特許 5931022 ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5931022

(24)【登録日】2016年5月13日

(45)【発行日】2016年6月8日

(54)【発明の名称】ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160526BHJP

   C40B 40/08 20060101ALI20160526BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20160526BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20160526BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20160526BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZCC

   C40B40/08ZNA

   C07K19/00

   C07K14/195

   C12N9/22

【請求項の数】5

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2013-166768(P2013-166768)

(22)【出願日】2013年8月9日

(65)【公開番号】特開2015-33365(P2015-33365A)

(43)【公開日】2015年2月19日

【審査請求日】2015年7月10日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 １．第４６回日本発生生物学会の予稿集が公開されたウェブサイトアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｄｂ．ｊｐ／ｋａｉｓａｉ／ｊｓｄｂ２０１３／ａｕｔｈｐａｒｔｉｃｉｐａｔｏｒ．ｐｈｐ？ｉｄ＝ＴＷ０１−４＆ｓｋ− 掲載日：平成２５年５月１５日 ２．第４６回日本発生生物学会 開催日：平成２５年５月２８日〜３１日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100140497

【弁理士】

【氏名又は名称】野中 信宏

(72)【発明者】

【氏名】山本 卓

(72)【発明者】

【氏名】佐久間 哲史

(72)【発明者】

【氏名】落合 博

(72)【発明者】

【氏名】松浦 伸也

(72)【発明者】

【氏名】宮本 達雄

【審査官】 濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５２９０８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−９４１４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Tetsushi Sakuma et al.，Advanced methods for the construction, evaluation and application of TALENs，Joint Meeting of The 45th Annual Meeting of the Japanese Society of Developmental Biologists & The 6，２０１２年 ４月２７日，p. 303, JYSS2-22(P1-128)

【文献】 Tetsushi Sakuma and Takashi Yamamoto，Platinum Gate TALEN: Establishment of highly-active TALEN construction system，第４６回日本発生生物学会予稿集，２０１３年 ５月１５日，TW01-4，ＵＲＬ，tt

【文献】 Satoshi Ota et al.，Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays，Genes to Cells，２０１３年 ６月，Vol. 18, No. 6，p. 450-458

【文献】 Jeffrey C Miller et al.，A TALE nuclease architecture for efficient genome editing，Nature Biotechnology，２０１１年，Vol. 29，p. 143-148

【文献】 Thomas Gaj et al.，ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering，Trends in Biotechnology，２０１３年 ７月，Vol. 31, No. 7，p. 397-405

【文献】 Tomas Cermak et al.，Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA target，Nucleic Acids Research，２０１１年，Vol. 39, No. 12，e82

【文献】 Tetsushi Sakuma et al.，Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity，Scientific Reports，２０１３年１１月２９日，Vol. 3，Article number: 3379

【文献】 Jens Boch and Ulla Bonas，Xanthomonas AvrBs3 Family-Type III Effectors: Discovery and Function，Annual Review of Phytopathology，２０１０年，Vol. 48，p. 419-436

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ０７Ｋ １４／００

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ ９／００

Ｃ４０Ｂ ４０／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ切断ドメインを含むＴＡＬＥＮポリペプチドであって、
ここで、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインは、４０〜５０のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
ＤＮＡ結合ドメインは、３４のアミノ酸からなる１６〜２０のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜５の自然数である、ポリペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載のＴＡＬＥＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端側に隣接する領域（ＴＡＬＥＮ−Ｎ’）のアミノ酸数が１５３であり、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端側とＤＮＡ切断ドメインに挟まれた領域（ＴＡＬＥＮ−Ｃ’）のアミノ酸数が４７である、ベクター。

【請求項3】

請求項２に記載のベクターを作製するためのベクターライブラリーであって、
ここで、ベクターライブラリーは、５’末端から順に、第１の制限酵素切断部位、４つのＤＮＡ結合モジュールをコードするポリヌクレオチド、および第２の制限酵素切断部位を有する複数のベクターによって構成され、
ここで、第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せは、Ａ型の制限酵素切断部位およびＢ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＣ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ｂ型の制限酵素切断部位およびＣ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ｃ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せ、ならびにＤ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せのいずれかであり、ここで、Ａ型の制限酵素切断部位〜Ｅ型の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、いずれも、互いに異なる切断末端を生じさせるものであり、
４つのＤＮＡ結合モジュールのうち、
５’末端から１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
５’末端から２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
５’末端から３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
５’末端から４番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
５’末端から１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、５’末端から２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、５’末端から３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、および５’末端から４番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なる、ベクターライブラリー。

