特許 5904369 精子保存液、精子保存方法及び人工授精方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5904369

(24)【登録日】2016年3月25日

(45)【発行日】2016年4月13日

(54)【発明の名称】精子保存液、精子保存方法及び人工授精方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/04 20060101AFI20160331BHJP

   A01K 67/02 20060101ALI20160331BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/04

   A01K67/02

【請求項の数】9

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2012-287668(P2012-287668)

(22)【出願日】2012年12月28日

(65)【公開番号】特開2014-128219(P2014-128219A)

(43)【公開日】2014年7月10日

【審査請求日】2014年6月3日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、生物系特定産業技術研究支援センター「イノベーション創出基礎的研究推進事業」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(73)【特許権者】

【識別番号】591224788

【氏名又は名称】大分県

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100138955

【弁理士】

【氏名又は名称】末次 渉

(74)【代理人】

【識別番号】100109449

【弁理士】

【氏名又は名称】毛受 隆典

(72)【発明者】

【氏名】島田 昌之

(72)【発明者】

【氏名】岡崎 哲司

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／００７４６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５２８３７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−０９８９３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本畜産学会報 ，１９７９年，50, 10，740-746

【文献】 J. Vet. Med. Sci.，２０１１年１０月１４日，74, 3，351-354，published online in J-STAGE 14 Octocer 2011

【文献】 宮崎大学農学部研究報告 ，１９７６年，22, 2，163-169

【文献】 Animal reproduction science，１９９６年，41，193-199

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ブタ精子を１０〜２５℃の液状で保存する精子保存液において、
嫌気的解糖系の非基質となる糖を含有し、
前記糖がラクトースであり、
グルコースを更に含有し、
前記ラクトースと前記グルコースとの配合割合がモル比で８：２〜５：５である、
ことを特徴とする精子保存液。

【請求項2】

乳酸及び／又はグリシンを含有する、
ことを特徴とする請求項１に記載の精子保存液。

【請求項3】

前記乳酸を４．５ｍＭ〜１０ｍＭ含有する、
ことを特徴とする請求項２に記載の精子保存液。

【請求項4】

前記グリシンを０．５ｍＭ以上含有する、
ことを特徴とする請求項２に記載の精子保存液。

【請求項5】

請求項１乃至４のいずれか一項に記載の精子保存液とブタ精子とを混合し、１０℃〜２５℃で保存する、
ことを特徴とする精子保存方法。

【請求項6】

前記ブタ精子を１×１０^７〜１×１０^９ｓｐｅｒｍ／ｍｌの割合で混合する、
ことを特徴とする請求項５に記載の精子保存方法。

【請求項7】

ブタ精液から精漿を除去した前記ブタ精子を用いる、
ことを特徴とする請求項５又は６に記載の精子保存方法。

【請求項8】

請求項１乃至４のいずれか一項に記載の精子保存液とブタ精子とを混合して調製した人工精液をブタの子宮内に注入して人工授精を行う、
ことを特徴とする人工授精方法。

【請求項9】

ブタ精液から精漿を除去した前記ブタ精子を用いる、
ことを特徴とする請求項８に記載の人工授精方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ブタの人工授精に用いる精子保存液、精子保存方法及び人工授精方法に関する。

【背景技術】

【0002】

日本において、ブタの年間生産頭数は１，６００万頭程度であり、その出荷額は５，０００億円程度と畜産全体の約２１％を占めている。産子数を増やし、かつ、母豚の空胎期間を縮小させることが養豚業の生産性向上にとって重要となる。しかし、いまだに自然交配による種付けが生産者当たりで約７０％、生産頭数あたりでも凡そ３０％を占めている。このため、種雄ブタの飼育に伴うコスト高、肉質改善などの育種改良の停滞などの問題があり、繁殖技術の向上が望まれている。

【0003】

このような状況下、近年では、液状精液を用いた人工授精の普及が図られている。各県の試験場や民間の種畜場では、人工授精用の液状精液を販売している。

【0004】

液状精液に用いられる保存液として、例えば、特許文献１に開示されている保存液等があり、採精された精液を保存液に添加して得られた人工精液が養豚業者へ運ばれ、人工授精に利用されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０００−２４７８０１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

