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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5929910
(24)【登録日】2016年5月13日
(45)【発行日】2016年6月8日
(54)【発明の名称】改良型ニトリルヒドラターゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 9/88 20060101AFI20160526BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20160526BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20160526BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20160526BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20160526BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20160526BHJP
C12P 13/02 20060101ALI20160526BHJP
【ＦＩ】
C12N9/88
C12N15/00 AZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P13/02
【請求項の数】13
【全頁数】61
(21)【出願番号】特願2013-519392(P2013-519392)
(86)(22)【出願日】2012年6月7日
(86)【国際出願番号】JP2012003745
(87)【国際公開番号】WO2012169203
(87)【国際公開日】20121213
【審査請求日】2014年12月2日
(31)【優先権主張番号】特願2011-127466(P2011-127466)
(32)【優先日】2011年6月7日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2011-144378(P2011-144378)
(32)【優先日】2011年6月29日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2011-145061(P2011-145061)
(32)【優先日】2011年6月30日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000006035
【氏名又は名称】三菱レイヨン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100105991
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 玲子
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(72)【発明者】
【氏名】渡辺 文昭
(72)【発明者】
【氏名】原 あい
(72)【発明者】
【氏名】安保 貴永
(72)【発明者】
【氏名】北原 彩
【審査官】
川口 裕美子
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００４／０５６９９０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１０／０５５６６６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Hiromi TAKARADA et al.，Mutational Study on αGln90 of Fe-Type Nitrile Hydratase from Rhodococcus sp. N771 ，Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry ，２００６年，Vol. 70 No. 4 ，P881-889
【文献】
Nitrile hydratases (NHases): At the interface of academia and industry，Biotechnology Advances，２０１０年，Volume 28, Issue 6，Pages 725-741
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ ９／８８
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／０９
Ｃ１２Ｐ １３／０２
ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも一つの特徴を有し、かつ、野生型よりも高い触媒活性を有する改良型ニトリルヒドラターゼ。
（ａ）βサブユニットにおいて、Ｎ末端から数えて４４〜５２番目に配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
ＧＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＤＸ5Ｘ6Ｒ（配列番号５０）
（Ｇはグリシン、Ｄはアスパラギン酸、Ｒはアルギニンを表す）
Ｘ1がイソロイシンまたはメチオニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がトリプトファン、Ｘ5がリジン、Ｘ6がセリンであり、
Ｘ4が、グルタミン酸、メチオニン、アスパラギン、およびプロリンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ
（ｂ）βサブユニットにおいて、Ｎ末端から数えて２９〜４９番目に配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
ＷＥＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15Ｘ
16Ｘ17Ｘ18Ｄ（配列番号８１）
（Ｗはトリプトファン、Ｅはグルタミン酸、Ｄはアスパラギン酸を表す）
Ｘ1がグリシン、Ｘ2がアルギニン、Ｘ3がスレオニン、Ｘ4がロイシン、Ｘ5がセリン、Ｘ6がイソロイシン、Ｘ8がスレオニン、Ｘ9がトリプトファン、Ｘ10がメチオニン、Ｘ11がヒスチジン、Ｘ12がロイシン、Ｘ13がリジン、Ｘ14がグリシン、Ｘ15がイソロイシンまたはメチオニン、Ｘ16がセリン、Ｘ17がトリプトファン、Ｘ18がトリプトファンであり、
Ｘ7が、アラニン、バリン、アスパラギン酸、スレオニン、フェニルアラニン、イソロイシンおよびメチオニンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
（ｃ）αサブユニットにおいて、Ｎ末端から数えて７３〜８３番目に配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
ＡＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＧＸ5Ｘ6ＧＸ7Ｘ8（配列番号１１９）
（Ａはアラニン、Ｇはグリシンを表す）
Ｘ1がメチオニン、Ｘ2がアラニン、Ｘ3がセリン、Ｘ4がロイシン、Ｘ5がチロシン、Ｘ6がアラニン、Ｘ7がグルタミン酸であり、
Ｘ8が、アラニン、メチオニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、プロリン、セリン、およびスレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
（ｄ）αサブユニットにおいて、Ｎ末端から数えて７３〜８３番目に配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
Ｘ1がメチオニン、Ｘ2がアラニン、Ｘ3がセリン、Ｘ4がロイシン、Ｘ5がチロシン、Ｘ6がアラニンであり、
Ｘ7がシステイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、スレオ二ン、およびチロシンよりなる群から選択されるアミノ酸に置換されたことを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
ＡＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＧＸ5Ｘ6ＧＸ7Ｑ（配列番号１３２）
（Ａはアラニン、Ｇはグリシン、Ｑはグルタミンを表す）
（ｅ）αサブユニットにおいて、Ｎ末端から数えて７３〜８５番目に配列番号１３６に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
Ｘ1がメチオニン、Ｘ2がアラニン、Ｘ3がセリン、Ｘ4がロイシン、Ｘ5がチロシン、Ｘ6がアラニン、Ｘ7がグルタミン酸、Ｘ8がアラニンであり、
Ｘ9がシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、およびチロシンよりなる群から選択されるアミノ酸に置換されたことを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
ＡＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＧＸ5Ｘ6ＧＸ7ＱＸ8Ｘ9（配列番号１３６）
（Ａはアラニン、Ｇはグリシン、Ｑはグルタミンを表す）
（ａ）βサブユニットにおいて、Ｎ末端から数えて４４〜５２番目に配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
ＧＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＤＸ5Ｘ6Ｒ（配列番号５０）
（Ｇはグリシン、Ｄはアスパラギン酸、Ｒはアルギニンを表す）
Ｘ1がイソロイシンまたはメチオニン、Ｘ2がセリン、Ｘ3がトリプトファン、Ｘ5がリジン、Ｘ6がセリンであり、
Ｘ4が、グルタミン酸、メチオニン、アスパラギン、およびプロリンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ
（ｂ）βサブユニットにおいて、Ｎ末端から数えて２９〜４９番目に配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
ＷＥＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15Ｘ
16Ｘ17Ｘ18Ｄ（配列番号８１）
（Ｗはトリプトファン、Ｅはグルタミン酸、Ｄはアスパラギン酸を表す）
Ｘ1がグリシン、Ｘ2がアルギニン、Ｘ3がスレオニン、Ｘ4がロイシン、Ｘ5がセリン、Ｘ6がイソロイシン、Ｘ8がスレオニン、Ｘ9がトリプトファン、Ｘ10がメチオニン、Ｘ11がヒスチジン、Ｘ12がロイシン、Ｘ13がリジン、Ｘ14がグリシン、Ｘ15がイソロイシンまたはメチオニン、Ｘ16がセリン、Ｘ17がトリプトファン、Ｘ18がトリプトファンであり、
Ｘ7が、アラニン、バリン、アスパラギン酸、スレオニン、フェニルアラニン、イソロイシンおよびメチオニンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
（ｃ）αサブユニットにおいて、Ｎ末端から数えて７３〜８３番目に配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
ＡＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＧＸ5Ｘ6ＧＸ7Ｘ8（配列番号１１９）
（Ａはアラニン、Ｇはグリシンを表す）
Ｘ1がメチオニン、Ｘ2がアラニン、Ｘ3がセリン、Ｘ4がロイシン、Ｘ5がチロシン、Ｘ6がアラニン、Ｘ7がグルタミン酸であり、
Ｘ8が、アラニン、メチオニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、プロリン、セリン、およびスレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
（ｄ）αサブユニットにおいて、Ｎ末端から数えて７３〜８３番目に配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
Ｘ1がメチオニン、Ｘ2がアラニン、Ｘ3がセリン、Ｘ4がロイシン、Ｘ5がチロシン、Ｘ6がアラニンであり、
Ｘ7がシステイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、スレオ二ン、およびチロシンよりなる群から選択されるアミノ酸に置換されたことを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
ＡＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＧＸ5Ｘ6ＧＸ7Ｑ（配列番号１３２）
（Ａはアラニン、Ｇはグリシン、Ｑはグルタミンを表す）
（ｅ）αサブユニットにおいて、Ｎ末端から数えて７３〜８５番目に配列番号１３６に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
Ｘ1がメチオニン、Ｘ2がアラニン、Ｘ3がセリン、Ｘ4がロイシン、Ｘ5がチロシン、Ｘ6がアラニン、Ｘ7がグルタミン酸、Ｘ8がアラニンであり、
Ｘ9がシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、およびチロシンよりなる群から選択されるアミノ酸に置換されたことを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
ＡＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＧＸ5Ｘ6ＧＸ7ＱＸ8Ｘ9（配列番号１３６）
（Ａはアラニン、Ｇはグリシン、Ｑはグルタミンを表す）
【請求項2】
前記配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼが、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項3】
前記配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼが、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項4】
前記配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼが、配列番号１２０に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項5】
前記配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼが、配列番号１３１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項6】
前記配列番号１３６に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼが、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項7】
前記ニトリルヒドラターゼが、ロドコッカス属細菌又はノカルジア属細菌由来である、請求項１〜６のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項8】
請求項１〜７のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡ。
【請求項9】
請求項８に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項10】
請求項９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項11】
請求項１０に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から採取されるニトリルヒドラターゼ。
【請求項12】
請求項１０に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項13】
請求項１〜７のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ又は請求項１０に記載の形質転換体を培養して得られる培養物、若しくは当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させることを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、改良型（変異型）ニトリルヒドラターゼ、及びその製造方法に関する。さらには、当該酵素をコードする遺伝子ＤＮＡ、当該遺伝子ＤＮＡを含む組換えベクター、及び当該組換えベクターを有する形質転換体、並びにアミド化合物の製造方法に関する。【背景技術】
【0002】
近年、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、当該酵素又は当該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が開示されている。この製造方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことで知られている。【0003】
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、クレビシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属等に属する微生物を挙げることができる。中でもロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株はアクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている（特許文献１参照）。【0004】
一方、自然界に存在する微生物から単離したニトリルヒドラターゼやその遺伝子を利用するのみならず、ニトリルヒドラターゼに対して、活性、基質特異性、Ｖｍａｘ、Ｋｍ、熱安定性、基質に対する安定性、生成物に対する安定性等を変化させる目的でニトリルヒドラターゼに変異を導入することが試みられており、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５のニトリルヒドラターゼにおいては、立体構造情報から基質特異性や熱安定性に関与する領域を予測し、それらの中から基質特異性の変化した変異酵素を取得している（特許文献２〜４参照）。また、本発明者らによって耐熱性又はアミド化合物耐性を共に向上させたニトリルヒドラターゼ遺伝子が取得されている（特許文献５〜９参照）。【0005】
酵素法を利用し工業的にアクリルアミドを生産する上で、触媒活性が向上したニトリルヒドラターゼを開発することは、触媒コスト等の生産コストの観点などから非常に有用であり、特に活性の向上した酵素の取得は、反応時の酵素量の削減及びコスト削減等の観点から開発が望まれている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第３１６２０９１号公報
【特許文献2】国際公開第２００４／０５６９９０号パンフレット
【特許文献3】特開２００４−１９４５８８号公報
【特許文献4】特開２００５−１６４０３号公報
【特許文献5】国際公開第２００５／１１６２０６号パンフレット
【特許文献6】特開２００７−１４３４０９号公報
【特許文献7】特開２００７−４３９１０号公報
【特許文献8】特開２００８−２５３１８２号公報
【特許文献9】特開２０１０−１７２２９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
そこで、本発明の目的は、ニトリルヒドラターゼの改良により、触媒活性が向上した改良型ニトリルヒドラターゼを提供することである。また、本発明の目的は、当該改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、当該形質転換体の培養物から採取されるニトリルヒドラターゼ及びその製造方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、当該培養物又は当該培養物の処理物を用いたアミド化合物の製造方法を提供することにある。【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列のうち、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したタンパク質が、ニトリルヒドラターゼ活性を有するとともに、触媒活性が向上したものであることを見出し、本発明を完成するに至った。【0009】