【請求項4】

請求項３に記載のベクターライブラリーを作製するためのベクターセットであって、
ここで、ベクターセットは、５’末端から順に、１番目の制限酵素切断部位、ＤＮＡ結合モジュール、および２番目の制限酵素切断部位を含む複数のベクターを含み、
１番目の制限酵素切断部位、および２番目の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、互いに異なる切断末端を生じさせるものであり、
ここで、１番目の制限酵素切断部位、および２番目の制限酵素切断部位は、請求項３に記載のベクターライブラリーを構成するベクターに含まれる第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位を切断する制限酵素によって切断されない部位であり、
ＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、４つの異なる組合せのいずれかである、ベクターセット。

【請求項5】

請求項２に記載のベクターを細胞（ヒト個体中の細胞を除く）に導入して発現させることを特徴とする、ゲノム上に変異が導入された細胞の生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドに関する。また、本発明は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。さらに、本発明は、当該ベクターを作製するためのベクターライブラリーに関する。また、本発明は、当該ベクターライブラリーを作製するためのベクターセットに関する。

【背景技術】

【0002】

ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインからなるヌクレアーゼサブユニットを複数含むポリペプチドとして、ＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）やＺＦＮ（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）などが知られている（特許文献１〜４、非特許文献１〜５）。例えば、機能ドメインとしてＤＮＡ切断ドメインを用いる人工ヌクレアーゼが知られている。これらの人工ヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインの結合部位において複数のＤＮＡ切断ドメインが近接して多量体を形成することによって、ＤＮＡの二本鎖切断を引き起こす。ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールを繰り返して含み、それぞれのＤＮＡ結合モジュールが、ＤＮＡ鎖中の特定の塩基対を認識するため、ＤＮＡ結合モジュールを適切に設計することによって、目的とする配列の特異的な切断を行うことができる。配列特異的な切断の修復の際に生じるエラーや組換えを利用すれば、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子の欠失、挿入、変異導入が可能であり、これらのヌクレアーゼは、ゲノム編集などの様々な遺伝子改変に応用することができる（非特許文献６参照）。

【0003】

非特許文献１は、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインとが４７アミノ酸のリンカーによって接続されたポリペプチドを開示している。非特許文献１には、ＤＮＡ結合モジュールにおけるＤＮＡ認識部位のアミノ酸以外の特定の部位の１つのアミノ酸を、用いる４つのＤＮＡ結合モジュールごとに周期的に変化させたヌクレアーゼが記載されている。しかしながら、非特許文献１には、用いたポリペプチドが機能ドメインによる所望の機能の高さとＤＮＡ結合ドメインの配列認識特異性の高さを両立させるものであるとの記載はなく、また、ＤＮＡ結合モジュールにおける複数のアミノ酸を周期的に変化させることの記載はなく、周期的な変化についての意義や目的に関する記載はない。

【0004】

非特許文献２は、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインが６３アミノ酸のリンカーによって接続されたポリペプチドを開示している。また、非特許文献２には、ＤＮＡ結合モジュールにおけるＤＮＡ認識部位のアミノ酸以外のアミノ酸を、用いる４つのＤＮＡ結合モジュールごとに周期的に変化させたポリペプチドが記載されている。しかしながら、非特許文献２には、用いたポリペプチドが、機能ドメインによる所望の機能の高さとＤＮＡ結合ドメインの配列認識特異性の高さを両立させるものであるとの記載はなく、また、４つのＤＮＡ結合モジュールごとの周期的な変化の目的や意義については何らの言及もない。

【0005】

非特許文献３は、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインが４７アミノ酸のリンカーによって接続されたポリペプチドを開示している。また、非特許文献３には、ＤＮＡ結合モジュールにおけるＤＮＡ認識部位のアミノ酸以外のアミノ酸を、用いるＤＮＡ結合モジュールごとにランダムに変化させたポリペプチドが記載されている。しかしながら、非特許文献３には、用いたポリペプチドが、機能ドメインによる所望の機能の高さとＤＮＡ結合ドメインの配列認識特異性の高さを両立させるものであるとの記載はなく、ランダムに変化させることの目的や意義に関する記載はなく、また、ＤＮＡ結合モジュールごとに周期的に変化させることの記載はない。