特許文献１の保存液を利用した場合でも、良好な精液では５日以上の保存（利用）が可能な場合もあるが、３日以内に著しく運動性が低下する個体も多く認められている。また、液状精液の輸送中の劣化も問題となっていることから、安定的に精液を液状保存できる保存液の開発が望まれている。

【0007】

本発明は上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的は、長期間ブタ精子を液状で保存しても、精子の運動性及び受精能を維持させ得る精子保存液、精子保存方法及び人工授精方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第１の態様に係る精子保存液は、
ブタ精子を１０〜２５℃の液状で保存する精子保存液において、
嫌気的解糖系の非基質となる糖を含有し、
前記糖がラクトースであり、
グルコースを更に含有し、
前記ラクトースと前記グルコースとの配合割合がモル比で８：２〜５：５である、
ことを特徴とする。

【0012】

また、乳酸及び／又はグリシンを含有することが好ましい。

【0013】

また、前記乳酸を４．５ｍＭ〜１０ｍＭ含有することが好ましい。

【0014】

また、前記グリシンを０．５ｍＭ以上含有することが好ましい。

【0015】

本発明の第２の態様に係る精子保存方法は、
本発明の第１の態様に係る精子保存液とブタ精子とを混合し、１０℃〜２５℃で保存する、
ことを特徴とする。

【0016】

また、前記ブタ精子を１×１０^７〜１×１０^９ｓｐｅｒｍ／ｍｌの割合で混合することが好ましい。

【0017】

また、ブタ精液から精漿を除去した前記ブタ精子を用いてもよい。

【0018】

本発明の第３の態様に係る人工授精方法は、
本発明の第１の態様に係る精子保存液とブタ精子とを混合して調製した人工精液をブタの子宮内に注入して人工授精を行う、
ことを特徴とする。

【0019】

また、ブタ精液から精漿を除去した前記ブタ精子を用いてもよい。

【発明の効果】

【0020】

本発明に係るブタ精子保存液では、嫌気的解糖系の非基質となる糖を含有しており、ブタ精子の酸素呼吸が亢進され、長期間保存後においても精子の運動性及び受精能を維持させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ブタ精漿添加培地で培養したマウス精子の運動性を示すグラフである。

【図2】ブタ精漿の各分子量分画がマウス精子の運動性に及ぼす影響を示すグラフである。

【図3】ブタ精漿添加培地で培養したマウス精子のＡＴＰ含有量を示すグラフである。

【図4】ブタ精漿のメタボローム解析を示す図である。

【図5】ブタ精漿中の乳酸含有量と精子運動性との関係を示すグラフである。

【図6】乳酸又はグリシンを含有する精子保存液で保存したブタ精子の運動性を示すグラフである。

【図7】ブタ精子を乳酸又はグリシンを含有する精子保存液で保存した際の精子保存液中の酸素濃度を示すグラフである。

【図8】ラクトースとグルコースの配合比率が異なる精子保存液で保存したブタ精子の運動性を示すグラフである。

【図9】ラクトースとグルコースの配合比率が異なる精子保存液で保存したブタ精子の直進運動速度を示すグラフである。

【図10】種々の嫌気的解糖系の非基質である糖を含有する精子保存液で保存したブタ精子の運動性を示すグラフである。

【図11】種々の嫌気的解糖系の非基質である糖を含有する精子保存液で保存したブタ精子の直進運動速度を示すグラフである。

【図12】図１２（Ａ）は培養直後、図１２（Ｂ）は７日培養後における精子のミトコンドリアの膜電位の解析結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

実施の形態１に係る精子保存液は、ブタ精子を液状で保存する精子保存液であって、嫌気的解糖系の非基質となる糖を含有する。

【0023】

嫌気的解糖系の非基質となる糖とは、嫌気条件ではピルビン酸などの有機酸に分解されず、エネルギー産生の栄養源にならない糖をいう。嫌気的解糖系の非基質となる糖として、例えば、ラクトース、ガラクトース、スクロース等が挙げられる。なかでも、後述の実施例及びコストの面から、ラクトースであることが好ましい。