すなわち、本発明は以下の通りである。（１）下記（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも一つの特徴を有する改良型ニトリルヒドラターゼ。
（ａ）βサブユニットにおいて、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
ＧＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＤＸ５Ｘ６Ｒ（配列番号５０）
（Ｇはグリシン、Ｄはアスパラギン酸、Ｒはアルギニンを表し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表す）
Ｘ４が、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリンおよびスレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ
（ｂ）βサブユニットにおいて、配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
ＷＥＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｄ（配列番号８１）
（Ｗはトリプトファン、Ｅはグルタミン酸、Ｄはアスパラギン酸、Ｘ１〜Ｘ６およびＸ８〜Ｘ１８はそれぞれ独立した任意のアミノ酸残基を表す）
Ｘ７が、アラニン、バリン、アスパラギン酸、スレオニン、フェニルアラニン、イソロイシンおよびメチオニンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
（ｃ）αサブユニットにおいて、配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、
ＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６ＧＸ７Ｘ８（配列番号１１９）
（Ａはアラニン、Ｇはグリシン、Ｘ１〜Ｘ７はそれぞれ独立した任意のアミノ酸残基を表す）
Ｘ８が、アラニン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、アルギニン、セリン、スレオニン、トリプトファンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
（ｄ）αサブユニットにおいて、配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、Ｘ７が野生型とは別のアミノ酸に置換されたことを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
ＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６ＧＸ７Ｑ（配列番号１３２）
（Ａはアラニン、Ｇはグリシン、Ｑはグルタミン、Ｘ１〜Ｘ６はそれぞれ独立した任意のアミノ酸残基を表す）
（ｅ）αサブユニットにおいて、配列番号１３６に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、Ｘ９が野生型とは別のアミノ酸に置換されたことを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
ＡＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６ＧＸ７ＱＸ８Ｘ９（配列番号１３６）
（Ａはアラニン、Ｇはグリシン、Ｑはグルタミン、Ｘ１〜Ｘ８はそれぞれ独立した任意のアミノ酸残基を表す）
（２）配列番号５０のＸ２が、Ｓ（セリン）であることを特徴とする、（１）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（３）配列番号５０のＸ１がＩ（イソロイシン）、Ｘ２がＳ（セリン）、Ｘ３がＷ（トリプトファン）、Ｘ５がＫ（リジン）、Ｘ６がＳ（セリン）であることを特徴とする、（１）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（４）前記配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼが、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（５）配列番号８１のＸ１４がＧ（グリシン）であることを特徴とする、（１）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（６）配列番号８１のＸ１がＧ（グリシン）、Ｘ２がＲ（アルギニン）、Ｘ３がＴ（スレオニン）、Ｘ４がＬ（ロイシン）、Ｘ５がＳ（セリン）、Ｘ６がＩ（イソロイシン）、Ｘ８がＴ（スレオニン）、Ｘ９がＷ（トリプトファン）、Ｘ１０がＭ（メチオニン）、Ｘ１１がＨ（ヒスチジン）、Ｘ１２がＬ（ロイシン）、Ｘ１３がＫ（リジン）、Ｘ１４がＧ（グリシン）であることを特徴とする（１）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（７）前記配列番号８１に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼが、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を有する、（１）、（５）および（６）のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（８）配列番号１１９のＸ１がＭ（メチオニン）、Ｘ２がＡ（アラニン）、Ｘ３がＳ（セリン）、Ｘ４がＬ（ロイシン）、Ｘ５がＹ（チロシン）、Ｘ６がＡ（アラニン）、Ｘ７がＥ（グルタミン酸）であることを特徴とする、（１）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（９）前記配列番号１１９に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼが、配列番号１２０に示されるアミノ酸配列を有する、（１）または（８）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（１０）αサブユニットにおいて、配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、Ｘ７がシステイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、チロシンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする、（１）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（１１）配列番号１３２のＸ１がＭ（メチオニン）、Ｘ２がＡ（アラニン）、Ｘ３がＳ（セリン）、Ｘ４がＬ（ロイシン）、Ｘ５がＹ（チロシン）、Ｘ６がＡ（アラニン）であることを特徴とする、（１）または（１０）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（１２）前記配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼが、配列番号１３１に示されるアミノ酸配列を有する、（１）、（１０）および（１１）のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（１３）αサブユニットにおいて、配列番号１３６に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼであって、Ｘ９がシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、チロシンよりなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする（１）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（１４）配列番号１３６のＸ１がＭ（メチオニン）、Ｘ２がＡ（アラニン）、Ｘ３がＳ（セリン）、Ｘ４がＬ（ロイシン）、Ｘ５がＹ（チロシン）、Ｘ６がＡ（アラニン）、Ｘ７がＥ（グルタミン酸）、Ｘ８がＡ（アラニン）であることを特徴とする、（１）または（１３）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（１５）前記配列番号１３６に示されるアミノ酸配列を含むニトリルヒドラターゼが、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を有する、（１）、（１３）および（１４）のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（１６）前記ニトリルヒドラターゼが、ロドコッカス属細菌又はノカルジア属細菌由来である、（１）〜（１５）のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
（１７）（１）〜（１６）のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡ。
（１８）（１７）に記載のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（１９）（１７）または（１８）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（２０）（１９）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（２１）（２０）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から採取されるニトリルヒドラターゼ。
（２２）（２０）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
（２３）（１）〜（１６）のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ又は（２０）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物、若しくは当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させることを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、触媒活性が向上した、新規な改良型（変異型）ニトリルヒドラターゼを提供することができる。触媒活性が向上した改良型ニトリルヒドラターゼは、アミド化合物の製造上非常に有用である。【0011】
本発明によれば、さらに、上記改良型ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ、当該遺伝子ＤＮＡを含む組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、当該形質転換体の培養物から採取されるニトリルヒドラターゼ及びその製造、並びに前記タンパク質（改良型ニトリルヒドラターゼ）又は、当該培養物若しくは当該培養物の処理物を用いたアミド化合物の製造方法を提供することができる。【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】プラスミドｐＳＪ０３４の構成図である。
【図2-1】既知のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアライメント結果を示す図である。
【図2-2】既知のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアライメント結果を示す図である。
【図3】配列番号５１で示される、本発明のβサブユニットのアミノ酸配列である。
【図4】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図5】プラスミドｐＥＲ８５５Ａの構成図である。
【図6-1】各種微生物由来の野生型ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列（Ｎ末端側の一部）を示す図である。
【図7】配列番号８２で示される、本発明のβサブユニットのアミノ酸配列である。
【図8-1】各種微生物由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列（Ｎ末端側の一部）を示す図である。
【図9】配列番号１２１で示される、本発明のαサブユニットのアミノ酸配列である
【図10-1】各種微生物由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列（Ｎ末端側の一部）を示す図である。
【図11】配列番号１３１で示される、本発明のαサブユニットのアミノ酸配列である。
【図12-1】各種微生物由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列（Ｎ末端側の一部）を示す図である。
【図13】配列番号１３５で示される、本発明のαサブユニットのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下に、本発明を詳細に説明する。１．ニトリルヒドラターゼ
（ａ）既知のニトリルヒドラターゼ
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、既知のニトリルヒドラターゼの改良型であり、その由来は特に限定されるものではない。例えば、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ＣＭＤ＝ｓｅａｒｃｈ＆ＤＢ＝ｐｒｏｔｅｉｎ）においてニトリルヒドラターゼとして登録されているものや、公知文献でニトリルヒドラターゼについて記載されているものがあればそれを参考にしてもよい。例えば、特許文献５〜９（参照することにより、本明細書に取り込まれる）に記載されたニトリルヒドラターゼを示すことができる。特許文献５〜９のニトリルヒドラターゼは耐熱性やアクリルアミド耐性を有しており、本発明のアミノ酸置換の付加により、触媒活性の向上という性質を付加することができる。具体的には、配列番号５３〜５７のアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼを挙げることができる。
【0014】
また、上記アミノ酸配列をコードする遺伝子から公知の方法を用いて変異を導入し、所望の性能を有する変異酵素を評価・選抜する事で、さらに性能向上した改良酵素を取得することができる。具体的には配列番号５８〜６１のアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼを挙げることができる。【0015】
「ニトリルヒドラターゼ」は、αサブユニット及びβサブユニットのドメインが集合してなる高次構造をとり、補欠分子として非ヘム鉄原子、又は非コリン核コバルト原子を有している。これらのニトリルヒドラターゼは、それぞれ鉄型ニトリルヒドラターゼ及びコバルト型ニトリルヒドラターゼという呼称で区別されている。【0016】
鉄型ニトリルヒドラターゼとしては、ロドコッカス属Ｎ−７７１株由来のものをその代表例として挙げることができる。この鉄型ニトリルヒドラターゼは、Ｘ線結晶構造解析がなされ、その立体構造が明らかになっている。その結果、当該酵素は、活性中心を形成するαサブユニットのシステインクラスター（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ）（配列番号４８）中の４つのアミノ酸残基を介して非へム鉄と結合している。【0017】
コバルト型ニトリルヒドラターゼとしては、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株（以下「Ｊ１菌」と称する場合がある）由来のもの、又はシュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来のものを代表例として挙げることができる。【0018】
Ｊ１菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼは、活性中心を形成するαサブユニットのシステインクラスター（Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ）（配列番号４９）で示される領域を介してコバルト原子と結合している。なお、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのシステインクラスターは、上記Ｊ１菌由来のシステインクラスターにおける上流側（Ｎ末端側）から第４番目のシステイン（Ｃｙｓ）がシステインスルフィン酸（Ｃｓｉ）であり、最も下流側（Ｃ末端側）の第６番目のシステイン（Ｃｙｓ）がシステインスルフェン酸（Ｃｓｅ）である。【0019】
上述の通り、補欠分子は、αサブユニット中のシステインクラスター「Ｃ（Ｓ／Ｔ）ＬＣＳＣ」（配列番号４８、４９）で表される領域と結合している。このような補欠分子結合領域を含むニトリルヒドラターゼとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）、ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４）、ロドコッカス・ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ Ａｃ−１５１５Ｄ）、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ３９４８４（特開２００１−２９２７７２）、バチルス・スミシ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）（特開平９−２４８１８８）、シュードノカルディア・サーモフィラ（特開平９−２７５９７８） 又はジオバチルス・サーモグルコシダシアス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）由来のアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ及び遺伝子配列でコードされるニトリルヒドラターゼが挙げられる。【0020】
一方、βサブユニットの機能については構造の安定性に関与していると考えられている。【0021】
例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）由来のαサブユニットは、アミノ酸配列が配列番号４で示され、塩基配列が配列番号３で示される。また、βサブユニットはアミノ酸配列が配列番号２で示され、塩基配列が配列番号１で示され、アクセッション番号は「Ｐ２１２２０」である。また、ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４）由来のαサブユニットのアクセッション番号は「ＡＴＴ７９３４０」であり、βサブユニットのアクセッション番号は「ＡＡＴ７９３３９」である。ロドコッカス・ピリジノボランスＭＷ３由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子のアクセッション番号はＡＪ５８２６０５、ロドコッカス・ピリジノボランスＳ８５−２由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子のアクセッション番号はＡＪ５８２６０５、ロドコッカス・ルーバーＲＨ（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３８０）のニトリルヒドラターゼ遺伝子はＣＮ１０１４６３３５８に記載されている。さらに、ノカルジア・ＹＳ−２００２由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子はアクセッション番号「Ｘ８６７３７」であり、ノカルジア ｓｐ．ＪＢＲｓ由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子はアクセッション番号「ＡＹ１４１１３０」である。【0022】
（ｂ−１）改良型ニトリルヒドラターゼ（β４８）各種微生物由来の既知のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸（一文字表記）配列のアライメントを、図２−１および２−２に示した。なお、図２−１、２−２のそれぞれにおいて、各アミノ酸配列は、上から順に、配列番号２、５〜１２および４２〜４７を示す。
【0023】