【0006】

非特許文献４は、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインが６３アミノ酸のリンカーによって接続されたポリペプチドを開示している。また、非特許文献５は、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインが４７アミノ酸のリンカーによって接続されたポリペプチドを開示している。しかしながら、非特許文献４にも非特許文献５にも、用いたポリペプチドが、機能ドメインによる所望の機能の高さとＤＮＡ結合ドメインの配列認識特異性の高さを両立させるものであるとの記載はなく、ＤＮＡ結合モジュールごとに周期的な変化を持たせることの記載はない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２０１１／０７２２４６号

【特許文献2】国際公開第２０１１／１５４３９３号

【特許文献3】国際公開第２０１１／１５９３６９号

【特許文献4】国際公開第２０１２／０９３８３３号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１１ Ｎｏｖ；３９（２１）：９２８３−９３．

【非特許文献2】Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ Ａｕｇ ５；２９（８）：６９７−８．

【非特許文献3】Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ Ｆｅｂ；２９（２）：１４３−８．

【非特許文献4】Ｎａｔｕｒｅ． ２０１２ Ｎｏｖ １；４９１（７４２２）：１１４−８．

【非特許文献5】Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２０１３ Ａｐｒ；１８（４）：３１５−２６．

【非特許文献6】Ｃｅｌｌ．２０１１ Ｊｕｌ ２２；１４６（２）：３１８−３１．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドとして、機能ドメインによる機能を高く示すものを用いれば、所望の結果が得られる効率が向上すると期待される。たとえば、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼの場合には、ＤＮＡ切断活性を高く示すものを用いることによって、ＤＮＡ切断が起こる確率が向上し、目的とする遺伝子改変の生じた細胞を取得できる効率も向上すると期待される。しかしながら、従来のＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドにおいては、機能ドメインによる活性を高く示すものは、ＤＮＡ結合ドメインによる標的塩基配列以外の部分においても高い機能を発揮し、安全性などの観点から十分とはいえないという傾向があった。このように、ＤＮＡ配列に対する認識特異性の高さと機能ドメインによる機能の高さの両立は困難であった。また、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドの調製には、標的配列に対応したＤＮＡ結合モジュールの繰り返しをベクターに導入するなどの煩雑な操作が必要であり、より簡便な操作で迅速に作製することができるポリペプチドが求められている。

【0010】

したがって、本発明は、機能ドメインによる機能の高さとＤＮＡ配列に対する認識特異性の高さを両立し、所望の機能を高確率で安全に発揮させることができ、しかも、簡便な操作で作製することができるポリペプチドを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、鋭意検討したところ、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインが、３５〜５５のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続され、かつ、ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールにおける２つの特定の位置のアミノ酸が、４つのＤＮＡ結合モジュールごとに異なる繰り返し様式を呈するポリペプチドは、機能ドメインによる機能の高さとＤＮＡ配列に対する認識特異性の高さを両立することができることを見出した。当該ポリペプチドを発現させるためのベクターは、特定の特徴を有するベクターセット、および特定の特徴を有するベクターライブラリーを用いることによって簡便に作製することができた。

【0012】

すなわち、本発明は、第１の態様において、
ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドであって、
ここで、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインは、３５〜５５のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である、
ポリペプチド
を提供するものである。

【0013】

また、本発明は、第２の態様において、機能ドメインがＤＮＡ切断ドメインである、第１の態様に記載のポリペプチドを提供するものである。

【0014】

また、本発明は、第３の態様において、第１の態様または第２の態様に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供するものである。