【0024】

一般的な保存液では、グルコースが添加されている。グルコースは精子の栄養源として機能し、細胞質における嫌気的解糖系で分解されて、一過的にＡＴＰ生産を促進させてしまう。そして、その後、ＡＴＰの生産量が減少に転じてしまい、精子の運動性が低下していく。したがって、長期保存後ではブタ精子の運動性、受精能を担保できない。

【0025】

一方で、グルコースを除去すると浸透圧が低下してしまうことから、本実施の形態に係る精子保存液では、浸透圧調整のために添加される糖類として、嫌気的解糖系の非基質であるラクトース等の糖を含有している。嫌気的解糖系におけるＡＴＰ生産から、ミトコンドリアにおける酸素呼吸によるＡＴＰ生産へと転換される。これにより、酸素濃度依存的に、長期間に渡り一定量のＡＴＰが継続的に産生される。したがって、ブタ精子の運動性及び受精能が長期間に渡って担保される。

【0026】

また、精子保存液はグルコースを含有することが好ましく、嫌気的解糖系の非基質となる糖とグルコースとの配合割合がモル比で９：１〜５：５であることが好ましく、９：１〜７：３であることがより好ましい。後述の実施例より、グルコースを全く含有していないよりも、一部含有している方が、長期間保存後の精子の運動性が高まる。

【0027】

更に、精子保存液には、精子の代謝物質として乳酸及び／又はグリシンが含有されていることが好ましい。後述の実施例から、良好精漿と不良精漿では、含まれる基礎代謝物質が異なっており、良好なブタ精漿には乳酸、グリシンが多く含有されている。乳酸及び／又はグリシンを含有することで、精子の酸素呼吸によるＡＴＰ生産が促進される。

【0028】

精子保存液中の乳酸の含有量は、４．５ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、より好ましくは、５ｍＭ〜１０ｍＭである。また、グリシンの含有量は、０．５ｍＭ以上であることが好ましく、より好ましくは、０．５ｍＭ〜１．０ｍＭである。

【0029】

精子保存液は、嫌気的解糖系の非基質となる糖と乳酸及び／又はグリシン、更にはグルコースを、他の成分（例えば、クエン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、クエン酸、トリス（ヒドロキシル）アミノメタンなど）と混合することで調製され得る。

【0030】

また、精子保存液は、公知の保存液を利用して調製することもできる。例えば、公知の保存液に、嫌気的解糖系の非基質となる糖及び乳酸及び／又はグリシンを添加することで調整され得る。用いられる公知の保存液として、この分野で通常用いられる液体であれば特に限定されないが、例えば、モデナ液（０．１５Ｍグルコース、２６．７ｍＭクエン酸ナトリウム、１１．９ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１５．１ｍＭクエン酸、６．３ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、４６．６ｍＭトリス及び１，０００ＩＵ／ｍｌペニシリン）が挙げられる。この場合、モデナ液中のグルコースを除去し、嫌気的解糖系の非基質となる糖、乳酸及び／又はグリシンを所定の割合で添加して混合すればよい。

【0031】

実施の形態２に係る精子保存方法では、採取したブタ精液と上述した精子保存液とを混合し、人工精液として保存する。例えば、精子保存液を３０〜３８℃の温度にしておき、これと採取した精液とを混合する。人工精液中の精子の終濃度が、１×１０^７ｓｐｅｒｍ／ｍｌ〜１×１０^９ｓｐｅｒｍ／ｍｌになるように調製するとよい。そして、調製した人工精液を１０℃〜２５℃、より好ましくは１３℃〜１８℃で保存する。採取した精液を遠心分離等で精漿を除去した後、精子保存液にて上記濃度に希釈してもよい。

