特許 5920787 ヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5920787

(24)【登録日】2016年4月22日

(45)【発行日】2016年5月18日

(54)【発明の名称】ヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/076 20100101AFI20160428BHJP

   A01K 67/02 20060101ALI20160428BHJP

   A61K 35/52 20150101ALI20160428BHJP

   A61P 15/08 20060101ALI20160428BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/076

   A01K67/02

   A61K35/52

   A61P15/08

【請求項の数】6

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2012-542878(P2012-542878)

(86)(22)【出願日】2011年11月1日

(86)【国際出願番号】JP2011075219

(87)【国際公開番号】WO2012063687

(87)【国際公開日】20120518

【審査請求日】2014年8月26日

(31)【優先権主張番号】特願2010-251342(P2010-251342)

(32)【優先日】2010年11月9日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(73)【特許権者】

【識別番号】510297369

【氏名又は名称】医療法人社団レニア会

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100138955

【弁理士】

【氏名又は名称】末次 渉

(74)【代理人】

【識別番号】100109449

【弁理士】

【氏名又は名称】毛受 隆典

(72)【発明者】

【氏名】島田 昌之

(72)【発明者】

【氏名】岡崎 哲司

(72)【発明者】

【氏名】藤田 陽子

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５０６６３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５２４０５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Quinn's Advantage Sperm Freeze，２００８年 ６月，http://www.kbbiosystem.com/pdf/DFU/DFU-8022.pdf参照

【文献】 QUINN’S Sperm Washing Medium，２００８年 ８月，http://www.kbbiosystem.com/pdf/DFU/DFU-1005,1006.pdf参照

【文献】 Fertility and Sterility，１９９７年，68，143-148

【文献】 岡崎 哲司，博士論文 ブタ精子および精漿の機能解析, それを基とした凍結精液による人工授精法の開発に関する研究，２０１０年 ３月，1-138頁，http://ir.lib.hiroshima-u.ac.jp/files/public/31103/20141016180540651327/diss_ko5212.pdf参照

【文献】 Biology of Reproduction，１９９９年，60，336-340

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／０７６

Ａ０１Ｋ ６７／０２

Ａ０１Ｎ １／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＷＰＩ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト凍結精子を融解して、カルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤としてＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを含有しｐＨが６．７５以上７．４未満であるヒト凍結精子用希釈液と混和し、
混和後、融解開始から１５分以内に精子を前記ヒト凍結精子用希釈液から分離する、
ことを特徴とするヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法。

【請求項2】

分離した精子を胚培養培地で培養する、
ことを特徴とする請求項１に記載のヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法。

【請求項3】

ヒトの精液を精子と精漿に分離し、分離した精子を高浸透圧処理して脱水し、脱水した精子を凍結したヒト凍結精子を用いる、
ことを特徴とする請求項１に記載のヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法。

【請求項4】

３００ｍＯｓｍ／ｋｇより高く５００ｍＯｓｍ／ｋｇより低い高浸透圧液を用いる、
ことを特徴とする請求項３に記載のヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法。

【請求項5】

グリセロールを添加し、グリセロール濃度が２体積％より高く５体積％より低い条件下でグリセロール平衡を行った後に凍結させたヒト凍結精子を用いる、
ことを特徴とする請求項３に記載のヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法。

【請求項6】

ｐＨが６．９以上７．１以下である前記ヒト凍結精子用希釈液を用いる、
ことを特徴とする請求項１に記載のヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法に関する。

【背景技術】

【0002】

日本においては、晩婚化の影響等により、４組に一組のカップルが不妊の問題を抱えていると言われている。このため、人工授精を含む不妊治療に加え、体外受精、顕微授精などの高度生殖補助医療の実施が増加傾向にある。

【0003】

人工授精や体外受精では、その実施時に夫も不妊治療を実施するクリニックへ出向く必要がある。しかし、採精される精子の数は体調等の影響により日によって異なること、また、採精される精子の運動性が異なることから、治療を行えない症例も数多く認められる。更には、実施日に夫が急用でクリニックへ出向くことができず、治療がキャンセルされることもある。更には、抗ガン剤治療を受けなければならない夫の場合、抗ガン剤治療を実施することで、乏精子症となるリスクが上昇することから、抗ガン剤治療前に精子を採精して保存を希望する患者もいる。

【0004】

このような背景から、ヒトにおいても精子を凍結保存することは重要な技術である。しかし、既存の技術で凍結保存した精子を用いた人工授精による妊娠率は著しく低いものであり、凍結精液は主に顕微操作により卵子に直接注入する顕微授精（ＩＣＳＩ）症例において利用されているのが現状である。

【0005】

現状、ヒト精子の凍結用の溶液が数多く市販されている。その代表的なものとして、ニワトリ卵黄とグリセロールが添加された市販液（ｓｐｅｒｍ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ、アイエスジャパン）がある。そして、上記市販液を用いて凍結した精子を、胚培養用培地を用いて融解、培養した精子が顕微授精、体外受精や人工授精等に用いられている。