【0015】

さらに、本発明は、第４の態様において、
第３の態様に記載のベクターを作製するためのベクターライブラリーであって、
ここで、ベクターライブラリーは、５’末端から順に、第１の制限酵素切断部位、４つのＤＮＡ結合モジュールをコードするポリヌクレオチド、および第２の制限酵素切断部位を有する複数のベクターによって構成され、
ここで、第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せは、Ａ型の制限酵素切断部位およびＢ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＣ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ｂ型の制限酵素切断部位およびＣ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ｃ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せ、ならびにＤ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せのいずれかであり、ここで、Ａ型の制限酵素切断部位〜Ｅ型の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、いずれも、互いに異なる切断末端を生じさせるものであり、
４つのＤＮＡ結合モジュールのうち、
５’末端から１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
５’末端から２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
５’末端から３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
５’末端から４番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
５’末端から１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、５’末端から２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、５’末端から３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、および５’末端から４番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である、
ベクターライブラリーを提供するものである。

【0016】

さらに、本発明は、第５の態様において、
第４の態様に記載のベクターライブラリーを作製するためのベクターセットであって、
ここで、ベクターセットは、５’末端から順に、１番目の制限酵素切断部位、ＤＮＡ結合モジュール、および２番目の制限酵素切断部位を含む複数のベクターを含み、
１番目の制限酵素切断部位、および２番目の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、互いに異なる切断末端を生じさせるものであり、
ＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、４つの異なる組合せのいずれかであり、
ここで、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である、
ベクターセットを提供するものである。

【発明の効果】

【0017】

本発明のポリペプチドは、機能ドメインによる高い機能を実現すると同時に、ＤＮＡ配列に対する高い認識特異性を実現するため、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することによって、安全に、かつ高確率で、所望の結果を実現することができる。また、本発明のベクターライブラリーを用いれば、機能ドメインによる高い機能とＤＮＡ配列に対する高い認識特異性を両立するポリペプチド発現用ベクターを、簡便かつ迅速に調製することができる。さらに、本発明のベクターセットを用いれば、本発明のベクターライブラリーを簡便に調製することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、本発明のベクターセット、ベクターライブラリー、およびベクターの構造的特徴、および作製方法を示す模式図である。

【図2】図２は、本発明のベクターセット、ベクターライブラリー、およびベクターに含まれるＤＮＡ結合モジュールのアミノ酸配列および塩基配列の一例を示す図である。

【図3】図３は、本発明のベクターに含まれるアミノ酸配列および塩基配列の一例を示す図である。

【図4】図４は、実施例３、および比較例１〜３の方法によって作製したベクターの構造的特徴を示し（図４Ａおよび図４Ｂ）、各種のベクターの組合せにより発現されるヌクレアーゼの配列特異性の高さを比較する（図４Ｃ）ものである。

【図5】図５は、実施例３、および比較例１〜３の方法によって作製するベクターの設計を示し（図５Ａ）、それらのベクターにより発現されるヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性の高さを比較する（図５Ｂ）ものである。

【図6】図６は、実施例３、および比較例１〜３の方法によって作製するベクターの設計を示し（図６Ａ）、それらのベクターにより発現されるヌクレアーゼのＤＮＡ切断活性の配列特異性を比較する（図６Ｂ）ものである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

第１の態様において、本発明は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドを提供する。ＤＮＡ結合ドメインの由来としては、植物病原菌ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ジンクフィンガー（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）などが挙げられる。

【0020】

機能ドメインとしては、酵素、転写調節因子、レポータータンパク質などをコードするドメインが挙げられる。酵素としては、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、リガーゼ、キナーゼ、フォスファターゼなどのＤＮＡ修飾酵素；ラクタマーゼなどのその他の酵素が挙げられる。本明細書においては、ヌクレアーゼをコードするドメインを、ＤＮＡ切断ドメインと称する。転写調節因子としては、アクチベーター、リプレッサーなどが挙げられる。レポータータンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰまたはＤｓＲｅｄ）、ｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質；ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質；アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの化学発光基質を変換する酵素などが挙げられる。ＤＮＡ切断ドメインは、好ましくは、他のＤＮＡ切断ドメインと接近して多量体を形成し、向上したヌクレアーゼ活性を取得するものである。このようなＤＮＡ切断ドメインとしては、ＦｏｋＩに由来するものなどが挙げられる。

【0021】

本発明の第１の態様のポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインは、３５〜５５、好ましくは、４０〜５０、より好ましくは、４５〜４９、最も好ましくは、４７のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されている。ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインを接続するポリペプチドとしては、例えば、配列番号３４の７５４番目から８０１番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、また、配列番号３４の７５４番目から８０１番目のアミノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、または９７％の同一性を有するポリペプチドが挙げられる。