【0032】

実施の形態３に係るブタの人工授精方法では、上述の精子保存液が用いられる。上述したように調製され、保存された人工精液を用いて雌ブタに人工授精を行う。３０〜３８℃にした人工精液を、発情期を迎えた雌ブタの子宮内に注入することで人工授精を行い得る。その際、子宮頸管注入用のカテーテルを用いて、約５０ｍｌ（約５×１０^９ｓｐｅｒｍ／５０ｍｌ）の精液を注入すればよい（子宮頸管内精液注入法）。或いは、子宮角内へ注入できる深部注入カテーテルを用いて子宮角内へ人工精液を注入してもよい（子宮角内精液注入法）。子宮角内精液注入法の場合、逆流漏出や子宮内多核白血球の色作用等による精子の損失が抑えられるので、精子濃度を５×１０^９ｓｐｅｒｍ／５０ｍｌ以下に減少させて用いても構わない。なお、雌ブタでは、人工授精後、凡そ１１４日齢で分娩に至る。分娩後、子ブタが２０〜４０日齢のほ乳期間を経て離乳し、離乳して４日後程で雌ブタに発情が再来する。雌ブタの再発情に合わせて、上記と同様に人工授精を行うとよい。このようなサイクルで人工授精を行うことで、一頭の雌ブタの一生涯に、より多くの子ブタを出産させることができる。

【0033】

上述したように、精子保存液は、ブタ精子の運動性及び受精能を長期間に渡って維持し得るので、長期保存後でも、高い受胎率をなしえる。

【0034】

なお、採精したブタ精液をそのまま精子保存液と混合しても、精液を遠心分離等によって精漿と精子とを分離し、精子のみを精子保存液と混合して人工精液を調製してもよい。

【実施例】

【0035】

以下、実施例に基づき、精子保存液及びこれを用いた人工授精方法について詳細に説明する。以下の実験に用いたブタ精液等について記す。

【0036】

（ブタ精液）
ブタの精液は、以下のようにして採精して用いた。採精に使用する雄ブタを、それぞれ個々の豚房で別々に飼育し、朝、夕の２回、計２．５ｋｇの種ブタ用飼料を給餌した。ブタには、日本脳炎・ブタパルボウイルス感染症ワクチンの接種を行った。本検討には、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）、オーエスキー病に対して抗体陰性のブタを選択した。採精は、１週間間隔をあけて行った。採精前は、餌食い、病気の兆候等を確認し、良好なブタであることを確認し、ブタを興奮させないように採精を行った。疑牝台を雄ブタの豚房に入れ、雄ブタを台にのせ、ペニス及び包皮内を生理食塩水で洗浄し、尿を除去した。採精は手圧法で行い、予め滅菌したカップにガーゼをかぶせ、精液と共に出るゼリー状の物質である膠様物を除去しながら、精液をカップに入れた。このように採精した精液を以下の実験に用いた。
また、ブタ精漿は、上記のようにして採精した後、遠心分離によって精漿を精液から分離して用いた。
（精子の運動性及び直進運動速度の測定）
以下における精子運動性及び直進運動速度は、３８℃のプレートの上に、精子を含有するサンプル（精液、精子を精漿で培養したもの、精液を各種精子保存液或いは培地で保存・培養したもの）を５μｌ載せ、運動性解析装置（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｉｄｅｄ Ｓｐｅｒｍ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＳＡ）ｓｙｓｔｅｍ）を用いて解析した。なお、精子の運動性は、観測される全精子中における動いている精子の割合が１００分率で解析され、直進運動速度は、直進する精子の速度の平均が解析される。

【0037】

（実験１：ブタ精漿が精子の運動性に及ぼす影響）
まず、精子の運動性に及ぼす精漿成分の影響を検討した。精漿に曝されていないマウス精巣上体精子を取り出した。ＨＴＦ培地（株式会社アイエスジャパン）に、６個体のブタ（識別ＩＤ：Ｗ３２７，Ｌ２４１，Ｄ７１７，Ｄ６２１，Ｌ２８４，Ｌ２９１）の精漿をそれぞれ加えて調製した１０％ブタ精漿添加培地で、マウス精子を培養した。そして、経時的にマウス精子の運動性を測定した。