さらに、本発明の改良型ニトリルヒドラターゼには、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を除く既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加された改良型ニトリルヒドラターゼも含まれる。【0024】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの一例としては、図３に示すように、βサブユニットが配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここでは、Ｎ末端から数えて４４番目〜５２番目に、配列番号５０で示されるアミノ酸配列が存在する。【0025】
一つの実施態様では、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ４は、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリンおよびスレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0026】
また、他の実施態様では、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６はそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＳ（セリン）であり、Ｘ４は、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリンおよびスレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0027】
さらに、他の実施態様では、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１がＩ（イソロイシン）、Ｘ２がＳ（セリン）、Ｘ３がＷ（トリプトファン）、Ｘ５がＫ（リジン）、Ｘ６がＳ（セリン）であり、Ｘ４は、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリンおよびスレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0028】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの他の一例としては、配列番号２で示される既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、βサブユニットの４８番目のアミノ酸残基（トリプトファン）が、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、またはスレオニンに置換したものが挙げられる。【0029】
このようなアミノ酸置換の態様の表記例としては、Ｗβ４８Ｃ、Ｗβ４８Ｄ、Ｗβ４８Ｅ、Ｗβ４８Ｈ、Ｗβ４８Ｉ、Ｗβ４８Ｋ、Ｗβ４８Ｍ、Ｗβ４８Ｎ、Ｗβ４８Ｐ、Ｗβ４８Ｑ、Ｗβ４８Ｓ、Ｗβ４８Ｔが挙げられる。尚、アミノ酸のアルファベット表記は通常の１文字で表すことができ、置換箇所までのアミノ酸残基数を表す数字（例えば「４８」）の左側に表示したアルファベットは、置換前のアミノ酸の１文字表記を示し、右側に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の１文字表記を示している。【0030】
具体的には、配列番号２に示すβサブユニットのアミノ酸配列に関して、「Ｗβ４８Ｃ」と表記した場合は、βサブユニットのアミノ酸配列（配列番号２）のうちＮ末端のアミノ酸残基から数えて（当該Ｎ末端のアミノ酸残基を含めて数えて）４８番目のトリプトファイン（Ｗ）がシステイン（Ｃ）に置換された改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様を意味する。【0031】
本発明のより好ましい改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様は、それぞれ以下の１〜１２の表記で表すことができる。１． Ｗβ４８Ｃ
２． Ｗβ４８Ｄ
３． Ｗβ４８Ｅ
４． Ｗβ４８Ｈ
５． Ｗβ４８Ｉ
６． Ｗβ４８Ｋ
７． Ｗβ４８Ｍ
８． Ｗβ４８Ｎ
９． Ｗβ４８Ｐ
１０． Ｗβ４８Ｑ
１１． Ｗβ４８Ｓ
１２． Ｗβ４８Ｔ
上記アミノ酸置換を生じさせるための塩基置換としては、以下の態様が好ましく挙げられる。
【0032】
Ｗβ４８Ｃ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＴＧＣに置換させること（ＴＧＧ→ＴＧＣ）が好ましい。Ｗβ４８Ｄ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＧＡＣに置換させること（ＴＧＧ→ＧＡＣ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｅ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＧＡＧに置換させること（ＴＧＧ→ＧＡＧ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｆ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＴＴＣに置換させること（ＴＧＧ→ＴＴＣ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｈ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＣＡＣに置換させること（ＴＧＧ→ＣＡＣ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｉ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＡＴＣに置換させること（ＴＧＧ→ＡＴＣ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｋ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＡＡＧに置換させること（ＴＧＧ→ＡＡＧ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｍ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＡＴＧに置換させること（ＴＧＧ→ＡＴＧ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｎ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＡＡＣに置換させること（ＴＧＧ→ＡＡＣ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｐ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＣＣＧに置換させること（ＴＧＧ→ＣＣＧ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｑ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＣＡＧに置換させること（ＴＧＧ→ＣＡＧ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｓ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＴＣＣに置換させること（ＴＧＧ→ＴＣＣ）が好ましい。
Ｗβ４８Ｔ：塩基配列ＴＧＧ（配列番号１における１４２〜１４４番目に位置する）をＡＣＣに置換させること（ＴＧＧ→ＡＣＣ）が好ましい。
【0033】
（ｂ−２）改良型ニトリルヒドラターゼ（β３７）各種微生物由来の既知のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸（一文字表記）配列のアライメントを、図６−１および６−２に示した。なお、図６−１、６−２のそれぞれにおいて、各アミノ酸配列は、上から順に、配列番号２、５〜１２、４２〜４９を示す。
【0034】
さらに、本発明の改良型ニトリルヒドラターゼには、配列番号８１で示されるアミノ酸配列を除く既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加された改良型ニトリルヒドラターゼも含まれる。【0035】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの一例としては、図７に示すように、βサブユニットが配列番号８２に示されるアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここでは、Ｎ末端から数えて２９番目〜４９番目に、配列番号８１で示されるアミノ酸配列が存在する。【0036】
一つの実施態様では、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１〜Ｘ６およびＸ８〜Ｘ１８はそれぞれ独立した任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ７は、アラニン、バリン、アスパラギン酸、スレオニン、フェニルアラニン、イソロイシンおよびメチオニンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0037】
また、他の実施態様では、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１〜Ｘ６、Ｘ８〜Ｘ１３およびＸ１５〜Ｘ１８はそれぞれ独立した任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ１４はＧ（グリシン）であり、Ｘ７は、アラニン、バリン、アスパラギン酸、スレオニン、フェニルアラニン、イソロイシンおよびメチオニンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0038】
さらに、他の実施態様では、配列番号８２に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１５〜Ｘ１８はそれぞれ独立した任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ１がＧ（グリシン）、Ｘ２がＲ（アルギニン）、Ｘ３がＴ（スレオニン）、Ｘ４がＬ（ロイシン）、Ｘ５がＳ（セリン）、Ｘ６がＩ（イソロイシン）、Ｘ８がＴ（スレオニン）、Ｘ９がＷ（トリプトファン）、Ｘ１０がＭ（メチオニン）、Ｘ１１がＨ（ヒスチジン）、Ｘ１２がＬ（ロイシン）、Ｘ１３がＫ（リジン）、Ｘ１４がＧ（グリシン）であり、Ｘ７は、アラニン、バリン、アスパラギン酸、スレオニン、フェニルアラニン、イソロイシンおよびメチオニンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0039】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの他の一例としては、配列番号２で示される既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、βサブユニットの３７番目のアミノ酸残基（ロイシン）が、アラニン、バリン、アスパラギン酸、スレオニン、フェニルアラニン、イソロイシンまたはメチオニンに置換したものが挙げられる。【0040】
このようなアミノ酸置換の態様の表記例としては、Ｌβ３７Ａ、Ｌβ３７Ｄ、Ｌβ３７Ｆ、Ｌβ３７Ｉ、Ｌβ３７Ｍ、Ｌβ３７Ｔ、Ｌβ３７Ｖが挙げられる。尚、アミノ酸のアルファベット表記は通常の１文字で表すことができ、置換箇所までのアミノ酸残基数を表す数字（例えば「３７」）の左側に表示したアルファベットは、置換前のアミノ酸の１文字表記を示し、右側に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の１文字表記を示している。【0041】
具体的には、配列番号２に示すβサブユニットのアミノ酸配列に関して、「Ｌβ３７Ａ」と表記した場合は、βサブユニットのアミノ酸配列（配列番号２）のうちＮ末端のアミノ酸残基から数えて（当該Ｎ末端のアミノ酸残基を含めて数えて）３７番目のロイシン（Ｌ）がアラニン（Ａ）に置換された改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様を意味する。【0042】
本発明のより好ましい改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様は、それぞれ以下の１〜７の表記で表すことができる。１． Ｌβ３７Ａ
２． Ｌβ３７Ｄ
３． Ｌβ３７Ｆ
４． Ｌβ３７Ｉ
５． Ｌβ３７Ｍ
６． Ｌβ３７Ｔ
７． Ｌβ３７Ｖ
上記アミノ酸置換を生じさせるための塩基置換としては、以下の表１に示す態様が好ましく挙げられる。
【0043】
【表1】
【0044】
（ｂ−３）改良型ニトリルヒドラターゼ（α８３）各種微生物由来の既知のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸（一文字表記）配列のアライメントを、図８−１および８−２に示した。なお、図８−１、８−２のそれぞれにおいて、各アミノ酸配列は、上から順に、配列番号４、１０５〜１０８、１２１、１０９、１１０、１１２、１１１、１２２〜１２４、１１３、１１４、１２５をそれぞれ示す。
【0045】
さらに、本発明の改良型ニトリルヒドラターゼには、配列番号１１９で示されるアミノ酸配列を除く既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加された改良型ニトリルヒドラターゼも含まれる。一例としては、特許文献５〜９（参照により本明細書に取り込まれるものとする）に記載されたニトリルヒドラターゼを示すことができる。特許文献５〜９のニトリルヒドラターゼは耐熱性やアクリルアミド耐性を有しており、本発明のアミノ酸置換の付加により、触媒活性の向上という性質を付加することができる。【0046】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの一例としては、図９に示すように、αサブユニットが配列番号１２０に示されるアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここでは、Ｎ末端から数えて７３番目〜８３番目に、配列番号１１９で示されるアミノ酸配列が存在する。【0047】
一つの実施態様では、配列番号１２０に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１〜Ｘ７は独立した任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ８はアラニン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、アルギニン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0048】
また、他の実施態様では、配列番号１２０に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１がＭ（メチオニン）、Ｘ２がＡ（アラニン）、Ｘ３がＳ（セリン）、Ｘ４がＬ（ロイシン）、Ｘ５がＹ（チロシン）、Ｘ６がＡ（アラニン）、Ｘ７がＥ（グルタミン酸）であり、Ｘ８はアラニン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、アルギニン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0049】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの他の一例としては、配列番号４で示される既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、αサブユニットの８３番目のアミノ酸残基（グルタミン）が、アラニン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、アルギニン、セリン、スレオニン、チロシンまたはトリプトファンに置換したものが挙げられる。【0050】
このようなアミノ酸置換の態様の表記例としては、Ｑα８３Ａ、Ｑα８３Ｃ、Ｑα８３Ｄ、Ｑα８３Ｅ、Ｑα８３Ｆ、Ｑα８３Ｇ、Ｑα８３Ｈ、Ｑα８３Ｋ、Ｑα８３Ｌ、Ｑα８３Ｍ、Ｑα８３Ｎ、Ｑα８３Ｐ、Ｑα８３Ｒ、Ｑα８３Ｓ、Ｑα８３Ｔ、Ｑα８３ＡＹ、Ｑα８３Ｗが挙げられる。尚、アミノ酸のアルファベット表記は通常の１文字で表すことができ、置換箇所までのアミノ酸残基数を表す数字（例えば「８３」）の左側に表示したアルファベットは、置換前のアミノ酸の１文字表記を示し、右側に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の１文字表記を示している。【0051】
具体的には、配列番号４に示すαサブユニットのアミノ酸配列に関して、「Ｑα８３Ａ」と表記した場合は、αサブユニットのアミノ酸配列（配列番号４）のうちＮ末端のアミノ酸残基から数えて（当該Ｎ末端のアミノ酸残基を含めて数えて）８３番目のグルタミン（Ｑ）がアラニン（Ａ）に置換された改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様を意味する。【0052】
本発明のより好ましい改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様は、それぞれ以下の１〜１７の表記で表すことができる。１．Ｑα８３Ａ
２．Ｑα８３Ｃ
３．Ｑα８３Ｄ
４．Ｑα８３Ｅ
５．Ｑα８３Ｆ
６．Ｑα８３Ｇ
７．Ｑα８３Ｈ
８．Ｑα８３Ｋ
９．Ｑα８３Ｌ
１０．Ｑα８３Ｍ
１１．Ｑα８３Ｎ
１２．Ｑα８３Ｐ
１３．Ｑα８３Ｒ
１４．Ｑα８３Ｓ
１５．Ｑα８３Ｔ
１６．Ｑα８３Ｙ
１７．Ｑα８３Ｗ
上記アミノ酸置換を生じさせるための塩基置換としては、以下の態様が好ましく挙げられる。
【0053】
【表2】
【0054】
（ｂ−４）改良型ニトリルヒドラターゼ（α８２）各種微生物由来の既知のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸（一文字表記）配列のアライメントを、図１０−１および１０−２に示した。なお、図１０−１、１０−２のそれぞれにおいて、各アミノ酸配列は、上から順に、配列番号４、１０５〜１０８、１２１、１０９、１１０、１１２、１１１、１２２〜１２４、１１３、１１４、１２５をそれぞれ示す。
【0055】
さらに、本発明の改良型ニトリルヒドラターゼには、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を除く既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加された改良型ニトリルヒドラターゼも含まれる。一例としては、特許文献５〜９（参照により本明細書に取り込まれるものとする）に記載されたニトリルヒドラターゼを示すことができる。特許文献５〜９のニトリルヒドラターゼは耐熱性やアクリルアミド耐性を有しており、本発明のアミノ酸置換の付加により、触媒活性の向上という性質を付加することができる。【0056】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの一例としては、図１１に示すように、αサブユニットが配列番号１３１に示されるアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここでは、Ｎ末端から数えて７３番目〜８２番目に、配列番号１３２で示されるアミノ酸配列が存在する。【0057】
本発明における一つの実施態様では、配列番号１３１に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１〜Ｘ６は独立した任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ７はシステイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、チロシンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0058】