【0022】

本発明の第１の態様のポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含む。１つのＤＮＡ結合モジュールは、１つの塩基対を特異的に認識する。ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの数は、機能ドメインの機能の高さとＤＮＡ配列認識特異性の高さの両立性の観点から、好ましくは、８〜４０、より好ましくは、１２〜２５、さらにより好ましくは、１５〜２０である。ＤＮＡ結合モジュールとしては、たとえば、ＴＡＬエフェクターリピート（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｒｅｐｅａｔ）などが挙げられる。１つのＤＮＡ結合モジュールの長さとしては、例えば、２０〜４５、３０〜３８、３２〜３６、または３４などが挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの長さは、好ましくは、全てのＤＮＡ結合モジュールに関して同一である。ＤＮＡ結合モジュールとしては、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の１番目から３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の１番目から３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドにおける１２番目のアミノ酸と１３番目のアミノ酸が、順にＨ、Ｄである場合には、当該ＤＮＡ結合ドメインは、塩基としてＣを認識し、順にＮ、Ｇである場合には、当該ＤＮＡ結合ドメインは、塩基としてＴを認識し、順にＮ、Ｉである場合には、当該ＤＮＡ結合ドメインは、塩基としてＡを認識し、順にＮ、Ｎである場合には、当該ＤＮＡ結合ドメインは、塩基としてＧを認識する。また、ＤＮＡ結合モジュールとしては、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の１番目から３４番目のアミノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、または９７％の同一性を有し、１つの塩基対を認識する機能を実質的に保持するポリペプチドが挙げられる。

【0023】

本発明の第１の態様のポリペプチドにおいて、Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一である。また、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一である。また、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一である。また、Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一である。ここで、ｎは、１〜１０の自然数、好ましくは、１〜７の自然数、より好ましくは、１〜５の自然数である。ｎは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの全てを指し示すに足りる自然数である。また、ｘは、１〜４０の自然数、好ましくは、１〜１０の自然数、より好ましくは、２〜６の自然数、さらにより好ましくは、３〜５の自然数、最も好ましくは、自然数４である。また、ｙは、１〜４０の自然数、好ましくは、２５〜４０の自然数、より好ましくは、３０〜３６の自然数、さらにより好ましくは、３１〜３３の自然数、最も好ましくは、自然数３２である。ｘとｙは、異なる自然数である。ｘおよびｙの数値は、用いるＤＮＡ結合モジュールの長さによって異なりうる。ｘは、好ましくは、３４のアミノ酸からなるＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸に相当する位置を示す数値である。ｙは、好ましくは、３４のアミノ酸からなるＤＮＡ結合モジュールにおける３２番目のアミノ酸に相当する位置を示す数値である。

【0024】

本発明の第１の態様のポリペプチドにおいて、Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なる。ここで、ｎは、１〜１０の自然数、好ましくは、１〜７の自然数、より好ましくは、１〜５の自然数である。ｎは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの全てを指し示すに足りる自然数である。また、ｘは、１〜４０の自然数、好ましくは、１〜１０の自然数、より好ましくは、２〜６の自然数、さらにより好ましくは、３〜５の自然数、最も好ましくは、自然数４である。また、ｙは、１〜４０の自然数、好ましくは、２５〜４０の自然数、より好ましくは、３０〜３６の自然数、さらにより好ましくは、３１〜３３の自然数、最も好ましくは、自然数３２である。ｘとｙは、異なる自然数である。好ましくは、Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、それぞれ、ｘとｙの順にＤとＤの組合せ、ＥとＡの組合せ、ＤとＡの組合せ、およびＡとＤの組合せからなる群から選ばれる。

【0025】

本発明は、第２の態様において、機能ドメインがＤＮＡ切断ドメインである、第１の態様のポリペプチドを提供する。

【0026】

本発明は、第３の態様において、第１の態様または第２の態様のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。人工染色体ベクターとしては、酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣ）、細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）、Ｐ１人工染色体ベクター（ＰＡＣ）、マウス人工染色体ベクター（ＭＡＣ）、ヒト人工染色体ベクター（ＨＡＣ）が挙げられる。また、ベクターの成分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、ＧＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡなどの核酸アナログなどが挙げられる。ベクターは、糖類などの核酸以外の成分によって修飾されていてもよい。