【0038】

その結果を図１に示す。ブタ個体の違いにより、精漿添加によりマウス精子の運動性が低下する場合（Ｗ３２７，Ｌ２４１，Ｄ７１７）、高い運動性が維持される場合（Ｄ６２１，Ｌ２８４，Ｌ２９１）の両者が認められた。即ち、ブタ精漿は、個体により精子の運動性を維持することができる良好な精漿と、運動性を抑制或いは向上させる成分を有さない不良な精漿に分けられることがわかった。

【0039】

（実験２：ブタ精漿の分子量画分が精子の運動性に及ぼす影響）
ブタ精漿中に含まれる精子の運動性を抑制する因子或いは運動性を向上させる因子について明かにすべく、以下の実験を行った。

【0040】

限界濾過膜を用いた遠心分離にて、精漿を分子量１０万以上、１−１０万、５０００−１万、５０００以下に分子量分画した。いずれの画分についてもＨＴＦ培地に１０％量となるよう添加し、１０％ブタ精漿添加培地を調製した。そして、それぞれの１０％ブタ精漿添加培地でマウス精巣上体精子を培養した。そして、１時間培養後の精子運動性を測定した。

【0041】

その結果を図２に示す。分子量５０００−１万、５０００以下の分画において、精子の運動性が低下している。したがって、分子量１万以下の分画に１時間培養後の精子の運動性を低下させる因子が含まれていることがわかった。

【0042】

（実験３：ブタ精漿が精子の代謝能（ＡＴＰ生産）に及ぼす影響）
ブタ精漿の分子量１万以下の低分子画分が、マウス精子の運動性を低下させることが明らかになったことから、精漿に含まれる代謝基質が精子の運動性に影響を及ぼしていると考えられる。そこで、精子の運動性に直接的に関わるＡＴＰ生産量に及ぼす影響を検討した。

【0043】

マウス精巣上体精子を１０％精漿添加ＴＨＦ培地で１５分、３０分、６０分培養して回収した精子を蛍光発光法にてＡＴＰ含有量の測定を行った。

【0044】

その結果を図３に示す。１５分培養後において、不良精漿（Ｗ３２７，Ｌ２４１，Ｄ７１７）において、１５分培養後にＡＴＰ含有量が増加し、６０分後には低下していた。

【0045】

一方、良好精漿（Ｄ６２１，Ｌ２８４，Ｌ２９１）では、１５分、３０分、６０分の培養では、精子のＡＴＰ含有量に大きな変動は見られなかった。

【0046】

すなわち、不良精漿では一過的にＡＴＰ合成が盛んに行われ、精子の運動性が向上するものの、それが持続せず、１時間後には運動性が低下してしまうことが示された。この結果から、長時間に渡って精子の運動性を維持するためには、精子の代謝量を一定に維持させる必要があることがわかった。

【0047】

（実験４：ブタ精漿のメタボローム解析（代謝基質の網羅的解析））
精漿を短期間で精子の運動性が低下する不良精漿、中庸な中庸精漿、長期間維持する良好精漿に区分し、それぞれの精漿中に含まれる基質成分を、キャピラリー電気泳動質量分析（ＣＥ−ＭＡＳ）によりメタボローム解析を行った。なお、不良精漿、中庸精漿、良好精漿の区分は、実験１にて、２時間培養後の精子の運動性が３０％以下に低下した精漿を不良精漿（Ｄ７１７）、精子の運動性が３０〜６０％であった精漿を中庸精漿（Ｗ３２７，Ｌ２４１）、精子の運動性が６０％以上であった精漿を良好精漿（Ｄ６２１，Ｌ２８４，Ｌ２９１）と区分して行った。また、測定は、Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社） Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cmを用い、以下の条件１又は２で行った。
＜条件１＞
Run buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Rinse buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage : Positive, 27 kV
MS ionization : ESI Positive
MS capillary voltage : 4,000 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
＜条件２＞
Run buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1021)
Rinse buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1022)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage : Positive, 30 kV
MS ionization : ESI Negative
MS capillary voltage : 3,500 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)

