光束を少なくとも２つの分岐光束に分岐する回折光学素子（１３）と、前記２つの分岐光束を対物レンズ（６）の瞳面（６Ａ）の互いに異なる位置へそれぞれ集光させることで前記２つの分岐光束を前記対物レンズ（６）の物体側で互いに干渉させ、その干渉縞で標本（５）を照明する照明光学系（１０）と、前記照明光学系（１０）の光軸（ＡＺ）から、前記２つの分岐光束が前記瞳面（６Ａ）に形成する２つの集光点までの高さを、調整又は制御する調整手段（２００）とを備え、前記調整手段（２００）は、前記２つの分岐光束の波長に応じた偏向角で前記２つの分岐光束を偏向する光学部材（２０１、２０１’）を含む。

【0245】

そして、前記調整手段（２００）は、前記光軸（ＡＺ）から、前記２つの分岐光束が前記瞳面（６Ａ）に形成する２つの集光点までの高さを、波長の異なる少なくとも２種類の前記射出光束（λ１、λ２）の間で略一致させる。

【0246】

具体的に、前記調整手段（２００）は、前記２つの分岐光束の各々を偏向するものであり、前記調整手段（２００）が前記２種類の射出光束に与える偏向角度の差は、前記回折光学素子（１３）が前記２種類の射出光束に与える回折角度の差を相殺する値に設定されている。

【0247】

また、前記調整手段（２００）の配置先は、前記２つの分岐光束が空間的に分離した箇所である。

【0248】

また、前記調整手段（２００）は、前記２つの分岐光束が互いに離れながら進行する箇所に配置された屈折部材（２０１、２０１’）を備え、前記屈折部材の光軸（ＡＺ）方向の厚さは、前記光軸（ＡＺ）から離れるほど大きく設定されている。

【0249】

或いは、前記調整手段（２００）は、前記２つの分岐光束が互いに近づきながら進行する箇所に配置された屈折部材（不図示）を備え、前記屈折部材（不図示）の光軸（ＡＺ）方向の厚さは、前記光軸（ＡＺ）から離れるほど小さく設定されている。

【0250】

したがって、第２実施形態の構造化照明装置は、前記２種類の射出光束（λ１、λ２）の間で超解像効果を共通にすることができる。

【0251】

なお、前記光源（１００）は、前記２種類の射出光束（λ１、λ２）を同時又は順次に出射する。

【0252】

したがって、第２実施形態の構造化照明装置は、前記２種類の射出光束（λ１、λ２）による照明を同時又は順次に行うことができる。

【0253】

また、第２実施形態の構造化照明装置は、前記２つの集光点の位置を光軸（ＡＺ）周りの複数の回転位置の間で切り替える切替手段（１８）を更に備え、前記調整手段（２００）は、前記複数の回転位置毎に用意されている。

【0254】

或いは、第２実施形態の構造化照明装置は、前記２つの集光点の位置を光軸（ＡＺ）周りの複数の回転位置の間で切り替える第１切替手段（１８）と、前記調整手段（２００）の位置を前記複数の回転位置の間で切り替える第２切替手段（不図示）とを更に備える。

【0255】

また、第２実施形態の構造化照明装置は、前記干渉縞の位相をシフトさせる位相シフト手段（１５Ａ）を更に備える。

【0256】

したがって、第２実施形態の構造化照明装置は、標本（５）に投影される干渉縞の方向及び位相を切り替えることが可能である。

【0257】

また、第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、以上説明した何れかの構造化照明装置と、前記干渉縞で変調された前記標本（５）からの観察光束を光検出器（３５１、３５２）に結像する結像光学系（３０）とを備える。

【0258】

したがって、第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、前記標本（５）の変調像を画像化することができる。

【0259】

また、第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、前記光検出器（３５１、３５２）が生成した画像に基づき前記標本（５）の復調像を演算する演算手段（４０）を更に備える。

【0260】

したがって、第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、前記標本（５）の超解像画像を取得することができる。

【0261】

［第３実施形態］
以下、本発明の第３実施形態として第２実施形態の変形例を説明する。ここでは、第２実施形態との相違点のみを説明する。相違点は、間隔調整部２００の構成にある。