【0027】

本発明の第３の態様のベクターを、細胞などに導入して、発現させることによって、本発明の第１の態様または第２の態様のポリペプチドを調製することができる。また、本発明の第３の態様のベクターを、細胞などに導入して、発現させることによって、細胞内において、ＤＮＡ組換え、ＤＮＡ切断などのＤＮＡ修飾；転写調節などのその他の酵素活性の発現；レポータータンパク質によるＤＮＡ領域の標識化などの機能ドメインに応じた所望の機能を発揮させることができる。機能ドメインがＤＮＡ切断ドメインである場合には、複数の、好ましくは、２つの本発明の第３の態様のベクターを、細胞などに導入して、発現させることによって、ベクターを導入した細胞のゲノムＤＮＡ上において塩基配列特異的な二本鎖切断を生じさせることができ、細胞のゲノム上に変異を導入することができる。本発明の第３の態様のベクターを導入する細胞の由来としては、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウスなどの哺乳類などの動物、シロイヌナズナなどの植物、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの培養細胞などが挙げられる。

【0028】

本発明は、第４の態様において、第３の態様のベクターを作製するためのベクターライブラリーを提供する。本発明の第４の態様のベクターライブラリーは、複数のベクターによって構成される。ベクターライブラリーは、第３の態様のベクターを作製するのに有用なベクターを、４つのＤＮＡ結合モジュールの組合せが認識する４つの塩基の組合せに関して網羅的に含むことが好ましいが、第３の態様のベクターの作製が可能であるかぎり、含まれるベクターは網羅的でなくてもよい。本発明の第４の態様のベクターライブラリーは、たとえば、６〜９個、１０〜１３個、１４〜１７個、または１８〜２１個のＤＮＡ結合モジュールを含む本発明の第１の態様または第２の態様のポリペプチドを網羅的に構築するためのベクターを含み、好ましくは、１４〜２１個のＤＮＡ結合モジュールを含む本発明の第１の態様または第２の態様のポリペプチドを網羅的に構築するためのベクターを含む。本発明の第１の態様または第２の態様のポリペプチドは、１４〜２１のＤＮＡ結合モジュールを含む場合において、認識特異性の高さと機能ドメインによる機能の高さの両立性が特に優れているため、このようなベクターライブラリーは、構成するベクターが少ないながらも、効果の高い本発明の第１の態様または第２の態様のポリペプチドを簡便に作製することができ、優れている。

【0029】

本発明の第４の態様のベクターライブラリーを構成する全てのベクターは、５’末端から順に、第１の制限酵素切断部位、４つのＤＮＡ結合モジュールをコードするポリヌクレオチド、および第２の制限酵素切断部位を有する。

【0030】

本発明の第４の態様のベクターライブラリーを構成するベクターに含まれる第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せは、Ａ型の制限酵素切断部位およびＢ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＣ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ｂ型の制限酵素切断部位およびＣ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ｃ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せ、ならびにＤ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せのいずれかである。制限酵素切断部位についてのＡ型〜Ｅ型は、制限酵素切断部位の性質の相違を示すために本明細書において便宜的に設定した表記である。型が異なる場合には、制限酵素切断部位の性質が互いに異なり、および型が同一である場合には、制限酵素切断部位の性質が共通であることを示す。本発明の第４の態様のベクターライブラリーにおいて、Ａ型の制限酵素切断部位〜Ｅ型の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素によって切断されるものである。また、Ａ型の制限酵素切断部位〜Ｅ型の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、いずれも、互いに異なる切断末端を生じさせるものである。このような制限酵素切断部位としては、制限酵素による認識部位に隣接する任意の部位を切断する制限酵素（たとえば、ＢｓａＩ、ＢｂｓI、ＢｓｍＢＩなど）による切断部位が挙げられる。

【0031】

図１のＳＴＥＰ２に示されるように、１８〜２１のＤＮＡ結合モジュールを含む本発明の第３の態様のベクターを作製することを目的とする場合には、本発明の第４の態様のベクターライブラリーは、第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せがＡ型の制限酵素切断部位およびＢ型の制限酵素切断部位の組合せであるベクター、第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せがＢ型の制限酵素切断部位およびＣ型の制限酵素切断部位の組合せであるベクター、第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せがＣ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せであるベクター、ならびに第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せがＤ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せであるベクターを、好ましくは、ＤＮＡ結合モジュールによる認識塩基に関して網羅的に含む。