【0048】

その結果を図４に示す。本結果から、良好精漿と不良精漿に含まれる代謝物質が大きく異なっていることがわかる。精漿に含まれる代謝物質の相違から、良好精漿では精子のＴＣＡサイクルが活性化されることが示唆された。そして、本解析からは、良好精漿にはアセチルＣｏＡに変換され得る乳酸、グリシンが高値を示しており、一方、ピルビン酸等の嫌気的解糖系に関わる因子が低値を示していた。なお、良好精漿では、乳酸が５．３０４ｍＭ、グリシンが０．９７ｍＭであり、不良精漿では、乳酸が２．６０１ｍＭ、グリシンが０．５２４ｍＭであった。なお、乳酸については、別途、乳酸測定キット（日東紡績株式会社製）を用いて測定した。

【0049】

（実験５：ブタ精漿中の乳酸含有量と精子運動性との関係の検証）
ブタ精液中のグルコース及び乳酸のそれぞれの濃度を測定するとともに、その精液を１時間培養した後の精子運動性を測定した。

【0050】

乳酸濃度と精子運動性との関係を図５に示す。乳酸の含有量はサンプル間で大きく異なり、精子の運動性と正の相関関係が認められた（ｒ＝０．５２８６，ｐ＝０．０００８）。図５に示した理論値からは、乳酸濃度が凡そ４．５ｍＭ以上で精子の運動性が７０％程度を越えており、凡そ５ｍＭ以上で精子の運動性が８０％を越えている。このことから、精子保存液中の乳酸濃度は４．５ｍＭ以上であることが好ましく、５ｍＭ以上であることがより好ましいと考えられる。また、図５では、乳酸濃度が高いほど精子運動性は高い傾向にあるが、後述の実験６で乳酸濃度が１５ｍＭの場合に精子運動性が低下していること、及び、図５から乳酸濃度が１０ｍＭを超える精漿の個体が見受けられなかったことから、乳酸濃度は１０ｍＭ以下であることが好ましいと考えられる。なお、グルコースの含有量はいずれの精漿中でも検出限界以下で低濃度であり有意な差はなかった。

【0051】

（実験６：乳酸、グリシンを含有する精子保存液が精子運動性に及ぼす影響）
そこで、良好な精漿に多量に含まれていた代謝基質である乳酸、グリシンをモデナ液に添加して精子保存液を調製し、この精子保存液がブタ精子の運動性に及ぼす影響を検証した。

【0052】

モデナ液に乳酸を添加し、乳酸含有量が５ｍＭ、１５ｍＭの精子保存液をそれぞれ調製した。また、モデナ液にグリシン含有量が０．５ｍＭ、１．０ｍＭの精子保存液をそれぞれ調製した。

【0053】

それぞれの精子保存液でブタ精液を１×１０^８ｓｐｅｒｍ／ｍｌに希釈して、１５℃で保存した。また、参照実験として、モデナ液をそのまま用い、モデナ液にブタ精液を加えて同様に培養した。

【0054】

保存開始から三日後に、３７℃に加温後の精子運動性の測定を行った。その結果を図６に示す。

【0055】

保存３日後では、乳酸５ｍＭ添加区、グリシン０．５ｍＭ添加区及びグリシン１．０ｍＭ添加区では、乳酸、グリシンのいずれも添加されていない無添加区（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、精子運動性は有意に高い値を示した。精子保存液がグリシン、乳酸を含有していることによって、ブタ精子は長期間運動性を維持することが証明された。

【0056】

（実験７：精子保存液中の溶存酸素量に及ぼす影響）
更に、保存後の精子保存液中の溶存酸素量を測定することで、乳酸、グリシンを含有する精子保存液において、精子の嫌気的解糖系が抑制され酸素呼吸が促進されることを検証した。

【0057】

モデナ液に乳酸及びグリシンを加え、乳酸５ｍＭ、グリシン１ｍＭの精子保存液をそれぞれ調製した。

【0058】

それぞれの精子保存液にブタ精液を加えて１×１０^８ｓｐｅｒｍ／ｍｌに希釈し、３７℃で培養した。また、参照実験として、モデナ液をそのまま用い、モデナ液にブタ精液を加えて同様に培養した。また、良好なブタ精液をそのまま培養した。