【0006】

また、畜産業においては、凍結精子を希釈液で融解して人工授精を行う手法が開示されている（非特許文献１、特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】岡崎哲司，吉田周司，手島久智，島田昌之，ブタ凍結融解精子の人工授精に用いる完全合成融解液（人工精漿）の開発，第１１２回日本畜産学会大会講演要旨集ＩＹＳ−０２，発表日２０１０年３月２８日

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２０１０／１４７１９４号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

上記市販液を用いて凍結精子を作成した後、胚培養培地にて融解・培養した精子の運動性は高いとは言えない。融解後の精子の運動性が高くないことから、この精子を用いて体外受精（顕微授精を除く）や人工授精等を行っても妊娠率は低いという問題がある。

【0010】

また、非特許文献１、特許文献１では多胎動物であるブタ等を対象とした凍結精子用希釈液であり、そのままヒト凍結精子に適用できるものではない。

【0011】

本発明は上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的はヒト凍結精子を融解した後の精子運動性の低下を抑制し得るヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0021】

本発明に係るヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法は、
ヒト凍結精子を融解して、カルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤としてＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを含有しｐＨが６．７５以上７．４未満であるヒト凍結精子用希釈液と混和し、
混和後、融解開始から１５分以内に精子を前記ヒト凍結精子用希釈液から分離することを特徴とする。

【0023】

また、分離した精子を胚培養培地で培養することが好ましい。

【0024】

また、ヒトの精液を精子と精漿に分離し、分離した精子を高浸透圧処理して脱水し、脱水した精子を凍結したヒト凍結精子を用いることが好ましい。

【0025】

また、３００ｍＯｓｍ／ｋｇより高く５００ｍＯｓｍ／ｋｇより低い高浸透圧液を用いることが好ましい。

【0026】

また、グリセロールを添加し、グリセロール濃度が２体積％より高く５体積％より低い条件下でグリセロール平衡を行った後に凍結させたヒト凍結精子を用いることが好ましい。
また、ｐＨが６．９以上７．１以下である前記ヒト凍結精子用希釈液を用いることが好ましい。

【発明の効果】

【0028】

ヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法では、ヒト凍結精子を融解して上記ヒト凍結精子用希釈液と混和している。そして、ヒト凍結精子の融解開始から所定時間以内に、融解した精子をヒト凍結精子用希釈液から分離することにより、ヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液を得ている。融解時・融解直後に、急激にカルシウムイオンが精子に作用することを抑えるとともに、その後、ヒト凍結精子用希釈液から融解した精子を分離することで、精子の活性に必要なカルシウムの供給が可能となる。このようにして得られたヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液は、長時間に渡って精子の活性が保たれるので、体外受精だけでなく人工授精にも用いることが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】実施例１及び比較例１における精子運動性の測定結果を示すグラフである。

【図2】実験例及び比較例２における精子運動性の測定結果を示すグラフである。

【図3】実施例２及び比較例３における精子運動性の測定結果を示すグラフである。

【図4】実施例３及び比較例４におけるヒト凍結精子融解６時間後の精子運動性の測定結果を示すグラフである。

【図5】実施例３及び比較例４におけるヒト凍結精子融解２４時間後の精子運動性の測定結果を示すグラフである。

【図6】実施例４及び比較例５におけるチロシンリン酸化バンドの検出結果を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

本実施の形態に係るヒト凍結精子用希釈液、及び、これを用いたヒト凍結精子の希釈方法、並びにヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法について詳述する。

【0031】

（ヒト凍結精子用希釈液）
本実施の形態に係るヒト凍結精子用希釈液は、ヒト凍結精子を融解して、速やかに精子を混和させる液体である。ヒト凍結精子用希釈液は、後述する基礎希釈液にカルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤が含有されている。ヒト凍結精子用希釈液は、キレート剤を含有しているので、ヒト凍結精子を融解した際に、カルシウムイオンの関与によって生じる精子のタンパク質のリン酸化が抑制され、機能障害が抑制される。

【0032】

より詳細に説明すると、精子の中片部にはミトコンドリアが存在し、ミトコンドリアで精子の運動に用いられるエネルギー（ＡＴＰ）が生産されている。カルシウムイオンがミトコンドリア（より詳細にはＡＴＰを生産する酵素）に作用すると、ＡＴＰの生産が活性化され、精子が激しく運動することになる。

【0033】

ヒト凍結精子の融解時・融解直後にカルシウムイオンが作用すると、精子が急激に活性化する。精子の活性は受精時に高いことが要求されるが、精子の融解時・融解直後に急激に精子が活性化すると、精子の活性が受精時まで続かず、精子が死滅してしまう。このため、体外受精や人工授精等における妊娠率の向上が期待できない。