【0262】

図１９は、第３実施形態の間隔調整部２００を説明する図である。但し、図１９では、−１次回折光束の図示を省略し、長い波長λ１の＋１次回折光束と短い波長λ２の＋１次回折光束とを同時に描いた。図１９において、回折格子１３から大角度で射出した光束が、長い波長λ１の＋１次回折光束であり、回折格子１３から小角度で射出した光束が、短い波長λ２の＋１次回折光束である。

【0263】

図１９に示すとおり、本実施形態の間隔調整部２００には、１対のプリズム２０１、２０１’に加えて、１対の補助屈折部材（プリズム）２０２、２０２’とが備えられ、これらのプリズム２０１、２０１’と、プリズム２０２、２０２’とは、互いに直列の関係で順に配置される。

【0264】

先ず、上流側に配置された１対のプリズム２０１、２０１’は、光軸ＡＺに関して対称な形状、かつ、互いに同じ材質を有している。このうち一方のプリズム２０１の配置先は＋１次回折光束の光路であり、他方のプリズム２０１’の配置先は−１次回折光束の光路である。これらのプリズム２０１、２０１’の各々の光軸ＡＺ方向の厚さは、光軸ＡＺから離れるほど大きく設定されている。このような１対のプリズム２０１、２０１’には、第２実施形態における１対のプリズムと同様、±１次回折光束を両者の乖離量が更に大きくなるような方向へと偏向する機能がある。

【0265】

但し、本実施形態における１対のプリズム２０１、２０１’が波長λ１、λ２に与える偏向角度の差は、第２実施形態におけるそれよりも大きく、１対のプリズム２０１、２０１’を射出した直後では、短い波長λ２の光線の角度が、長い波長λ１の光線の角度よりも大きくなっているものとする。そのために、本実施形態における１対のプリズム２０１、２０１’の材質としては、波長λ１、λ２に対する分散がなるべく高いものが使用されていることが望ましい。

【0266】

次に、下流側に配置された１対のプリズム２０２、２０２’は、光軸ＡＺに関して対称な形状、かつ、互いに同じ材質を有している。このうち一方のプリズム２０２の配置先は＋１次回折光束の光路であり、他方のプリズム２０２’の配置先は−１次回折光束の光路である。これらのプリズム２０２、２０２’の各々の光軸ＡＺ方向の厚さは、光軸ＡＺから離れるほど小さく設定されている。このような１対のプリズム２０２、２０２’には、±１次回折光束の角度を抑え、特に、短い波長λ２の角度を強く抑えることにより、波長λ１の角度と波長λ２の角度との双方を小さな値にするという機能がある。そのために、１対のプリズム２０２、２０２’の材質としては、波長λ１、λ２に対する分散がなるべく低いものが使用されていることが望ましい。

【0267】

したがって、本実施形態では、集光レンズ１６へ入射する光線の角度が、波長λ１、λ２の双方について小さな値に設定される。

【0268】

よって、本実施形態では、第２実施形態と同様の効果が得られるだけでなく、集光レンズ１６として屈折力の弱いレンズを使用できるという更なる効果も得られる。

【0269】

なお、本実施形態では、下流側のプリズム２０２、２０２’の材質に上流側のプリズム２０１、２０１’の材質よりも分散の高いものを使用してしまうと、上流側のプリズム２０１、２０１’の機能を妨げてしまう。

【0270】

よって、本実施形態では、上流側のプリズム２０１、２０１’の機能を無駄にしないためにも、下流側のプリズム２０２、２０２’の材質には、上流側のプリズム２０１、２０１’の材質よりも分散の低いものが使用されることが望ましい。

【0271】

［第３実施形態の変形例］
なお、第３実施形態も第２実施形態と同様に変形することが可能である。

【0272】

例えば、第３実施形態における間隔調整部２００の配置先は、第２実施形態におけるそれと同様に変更することが可能である。

【0273】

例えば、第３実施形態における間隔調整部２００の配置先を、＋１次回折光束と−１次回折光束とが互いに近づきながら進行する箇所（レンズ２５と視野絞り２６との間）とした場合は、プリズム２０１、２０１’、２０２、２０２’の各々の形状を反転させればよい。つまり、１対のプリズム２０１、２０１’の各々の光軸ＡＺ方向の厚さは、光軸ＡＺから離れるほど小さく設定され、１対のプリズム２０２、２０２’の各々の光軸ＡＺ方向の厚さは、光軸ＡＺから離れるほど大きく設定される。