【0059】

そして、３０分培養後、それぞれの精子保存液中の酸素分圧を測定し、精子保存液中に溶存している酸素濃度を算出した。

【0060】

その結果を図７に示す。モデナ液に比べて、乳酸５ｍＭ添加区及びグリシン１ｍＭ添加区では、良好な精液と同様、精子保存液中の酸素濃度が有意に減少していた。即ち、乳酸５ｍＭ添加区及びグリシン１ｍＭ添加区では、精子による酸素消費量（呼吸量）が有意に増加していることがわかった。

【0061】

精子保存液に乳酸、グリシンが添加されていることにより、酸素呼吸が活発化することが示された。即ち、酸素呼吸によるＡＴＰ生産が促され、精子が持続的に運動可能になっていることが関連付けられた。

【0062】

（実施例１：ラクトースを含有する精子保存液が精子運動性に及ぼす影響）
一般的な精子保存液であるモデナ液では、栄養源として、グルコースが１５０ｍＭ程度添加されている。グルコースは嫌気的解糖系の基質であるため、嫌気的解糖系により一過的なＡＴＰ合成が起こり、長期間に渡った運動性の維持に支障をきたしていると考えられる。

【0063】

そこで、モデナ液に含まれるグルコースを除去し、グルコース除去に伴う浸透圧低下を嫌気的解糖系の非基質となる糖に置換して調整し、嫌気的解糖を抑制して、精子の運動性が長時間維持されるか否か検証した。

【0064】

モデナ液から、グルコースを除去した後、これに、ラクトース及びグルコースを添加し、
ラクトースとグルコースとのモル比が１０：０（１０：０区）、９：１（９：１区）、８：２（８：２区）、７：３（７：３区）、５：５（５：５区）である精子保存液を調製した。

【0065】

また、参照実験として、モデナ液に乳酸及びグリシンを加えた精子保存液（０：１０区）を調製した。

【0066】

それぞれの精子保存液の組成は表１に示す通りである。なお、精子保存液のｐＨはいずれも７．０〜７．１、浸透圧はいずれも３２８〜３３７ｍＯｓｍｋｇである。

【0067】

【表1】

【0068】

ブタ精液をそれぞれの精子保存液で１×１０^８ｓｐｅｒｍ／ｍｌに希釈し、１５℃で１０日間保存し、１０日後の運動性を測定した。その結果を図８に示す。

【0069】

図８を見ると、ラクトースを含有していない０：１０区の精子保存液に比べて、ラクトースを含有する処理区の精子保存液では、いずれも精子運動性は有意に高い値を示している。また、８：２区、７：３区及び５：５区でより高い精子運動性を示している。

【0070】

さらに、精子の活力を示す直進運動速度を解析した。その結果を図９に示す。

【0071】

図９を見ると、８：２区が最も高い直進運動速度を示している。直進運動速度が高い精子ほど受精能が高いことから、８：２区の精子保存液が最も長期間精子の受精能を高く維持させ得ることがわかった。

【0072】

（実施例２：その他の嫌気的解糖系の非基質となる糖を含有する精子保存液が精子運動性に及ぼす影響）
ラクトースの他、嫌気的解糖系の非基質となる糖（ガラクトース、スクロース）についても上記と同様に行った。

【0073】

モデナ液から、グルコースを除去した後、これに、乳酸及びグリシン並びに種々の嫌気的解糖系の非基質となる糖及びグルコースを添加し、乳酸が５ｍＭ、グリシンが１ｍＭ、嫌気的解糖系の非基質となる糖が１２０ｍＭ、グルコースが３０ｍＭである精子保存液を調製した。嫌気的解糖系の非基質となる糖として、ガラクトース、ラクトース、スクロースを用い、それぞれを添加して得られた精子保存液をガラクトース区、ラクトース区、スクロース区と記す。