他の実施態様では、配列番号１３１に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１がＭ（メチオニン）、Ｘ２がＡ（アラニン）、Ｘ３がＳ（セリン）、Ｘ４がＬ（ロイシン）、Ｘ５がＹ（チロシン）、Ｘ６がＡ（アラニン）であり、Ｘ７はシステイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、チロシンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0059】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの他の一例としては、配列番号４で示される既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、αサブユニットの８２番目のアミノ酸残基（グルタミン酸）が、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、またはチロシンに置換したものが挙げられる。【0060】
このようなアミノ酸置換の態様の表記例としては、Ｅα８２Ｃ、Ｅα８２Ｆ、Ｅα８２Ｈ、Ｅα８２Ｉ、Ｅα８２Ｋ、Ｅα８２Ｍ、Ｅα８２Ｑ、Ｅα８２Ｒ、Ｅα８２Ｔ、Ｅα８２Ｙが挙げられる。尚、アミノ酸のアルファベット表記は通常の１文字で表すことができ、置換箇所までのアミノ酸残基数を表す数字（例えば「８２」）の左側に表示したアルファベットは、置換前のアミノ酸の１文字表記を示し、右側に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の１文字表記を示している。【0061】
具体的には、配列番号４に示すαサブユニットのアミノ酸配列に関して、「Ｅα８２Ｃ」と表記した場合は、αサブユニットのアミノ酸配列（配列番号４）のうちＮ末端のアミノ酸残基から数えて（当該Ｎ末端のアミノ酸残基を含めて数えて）８２番目のグルタミン酸（Ｅ）がシステイン（Ｃ）に置換された改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様を意味する。【0062】
本発明のより好ましい改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様は、それぞれ以下の１〜１０の表記で表すことができる。１．Ｅα８２Ｃ
２．Ｅα８２Ｆ
３．Ｅα８２Ｈ
４．Ｅα８２Ｉ
５．Ｅα８２Ｋ
６．Ｅα８２Ｍ
７．Ｅα８２Ｑ
８．Ｅα８２Ｒ
９．Ｅα８２Ｔ
１０．Ｅα８２Ｙ
上記アミノ酸置換を生じさせるための塩基置換としては、以下の態様が好ましく挙げられる。
【0063】
【表3】
【0064】
（ｂ−５）改良型ニトリルヒドラターゼ（α８５）各種微生物由来の既知のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸（一文字表記）配列のアライメントを、図１２−１および１２−２に示した。なお、図１２−１、１２−２のそれぞれにおいて、各アミノ酸配列は、上から順に、配列番号４、１０５〜１０８、１２１、１０９、１１０、１１２、１１１、１２２〜１２４、１１３、１１４、１２５をそれぞれ示す。
【0065】
さらに、本発明の改良型ニトリルヒドラターゼには、配列番号１３５で示されるアミノ酸配列を除く既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、１個又は数個（例えば１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加された改良型ニトリルヒドラターゼも含まれる。一例としては、特許文献５〜９（参照により本明細書に取り込まれるものとする）に記載されたニトリルヒドラターゼを示すことができる。特許文献５〜９のニトリルヒドラターゼは耐熱性やアクリルアミド耐性を有しており、本発明のアミノ酸置換の付加により、触媒活性の向上という性質を付加することができる。【0066】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの一例としては、図１３に示すように、αサブユニットが配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここでは、Ｎ末端から数えて７３番目〜８５番目に、配列番号１３６で示されるアミノ酸配列が存在する。【0067】
本発明における一つの実施態様では、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１〜Ｘ８は独立した任意のアミノ酸残基を表し、Ｘ９はシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、チロシンよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0068】
他の実施態様では、配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ１がＭ（メチオニン）、Ｘ２がＡ（アラニン）、Ｘ３がＳ（セリン）、Ｘ４がＬ（ロイシン）、Ｘ５がＹ（チロシン）、Ｘ６がＡ（アラニン）、Ｘ７がＥ（グルタミン酸）、Ｘ８がＡ（アラニン）であり、Ｘ９はシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、チロシンよりよりなる群から選択されるアミノ酸である。【0069】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの他の一例としては、配列番号４で示される既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、αサブユニットの８５番目のアミノ酸残基（ヒスチジン）が、Ｘ９がシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、またはチロシンに置換したものが挙げられる。【0070】
このようなアミノ酸置換の態様の表記例としては、Ｈα８５C、Ｈα８５E、Ｈα８５FＨα８５I、Ｈα８５N、Ｈα８５Q、Ｈα８５S、Ｈα８５Yが挙げられる。尚、アミノ酸のアルファベット表記は通常の１文字で表すことができ、置換箇所までのアミノ酸残基数を表す数字（例えば「８５」）の左側に表示したアルファベットは、置換前のアミノ酸の１文字表記を示し、右側に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の１文字表記を示している。【0071】
具体的には、配列番号４に示すαサブユニットのアミノ酸配列に関して、「Hα８５C」と表記した場合は、αサブユニットのアミノ酸配列（配列番号４）のうちＮ末端のアミノ酸残基から数えて（当該Ｎ末端のアミノ酸残基を含めて数えて）８５番目のヒスチジン（H）がシステイン（C）に置換された改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様を意味する。【0072】
本発明のより好ましい改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様は、それぞれ以下の１〜８の表記で表すことができる。１．Hα８５C
２．Hα８５E
３．Ｈα８５F
４．Ｈα８５I
５．Ｈα８５N
６．Ｈα８５Ｑ
７．Ｈα８５Ｓ
８．Ｈα８５Ｙ
上記アミノ酸置換を生じさせるための塩基置換としては、以下の態様が好ましく挙げられる。
【0073】
【表4】
【0074】
（ｂ−６）ニトリルヒドラターゼ活性本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの活性は、変異を導入する前のニトリルヒドラターゼの活性に対して触媒活性が向上している。
【0075】
ここで、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル化合物を、対応するアミド化合物に変換する水和反応（ＲＣＮ＋Ｈ２Ｏ→ＲＣＯＮＨ２）を触媒する酵素である。活性測定は、基質であるニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させ、対応するアミド化合物に変換した後、当該アミド化合物を定量することにより算出することができる。基質としては、ニトリルヒドラターゼが反応すればいかなるニトリル化合物でも使用できるが、アクリロニトリルが好ましい。【0076】
反応条件としては、基質濃度は２．５％、反応温度は１０℃から３０℃、反応時間は１０分から３０分の範囲で行う。酵素反応はリン酸を添加して停止させる。その後、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）やガスクロマトグラフィーにより、生成したアクリルアミドを分析することでアミド化合物の定量を行うことができる。【0077】
「触媒活性の向上」とは、改良型ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の培養物又は当該形質転換体から単離した改良型ニトリルヒドラターゼの活性測定によって、改良型ニトリルヒドラターゼの触媒活性が同条件で測定した親株の活性値より１割以上高いことを意味する。本発明における親株とは、変異導入する鋳型プラスミドが導入された形質転換体を意味する。アミド化合物としては、例えば、下記一般式（１）：
Ｒ−ＣＯＮＨ２ （１）
（ここで、Ｒは、置換されていてもよい炭素数１〜１０の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基又はアルケニル基、置換されていてもよい炭素数３〜１８のシクロアルキル基又はアリール基、あるいは、置換されていてもよい飽和又は不飽和複素環基を表す。）
で表されるアミド化合物が挙げられる。特に、式中、Ｒが「ＣＨ２＝ＣＨ−」であるアクリルアミドが好ましい。
【0078】
上記の改良型ニトリルヒドラターゼは、ニトリルヒドラターゼをアミノ酸置換することで得られるものであり、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株由来のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列（配列番号２）を改変し、触媒活性が向上したニトリルヒドラターゼを選択することにより得られる。【0079】
なお、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に昭和６２（１９８７）年９月１８日付けで国際寄託されている。【0080】
Ｊ１菌以外のニトリルヒドラターゼにおいても上述の変異の位置、変異するアミノ酸種、ＤＮＡ配列によって触媒活性が向上すると考えられる。その様な菌としては、好ましくは、ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４）（配列番号５）、ロドコッカス・ルーバーＴＨ（配列番号６）、ロドコッカス・ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ Ａｃ−１５１５Ｄ）、ロドコッカス・ピリジノボランスＭＷ３（配列番号７）、ロドコッカス・ピリジノボランスＳ８５−２（配列番号８）、ロドコッカス・ピリジノボランスＭＳ−３８（配列番号９）、ロドコッカス・ルーバーＲＨ（ＣＮ１０１４６３３５８）（配列番号５２）、ノカルジア ｓｐ．ＪＢＲｓ（配列番号１０）、ノカルジア・ＹＳ−２００２（配列番号１１）、ロドコッカス・ロドクロウス ＡＴＣＣ３９３８４（配列番号１２）、アンカルチャード・バクテリウム ＳＰ１（配列番号４２）、アンカルチャード・バクテリウム ＢＤ２（配列番号４３）、コマモナス・テストストローニ（配列番号４４）、オバチルス・サーモグルコシダシウス Ｑ６（配列番号４５）、シュードノカルディア・サーモフィラ ＪＣＭ３０９５（配列番号４６）、ロドコッカス・ロドクロウス Ｃｒ４（配列番号４７）等が挙げられる。なお、ロドコッカス・ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ Ａｃ−１５１５Ｄ）は、上記Ｍ８菌（ＳＵ１７３１８１４）から自然突然変異によって構成的にニトリルヒドラターゼを発現する株として選抜された菌株である。そのニトリルヒドラターゼ自体のアミノ酸配列及び遺伝子配列に変異はない（米国特許第５，８２７，６９９号）。これらの菌のβサブユニットにおいて、Ｎ末端から４８番目のアミノ酸残基を、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、またはスレオニンに置換したものが挙げられる。【0081】
ニトリルヒドラターゼをアミノ酸置換する方法としては、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物にハイドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射により変異を誘発する方法、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子にＰＣＲを用いてランダムに変異を導入するＥｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ方法等を採用することができる。【0082】
（ｂ−７）Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ変異体を用いたタンパク質の機能、性質を研究する方法の一つに、ランダム変異導入法がある。ランダム変異導入法とは、特定のタンパク質をコードする遺伝子に対してランダムな変異を導入し、変異体を作製する方法である。ＰＣＲによるランダム変異導入法では、ＤＮＡ増幅時に厳密度（ストリンジェンシー）の低い条件を設定して、塩基の変異を導入する（Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）ことができる。
【0083】
このＥｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲでは、増幅されるＤＮＡの全域に対して任意の部位に変異が導入される。そうすると、得られた任意の部位に変異が導入された変異体の機能を検討することによって、タンパク質固有の機能に重要なアミノ酸やドメインの情報を得ることができる。【0084】
Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲの鋳型となるニトリルヒドラターゼは、野生株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子、Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲによる増幅産物であるＤＮＡを用いることができる。【0085】
Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲの反応条件としては、例えば、反応液中のｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ又はｄＴＴＰ）のいずれか１種、２種又は３種の配合割合を他のｄＮＴＰに比べて減らした組成とする条件が挙げられる。これにより、ＤＮＡ合成の際、配合割合を減らしたｄＮＴＰが必要な箇所においては、誤って他のｄＮＴＰが用いられる可能性が高くなり、変異が導入される。また、他の反応条件としては、反応液中のＭｇＣｌ２及び／又はＭｎＣｌ２量を増やした組成とする条件も好ましく挙げられる。【0086】
（ｂ−８）改良型ニトリルヒドラターゼ改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡは、既知のニトリルヒドラターゼＤＮＡを基に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）等に記載の部位特異的変位誘発法に従って調製することができる。ＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法や Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
【0087】
また、本発明のＤＮＡとしては、当該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。【0088】
このような改良型ニトリルヒドラターゼＤＮＡは、上記の通り野性型遺伝子に変異を導入することにより得ることができるが、当該ＤＮＡ配列若しくはその相補配列、又はこれらの断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることもできる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用することが可能であり、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを利用することも可能である。【0089】
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が３００〜２０００ｍＭ、温度が４０〜７５℃、好ましくは塩濃度が６００〜９００ｍＭ、温度が６５℃の条件を意味する。例えば、２×ＳＳＣで５０℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。【0090】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ． （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））等を参照することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、本発明のＤＮＡに対して少なくとも４０％以上、好ましくは６０％、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分断片が挙げられる。【0091】
（ｃ）組換えベクター、形質転換体ニトリルヒドラターゼ遺伝子は、形質転換される宿主生物において発現可能なように、ベクターに組み込むことが必要である。例えば、ベクターとしてはプラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。
【0092】
また、本発明において使用し得る宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的のニトリルヒドラターゼを発現することができる限り特に限定されるものではない。例えば、大腸菌及び枯草菌等の細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用いることができる。大腸菌を宿主とする場合、発現効率の高い発現ベクター、例えばｔｒｃプロモーターを有する発現ベクターｐｋｋ２３３−２（アマシャムバイオサイエンス社製）又はｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス社製）などを用いることが好ましい。【0093】
ベクターには、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばカナマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。【0094】
細菌を宿主とする場合、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられ、ロドコッカス菌としては、例えばロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１７８９５、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１９１４０等が挙げられる。これらのＡＴＣＣ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手できる。【0095】
ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体の作製に際し、宿主に大腸菌を使用した場合、発現した大部分のニトリルヒドラターゼがインクルージョンボディーとなり不溶化するため、触媒活性の低い形質転換体が得られる。一方、ロドコッカス菌を宿主として使用した場合、ニトリルヒドラターゼは可溶性画分に存在するため、高活性な形質転換体が得られる。これらの形質転換体は目的に応じて選択すれば良いが、厳しい条件で改良型酵素を選抜する場合は高活性なロドコッカス菌の形質転換体を用いるのが好ましい。【0096】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。【0097】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。【0098】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。【0099】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が用いられる。【0100】
植物細胞を宿主とする場合は、タバコＢＹ−２細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等が用いられる。【0101】