【0274】

また、第３実施形態の間隔調整部２００においては、上流側のプリズム２０１、２０１’の配置先と、下流側のプリズム２０２、２０２’の配置先とを、反対にしても構わない。

【0275】

［第３実施形態の作用効果］
以上、第３実施形態の調整手段（２００）は、２つの分岐光束が互いに離れながら進行する箇所に配置された屈折部材（２０１、２０１’）を備えると共に、前記屈折部材（２０１、２０１’）の前側又は後側へ配置され、かつ前記屈折部材（２０１、２０１’）より分散の弱い補助屈折部材（２０２、２０２’）を備え、前記補助屈折部材（２０２、２０２’）の光軸（ＡＺ）方向の厚さは、前記光軸（ＡＺ）から離れるほど小さく設定されている。

【0276】

或いは、第３実施形態の調整手段（不図示）は、２つの分岐光束が互いに近づきながら進行する箇所に配置された屈折部材（不図示）を備えると共に、前記屈折部材（不図示）の前側又は後側へ配置され、かつ前記屈折部材（不図示）より分散の弱い補助屈折部材（不図示）を備え、前記補助屈折部材（不図示）の光軸（ＡＺ）方向の厚さは、前記光軸（ＡＺ）から離れるほど大きく設定されている。

【0277】

したがって、第３実施形態では、第２実施形態と同様の効果が得られるだけでなく、集光点を形成するための集光レンズ（１６）として、屈折力の弱いレンズを使用できるという更なる効果も得られる。

【0278】

［第４実施形態］
以下、本発明の第４実施形態として第２実施形態の変形例を説明する。ここでは、第２実施形態との相違点のみを説明する。相違点は、間隔調整部２００の構成にある。

【0279】

図２０は、第４実施形態の間隔調整部２００を説明する図である。但し、図２０では、−１次回折光束の図示を省略し、長い波長λ１の＋１次回折光束と短い波長λ２の＋１次回折光束とを同時に描いた。図２０において、回折格子１３から大きな回折角度で射出した光束が、長い波長λ１の＋１次回折光束であり、回折格子１３から小さな回折角度で射出した光束が、短い波長λ２の＋１次回折光束である。

【0280】

図２０に示すとおり、本実施形態の間隔調整部２００には、光軸ＡＺに関して対称な形状、かつ互いに同じ材質の１対のプリズム２０３、２０３’が備えられる。このうち一方のプリズム２０３の配置先は＋１次回折光束の光路であり、他方のプリズム２０３’の配置先は−１次回折光束の光路である。これらのプリズム２０３、２０３’の各々の光軸ＡＺ方向の厚さは、光軸ＡＺから離れるに従って大きく設定されている。また、１対のプリズム２０３、２０３’の各々の材質としては、波長λ１、λ２に対する分散のなるべく低いものが使用される。

【0281】

さて、本実施形態では、プリズム２０３の光入射面、プリズム２０３’の光入射面に、回折光学面２０３ａ、回折光学面２０３ａ’が個別に形成されている。回折光学面２０３ａの構造と、回折光学面２０３ａ’の構造との関係は、光軸ＡＺに関して対称である。

【0282】

このようなプリズム２０３、２０３’は、プリズムとしての機能と、回折格子としての機能とを併せ持つ。このようなプリズム２０３、２０３’の各々は、「楔状基板に回折パターンを形成してなる回折格子」とみなすこともできる。

【0283】

これらの回折光学面２０３ａ、２０３ａ’には、回折格子１３を射出した±１次回折光束の角度を抑え、特に、長い波長λ１の角度を強く抑えることにより、プリズム内部における波長λ１の角度と波長λ２の角度との双方を小さな値（例えばゼロ）にする働きがある。

【0284】

そのために、回折光学面２０３ａ、２０３ａ’の各々の構造周期は、回折格子１３の構造周期と同程度に設定される。

【0285】

なお、図示省略したが、回折光学面２０３ａでは角度の異なる各次数の回折成分が発生している。但し、本実施形態では、回折光学面２０３ａから射出し標本５に到達できる有効な光線は、図１９に示すとおり、回折光学面２０３ａで発生した−１次回折成分のみと仮定し、回折光学面２０３ａで発生した無効な光線は無視する。