【0034】

本実施の形態に係るヒト凍結精子用希釈液では、ヒト凍結精子の融解時・融解直後に、キレート剤がカルシウムイオンと錯体を形成することで、精子のミトコンドリアにカルシウムイオンが作用することが抑制される。これにより、急激な活性化による精子の死滅が抑制され、精子の生存が担保される。

【0035】

更に、ヒト凍結精子用希釈液は、ｐＨが６．７５以上７．４未満である。後述の実施例に示すように、ヒト凍結精子を胚培養用培地にて融解させる場合に比べ、融解後の精子の運動性が高い。

【0036】

更に、ヒト凍結精子用希釈液は、ｐＨが６．９以上７．１以下であることがより好ましい。後述の実施例に示すように、ヒト凍結精子用希釈液のｐＨが７．０の際に、ヒト凍結精子を融解して２４時間経過しても、精子運動性が高い。人工授精では、排卵時に精子が卵子に辿りつき受精することが要求されるが、受精するまでにはある程度の時間がかかる。このため、精子は受精時まで高い運動性を保つことが要求される。ｐＨ７．０のヒト凍結精子用希釈液に、ヒト凍結精子を融解して混和させた場合では、２４時間経過しても精子運動性を保っているので、人工授精や体外受精の際にも有用であり、人工授精等における妊娠率の向上が期待できる。

【0037】

上述したヒト凍結精子用希釈液は、カルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を基礎希釈液に添加することで得られる。

【0038】

ここで、基礎希釈液とは、採精された精液を室温下で一定時間、その精液中の精子の有する機能を低下させずに保持できるように調製された希釈液であり、グルコース、クエン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、クエン酸、トリス、塩化カリウム等の成分を含んでいる液体である。基礎希釈液として、この分野で通常用いられる液体であれば特に限定されない。例えば、基礎希釈液としてモデナ液（０．１５Ｍグルコース、２６．７ｍＭクエン酸ナトリウム、１１．９ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１５．１ｍＭクエン酸、６．３ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、４６．６ｍＭトリスおよび１，０００ＩＵ／ｍｌペニシリン）が挙げられる。

【0039】

キレート剤として、カルシウムイオンと特異的に錯体を形成する物質であれば、特に限定されないが、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ））を用いることが好ましい。ＥＧＴＡはカルシウムイオンと特異的に錯体を形成することにより、精子のミトコンドリアにカルシウムイオンが作用することを効果的に抑制できる。

【0040】

また、ＥＧＴＡとともに、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ））を含有していてもよい。ＥＤＴＡは、カルシウムイオンの他、マグネシウムイオンや亜鉛イオン等、種々の二価イオンと錯体を形成する物質である。

【0041】

ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ双方を含有していれば、ＥＤＴＡでキレート化できなかったカルシウムイオンをＥＧＴＡでキレート化することができ、基礎希釈液に存在するほとんどのカルシウムイオンをキレート化できることになる。例えば、キレート剤としてＥＤＴＡのみを用いる場合、全てのカルシウムイオンをＥＤＴＡでキレート化しようとすれば、基礎希釈液に添加するＥＤＴＡの濃度を高くしなければならない。基礎希釈液には、カルシウムイオン以外のマグネシウムイオンや亜鉛イオン等、種々の二価イオンが含まれており、ＥＤＴＡの濃度が高すぎると、これらの二価イオンまで過剰にキレート化されるおそれがあり、精子機能（受精）に影響を及ぼしかねない。このため、ヒト凍結精子用希釈液は、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ双方を含有することが好ましい。

【0042】

更に、ｐＨ調整することによりヒト凍結精子用希釈液が得られる。例えば、上述したモデナ液（ｐＨ：７．４）にＥＧＴＡ等のキレート剤を添加すると、ｐＨが低下する。このため、ＮａＯＨ水溶液等のアルカリ溶液を添加し、ｐＨが上述した範囲の値となるよう調整すればよい。

【0043】

（ヒト凍結精子の希釈方法及びヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法）
続いて、ヒト凍結精子の希釈方法及びヒトの人工授精用精液等の調整方法について詳述する。

【0044】

まず、ヒト凍結精子は、以下のようにして凍結された凍結精子を用いるとよい。採取した精液をモデナ液等の希釈液で希釈し、射出から１５分以上液化した後、精漿から精子を分離する。精子をモデナ液等の希釈液に再浮遊し、１５℃程度まで温度を低下させる。そして、希釈液から精子を分離する。分離は遠心分離等で行えばよい。

【0045】

分離した精子に高浸透圧液を添加して混和し、２時間程度かけて５℃程度まで温度を下げる。このように高浸透圧処理することで、精子中の水分子を除去する。水分子は凍結の過程にて体積膨張し、これが精子にストレスを与えてしまうためである。高浸透圧液として、たとえば、スクロース等の糖を加えて、浸透圧が３００ｍＯｓｍ／ｋｇより高く５００ｍＯｓｍ／ｋｇより低い溶液を用いればよい。浸透圧が３００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下だと、脱水が不十分であり、水分子の凍結時による体積膨張が精子にストレスを与えてしまう。また、浸透圧が５００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上だと、精子の水分まで除去されて精子が死滅してしまう。なお、４００ｍＯｓｍ／ｋｇの高浸透圧液を用いることがより好ましい。