（ｄ）培養物及び改良型ニトリルヒドラターゼの製造方法本発明において、改良型ニトリルヒドラターゼは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から採取することにより製造することができる。
【0102】
本発明は当該培養物から改良型ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、改良型ニトリルヒドラターゼの製造方法をも含む。【0103】
本発明において、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的の改良型ニトリルヒドラターゼは、上記培養物中に蓄積される。【0104】
本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース及びデンプン等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、エタノール及びプロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸、若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物が挙げられる。【0105】
その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。【0106】
培養中、ベクター及び目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
【0107】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＡＡ等を培地に添加することができる。【0108】
形質転換体の培養条件は、目的の改良型ニトリルヒドラターゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば特段限定されるものではないが、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３７℃で５〜１００時間行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、例えば大腸菌であれば６〜９に調整する。【0109】
培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、特に大腸菌形質転換体を培養する場合には、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。【0110】
上記培養条件で培養すると、高収率で本発明の改良型ニトリルヒドラターゼを上記培養物中、すなわち、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。【0111】
培養後、改良型ニトリルヒドラターゼが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより、目的の改良型ニトリルヒドラターゼを採取することができる。菌体又は細胞の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。【0112】
破砕後、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製した改良型ニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。【0113】
また、改良型ニトリルヒドラターゼが菌体内又は細胞内に生産される場合、菌体や細胞そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。【0114】
改良型ニトリルヒドラターゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体又は細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から改良型ニトリルヒドラターゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。【0115】
形質転換体を培養して得られたニトリルヒドラターゼの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）やニトリルヒドラターゼ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、ニトリルヒドラターゼ活性は、上述した活性の値を適用することができる。【0116】
また、本発明においては、生細胞を全く使用することなく、無細胞タンパク質合成系を採用して改良型ニトリルヒドラターゼを産生することが可能である。【0117】
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。【0118】
この場合、上記の宿主に対応する生物は、下記の細胞抽出液の由来する生物に相当する。ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。【0119】
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。【0120】
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる改良型ニトリルヒドラターゼは、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。【0121】
２．アミド化合物の製造方法上述のように製造された改良型ニトリルヒドラターゼは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、上記改良型ニトリルヒドラターゼを接触させることにより、アミド化合物を生成する。そして、接触により生成されるアミド化合物を採取する。これにより、アミド化合物を製造することができる。
【0122】
酵素触媒としては、前述のように分離精製されたニトリルヒドラターゼを使用することができる。また、前述のように適当な宿主内で改良型ニトリルヒドラターゼ遺伝子が発現するように遺伝子導入を行い、宿主を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の細胞をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。【0123】
ここで、「接触」とは、改良型ニトリルヒドラターゼとニトリル化合物を同一の反応系又は培養系に存在させることを意味し、例えば、分離精製した改良型ニトリルヒドラターゼとニトリル化合物を混合すること、改良型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現する細胞の培養容器にニトリル化合物を添加すること、当該細胞をニトリル化合物の存在下で培養すること、当該細胞の抽出液をニトリル化合物と混合することなどが含まれる。【0124】
基質として使用されるニトリル化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。ニトリル化合物としては、アクリロニトリルが好ましい。反応方法、及び反応終了後のアミド化合物の採取方法は、基質及び酵素触媒の特性により適宜選択される。【0125】
酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止やリサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。【実施例】
【0126】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として独立行攻法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている（原寄託日：１９８７年９月１８日）。【0127】
［調製例１］プラスミドｐＳＪ０３４の作製
本発明のアミノ酸置換を導入するための鋳型となるＪ１菌のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有するプラスミドｐＳＪ０３４（図１）を、以下の方法で作製した。
【0128】
ｐＳＪ０３４は、ロドコッカス菌においてニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドであり、ｐＳＪ０２３より特開平１０−３３７１８５号公報に示す方法で作製した。すなわち、プラスミドｐＳＪ０２３をＸｂａＩの部分切断とＳｓｅ８３８７Ｉリンカーライゲーションにより、１箇所のＸｂａＩサイトをＳｓｅ８３８７Ｉに置換したプラスミドｐＳＪ０３３を作製した。次に、ｐＳＪ０３３をＳｓｅ８３８７Ｉで部分切断し、クレノウフラグメントを用いて末端平滑化を行い、セルフライゲーションすることによりプラスミドｐＳＪ０３４を作製した。なお、ｐＳＪ０２３は形質転換体「Ｒ． ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３」であり、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成９（１９９７）年３月４日付けで国際寄託されている。【0129】
［調製例２］プラスミドｐＦＲ００５の作製
（１）変異遺伝子ライブラリーの構築
鋳型としたプラスミドとしては、βサブユニットのアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端のアミノ酸残基から数えて１６７残基下流のアミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）に変異し、かつ、上記Ｎ末端のアミノ酸残基から数えて２１９残基下流のアミノ酸残基がバリン（Ｖ）からアラニン（Ａ）に変異し、かつ、上記Ｎ末端のアミノ酸残基から数えて５７残基下流のアミノ酸残基がセリン（Ｓ）からメチオニン（Ｍ）に変異し、かつ、上記Ｎ末端のアミノ酸残基から数えて１１４残基下流のアミノ酸残基がリジン（Ｋ）からチオｒシン（Ｙ）に変異し、かつ、上記Ｎ末端のアミノ酸残基から数えて１０７残基下流のアミノ酸残基がスレオニン（Ｔ）からリジン（Ｋ）に変異したプラスミドｐＥＲ８５５（特開２０１０−１７２２９５参照）の改変物であるｐＥＲ８５５Ａ（図５）を用いた。
【0130】
先ず、ニトリルヒドラターゼ遺伝子への変異導入を下記の手法で行った。＜ＰＣＲ反応液組成＞
滅菌水 ２０μｌ
ｐＥＲ８５５Ａ （１ｎｇ／ｍｌ） １μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ （２×） ２５μｌ
合 計 ５０μｌ
＜ＰＣＲ反応条件＞
（９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃で９０秒）×３０サイクル
＜プライマー＞β１７の飽和変異プライマー
β１７ＲＭ−Ｆ ｇｇａｔａｃｇｇａｃｃｇｇｔｃＮＮＳｔａｔｃａｇａａｇｇａｃｇａｇ （配列番号６３）
β１７ＲＭ−Ｒ ｃｔｃｇｔｃｃｔｔｃｔｇａｔａＳＮＮｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｔａｔｃｃ （配列番号６４）
＜反応条件＞
（９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３分）×３０サイクル
【0131】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、１１ｋｂの増幅断片を確認し、１μｌのＤｐｎＩ（キットに付属）をＰＣＲ反応液に添加して３７℃で１時間反応させ、鋳型プラスミドの除去を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）で精製し、精製したＰＣＲ反応物を用いてＪＭ１０９に形質転換した。得られたコロニー数千個をプレートから回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出、変異遺伝子ライブラリーとした。【0132】
（２）ロドコッカス菌形質転換体の作製ロドコッカス・ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記（２）で調製したプラスミド１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合して氷冷し、キュベットにプラスミドＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置 Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢＩＯ ＲＡＤ）により２．０ＫＶ、２００ ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。
【0133】
電気パルス処理液の入ったキュベットを氷冷下１０分間静置し、３７℃で１０分間ヒートショクを行った。その後、キュベットにＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）５００μｌを加え、３０℃、５時間静置した後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布した。３０℃、３日間培養後のコロニーを形質転換体とした。同様に比較株としてｐＥＲ８５５Ａの形質転換体を作製した。【0134】
（３）ロドコッカス菌形質転換体のアミド処理スクリーニングには、上記（３）で得られたニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むロドコッカス菌形質転換体、及び比較株であるＡＴＣＣ１２６７４／ｐＥＲ８５５Ａを使用した。ＧＧＰＫ培地（１．５％グルコース、１％グルタミン酸ナトリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１％ＣｏＣｌ２、０．１％尿素、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７．２）を１ｍｌずつ入れた９６穴ディープウェルプレートに上記菌株を各々接種し、３０℃で３日間液体培養した。
【0135】
次に、得られた培養液の３０μｌを９６穴プレートに分注し、遠心分離によって培地を除き、最後に５０％アクリルアミド溶液を４０μｌ添加し、菌を懸濁した。高濃度アクリルアミド溶液に懸濁した形質転換体をインキュベーター中に置き、５０℃の温度下、３０分間の加熱処理で比較となる比較株を完全に失活させた。残存ニトリルヒドラターゼ活性は下記の方法で測定した。【0136】
先ず、アクリルアミド処理をした形質転換体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、以下の方法で活性測定を行った。試験管に洗浄した形質転換体と５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、３０℃で１０分間プレインキュベートし、等量の５％アクリロニトリル溶液（ｐＨ７．０）を添加して１０分間反応させ、１Ｍリン酸を１／１０量添加することにより反応を停止させた。次に停止させた反応液から遠心分離によって形質転換体を除き、適当な濃度に希釈してＨＰＬＣにより分析した（ＷＡＫＯＳＩＬ ５Ｃ８（和光純薬社）２５０ｍｍ、５ｍＭリン酸を含んだ１０％アセトニトリル、移動相の流速１ｍｌ／ｍｉｎ及び紫外吸収検出器波長２６０ｎｍ）。尚、比較対照としてアクリルアミド処理を行わない各々の無処理菌を用いて活性測定を行い、得られた活性値を基準として、アクリルアミド処理後の残存活性を求めた。【0137】
上記の方法で変異導入したニトリルヒドラターゼ遺伝子を有する数百個の形質転換体の中から、高濃度アクリルアミドに耐性を有する変異酵素ｐＦＲ００５を選抜した。【0138】
（４）塩基配列の確認ニトリルヒドラターゼ遺伝子の塩基配列の確認をするため、得られた選抜株からプラスミドを回収した。ロドコッカス形質転換体を、１０ｍｌのＭＹＫ培地（ポリペプトン０．５％、バクトイーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、グルコース１％、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に植菌した。２４時間培養した後に終濃度２％となるように滅菌した２０％グリシン溶液を添加し、さらに２４時間培養した。その後、遠心分離により菌体を回収し、菌体をＴＥＳ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−１０ｍＭＮａＣｌ−１ｍＭＥＤＴＡ）緩衝液で洗浄後、２ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−１２．５％シュークロース−１００ｍＭＮａＣｌ−１ｍｇ／ｍｌリゾチームに懸濁し、３７℃にて３時間振盪した。これに０．４ｍｌの１０％ＳＤＳを加え室温で穏やかに１時間振盪し、さらに２．１ｍｌの５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を添加し氷中で１時間静置した。その後、４℃にて１０，０００ｘｇ、１時間遠心し上清を得た。これに５倍量のエタノールを加え、−２０℃で３０分静置した後、１０，０００ｘｇ、２０分間遠心した。沈澱物を１０ｍｌの７０％エタノールで洗浄した後、１００μｌのＴＥ緩衝液に溶解しＤＮＡ溶液を得た。
【0139】
次に、ニトリルヒドラターゼを含む配列をＰＣＲ法で増幅した。＜ＰＣＲ反応液組成＞
鋳型プラスミド １μｌ
１０× ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ社製） １０μｌ
プライマーＮＨ−１９（５０μＭ） １μｌ
プライマーＮＨ−２０（５０μＭ） １μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ ８μｌ
滅菌水 ７９μｌ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製） １μｌ
＜プライマー＞
ＮＨ−１９ ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＣＧＴＴＧＣＣＧＧ（配列番号６５）
ＮＨ−２０ ＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＧＧＣＧＣＡＣＣＧＧＡＴＧＣＣＣＡＣ（配列番号６６）
＜反応条件＞
（９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３分）×３０サイクル。
【0140】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、２．５ｋｂのＰＣＲ増幅産物の検出を行った。ＰＣＲ反応液はＥｘｏ−ＳＡＰ処理（アマシャムファルマシア）後、サイクルシークエンシング法により配列解析用サンプルを調製し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣＥＱ−２０００ＸＬで解析を行った。その結果、ｐＦＲ００５の変異箇所は、Ｎβ１６７Ｓ、Ｖβ２１９Ａ、Ｓβ５７Ｍ、Ｋβ１１４Ｙ、Ｔβ１０７Ｋ、Ｐβ１７Ｇであることを確認した。すなわち、ｐＦＲ００５はβサブユニット１７番目のプロリンがグリシンに、βサブユニット５７番目のセリンがリジンに、βサブユニット１０７番目のチロシンがリジンに、βサブユニット１１４番目のリジンがチロシンに、βサブユニット１６７番目のアスパラギンがセリンに、βサブユニット２１９番目のバリンがアラニンに変異したものである。【実施例1】
【0141】
改良型ニトリルヒドラターゼの作製調製例１で作製したｐＳＪ０３４を使用し、アミノ酸置換を行った。ＰＣＲは、下記反応液組成、反応条件、プライマーを用いて行った。
＜ＰＣＲ反応液組成＞
滅菌水 ２０μｌ
ｐＳＪ０３４ （１ｎｇ／ｍｌ） １μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ （２×） ２５μｌ
合 計 ５０μｌ
＜ＰＣＲ反応条件＞
（９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃で９０秒）×３０サイクル
＜プライマー＞
【0142】
【表5】