【0286】

同様に、回折光学面２０３ａ’でも各次数の回折成分が発生している。しかし、本実施形態では、回折光学面２０３ａ’から射出し標本５に到達できる有効な光線は、回折光学面２０３ａ’で発生した＋１次回折成分のみと仮定し、回折光学面２０３ａ’で発生した無効な光線は無視する。

【0287】

さて、上述したとおり本実施形態では、回折光学面２０３ａ、２０３ａ’の各々の構造周期を、回折格子１３の構造周期と同程度に設定した。

【0288】

したがって、プリズム内部における波長λ１の角度と、プリズム内部における波長λ２の角度との各々は、ほぼゼロとなる。
なお、回折光学面２０３ａ、２０３ａ’は、予め回折光学素子を作成し、プリズム２０３の光入射面、プリズム２０３’の光入射面に貼り付けることによって形成することも可能であるし、プリズム２０３の光入射面、プリズム２０３’の光入射面にそれぞれエッチング等により直接形成することも可能である。
また、上述したとおり、１対のプリズム２０３、２０３’の各々の光軸ＡＺ方向の厚さは、光軸ＡＺから離れるに従って大きく設定されており、しかも、１対のプリズム２０３、２０３’の材質の波長λ１、λ２に対する分散はなるべく低く設定されている。

【0289】

したがって、プリズムから射出する際に、波長が共通の１対の光束（図２０では一方の光束は不図示。）は、互いに離れる方向へと偏向され、しかも、その偏向角度は、図２０に示すとおり、波長λ１、λ２の間でほぼ共通となる。

【0290】

したがって、図２０に示すとおり、集光レンズ１６へ向かう光線の角度は、波長λ１、λ２の間で等しくなり、瞳共役面６Ａ’における集光点の高さ（瞳面６Ａにおける集光点の高さ）も、波長λ１、λ２の間で等しくなる。

【0291】

したがって、本実施形態においても、第２実施形態と同様の効果を得ることができる。

【0292】

なお、本実施形態では、プリズム内部における光線の角度を波長λ１、λ２の間で完全に一致させてしまうと、プリズムを射出する光線の角度が波長λ１、λ２の間で若干ずれてしまう。なぜなら、プリズムの分散を完全にゼロとすることはできないからである。

【0293】

そこで、本実施形態では、プリズムを射出した直後の角度が波長λ１、λ２の間で完全に一致するよう、回折光学面２０３ａ、２０３ａ’の各々の構造周期は、回折格子１３の構造周期格よりも僅かに大きく設定しておくことが望ましい。

【0294】

［第４実施形態の変形例］
なお、第４実施形態も、第２実施形態と同様に変形することが可能である。

【0295】

例えば、第４実施形態における間隔調整部２００の配置先は、第１実施形態におけるそれと同様に変更することが可能である。

【0296】

例えば、第４実施形態における間隔調整部２００の配置先を、＋１次回折光束と−１次回折光束とが互いに近づきながら進行する箇所（レンズ２５と視野絞り２６との間）とした場合は、プリズム２０３、２０３’の各々の形状を反転させればよい。つまり、１対のプリズム２０３、２０３’の各々の光軸ＡＺ方向の厚さは、光軸ＡＺから離れるほど小さく設定される。

【0297】

また、第４実施形態の間隔調整部２００においては、回折光学面２０３ａ、２０３ａ’の形成先を、プリズム２０３、２０３’の入射面側としたが、プリズム２０３、２０３’の射出面側としてもよい。

【0298】

また、第４実施形態の間隔調整部２００は、回折光学面の形成先をプリズム（楔状基板）としたが、平行平板としてもよい。但し、その場合は、平行平板から射出する光線の角度（波長λ１、λ２の光線の角度）がゼロ以外の適正値となるように、平行平板の配置姿勢と回折光学面の構造周期との組み合わせが最適化されるものとする。

【0299】

［第４実施形態の作用効果］
以上、第４実施形態の調整手段（２００）は、回折光学面（２０３ａ、２０３ａ’）を備え、前記回折光学面（２０３ａ、２０３ａ’）の構造周期は、射出光束を分岐する前記回折光学素子（１３）の構造周期と同程度に設定されている。