【0046】

高浸透圧処理し、更に、耐凍剤を添加した後に、精子を凍結することが好ましい。耐凍剤として、たとえば、グリセロールを用いることができる。具体的には、上記の高浸透圧液にグリセロールを添加した溶液を更に添加し、グリセロール平衡を行う。添加後のグリセロール濃度が２体積％より高く５体積％より低くなるよう調整し、グリセロール平衡は２０分間程度行う。グリセロール平衡後の混和物を所定容器に充填し凍結する。グリセロール濃度が２ｖ／ｖ％以下だと、精子の細胞膜が変質してしまう。また、５ｖ／ｖ％以上だと、融解後の運動性が低下する。なお、グリセロール濃度が３ｖ／ｖ％となるよう調節することがより好ましい。

【0047】

凍結方法について、精子を凍結可能であれば特に限定されず、一例として、液体窒素に浸漬して精子を凍結させる方法が挙げられる。液体窒素にて精子を凍結させる場合、直ちに浸漬せず、精子が充填された容器を液体窒素表面から少し離間させた箇所に固定し、所定時間予備凍結させた後、液体窒素中に浸漬して凍結、保管するとよい。

【0048】

上記のようにして凍結、保管しておいたヒト凍結精子を融解し、融解された精子とヒト凍結精子用希釈液とを速やかに混和する。ヒト凍結精子の融解は、例えば、ヒト凍結精子が充填された容器を３７℃程度の温湯に６０秒間程度浸漬するなど、種々の手法で行うことができる。そして、融解した精子を、例えば、３７℃程度に温度調整したヒト凍結精子用希釈液に添加し、混和する。精子とヒト凍結精子用希釈液とを混和した際に、ヒト凍結精子用希釈液に含まれているキレート剤がカルシウムイオンと結合して錯体を形成するので、カルシウムイオンが精子に作用することを抑制できる。これにより、精子が急激に運動して死滅することが抑制される。

【0049】

そして、融解開始後、所定時間以内に、融解した精子をヒト凍結精子用希釈液から分離するとよい。これにより、精子がＥＧＴＡ等のキレート化剤から分離される。凍結精子の融解時・融解直後に、急激にカルシウムイオンが精子に作用することを抑える必要がある一方、カルシウムイオンは精子の生存に欠かすことができない成分でもある。ヒト凍結精子の融解後、長時間に渡って、精子がカルシウムイオンを取り込めない状態が続けば、精子はカルシウムイオンの不足によって死滅してしまうためである。精子がＥＧＴＡ等のキレート化剤から分離されることで、その後、精子はカルシウムイオンを取り込むことが可能になり、精子の生存が担保される。精子とヒト凍結精子用希釈液との分離は、十分に混和させた後、速やかに行えばよく、融解開始から１５分以内に分離されることが好ましい。精子とヒト凍結精子用希釈液との分離は、遠心分離等により行い得る。遠心分離にて精子とヒト凍結精子用希釈液との分離を行う場合、精子にストレスがかからない回転数で行う。この場合、遠心分離は、４００Ｇで１０分程度行うことで分離できる。なお、後述の実施例にて示すように、特許文献１に開示のブタの凍結精子の融解、希釈、培養においては、キレート化剤を分離せずにそのまま培養しており、ブタの精子はその後も運動性を高く保っているが、ヒトの精子では、融解開始後、所定時間内にキレート化剤から分離しなければカルシウム不足により死滅してしまう。

【0050】

分離した精子を胚培養用培地に移して培養し、人工授精や体外受精に備えておけばよい。胚培養培地は、精子の生存に必要な成分が含まれた培地であり、この分野で通常用いられる培地であれば特に限定されない。

【0051】

ここで、体外受精とは、ヒトの体外で受精させることを言い、具体的には、ヒトから取り出された卵子に精液を滴下して受精させることや、顕微鏡下で、直接卵子に精液から選択した精子を注入することをいう。一方、人工受精とは、ヒトの体内に、別途、採取した精子又は採取後調整した精液を注入することをいう。

【0052】

また、凍結精子の融解後、直ちに融解した精子とヒト凍結精子用希釈液とが十分に混合するよう、凍結用のストロー（筒体）を用いて凍結させることが好ましい。一本の凍結用のストローに精子及びヒト凍結精子希釈液を充填したまま凍結させればよい。ここで、融解前に精子がヒト凍結精子用希釈液と混ざらないよう、精子とヒト凍結精子用希釈液との間に空気の層をつくって、それぞれをストローに充填、封入して凍結させるとよい。