【0074】

また、参照実験として、モデナ液に乳酸５ｍＭ及びグリシン１ｍＭを加えた精子保存液（グルコース区）を調製した。

【0075】

そして、各精子保存液でブタ精液を１×１０^８ｓｐｅｒｍ／ｍｌに希釈し、１０日間１５℃で保存して、１０日後の精子の運動性及び直進運動速度を測定した。精子運動性の測定結果を図１０に、直進運動速度の測定結果を図１１にそれぞれ示す。なお、図１０及び図１１におけるＤａｙ０は、用いたブタ精液を精子保存液で希釈する前の精子運動性及び直進運動速度である。

【0076】

図１０を見ると、グルコース区に比べて、嫌気的解糖系の非基質となる糖を含有するガラクトース区、ラクトース区及びスクロース区では、精子の運動性は有意に高い値を示した。

【0077】

また、図１１を見ると、精子の直進運動速度についても、グルコース区に比べて、嫌気的解糖系の非基質となる糖を含有するガラクトース区、ラクトース区及びスクロース区では高い値を示した。グルコースから嫌気的解糖系の非基質となる糖に置換することで、ブタ精子を長期間高い活力で保存可能であることが明らかとなった。なお、精子の直進運動速度では、ラクトース区が最も高い値を示しており、嫌気的解糖系の非基質となる糖のなかでラクトースであることが最も好ましいことがわかった。

【0078】

（実施例３：精子のミトコンドリア代謝能）
続いて、ミトコンドリアの代謝機能（酸素呼吸能）が亢進されているかを確認した。

【0079】

実施例１の８：２区（ラクトース：グルコースのモル比が８：２、乳酸５ｍＭ、グリシン１ｍＭ）の精子保存液でブタ精液を精子保存液で１×１０^８ｓｐｅｒｍ／ｍｌに希釈した。そして、これにローダミンを添加し染色した。ローダミンはミトコンドリアの膜電位により蛍光を発する。そして、これを７日間培養した。また、参照実験として、モデナ液をそのまま用い、同様に行った。

【0080】

その結果を図１２に示す。モデナ液に比べて、８：２区の精子保存液で保存した精子では、ローダミン蛍光が強い精子の割合が増加し、ミトコンドリアの活性が高まっていることがわかる。したがって、ミトコンドリアの代謝機能が亢進され、精子の長期間保存後でも十分な運動性及び受精能が担保されることが明かになった。

【0081】

（実施例４：人工精液によるブタの人工授精）
実施例１の８：２区（ラクトース：グルコースのモル比が８：２、乳酸５ｍＭ、グリシン１ｍＭ）の精子保存液でブタ精液を１×１０^８ｓｐｅｒｍ／ｍｌに希釈し、液状精液を調製した。液状精液は保存５日以内にブタの人工授精に用いた。

【0082】

人工授精は、自然発情の雌ブタを用いて行った。上述のように調製した人工精液５０ｍｌ（総精子数５０億）を１９頭の雌ブタの子宮にそれぞれ注入し、人工授精を行った。

【0083】

人工授精後、２１日目に超音波妊娠鑑定にて胎子をモニターで確認した。２１日目に行うのは、ブタは２１日周期で発情がくるため、受精後２１日目に妊娠鑑定をする際、受精していない、若しくは受精卵が退行した等があれば、陰部は発情の兆候を示すためである。また、同時に２１日目にノンリターン法にて再発情（リターン）がきているかどうかも確認し、妊娠を決定した。

【0084】

その結果、ラクトースを含有する精子保存液で調製した人工精液では、１９頭中１７匹が受胎し、受胎率は８９％であった。モデナ液で調製された人工精液で行われた人工授精の統計では受胎率が７６％であるところ、著しく高い値を示した。

【0085】

このように、嫌気的解糖系の非基質となる糖、乳酸、グリシンを含有する精子保存液では、ブタ精子を長期保存した後でも、ブタ精子の受精能が維持され、受胎率の向上に資することを確認した。

【産業上の利用可能性】

【0086】

以上説明したように、本発明に係る精子保存液では、長期間保存後においてもブタ精子の運動性及び受精能を維持させることができるので、養豚業等におけるブタの人工授精に利用可能である。

【図6】

【図7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】