【0300】

また、第４実施形態の前記調整手段（２００）は、２つの分岐光束が互いに離れながら進行する箇所に配置された屈折部材（２０３、２０３’）を備え、前記屈折部材（２０３、２０３’）の表面には前記回折光学面（２０３ａ、２０３ａ’）が形成され、前記屈折部材（２０３、２０３’）の光軸（ＡＺ）方向の厚さは、前記光軸（ＡＺ）から離れるほど大きく設定されている。

【0301】

或いは、第４実施形態の前記調整手段（不図示）は、２つの分岐光束が互いに近づきながら進行する箇所に配置された屈折部材（不図示）と、前記屈折部材（不図示）に形成された前記回折光学素子（不図示）とを備え、前記屈折部材（不図示）の光軸（ＡＺ）方向の厚さは、前記光軸（ＡＺ）から離れるほど小さく設定されている。

【0302】

したがって、第４実施形態でも、第２実施形態と同様の効果を得ることができる。

【0303】

［第５実施形態］
以下、本発明の第５実施形態として第１実施形態の変形例を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。相違点は、照明光学系に間隔調整部を備える代わりに変倍機能を搭載した点にある。

【0304】

図２１は、本実施形態における構造化照明顕微鏡の概略構成図であり、図２１（Ａ）は、リレー変倍光学系が高倍端状態にあるときの様子であり、図２１（Ｂ）は、リレー変倍光学系が低倍端状態にあるときの様子である。

【0305】

図２１（Ａ）、（Ｂ）では、説明に必要の無い要素、例えば波長板、光束選択部材、機構、制御装置などの要素の図示を省略した。

【0306】

図２１（Ａ）、（Ｂ）における符号Ｌは点光源、符号Ｇｃはコレクタレンズ、符号Ｇｒは回折格子、符号Ｐは瞳共役面、符号Ｆ．Ｓ．は視野絞り、符号Ｇｔはフィールドレンズ、符号ＤＭはダイクロイックミラー、符号Ｐｏｂは対物レンズの瞳、符号Ｇｏｂは対物レンズ、符号Ｓは標本面、符号Ｇｉは結像レンズ（第２対物レンズ）、符号ＣＣＤは撮像面を示している。また、図２１における実線は、回折格子Ｇｒと標本面Ｓとの共役に関する光線を示しており、破線は、点光源Ｌと対物レンズＧｏｂの瞳Ｐｏｂとの共役に関する光線を示している。

【0307】

図２１（Ａ）、（Ｂ）において、第１レンズ群Ｇ１〜第５レンズ群Ｇ５（正屈折力の第１レンズ群Ｇ１、負屈折力の第２レンズ群Ｇ２、正屈折力の第３レンズ群Ｇ３、正屈折力の第４レンズ群Ｇ４、正屈折力の第５レンズ群Ｇ５）がリレー変倍光学系を構成している。このうち、第１レンズ群Ｇ１〜第４レンズ群Ｇ４は、変倍機能を有した変倍光学系であって、第５レンズ群Ｇ５は、結像機能を有した結像光学系である。なお、回折格子Ｇｒが配置されるのは、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の前側焦点の位置である。

【0308】

さて、図２１（Ａ）、（Ｂ）に破線で示すように、光源Ｌからの光線は、コレクタレンズＧｃによって平行光となり、回折格子Ｇｒを照明する。回折格子Ｇｒからの光線は、変倍光学系（Ｇ１〜Ｇ４）によって変倍された後、結像光学系（Ｇ５）によって視野絞りＦ．Ｓ．の位置に結像する。視野絞りＦ．Ｓ．からの光線は、フィールドレンズＧｔによって収束光となり、ダイクロイックミラーＤＭで反射した後、瞳Ｐｏｂの位置に集光し、対物レンズＧｏｂにより平行光となって標本面Ｓを照射する。

【0309】

また、図２１（Ａ）、（Ｂ）に実線で示すように、標本面Ｓからの光線は、対物レンズＧｏｂに捕らえられ、瞳Ｐｏｂを通過すると、ダイクロイックミラーＤＭを透過し、結像レンズＧｉによって撮像面ＣＣＤに結像する。