【0143】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、１１ｋｂの増幅断片を確認し、１μｌのＤｐｎ Ｉ（キットに付属）をＰＣＲ反応液に添加して３７℃で１時間反応させ、鋳型プラスミドの除去を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）で精製し、精製したＰＣＲ反応物を用いてＪＭ１０９を形質転換した。得られた培養物から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出し、オートシークエンサーＣＥＱ ８０００（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。得られたプラスミドを以下のように命名した。【0144】
【表6】
【実施例2】
【0145】
ロドコッカス形質転換体の作製ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。実施例１で調製したプラスミド１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ）により２．０ｋＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショクを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）５００μｌを加え、３０℃、５時間静置した。その後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。３０℃、３日間培養後のコロニーを形質転換体とした。
【0146】
上記の工程で得られた各形質転換体をＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン）にそれぞれ接種し、３０℃にて２日間振盪培養し、ＧＧＰＫ培地（１．５％グルコース、１％グルタミン酸ナトリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％Ｍｇ２Ｏ４・７Ｈ２Ｏ、１％ ＣｏＣｌ２、０．１％尿素、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７．２）に１％植菌を行った。３０℃で３日間振盪培養し、遠心分離により集菌した。その後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で菌体を洗浄し、菌体懸濁液を調製した。【実施例3】
【0147】
改良型ニトリルヒドラターゼの活性菌体懸濁液のニトリルヒドラターゼ活性の測定は、下記の方法で行った。菌体液０．２ｍｌと５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４．８ｍｌとを混合し、さらに５．０％（ｗ／ｖ）のアクリロニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌを混合液に加えて、１０℃で１０分間振盪しながら反応させた。次いで、菌体を濾別して、ガスクロマトグラフィーを用いて生成したアクリルアミドの量を定量した。
＜分析条件＞
分析機器： ガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（島津製作所製）
検出器： ＦＩＤ（検出２００℃）
カラム： ポラパックＰＳ（ウォーターズ社製カラム充填剤）を充填した１ｍガラスカラム
カラム温度： １９０℃
【0148】
アクリルアミドの量からニトリルヒドラターゼ活性を換算した。ここで、ニトリルヒドラターゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのアクリルアミドを生成する酵素量を１Ｕと定義する。酵素活性はアミノ酸置換を導入した親株を１．０とした相対活性として表７に示す。【0149】
【表7】
【0150】
以上の結果より、βサブユニット４８番目のアミノ酸をアスパラギン酸、リジン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニンに置換した改良型ニトリルヒドラターゼは、触媒活性が向上することがわかった。【実施例4】
【0151】
改良型ニトリルヒドラターゼの作製と評価鋳型プラスミドとして調製例２で作製したｐＦＲ００５を使用して、βサブユニット４８番目のアミノ酸置換を行った。
【0152】
即ち、実施例１に記載の方法でアミノ酸置換した改良型ニトリルヒドラターゼを作製し、実施例２の方法で形質転換体を得た。さらに、実施例３と同様の方法で触媒活性を調べた。結果を表８に示す。【0153】
【表8】
【0154】
以上の結果より、配列番号５０で示されるアミノ酸配列の中で、Ｘ４（βサブユニット４８番目のアミノ酸に相当）をシステイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸にすることにより、変異が導入されたニトリルヒドラターゼに対しても同様の効果を有することが示された。【実施例5】
【0155】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動実施例２で調製した菌体懸濁液を、超音波破砕装置ＶＰ−３００（タイテック、日本）を用いて、氷冷しながら１０分間破砕した。次に、菌体の粉砕溶液を１３５００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離にかけ、上清から無細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液はＢｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１２％ｖ／ｖβメルカプトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセロール、微量ブロモフェノールブルー）と混合し、５分間煮沸し変性処理を行った。１０％ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを１レーンあたりタンパク質量として等量になるようにアプライし、電気泳動分析を行った（図４）。
【0156】
その結果、全てのサンプルでニトリルヒドラターゼのバンド強度に差がないことから、ニトリルヒドラターゼの発現量は同じであることがわかった。以上の結果より、触媒活性の向上は、酵素の比活性が向上していることによるものであることがわかった。【実施例6】
【0157】
ロドコッカス ロドクロウス Ｍ８株（以下、Ｍ８株と称する）由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製（１）Ｍ８株からの染色体ＤＮＡ調製
Ｍ８株（ＳＵ１７３１８１４）は、ロシア菌株センターＩＢＦＭ（ＶＫＰＭ Ｓ−９２６）から入手することができる。Ｍ８株を１００ｍｌのＭＹＫ（０．５％ ポリペプトン、０．３％ バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ ＫＨ２ＰＯ４）培地（ｐＨ７．０）中、３０℃にて７２時間振盪培養した。培養液を遠心分離し、集菌した菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液にリゾチーム８ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
【0158】
次に、当該懸濁液に１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加えた。さらに、当該懸濁液にプロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度０．１ｍｇ）を加え３７℃で１時間振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノールを加え攪拌後（ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））遠心した。上層を採取し、２倍量のエタノールを加えて、ガラス棒でＤＮＡを巻きとった。その後、これを順次９０％、８０％、７０％のエタノールで遠心分離しフェノールを取り除いた。【0159】
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるよう加え３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫ（メルク社）を加え３７℃で３０分間振盪した。これに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。【0160】
上層をさらに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。この操作を再度繰り返した。その後、上層に同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加えて遠心分離し、上層を回収した。次いで、上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でＤＮＡを巻きとって回収し、染色体ＤＮＡを得た。【0161】
（２）ＰＣＲを用いたＭ８株染色体ＤＮＡからの改良型ニトリルヒドラターゼの調製Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼは非特許文献（Ｖｅｉｋｏ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｍ８，Ｂｉｏｔｅｋｈｎｏｌｏｇｉｉａ（Ｍｏｓｃ．）５，３−５（１９９５））に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターの配列をそれぞれ配列番号３７，配列番号３８，配列番号３９に示す。配列情報に基づいて、配列表の配列番号４０及び４１記載のプライマーを合成し、（１）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
【0162】
＜ＰＣＲ反応溶液組成＞滅菌水 ２０μｌ
鋳型ＤＮＡ（染色体ＤＮＡ） １μｌ
プライマーＭ８−１（１０ｍＭ） ２μｌ
プライマーＭ８−２（１０ｍＭ） ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ （２×） ２５μｌ
合 計 ５０μｌ
【0163】
＜プライマー＞Ｍ８−１：ＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＡＧＧＣ（配列番号４０）
Ｍ８−２：ｃｃｃｃｔｇｃａｇｇｔｃａｇｔｃｇａｔｇａｔｇｇｃｃａｔｃｇａｔｔｃ（配列番号４１）
【0164】
＜反応条件＞（９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃ ３０秒）×３０サイクル
【0165】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル（同仁化学社製アガロースＩ使用；アガロース濃度０．７重量％）電気泳動に供し、１．６ｋｂの増幅断片の検出を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）を用いて精製した。【0166】
回収したＰＣＲ産物はＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いてベクター（ｐＵＣ１１８／ＨｉｎｃＩＩ部位）に連結し、反応液により大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体コロニーより数クローンをＬＢ−Ａｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃で１２時間振盪培養した。培養後、この培養物を遠心分離により集菌した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いることにより、集菌した菌体からプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡに対し、シークエンシングキットとオートシークエンサーＣＥＱ ８０００（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した（配列番号６２）。【0167】
次に、得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩとＳｓｅ８３８７Ｉで切断後、０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子断片（１．６ｋｂ）を回収し、プラスミドｐＳＪ０４２のＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉサイトに導入した。得られたプラスミドをｐＳＪ−Ｎ０１Ａと命名した。尚、ｐＳＪ０４２はロドコッカス菌においてＪ１株ニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドとして特開２００８−１５４５５２号公報（参照することにより、本明細書に取り込まれる）に示す方法で作製されたものであり、ｐＳＪ０４２の作製に使用したｐＳＪ０２３は形質転換体ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成９年３月４日付けで寄託されている。【実施例7】
【0168】
改良型ニトリルヒドラターゼの作製と評価実施例６で得られたプラスミドｐＳＪ−Ｎ０１Ａを用いて、βサブユニット４８番目のアミノ酸置換を行った。実施例１と同様の手法でアミノ酸置換を行い、改良型ニトリルヒドラターゼを作製した。さらに、実施例３と同様の手法でロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株の形質転換体及びその菌体懸濁液を得た後に、実施例４と同様の方法で触媒活性を測定した。結果を表９に示す。
【0169】
【表9】
【0170】
表９の結果より、βサブユニットの４８番目のアミノ酸を置換した改良型ニトリルヒドラターゼは、実施例３と同様に触媒活性が向上することがわかった。【実施例8】
【0171】
改良型ニトリルヒドラターゼの作製【0172】
調製例１で作製したプラスミドｐＳＪ０３４を使用し、アミノ酸置換を行った。ＰＣＲは、下記反応液組成、反応条件、表２に示すプライマーを用いて行った。＜ＰＣＲ反応液組成＞
滅菌水 ２０μｌ
ｐＳＪ０３４ （１ｎｇ／ｍｌ） １μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ （２×） ２５μｌ
合 計 ５０μｌ
＜ＰＣＲ反応条件＞
（９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃で９０秒）×３０サイクル
＜プライマー＞
【0173】
【表10】
【0174】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、１１ｋｂの増幅断片を確認し、１μｌのＤｐｎＩ（キットに付属）をＰＣＲ反応液に添加して３７℃で１時間反応させ、鋳型プラスミドの除去を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）で精製し、精製したＰＣＲ反応物を用いてＪＭ１０９を形質転換した。得られた培養物から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出し、オートシークエンサーＣＥＱ ８０００（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。得られたプラスミドを表１１のように命名した。【0175】
【表11】
【実施例9】
【0176】
ロドコッカス形質転換体の作製【0177】
ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。実施例１で調製したプラスミド１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ）により２．０ｋＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショクを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）５００μｌを加え、３０℃、５時間静置した。その後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。３０℃、３日間培養後のコロニーを形質転換体とした。【0178】
上記の工程で得られた各形質転換体をＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン）にそれぞれ接種し、３０℃にて２日間振盪培養し、ＧＧＰＫ培地（１．５％グルコース、１％グルタミン酸ナトリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％Ｍｇ２Ｏ４・７Ｈ２Ｏ、１％ ＣｏＣｌ２、０．１％尿素、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７．２）に１％植菌を行った。３０℃で３日間振盪培養し、遠心分離により集菌した。その後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で菌体を洗浄し、菌体懸濁液を調製した。【実施例10】
【0179】
改良型ニトリルヒドラターゼの活性【0180】
菌体懸濁液のニトリルヒドラターゼ活性の測定は、下記の方法で行った。菌体液０．２ｍｌと５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４．８ｍｌとを混合し、さらに５．０％（ｗ／ｖ）のアクリロニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌを混合液に加えて、１０℃で１０分間振盪しながら反応させた。次いで、菌体を濾別して、ガスクロマトグラフィーを用いて生成したアクリルアミドの量を定量した。
＜分析条件＞
分析機器： ガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（島津製作所製）
検出器： ＦＩＤ（検出２００℃）
カラム： ポラパックＰＳ（ウォーターズ社製カラム充填剤）を充填した１ｍガラスカラム
カラム温度： １９０℃
【0181】
アクリルアミドの量からニトリルヒドラターゼ活性を換算した。ここで、ニトリルヒドラターゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのアクリルアミドを生成する酵素量を１Ｕと定義する。酵素活性はアミノ酸置換を導入していない親株を１．０とした相対活性として表１２に示す。【0182】
【表12】
【0183】
以上の結果より、βサブユニット３７番目のアミノ酸を、アラニン、バリン、アスパラギン酸、スレオニン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニンよりなる群から選択されるアミノ酸に置換した酵素は、触媒活性が向上することがわかった。【実施例11】
【0184】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動【0185】
実施例２で調製した菌体懸濁液を、超音波破砕装置ＶＰ−３００（タイテック、日本）を用いて、氷冷しながら１０分間破砕した。次に、菌体の粉砕溶液を１３５００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離にかけ、上清から無細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液はＢｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１２％ｖ／ｖβメルカプトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセロール、微量ブロモフェノールブルー）と混合し、５分間煮沸し変性処理を行った。１０％ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを１レーンあたりタンパク質量として等量になるようにアプライし、電気泳動分析を行った。【0186】
その結果、全てのサンプルでニトリルヒドラターゼのバンド強度に差がないことから、ニトリルヒドラターゼの発現量は同じであることがわかった。以上の結果より、触媒活性の向上は、酵素の比活性が向上していることがわかった。【実施例12】
【0187】
改良型ニトリルヒドラターゼの作製と評価鋳型プラスミドとして下記のｐＦＲ００５を使用して、βサブユニット３７番目のアミノ酸置換を行った。
【0188】
即ち、実施例１に記載の方法でアミノ酸置換した改良型ニトリルヒドラターゼを作製し、実施例２の方法でロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株の形質転換体及びその菌体懸濁液を得た。さらに、実施例３と同様の方法で活性測定を調べた。結果を表１３に示す。【0189】