【0032】

また、図１のＳＴＥＰ２に示されるように、１４〜１７のＤＮＡ結合モジュールを含む本発明の第３の態様のベクターを作製することを目的とする場合には、本発明の第４の態様のベクターライブラリーは、第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せがＡ型の制限酵素切断部位およびＣ型の制限酵素切断部位の組合せであるベクター、第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せがＣ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せであるベクター、ならびに第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せがＤ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せであるベクターを、好ましくは、ＤＮＡ結合モジュールによる認識塩基に関して網羅的に含む。

【0033】

さらに、図１のＳＴＥＰ２に示されるように、１０〜１３のＤＮＡ結合モジュールを含む本発明の第３の態様のベクターを作製することを目的とする場合には、本発明の第４の態様のベクターライブラリーは、第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せがＡ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せであるベクター、ならびに第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せがＤ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せであるベクターを、好ましくは、ＤＮＡ結合モジュールによる認識塩基に関して網羅的に含む。

【0034】

さらに、図１のＳＴＥＰ２に示されるように、６〜９のＤＮＡ結合モジュールを含む本発明の第３の態様のベクターを作製することを目的とする場合には、本発明の第４の態様のベクターライブラリーは、第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せがＡ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せであるベクターを、好ましくは、ＤＮＡ結合モジュールによる認識塩基に関して網羅的に含む。

【0035】

本発明の第４の態様のベクターライブラリーを構成するベクターは、ＤＮＡ結合モジュールを含む。１つのＤＮＡ結合モジュールの長さとしては、例えば、３０〜３８、３２〜３６、または３４などが挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの長さは、好ましくは、ベクターライブラリーを構成する全てのベクターに関して同一である。また、ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの長さは、好ましくは、ベクターライブラリーを構成するベクターに含まれる４つのＤＮＡ結合モジュールの全てに関して同一である。ＤＮＡ結合モジュールとしては、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の１番目から３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。また、ＤＮＡ結合モジュールとしては、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の１番目から３４番目のアミノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、または９７％の同一性を有し、１つの塩基対を認識する機能を実質的に保持するポリペプチドが挙げられる。

【0036】

本発明の第４の態様のベクターライブラリーを構成するベクターに含まれる４つのＤＮＡ結合モジュールのうち、５’末端から１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ベクターライブラリーを構成する任意のベクターに関して同一である。同様に、５’末端から２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ベクターライブラリーを構成する任意のベクターに関して同一である。また、５’末端から３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ベクターライブラリーを構成する任意のベクターに関して同一である。また、５’末端から４番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ベクターライブラリーを構成する任意のベクターに関して同一である。ここで、ｘは、１〜４０の自然数、好ましくは、１〜１０の自然数、より好ましくは、２〜６の自然数、さらにより好ましくは、３〜５の自然数、最も好ましくは、自然数４である。また、ｙは、１〜４０の自然数、好ましくは、２５〜４０の自然数、より好ましくは、３０〜３６の自然数、さらにより好ましくは、３１〜３３の自然数、最も好ましくは、自然数３２である。ｘとｙは、異なる自然数である。ｘおよびｙの数値は、用いるＤＮＡ結合モジュールの長さによって異なりうる。ｘは、好ましくは、３４のアミノ酸からなるＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸に相当する位置を示す数値である。ｙは、好ましくは、３４のアミノ酸からなるＤＮＡ結合モジュールにおける３２番目のアミノ酸に相当する位置を示す数値である。

【0037】

本発明の第４の態様のベクターライブラリーを構成するベクターに含まれる４つのＤＮＡ結合モジュールのうち、５’末端から１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、５’末端から２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、５’末端から３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、および５’末端から４番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なる。ここで、ｘは、１〜４０の自然数、好ましくは、１〜１０の自然数、より好ましくは、２〜６の自然数、さらにより好ましくは、３〜５の自然数、最も好ましくは、自然数４である。また、ｙは、１〜４０の自然数、好ましくは、２５〜４０の自然数、より好ましくは、３０〜３６の自然数、さらにより好ましくは、３１〜３３の自然数、最も好ましくは、自然数３２である。ｘとｙは、異なる自然数である。ｘおよびｙの数値としては、例えば、前述と同様の数値が挙げられる。好ましくは、５’末端から１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ｘとｙの順にＤとＤであり、５’末端から２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ｘとｙの順にＥとＡであり、５’末端から３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ｘとｙの順にＤとＡであり、かつ、５’末端から４番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ｘとｙのＡとＤである。