【0053】

凍結させたストローを温浴に所定時間浸漬することで、ストロー中のヒト凍結精子及びヒト凍結精子用希釈液が融解され、速やかに精子とヒト凍結精子用希釈液が混ざる。これにより、カルシウムイオンが精子に作用することが速やかに抑制される。

【0054】

（高浸透圧処理の影響における融解後の精子運動性の検証）
採取した精液を精子と精漿に分離し、分離した精子を高浸透圧液で処理して凍結した精子を融解し、融解後の精子運動性を検証した。

【0055】

（実施例１）
ヒトから採取した精液をスポイト（ファルコンピペット７５７５）で遠沈管（ファルコンコニカルチューブ２０９５）に全量移し、量、液化状態、ゼリーの有無を確認した。

【0056】

精液をモデナ液（０．１５Ｍグルコース、２６．７ｍＭクエン酸ナトリウム、１１．９ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１５．１ｍＭクエン酸、６．３ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、４６．６ｍＭトリス、１，０００Ｕ／ｍＬペニシリン）で希釈し、射出から１５分以上液化した。その後、遠心分離（４００Ｇ、１０分間）にて精漿とモデナ液を除去し、分離した精子をモデナ液に再浮遊させ、１５℃へ低下させた。

【0057】

モデナ液を遠心分離（４００Ｇ、１０分間）にて除去し、精子を分離した。

【0058】

１５℃条件下で、分離した精子に分離した精子と同量の希釈液１を加え、十分に混和した。そして、２時間かけ、５℃に冷却した。なお、ここで用いた希釈液１は、浸透圧４００ｍＯｓｍ／ｋｇに調製したスクロース溶液に卵黄を２０％加えたものである。４００ｍＯｓｍ／ｋｇの高浸透圧液を用いて高浸透圧処理することで、精子から適度に脱水した。

【0059】

続いて、５℃条件下で、希釈液１及び精子の混和物に、混和物と等量の希釈液２を加えて混和した。そして、グリセロール平衡を２０分間行って精子を脱水した。なお、ここで用いた希釈液２は、上記の希釈液１（９．２５ｍＬ）に、界面活性剤としてＯＥＰ（Ｏｒｖｕｓ ＥＳ Ｐａｓｔｅ）（０．１５ｍＬ）、耐凍剤としてグリセロール（０．６ｍＬ）を混合し、グリセロール濃度３％（ｖ／ｖ）に調製した溶液である。調製した希釈液２も液温を５℃に低下させた後に用いた。

【0060】

上記のように調製した精子及び希釈液の混和物を凍結用のストローに適当量ずつ分注した。そして、ストローを液体窒素液面から４ｃｍ離間させたところに固定し、蒸気下に７分間置き、予備凍結を行った。その後、ストローを液体窒素中に浸漬し凍結保存した。

【0061】

液体窒素中から凍結ストローを取り出し、３７℃の温湯に５〜１０秒間浸漬して融解した。ストロー内の全量を遠沈管に移し、これに培養液を加え、遠心処理（４００Ｇ、１０分間）を行った。遠心処理後、上澄みを除去し、再度培養液を加えて遠心処理（４００Ｇ、１０分間）した。遠心処理後、上澄みを除去し、培養液を加え１ｍＬに調整し、培養した。なお、培養液は、Ｍｅｄｉｕｍ１９９（ＧＩＢＣＯ１１１５０）にＳｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ Ｓｕｐｐｌｅｍａｎｔ（Ｉ．Ｓ．ｊａｐａｎ）を１０％（ｖ／ｖ）添加したものである。

【0062】

融解直後、及び、融解６時間後の精子の運動率（精子運動性）を測定した。精子運動性は、マクラーチャンバー（Ｓｅｆｉ−Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて測定した。マクラーチャンバーに検体を２０μＬ滴下して、１０〜５０マスを３箇所以上測定し、カウントした精子数が２００以上になるよう測定した。精子運動性は、カウントした精子中の運動性ありの精子の割合であり、前進運動性のある精子を運動性ありの精子とした。

【0063】

（比較例１）
また、比較例として、これまでに行われてきた方法で精子の凍結・融解を行った。具体的には、以下に記すように、市販液である精子凍結用溶液を用い、市販液のプロトコールに従って凍結精子の作成及び凍結精子の融解を行い、融解後の精子運動性を測定した。

【0064】

採取した精液は、液化を待ってピペット（ファルコンピペット７５７５）で遠沈管（ファルコンコニカルチューブ２０９５）に全量を移し、量、液化状態、ゼリーの有無を確認した。

【0065】

精液に培養液を加えて混和し、遠心処理（２００Ｇ、１０分間）した。なお、培養液は、Ｍｅｄｉｕｍ１９９（ＧＩＢＣＯ１１１５０）にＳｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ Ｓｕｐｐｌｅｍａｎｔ（Ｉ．Ｓ．ｊａｐａｎ）を１０％（ｖ／ｖ）添加したものである。