【表13】
【0190】
以上の結果より、本発明のアミノ酸置換は野生型ニトリルヒドラターゼだけでなく変異が導入されたニトリルヒドラターゼに対しても同様の効果を有することが示された。【実施例13】
【0191】
改良型ニトリルヒドラターゼの作製【0192】
調製例１で作製したプラスミドｐＳＪ０３４を使用し、アミノ酸置換を行った。ＰＣＲは、下記反応液組成、反応条件、表２に示すプライマーを用いて行った。＜ＰＣＲ反応液組成＞
滅菌水 ２０μｌ
ｐＳＪ０３４ （１ｎｇ／ｍｌ） １μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ （２×） ２５μｌ
合 計 ５０μｌ
＜ＰＣＲ反応条件＞
（９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃で９０秒）×３０サイクル
＜プライマー＞
【0193】
【表14】
【0194】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、１１ｋｂの増幅断片を確認し、１μｌのＤｐｎＩ（キットに付属）をＰＣＲ反応液に添加して３７℃で１時間反応させ、鋳型プラスミドの除去を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）で精製し、精製したＰＣＲ反応物を用いてＪＭ１０９を形質転換した。得られた培養物から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出し、オートシークエンサーＣＥＱ ８０００（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。得られたプラスミドを表１５のように命名した。【0195】
【表15】
【実施例14】
【0196】
ロドコッカス形質転換体の作製【0197】
ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。実施例１で調製したプラスミド１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ）により２．０ｋＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショクを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）５００μｌを加え、３０℃、５時間静置した。その後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。３０℃、３日間培養後のコロニーを形質転換体とした。【0198】
上記の工程で得られた各形質転換体をＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン）にそれぞれ接種し、３０℃にて２日間振盪培養し、ＧＧＰＫ培地（１．５％グルコース、１％グルタミン酸ナトリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％Ｍｇ２Ｏ４・７Ｈ２Ｏ、１％ ＣｏＣｌ２、０．１％尿素、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７．２）に１％植菌を行った。３０℃で３日間振盪培養し、遠心分離により集菌した。その後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で菌体を洗浄し、菌体懸濁液を調製した。【実施例15】
【0199】
改良型ニトリルヒドラターゼの活性【0200】
菌体懸濁液のニトリルヒドラターゼ活性の測定は、下記の方法で行った。菌体液０．２ｍｌと５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４．８ｍｌとを混合し、さらに５．０％（ｗ／ｖ）のアクリロニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌを混合液に加えて、１０℃で１０分間振盪しながら反応させた。次いで、菌体を濾別して、ガスクロマトグラフィーを用いて生成したアクリルアミドの量を定量した。
＜分析条件＞
分析機器： ガスクロマトグラフＧＣ−１４Ｂ（島津製作所製）
検出器： ＦＩＤ（検出２００℃）
カラム： ポラパックＰＳ（ウォーターズ社製カラム充填剤）を充填した１ｍガラスカラム
カラム温度： １９０℃
【0201】
アクリルアミドの量からニトリルヒドラターゼ活性を換算した。ここで、ニトリルヒドラターゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのアクリルアミドを生成する酵素量を１Ｕと定義する。酵素活性はアミノ酸置換を導入していない親株を１．０とした相対活性として表１６に示す。【0202】
【表16】
【0203】
以上の結果より、αサブユニット８３番目のアミノ酸をアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン、よりなる群から選択されるアミノ酸に置換した酵素は、触媒活性が向上することがわかった。【実施例16】
【0204】
改良型ニトリルヒドラターゼの作製と評価鋳型プラスミドとして下記のｐＦＲ００５を使用して、αサブユニット８３番目のアミノ酸置換を行った。
【0205】
即ち、実施例１に記載の方法でアミノ酸置換した改良型ニトリルヒドラターゼを作製し、実施例２の方法でロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株の形質転換体及びその菌体懸濁液を得た。さらに、実施例３と同様の方法で活性測定を調べた。結果を表１７に示す。【0206】
【表17】
【0207】
以上の結果より、本発明のアミノ酸置換はニトリルヒドラターゼだけでなく変異が導入されたニトリルヒドラターゼに対しても同様の効果を有することが示された。【実施例17】
【0208】
ロドコッカス ロドクロウス Ｍ８株（以下、Ｍ８株と称する）由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製【0209】
（１）Ｍ８株からの染色体ＤＮＡ調製Ｍ８株（ＳＵ１７３１８１４）は、ロシア菌株センターＩＢＦＭ（ＶＫＰＭ Ｓ−９２６）から入手することができる。Ｍ８株を１００ｍｌのＭＹＫ（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ ＫＨ２ＰＯ４）培地（ｐＨ７．０）中、３０℃にて７２時間振盪培養した。培養液を遠心分離し、集菌した菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液にリゾチーム８ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
【0210】
次に、当該懸濁液に１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加えた。さらに、当該懸濁液にプロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度０．１ｍｇ）を加え３７℃で１時間振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノールを加え攪拌後（ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））遠心した。上層を採取し、２倍量のエタノールを加えて、ガラス棒でＤＮＡを巻きとった。その後、これを順次９０％、８０％、７０％のエタノールで遠心分離しフェノールを取り除いた。【0211】
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるよう加え３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫ（メルク社）を加え３７℃で３０分間振盪した。これに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。【0212】
上層をさらに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。この操作を再度繰り返した。その後、上層に同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加えて遠心分離し、上層を回収した。次いで、上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でＤＮＡを巻きとって回収し、染色体ＤＮＡを得た。【0213】
（２）ＰＣＲを用いたＭ８株染色体ＤＮＡからのニトリルヒドラターゼ遺伝子の調製Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼは非特許文献（Ｖｅｉｋｏ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ ａｌ， Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｍ８， Ｂｉｏｔｅｋｈｎｏｌｏｇｉｉａ （Ｍｏｓｃ．） ５， ３−５ （１９９５））に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、の配列をそれぞれ配列番号１７、配列番号１８に示す。配列情報に基づいて、配列表の配列番号１１５及び１１６記載のプライマーを合成し、（１）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
＜ＰＣＲ反応溶液組成＞
滅菌水 ２０μｌ
鋳型ＤＮＡ（染色体ＤＮＡ） １μｌ
プライマーＭ８−１ （１０ｍＭ） ２μｌ
プライマーＭ８−２ （１０ｍＭ） ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ （２×） ２５μｌ
合 計 ５０μｌ
＜プライマー＞
Ｍ８−１： ＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＡＧＧＣ（配列番号１１５）
Ｍ８−２： ＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＴＴＣ（配列番号１１６）
＜反応条件＞
（９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃ ３０秒）×３０サイクル
【0214】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル（同仁化学社製アガロースＩ使用；アガロース濃度０．７重量％）電気泳動に供し、１．６ｋｂの増幅断片の検出を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）を用いて精製した。【0215】
回収したＰＣＲ産物はＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いてベクター（ｐＵＣ１１８／ＨｉｎｃＩＩ部位）に連結し、反応液により大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体コロニーより数クローンをＬＢ−Ａｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃で１２時間振盪培養した。培養後、この培養物を遠心分離により集菌した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （キアゲン社）を用いることにより、集菌した菌体からプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡに対し、シークエンシングキットとオートシークエンサーＣＥＱ ８０００（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。【0216】
次に、得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩとＳｓｅ８３８７Ｉで切断後、０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子断片（１．６ｋｂ）を回収し、プラスミドｐＳＪ０４２のＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉサイトに導入した。得られたプラスミドをｐＳＪ−Ｎ０１Ａと命名した。尚、ｐＳＪ０４２はロドコッカス菌においてＪ１株ニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドとして特開２００８−１５４５５２号公報に示す方法で作製されたものであり、ｐＳＪ０４２の作製に使用したｐＳＪ０２３は形質転換体ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成９年３月４日付けで寄託されている。【実施例18】
【0217】
改良型ニトリルヒドラターゼの作製と評価【0218】
実施例５で得られたプラスミドｐＳＪ−Ｎ０１Ａを用いて、αサブユニット８３番目のアミノ酸置換を行った。実施例１と同様の手法でアミノ酸置換を行い、改良型ニトリルヒドラターゼを作製した。さらに、実施例２と同様の手法でロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株の形質転換体及びその菌体懸濁液を得た後に、実施例４と同様の方法で活性測定を調べた。結果を表１８に示す。【0219】
【表18】
【0220】
以上の結果より、αサブユニットの８３番目をメチオニンにアミノ酸置換を行ったｐＳＪＲ１７は、実施例４と同様に触媒活性が向上することがわかった。【実施例19】
【0221】
改良型ニトリルヒドラターゼの作製調製例１で作製したプラスミドｐＳＪ０３４を使用し、アミノ酸置換を行った。ＰＣＲは、下記反応液組成、反応条件、表２に示すプライマーを用いて行った。
＜ＰＣＲ反応液組成＞
滅菌水 ２０μｌ
ｐＳＪ０３４ （１ｎｇ／ｍｌ） １μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ （２×） ２５μｌ
合 計 ５０μｌ
＜ＰＣＲ反応条件＞
（９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃で９０秒）×３０サイクル
＜プライマー＞
α８２の飽和変異プライマー
α８２ＲＭ−Ｆ ＡＴＧＣＣＧＧＴＮＮＳＣＡＧＧＣＡＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴ（配列番号１２９）
α８２ＲＭ−Ｒ ＴＧＴＧＣＣＴＧＳＮＮＡＣＣＧＧＣＡＴＡＧＣＣＣＡＡＴ（配列番号１３０）
【0222】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、１１ｋｂの増幅断片を確認し、１μｌのＤｐｎＩ（キットに付属）をＰＣＲ反応液に添加して３７℃で１時間反応させ、鋳型プラスミドの除去を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）で精製し、精製したＰＣＲ反応物を用いてＪＭ１０９へ形質転換した。得られた培養物から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出し、オートシークエンサーＣＥＱ ８０００（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。得られたプラスミドを表１９のように命名した。【0223】
【表19】
【実施例20】
【0224】
ロドコッカス形質転換体の作製ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。実施例２で調製したプラスミド１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ）により２．０ｋＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショクを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）５００μｌを加え、３０℃、５時間静置した。その後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。３０℃、３日間培養後のコロニーを形質転換体とした。
【0225】
上記の工程で得られた各形質転換体をＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン）にそれぞれ接種し、３０℃にて２日間振盪培養し、ＧＧＰＫ培地（１．５％グルコース、１％グルタミン酸ナトリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％Ｍｇ２Ｏ４・７Ｈ２Ｏ、１％ ＣｏＣｌ２、０．１％尿素、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７．２）に１％植菌を行った。３０℃で３日間振盪培養し、遠心分離により集菌した。その後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で菌体を洗浄し、菌体懸濁液を調製した。【実施例21】
【0226】
改良型ニトリルヒドラターゼの活性菌体懸濁液のニトリルヒドラターゼ活性の測定は、下記の方法で行った。
【0227】
菌体液０．２ｍｌと５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４．８ｍｌとを混合し、さらに５．０％（ｗ／ｖ）のアクリロニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌを混合液に加えて、１０℃で１０分間振盪しながら反応させた。次いで、菌体を濾別して、ガスクロマトグラフィーを用いて生成したアクリルアミドの量を定量した。＜分析条件＞
分析機器： ガスクロマトグラフＧＣ２０１４（島津製作所製）
検出器： ＦＩＤ（検出２００℃）
カラム： ポラパックＰＳ（ウォーターズ社製カラム充填剤）を充填した１ｍガラスカラム
カラム温度： １９０℃
【0228】
アクリルアミドの量からニトリルヒドラターゼ活性を換算した。ここで、ニトリルヒドラターゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのアクリルアミドを生成する酵素量を１Ｕと定義する。酵素活性はアミノ酸置換を導入していない親株を１．０とした相対活性として表２０に示す。【0229】
【表20】
【実施例22】
【0230】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動実施例３で調製した菌体懸濁液を、超音波破砕装置ＶＰ−３００（タイテック、日本）を用いて、氷冷しながら１０分間破砕した。次に、菌体の粉砕溶液を１３５００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離にかけ、上清から無細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液はＢｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１２％ｖ／ｖβメルカプトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセロール、微量ブロモフェノールブルー）と混合し、５分間煮沸し変性処理を行った。１０％ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを１レーンあたりタンパク質量として等量になるようにアプライし、電気泳動分析を行った。
【0231】
その結果、全てのサンプルでニトリルヒドラターゼのバンド強度に差がないことから、ニトリルヒドラターゼの発現量は同じであることがわかった。以上の結果より、触媒活性の向上は、酵素の比活性が向上していることがわかった。【実施例23】
【0232】
改良型ニトリルヒドラターゼの作製調製例１で作製したプラスミドｐＳＪ０３４を使用し、アミノ酸置換を行った。ＰＣＲは、下記反応液組成、反応条件、表２に示すプライマーを用いて行った。
＜ＰＣＲ反応液組成＞
滅菌水 ２０μｌ
ｐＳＪ０３４ （１ｎｇ／ｍｌ） １μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ （１０ｍＭ） ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ （２×） ２５μｌ
合 計 ５０μｌ
＜ＰＣＲ反応条件＞
（９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃で９０秒）×３０サイクル
＜プライマー＞