【0310】

本実施形態の構造化照明顕微鏡装置では、光源波長が長い波長λ１にセットされた場合（つまり回折格子Ｇｒにおける±１次回折光束の回折角度が大きい場合）は、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の倍率が低くなるように第１レンズ群Ｇ１〜第５レンズ群Ｇ５の各々の配置先を設定し（図２１（Ｂ）参照）、光源波長が短い波長λ２にセットされた場合（つまり回折格子Ｇｒにおける±１次回折光束の回折角度が小さい場合）は、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の倍率が高くなるように第１レンズ群Ｇ１〜第５レンズ群Ｇ５の各々の配置先を設定することにより（図２１（Ａ）参照）、波長λ１、λ２の間で超解像効果を共通にすることができる。

【0311】

特に、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置では、±１次回折光束の集光点が前述したＴＩＲＦ領域に収まるようにリレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の倍率（つまり第１レンズ群Ｇ１〜第５レンズ群Ｇ５の各々の配置先）を制御すれば、エバネッセント場の生成条件（ＴＩＲＦ条件）を維持することもできる。

【0312】

また、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５に対して、波長に依存した集光位置ズレ特性を付与してもよい。この集光位置ズレ特性は、具体的には、光軸ＡＺに直交する方向における集光位置ズレ特性である。以下、この集光位置ズレ特性を、単に「倍率色収差」という。

【0313】

この倍率色収差は、使用波長λの切り替えに依らず±１次回折光の集光点がＴＩＲＦ領域に収まり続けるように設定される。

【0314】

この倍率色収差ｄＹ（λ）は、以下の条件式を満たす。

【0315】

（ｆｏ・ｎｗ -ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆｏ・ＮＡ - ａｆλ／Ｐ）、
ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、
ａ＝２（Ｍ＝３の場合） …（２）
但し、Ｍは回折格子Ｇｒが有する周期構造の方向数であり、λは複数波長の各々であり、ｄＹ（λ）は、複数波長の基準をλ_０としたときに、像高２ｆ・λ_０／Ｐにおけるリレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の倍率色収差である。また、ｆｏは対物レンズＧｏｂの焦点距離、ｆはリレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の焦点距離、Ｐは回折格子Ｇｒの格子ピッチ、ＮＡは対物レンズＧｏｂの開口数、ｎｗは標本の屈折率である。

【0316】

因みに、本実施形態では細胞を標本としたので、ｎｗは水の屈折率にほぼ等しい。また、本実施形態では回折格子Ｇｒの周期構造の方向数を３としたので、Ｍ＝３である。

【0317】

以下、条件式（２）の意義を説明する。

【0318】

先ず、回折格子Ｇｒの格子ピッチがＰ、周期構造の方向数がＭである場合、使用波長λのレーザ光に応じて回折格子Ｇｒで発生する１次回折光の回折角度θは、下記の式で表される。

【0319】

ここで、θは極めて小さいので、ｓｉｎθ＝θで近似する。

【0320】

θ＝ａλ／Ｐ、
ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、
ａ＝２（Ｍ＝３の場合） …（３）
また、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５が仮に無収差であって、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の焦点距離がｆであった場合、回折格子Ｇｒから回折角度θで射出した１次回折光は、瞳面上で光軸ＡＺからの高さがＹである位置に集光する。この高さＹは、下記の式で表される。

【0321】

ここで、θは極めて小さいので、ｔａｎθ＝θで近似する。

【0322】

Ｙ＝ｆθ …（４）
また、対物レンズＧｏｂの焦点距離がｆｏ、対物レンズＧｏｂの開口数がＮＡである場合、対物レンズＧｏｂの瞳半径ｒは下記の式で表される。

【0323】

ｒ＝ｆｏＮＡ …（５）
よって、使用波長λの切り替えに依らず（Ｙ＋ｄＹ（λ））が下記の条件式を満たしていれば、使用波長λの切り替えに依らず１次回折光の集光点がＴＩＲＦ領域に収まり続ける。つまり、ＴＩＲＦ条件が維持される。