【0066】

その後、上清を取り除き、ペレットにした。上清は混和し、遠心処理（２００Ｇ、１０分間）した。

【0067】

更に、上清を取り除き、上記ペレットに新たな培養液を加え、０．３ｍＬに調整した。

【0068】

０．３ｍＬに調整した精液を０．５ｍＬのバイアルに移し、培地として同量（０．５ｍＬ）のＦｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ−ＴＥＳＴ Ｙｏｌｋ Ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ Ｇｌｙｃｅｒｏｌを一滴ずつ滴下して加え、培地と精液を１：１（ｖ：ｖ）にした。なお、用いたＦｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ−ＴＥＳＴ Ｙｏｌｋ Ｂｕｆｆｅｒ ｗｉｔｈ Ｇｌｙｃｅｒｏｌの組成を以下に記す。
ＴＥＳ（Ｎ−ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
Ｔｒｉｓ（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）
Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ
Ｆｒｕｃｔｏｓｅ
Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ １０μｇ／ｍＬ
Ｇｌｙｃｅｒｏｌ １２％（ｖ／ｖ）
Ｅｇｇ ｙｏｌｋ ２０％（ｖ／ｖ）（非働化済み）

【0069】

培地と精液の混和物を３７℃から５℃までゆっくり冷却した（−０．５℃／ｍｉｎ）。冷却を開始して９０分程度経過した後、凍結用のケーンに適当量ずつ分注した。

【0070】

その後、ケーンを液体窒素液面から４ｃｍ離間させたところに固定し、蒸気下に７分間置き予備凍結した。その後、液体窒素中にケーンを浸漬し凍結保存した。

【0071】

実施例１と同様に、液体窒素中から凍結ケーンを取り出し、３７℃の温湯に浸漬し５分間融解した。ピペットを用い、ケーン内容物の全量を遠沈管に移し、これに上記の培養液を加え、遠心処理（４００Ｇ、１０分間）を行った。遠心処理後、上澄みを除去し、再度培養液を加えて遠心処理（４００Ｇ、１０分間）した。遠心処理後、上澄みを除去し、培養液を加え１ｍＬに調整し、培養した。

【0072】

実施例１と同様にマクラーチャンバーを用い、融解直後、及び、融解６時間後の精子運動性を測定した。

【0073】

図１に、実施例１及び比較例１において融解後の精子のそれぞれの精子運動性の測定結果を示す。

【0074】

融解直後、及び、融解６時間後のいずれにおいても、ヒト凍結精子用希釈液を用いて融解した実施例１の方が、比較例１よりも精子運動性が高い結果となった。実施例１では、精液から精漿を除去した精子を高浸透圧処理しているため、凍結時に精子にかかるストレスが緩和され、融解後にも運動性が高くなったものと考えられる。

【0075】

（特許文献１の希釈液並びに希釈方法でヒト凍結精子を融解、培養した精子運動性の検証）
続いて、特許文献１記載の希釈液及方法でヒト凍結精子を融解、培養し、融解後における精子運動性の検証を行った。特許文献１の希釈液及び方法は、主としてブタ等多胎動物の人工授精用の希釈液（以下、ブタ凍結精子用希釈液と記す）及び融解、培養方法である。

【0076】

（実験例）
実施例１と同様にして調製した精子及び希釈液の混和物を凍結用のストローに５０μＬ充填し、空気の層で隔て、更にブタ凍結精子用希釈液を５０μＬ充填し、封入した。

【0077】

なお、用いたブタ凍結精子用希釈液は、上述のモデナ液にＥＧＴＡを添加し、ＮａＯＨを滴下してｐＨ調整を行った液であり、ＥＧＴＡの最終濃度は６ｍＭ、ｐＨは７．４である。

【0078】

上述の混和物及びブタ凍結精子用希釈液を充填、封入したストローを液体窒素上面から４ｃｍ離間させて７分間予備凍結を行った後、液体窒素（−１９６℃）中に入れて保管した。

【0079】

凍結させたストローを液体窒素中から取り出し、３７〜４０℃の温湯に５〜１０秒間浸漬し、融解した。

【0080】

融解した精子が直ちにストロー中のブタ凍結精子用希釈液と混和するように、ストローから１５ｍＬ遠沈管（ファルコンコニカルチューブ２０９５）に移し、融解した精子をそのまま培養した。

【0081】

実施例１と同様にマクラーチャンバーを用い、融解６時間後、及び、融解２４時間後の精子運動性を測定した。

【0082】

（比較例２）
また、比較例として、ブタ凍結精子用希釈液の代わりに胚培養培地（ＨＦＦ９９（扶桑薬品工業株式会社製）にＳＳＳ（Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｉ．Ｓ．Ｊａｐａｎ製）を１０％（ｖ／ｖ）加えた溶液）を用いた以外、実験例と同様にしてヒト凍結精子を融解、培養した。