α８５の飽和変異プライマー
α８５ＲＭ−Ｆ ＣＡＧＧＣＡＮＮＳＣＡＡＡＴＴＴＣＧＧＣＧＧＴＣＴＴＣ（配列番号１３３）
α８５ＲＭ−Ｒ ＡＡＴＴＴＧＳＮＮＴＧＣＣＴＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＡＴＡ（配列番号１３４）
【0233】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、１１ｋｂの増幅断片を確認し、１μｌのＤｐｎＩ（キットに付属）をＰＣＲ反応液に添加して３７℃で１時間反応させ、鋳型プラスミドの除去を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）で精製し、精製したＰＣＲ反応物を用いてＪＭ１０９を形質転換した。得られた培養物から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出し、オートシークエンサーＣＥＱ ８０００（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。得られたプラスミドを表２１のように命名した。【0234】
【表21】
【実施例24】
【0235】
ロドコッカス形質転換体の作製ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。実施例２で調製したプラスミド１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ）により２．０ｋＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショクを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）５００μｌを加え、３０℃、５時間静置した。その後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。３０℃、３日間培養後のコロニーを形質転換体とした。
【0236】
上記の工程で得られた各形質転換体をＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン）にそれぞれ接種し、３０℃にて２日間振盪培養し、ＧＧＰＫ培地（１．５％グルコース、１％グルタミン酸ナトリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％Ｍｇ２Ｏ４・７Ｈ２Ｏ、１％ ＣｏＣｌ２、０．１％尿素、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７．２）に１％植菌を行った。３０℃で３日間振盪培養し、遠心分離により集菌した。その後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で菌体を洗浄し、菌体懸濁液を調製した。【実施例25】
【0237】
改良型ニトリルヒドラターゼの活性菌体懸濁液のニトリルヒドラターゼ活性の測定は、下記の方法で行った。
【0238】
菌体液０．２ｍｌと５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４．８ｍｌとを混合し、さらに５．０％（ｗ／ｖ）のアクリロニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌを混合液に加えて、１０℃で１０分間振盪しながら反応させた。次いで、菌体を濾別して、ガスクロマトグラフィーを用いて生成したアクリルアミドの量を定量した。＜分析条件＞
分析機器： ガスクロマトグラフＧＣ２０１４（島津製作所製）
検出器： ＦＩＤ（検出２００℃）
カラム： ポラパックＰＳ（ウォーターズ社製カラム充填剤）を充填した１ｍガラスカラム
カラム温度： １９０℃
【0239】
アクリルアミドの量からニトリルヒドラターゼ活性を換算した。ここで、ニトリルヒドラターゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのアクリルアミドを生成する酵素量を１Ｕと定義する。酵素活性はアミノ酸置換を導入していない親株を１．０とした相対活性として表２２に示す。【0240】
【表22】
【0241】
以上の結果より、αサブユニット８５番目のアミノ酸をシステイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、チロシンよりなる群から選択されるアミノ酸に置換した酵素は、触媒活性が向上することがわかった。【実施例26】
【0242】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動実施例３で調製した菌体懸濁液を、超音波破砕装置ＶＰ−３００（タイテック、日本）を用いて、氷冷しながら１０分間破砕した。次に、菌体の粉砕溶液を１３５００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離にかけ、上清から無細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液はＢｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１２％ｖ／ｖβメルカプトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセロール、微量ブロモフェノールブルー）と混合し、５分間煮沸し変性処理を行った。１０％ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを１レーンあたりタンパク質量として等量になるようにアプライし、電気泳動分析を行った。
【0243】
その結果、全てのサンプルでニトリルヒドラターゼのバンド強度に差がないことから、ニトリルヒドラターゼの発現量は同じであることがわかった。以上の結果より、触媒活性の向上は、酵素の比活性が向上していることがわかった。【産業上の利用可能性】
【0244】
本発明によれば、触媒活性が向上した新規な改良型（変異型）ニトリルヒドラターゼを提供することができる。触媒活性が向上した改良型ニトリルヒドラターゼは、アミド化合物の製造上非常に有用である。【0245】
本発明によれば、さらに、上記改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、当該形質転換体の培養物から採取されるニトリルヒドラターゼ及びその製造、並びに前記タンパク質（改良型ニトリルヒドラターゼ）又は、当該培養物若しくは当該培養物の処理物を用いたアミド化合物の製造方法を提供することができる。【0246】
本発明によれば、触媒活性が向上した、新規な改良型（変異型）ニトリルヒドラターゼを提供することができる。触媒活性が向上した改良型ニトリルヒドラターゼは、アミド化合物の製造上非常に有用である。【0247】
本発明によれば、さらに、上記改良型ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ、当該遺伝子ＤＮＡを含む組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、当該形質転換体の培養物から採取されるニトリルヒドラターゼ及びその製造、並びに前記タンパク質（改良型ニトリルヒドラターゼ）又は、当該培養物若しくは当該培養物の処理物を用いたアミド化合物の製造方法を提供することができる。【受託番号】
【0248】
ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に昭和６２（１９８７）年９月１８日付けで国際寄託されている。【0249】
ｐＳＪ０２３は形質転換体「Ｒ． ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３」であり、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成９（１９９７）年３月４日付けで国際寄託されている。【0250】
[配列表の説明]配列番号１：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）由来のβサブユニットの塩基配列。
配列番号２：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）由来のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号３：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）由来のαサブユニットの塩基配列。
配列番号４：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）由来のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号５：ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４）のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号６：ロドコッカス・ルーバーＴＨのβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号７：ロドコッカス・ピリジノボランスＭＷ３３（ＶＫＭ Ａｃ−１５１５Ｄ）のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号８：ロドコッカス・ピリジノボランスＳ８５−２のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号９：ロドコッカス・ピリジノボランスＭＳ−３８のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１０：ノカルジア ｓｐ．ＪＢＲｓのβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１１：ノカルジア ＳＰ．ＹＳ−２００２のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１２：ロドコッカス・ロドクロウス ＡＴＣＣ３９３８４のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１３：β４８Ｃ−Ｆプライマー。
配列番号１４：β４８Ｃ−Ｒプライマー。
配列番号１５：β４８Ｄ−Ｆプライマー。
配列番号１６：β４８Ｄ−Ｒプライマー。
配列番号１７：β４８Ｅ−Ｆプライマー。
配列番号１８：β４８Ｅ−Ｒプライマー。
配列番号１９：β４８Ｈ−Ｆプライマー。
配列番号２０：β４８Ｈ−Ｒプライマー。
配列番号２１：β４８Ｉ−Ｆプライマー。
配列番号２２：β４８Ｉ−Ｒプライマー。
配列番号２３：β４８Ｋ−Ｆプライマー。
配列番号２４：β４８Ｋ−Ｒプライマー。
配列番号２５：β４８Ｍ−Ｆプライマー。
配列番号２６：β４８Ｍ−Ｒプライマー。
配列番号２７：β４８Ｎ−Ｆプライマー。
配列番号２８：β４８Ｎ−Ｒプライマー。
配列番号２９：β４８Ｐ−Ｆプライマー。
配列番号３０：β４８Ｐ−Ｒプライマー。
配列番号３１：β４８Ｑ−Ｆプライマー。
配列番号３２：β４８Ｑ−Ｒプライマー。
配列番号３３：β４８Ｓ−Ｆプライマー。
配列番号３４：β４８Ｓ−Ｒプライマー。
配列番号３５：β４８Ｔ−Ｆプライマー。
配列番号３６：β４８Ｔ−Ｒプライマー。
配列番号３７：Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号３８：Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号３９：Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼのアクチベーターのアミノ酸配列。
配列番号４０：Ｍ８−１のプライマー。
配列番号４１：Ｍ８−２のプライマー。
配列番号４２：アンカルチャード・バクテリウム ＳＰ１のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号４３：アンカルチャード・バクテリウム ＢＤ２のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号４４：コマモナス・テストストローニのβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号４５：ジオバチルス・サーモグルコシダシウス Ｑ６のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号４６：シュードノカルディア・サーモフィラ ＪＣＭ３０９５のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号４７：ロドコッカス・ロドクロウス Ｃｒ４のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号４８：鉄型ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのシステインクラスターのアミノ酸配列。
配列番号４９：コバルト型ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのシステインクラスターのアミノ酸配列。
配列番号５０：本発明に用いる特定のアミノ酸配列。
配列番号５１：本発明のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号５２：ロドコッカス・ルーバーＲＨ（ＣＮ１０１４６３３５８）のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号５３：ニトリルヒドラターゼ Ｊ１Ｄの塩基配列。
配列番号５４：ニトリルヒドラターゼ ２０３の塩基配列。
配列番号５５：ニトリルヒドラターゼ ４１４の塩基配列。
配列番号５６：ニトリルヒドラターゼ ８５５の塩基配列。
配列番号５７：ニトリルヒドラターゼ Ｄ２のαサブユニットの塩基配列。
配列番号５８：ニトリルヒドラターゼ ００５の塩基配列。
配列番号５９：ニトリルヒドラターゼ １０８Ａの塩基配列。
配列番号６０：ニトリルヒドラターゼ ２１１の塩基配列。
配列番号６１：ニトリルヒドラターゼ ３０６Ａの塩基配列。
配列番号６２：ロドコッカス・ロドクロウスＭ８の両末端にプライマー配列を含むPCR断片の塩基配列。
配列番号６３：β１７ＲＭ−Ｆプライマー。
配列番号６４：β１７ＲＭ−Ｒプライマー。
配列番号６５：ＮＨ−１９プライマー。
配列番号６６：ＮＨ−２０プライマー。
配列番号６７：β３７Ａ−Ｆプライマー。
配列番号６８：β３７Ａ−Ｒプライマー。
配列番号６９：β３７Ｄ−Ｆプライマー。
配列番号７０：β３７Ｄ−Ｒプライマー。
配列番号７１：β３７Ｆ−Ｆプライマー。
配列番号７２：β３７Ｆ−Ｒプライマー。
配列番号７３：β３７Ｉ−Ｆプライマー。
配列番号７４：β３７Ｉ−Ｒプライマー。
配列番号７５：β３７Ｍ−Ｆプライマー。
配列番号７６：β３７Ｍ−Ｒプライマー。
配列番号７７：β３７Ｔ−Ｆプライマー。
配列番号７８：β３７Ｔ−Ｒプライマー。
配列番号７９：β３７Ｖ−Ｆプライマー。
配列番号８０：β３７Ｖ−Ｒプライマー。
配列番号８１：本発明に用いる特定のアミノ酸配列。
配列番号８２：本発明のβサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号８３：α８３Ａ−Ｆプライマー。
配列番号８４：α８３Ａ−Ｒプライマー。
配列番号８５：α８３Ｃ−Ｆプライマー。
配列番号８６：α８３Ｃ−Ｒプライマー。
配列番号８７：α８３Ｄ−Ｆプライマー。
配列番号８８：α８３Ｄ−Ｒプライマー。
配列番号８９：α８３Ｅ−Ｆプライマー。
配列番号９０：α８３Ｅ−Ｒプライマー。
配列番号９１：α８３Ｆ−Ｆプライマー。
配列番号９２：α８３Ｆ−Ｒプライマー。
配列番号９３：α８３Ｇ−Ｆプライマー。
配列番号９４：α８３Ｇ−Ｒプライマー。
配列番号９５：α８３Ｈ−Ｆプライマー。
配列番号９６：α８３Ｈ−Ｒプライマー。
配列番号９７：α８３Ｍ−Ｆプライマー。
配列番号９８：α８３Ｍ−Ｒプライマー。
配列番号９９：α８３Ｐ−Ｆプライマー。
配列番号１００：α８３Ｐ−Ｒプライマー。
配列番号１０１：α８３Ｓ−Ｆプライマー。
配列番号１０２：α８３Ｓ−Ｒプライマー。
配列番号１０３：α８３Ｔ−Ｆプライマー。
配列番号１０４：α８３Ｔ−Ｒプライマー。
配列番号１０５：ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４)のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１０６：ロドコッカス・ルーバーＴＨのαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１０７：ロドコッカス・ピリジノボランスＭＷ３３（ＶＫＭ Ａｃ−１５１５Ｄ）のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１０８：ロドコッカス・ピリジノボランスＳ８５−２のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１０９：ノカルジア ｓｐ．ＪＢＲｓのαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１１０：ノカルジア ｓｐ．ＹＳ−２００２のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１１１：アンカルチャード・バクテリウム ＢＤ２のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１１２：アンカルチャード・バクテリウム ＳＰ１のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１１３：シュードノカルディア・サーモフィラ ＪＣＭ３０９５のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１１４：ロドコッカス・ロドクロウス Ｃｒ４のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１１５：Ｍ８−１プライマー。
配列番号１１６：Ｍ８−２プライマー。
配列番号１１７：鉄型ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのシステインクラスターのアミノ酸配列。
配列番号１１８：コバルト型ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのシステインクラスターのアミノ酸配列。
配列番号１１９：本発明に用いる特定のアミノ酸配列。
配列番号１２０：本発明のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１２１：ロドコッカス・ピリジノボランスＭＳ−３８のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１２２：ロドコッカス・ロドクロウス ＡＴＣＣ３９３８４のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１２３：シノリゾビウム・メディカエ ＷＳＭ４１９のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１２４：ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス Ｑ６のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１２５：コマモナス・テストステローニのαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１２６：ロドコッカス・ルーバーＲＨ（ＣＮ１０１４６３３５８）のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１２７：α８３Ｎ−Ｆ プライマー。
配列番号１２８：α８３Ｎ−Ｒ プライマー。
配列番号１２９：α８２ＲＭ−Ｆプライマー。
配列番号１３０：α８２ＲＭ−Ｒプライマー。
配列番号１３１：本発明のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１３２：本発明に用いる特定のアミノ酸配列。
配列番号１３３：α８５ＲＭ−Ｆプライマー。
配列番号１３４：α８５ＲＭ−Ｒプライマー。
配列番号１３５：本発明のαサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１３６：本発明に用いる特定のアミノ酸配列。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]