【0324】

ｎｗｆｏ≦Ｙ＋ｄＹ（λ）≦ｒ …（６）
この式（６）に式（３）（４）（５）を代入し、ｄＹについて解くと、条件式（２）が得られる。

【0325】

以上の結果、条件式（２）は、使用波長λの切り替えに依らず±１次回折光の集光点をＴＩＲＦ領域に収め続けるため（ＴＩＲＦ条件を維持するため）の条件式であることがわかる。

【0326】

また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置では、光軸（ＡＺ）から集光点までの高さの制御に、光軸（ＡＺ）に関して回転対称な光学系（リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５）を利用するので、光軸（ＡＺ）に関する各集光点の対称性は、確実に維持される。

【0327】

また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置では、光軸（ＡＺ）から集光点までの高さの制御に、光軸（ＡＺ）に関して回転対称な光学系（リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５）を利用するので、干渉縞の方向切り替えにも対応できる。

【0328】

また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置では、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の倍率を変化させても、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の射出瞳位置が殆ど変動しないので、構造化照明顕微鏡装置のテレセントリック性は維持される。

【0329】

また、本実施形態では、変倍光学系Ｇ１〜Ｇ４の瞳が、その変倍光学系Ｇ１〜Ｇ４の外部（変倍光学系の後方）に位置しているので、干渉縞を制御する光学要素（前述した光束選択部など）がその瞳へ配置されても、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の変倍の妨げにはならない。

【0330】

［第５実施形態の変形例］
なお、第５実施形態における少なくとも１つのレンズ群は、複数のレンズで構成されても単一レンズで構成されても構わない。また、その単一レンズは、複数のレンズを接合した接合レンズであっても構わない。

【0331】

また、第５実施形態も第１実施形態と同様に変形することが可能である。

【0332】

例えば、第５実施形態では、光源波長の数の切り替え数を３以上に拡張してもよい。その場合、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の倍率（レンズ群Ｇ１〜Ｇ５の各々の配置先）の可変ステップ数を３以上とすればよい。

【0333】

また、第５実施形態では、光源波長が一定である期間にリレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の倍率（第１レンズ群Ｇ１〜第５レンズ群Ｇ５の各々の配置先）を可変としてもよい。

【0334】

但し、その場合であっても、前述したＴＩＲＦ領域から±１次回折光束の集光点が外れないよう、リレー変倍光学系Ｇ１〜Ｇ５の倍率（第１レンズ群Ｇ１〜第５レンズ群Ｇ５の各々の配置先）の調整範囲を制限することが望ましい。

【0335】

このようにすれば、エバネッセント場の生成条件（ＴＩＲＦ条件）を維持しながら、エバネッセント場の深さ（＝標本５に対するエバネッセント光の浸み出し量）を微調整することができる。

【0336】

また、制御装置３９は、この微調整をユーザからの指示に応じて行うことが望ましい。これによってユーザは、エバネッセント場の深さを自由に調整することが可能となる。

【0337】

［第５実施形態の作用効果］
以上、第５実施形態の調整手段（Ｇ１〜Ｇ５）は、複数のレンズ群からなる変倍光学系であり、前記複数のレンズ群の配置は、前記２つの分岐光束の波長、つまり、前記分岐手段（Ｇｒ）が前記２つの分岐光束に与える偏向角に応じて設定される。

【0338】

したがって、第５実施形態では、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。
［その他］
なお、第１実施形態〜第５実施形態の照明光学系１０は、対物レンズ６よる落射照明光学系で構成されたが、これに限られず、対物レンズ６に代えてコンデサレンズによる透過・反射照明光学系で構成されてもよい。その場合、集光点が形成されるのは、コンデサレンズの瞳面である。

【0339】

また、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

【符号の説明】

【0340】

１…構造化照明顕微鏡装置、１００…レーザユニット、１１…光ファイバ、１０…照明光学系、３０…結像光学系、３５…撮像素子、３９…制御装置、４０…画像記憶・演算装置、４５…画像表示装置、１２…コレクタレンズ、２３…偏光板、１５…光束分岐部、１６…集光レンズ、２００…間隔調整部、２４…光束選択部、２５…レンズ、２６…視野絞り、２７…フィールドレンズ、２８…励起フィルタ、７…ダイクロイックミラー、６…対物レンズ、５…標本、３５１…第１撮像素子、３５２…第２撮像素子

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】