【0083】

そして、実施例１と同様にマクラーチャンバーを用い、融解６時間後、及び、融解２４時間後の精子運動性を測定した。

【0084】

図２に、実験例及び比較例２における融解後の精子運動性の測定結果を示す。

【0085】

実験例のブタ凍結精子用希釈液で融解、培養した精子の運動性は、比較例２のＨＦＦ９９にＳＳＳを加えた溶液で融解、培養した精子の運動性に比べ、融解６時間後及び２４時間後のいずれについても低い結果となった。このことから、融解後長時間に渡って、精子にカルシウムイオンが作用しない状態では、精子が死滅してしまうことがわかった。特許文献１のブタ凍結精子を融解する方法を、ヒト凍結精子にもそのまま適用すれば、精子の運動性が保たれないことがわかった。

【0086】

（凍結精子を融解してヒト凍結精子用希釈液と混和させた後、精子とヒト凍結精子用希釈液とを分離した場合の精子運動性の検証）
続いて、ヒト凍結精子を融解してヒト凍結精子用希釈液に混和させた後、精子をヒト凍結精子用希釈液から分離した場合における精子運動性を検証した。
（実施例２）
まず、モデナ液にＥＧＴＡを添加し、ＮａＯＨを滴下し、ｐＨ７．０のヒト凍結精子用希釈液を調製した。なお、このヒト凍結精子用希釈液のＥＧＴＡの最終濃度は６ｍＭである。

【0087】

そして、実施例１と同様の方法で、精子及び希釈液の混和物を凍結用のストローに充填し、凍結させた。

【0088】

凍結させたストローを液体窒素中から取り出し、３７〜４０℃の温湯に６０秒間浸漬し、融解した。そして、ストロー内容物を３７℃に予め加温したヒト凍結精子用希釈液の入った１５ｍＬ遠沈管に移した。

【0089】

その後、速やかに遠心分離（４００Ｇ、１０分間）を行い、精子とヒト凍結精子用希釈液とを分離した。そして、上澄みを除去し、分離した精子を胚培養用培地に入れて培養した。なお、胚培養用培地は、ＨＦＦ９９（扶桑薬品工業株式会社製）にＳＳＳ（Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｉ．Ｓ．Ｊａｐａｎ製）を１０％（ｖ／ｖ）添加した培地である。

【0090】

そして、凍結精子の融解１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に、精子運動性を測定した。精子運動性は実施例１と同様の手法で測定した。

【0091】

（比較例３）
また、精子とヒト凍結精子用希釈液との分離を行わない以外、実施例２と同様の方法で凍結精子を融解、培養し、精子運動性を測定した。

【0092】

実施例２及び比較例３の結果を図３に示す。精子をヒト凍結精子用希釈液から分離した実施例２では、融解１５分後において、凍結前とほぼ同等の運動性を示しており、融解３０分後、６０分後、１２０分後においても、運動性は高く保たれている。一方、精子をヒト凍結精子用希釈液から分離しなかった比較例３を見ると、凍結前に比べ、融解１５分後では運動性が半減しており、その後更に減少を続け、融解１２０分後ではほぼ消失している。

【0093】

この結果から、ヒト凍結精子を融解してヒト凍結精子用希釈液と混和させた後、速やかに精子をヒト凍結精子用希釈液から分離すれば、その後の精子運動性が高く保たれることがわかった。また、精子とヒト凍結精子用希釈液とを分離しなかった場合、融解後１５分経過すると、精子運動性が凍結前に比べて半減することから、融解開始後１５分以内に、精子をヒト凍結精子用希釈液から分離することが好ましいと考えられる。

【0094】

（ヒト凍結精子用希釈液のｐＨが精子運動性に及ぼす影響の検証）
続いて、異なるｐＨのヒト凍結精子用希釈液を調整して、融解したヒト凍結精子をこれらのヒト凍結精子用希釈液と混和させた後、精子をヒト凍結精子用希釈液から分離して培養し、融解後の精子運動性を測定することで、ヒト凍結精子用希釈液のｐＨが精子運動性に及ぼす影響を検証した。

【0095】

（実施例３）
まず、ｐＨの異なるヒト凍結精子用希釈液を調製した。上述のモデナ液にＥＧＴＡを添加し、ＮａＯＨを滴下してｐＨ調整を行い、ｐＨを６．５、６．７５、７．０、７．４の４種類のヒト凍結精子用希釈液を調製した。なお、ＥＧＴＡの最終濃度はいずれも６ｍＭである。

【0096】

そして、調製した異なるｐＨのヒト凍結精子用希釈液を用い、実施例２と同様の手法で、ヒト凍結精子の融解、希釈、培養を行った。そして、実施例１と同様に、マクラーチャンバーを用いて融解６時間後、及び、融解２４時間後の精子運動性を測定した。

【0097】

（比較例４）
また、比較例として、ヒト凍結精子用希釈液を用いず、比較例２と同様の手法によってヒト凍結精子を融解、培養を行った。そして、実施例１と同様にマクラーチャンバーを用い、融解６時間後、及び、融解２４時間後の精子運動性を測定した。

【0098】

実施例３及び比較例４における、融解６時間後の精子運動性を図４に、融解２４時間後の精子運動性を図５にそれぞれ示す。

【0099】

実施例３において、ｐＨが６．７５、７．０、７．４のヒト凍結精子用希釈液を用いた場合では、ＨＦＦを用いて凍結精子を融解、培養した場合（比較例４）に比べ、融解６時間後及び２４時間後のいずれについても、精子運動性が有意に上昇した。

【0100】

また、ｐＨが７．０のヒト凍結精子用希釈液を用いた場合、融解２４時間後でも精子運動性が高く保たれており、最も良好であった。ヒト凍結精子用希釈液のｐＨが７．０前後（ｐＨが６．９以上７．１以下程度）であれば、融解後時間を経ても高い精子運動性が保たれると考えられる。

【0101】

（受精能を有しているか否かの検証）
更に、ヒト凍結精子を融解してヒト凍結精子用希釈液に混和させた後、精子をヒト凍結精子用希釈液から分離して培養した場合に、精子が受精能を有しているか否かを検証した。

【0102】

同一被験者の精子を用い、実験例と同様の方法で凍結精子を作成し、以下の実施例４及び比較例５それぞれに供した。被験者は二人（Ｐａｔｉｅｎｔ ｎｕｍｂｅｒ １，２）である。

【0103】

（実施例４）
実施例２と同様の方法で、ヒト凍結精子を融解してヒト凍結精子用希釈液と混和し、その後、精子をヒト凍結精子用希釈液から分離した。なお、用いたヒト凍結精子用希釈液のｐＨは７、ＥＧＴＡの最終濃度は６ｍＭである。

【0104】

分離した精子を、４ｍＭ ｃａｆｆｅｉｎ添加胚培養培地（Ｃａｆ）、及び、無添加胚培養培地（ｆｒｅｅ）にてそれぞれ培養した。

【0105】

６０分培養後、遠心操作で精子を回収し、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝液）で溶解し、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行い、ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ポリフッ化ビニリデン膜）に転写後、抗Ｔｙｒリン酸化抗体で、精子タンパク質のチロシン残基のリン酸化の程度を検出した。

【0106】

（比較例５）
比較例２と同様の方法で、ヒト凍結精子の融解し、培養を行った。そして、実施例４と同様の方法で、精子タンパク質のチロシン残基のリン酸化の程度を検出した。

【0107】

実施例４及び比較例５におけるチロシン残基のリン酸化バンドの検出結果を図６に示す。精子においては、タンパク質のチロシン残基がリン酸化されるか否かが、受精能を有しているか否かを判断する指標の一つである。タンパク質のチロシン残基はカフェインが介在するとリン酸化され、リン酸化バンドが検出されれば、精子が受精能を有していることを確認できる。

【0108】

比較例５では、ｆｒｅｅ及びＣａｆいずれについても薄いチロシンリン酸化バンドが出現しているだけであり、比較例５の精子は受精能をさほど有していない。一方、実施例４を見ると、いずれの被験者についても、ｆｒｅｅに比べて、Ｃａｆでは濃いチロシンリン酸化バンドが出現しており、実施例４の精子は十分な受精能を有していることがわかる。

【0109】

このように、ヒト凍結精子を融解して時間が経過した後でも、融解された精子は運動性を高く保ち、且つ、十分な受精能を有していることから、体外受精だけでなく人工授精においても妊娠率の向上が期待できる。

【0110】

なお、本発明は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

【0111】

本出願は、２０１０年１１月９日に出願された日本国特許出願２０１０−２５１３４２号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１０−２５１３４２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

【産業上の利用可能性】

【0112】

ヒト凍結精子用希釈液はカルシウムイオンと錯体を形成するキレート剤を含有し、ｐＨが６．７５以上７．４未満である。ヒト凍結精子の融解時・融解直後に、カルシウムイオンが大量に精子に作用することが抑制される。これにより、融解時・融解直後にカルシウムイオンが作用して精子が急激に運動し、死滅することが抑制され、融解後、長時間に渡って精子の運動性が保たれる。このため、人工授精や体外受精等に利用でき、そして妊娠率の向上が期待できる。

【0113】

また、ヒト凍結精子の希釈方法及びヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法では、ヒト凍結精子を融解して上記ヒト凍結用希釈液と混和している。そして、ヒト凍結精子の融解開始から所定時間以内に、融解した精子をヒト凍結精子用希釈液から分離することにより、ヒトの人工授精用精液等を得ている。融解時・融解直後に急激に精子にカルシウムイオンが作用することを抑えるとともに、混和後、ヒト凍結精子用希釈液から融解した精子を分離することで、その後の精子の活性に必要なカルシウムの供給が可能となる。このようにして得られたヒトの人工授精用精液等は、長時間に渡って精子の活性が保たれるので、人工授精に用いることが可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】