【0038】

本発明の第４の態様のベクターライブラリーを用いれば、本発明の第３の態様のベクターを、簡便に作製することができる。具体的には、本発明の第３の態様のベクターに含まれるＤＮＡ結合モジュールの配列に対応するベクターを、本発明の第４の態様のベクターライブラリーから選択し、選択したベクターを、Ａ型の制限酵素切断部位〜Ｅ型の制限酵素切断部位を切断する制限酵素によって消化して、消化によって得られたベクター断片を接続することによって本発明の第３の態様のベクターを作製することができる。本発明の第４の態様のベクターライブラリーを構成する全てのベクターは、同一の制限酵素によって切断される制限酵素切断部位を２つ有し、かつ、その制限酵素切断部位は、当該酵素による切断によって互いに異なる切断末端を生じさせる。したがって、本発明の第３の態様のベクターの作製において、選択したベクターの消化、およびベクター断片の接続は、それぞれ、同一の反応液において行うことができる。そのため、本発明の第４の態様のベクターライブラリーを用いれば、極めて簡便に、本発明の第３の態様のベクターを作製することができる。

【0039】

本発明は、第５の態様において、本発明の第４の態様のベクターライブラリーを作製するためのベクターセットを提供する。

【0040】

本発明の第５の態様のベクターセットは、複数のベクターを含む。ベクターセットは、第４の態様のベクターライブラリーを作製するのに有用なベクターを網羅的に含むことが好ましいが、第４の態様のベクターライブラリーの作製が可能なかぎり、含まれるベクターは網羅的でなくてもよい。

【0041】

本発明の第５の態様のベクターセットに含まれる全てのベクターは、５’末端から順に、１番目の制限酵素切断部位、ＤＮＡ結合モジュール、および２番目の制限酵素切断部位を含む。１番目の制限酵素切断部位、および２番目の制限酵素切断部位は、本発明の第４の態様のベクターライブラリーを構成するベクターに含まれる第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位を切断する制限酵素によって切断されない部位であることが好ましい。この場合、第４の態様のベクターライブラリーから第３の態様のベクターを、より簡便に作製することができる。

【0042】

本発明の第５の態様のベクターセットに含まれるベクターに含まれるＤＮＡ結合モジュールの長さは、好ましくは、ベクターセットに含まれる全てのベクターに関して同一である。ＤＮＡ結合モジュールとしては、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の１番目から３４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。また、ＤＮＡ結合モジュールとしては、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の１番目から３４番目のアミノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、または９７％の同一性を有し、１つの塩基対を認識する機能を実質的に保持するポリペプチドが挙げられる。

【0043】

本発明の第５の態様のベクターセットに含まれるベクターに含まれる１番目の制限酵素切断部位および２番目の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素によって切断されるものである。また、１番目の制限酵素切断部位、および２番目の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、互いに異なる切断末端を生じさせるものである。このような制限酵素切断部位としては、制限酵素による認識部位に隣接する任意の部位を切断する制限酵素（たとえば、ＢｓａＩ、ＢｂｓI、ＢｓｍＢＩなど）による切断部位が挙げられる。

【0044】

本発明の第５の態様のベクターセットに含まれるベクターに含まれるＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、４つの異なる組合せのいずれかである。ｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の４つの異なる組合せとしては、例えば、ｘとｙの順に、ＤとＤの組合せ、ＥとＡの組合せ、ＤとＡの組合せ、およびＡとＤの組合せが挙げられる。ここで、ｘは、１〜４０の自然数、好ましくは、１〜１０の自然数、より好ましくは、２〜６の自然数、さらにより好ましくは、３〜５の自然数、最も好ましくは、自然数４である。また、ｙは、１〜４０の自然数、好ましくは、２５〜４０の自然数、より好ましくは、３０〜３６の自然数、さらにより好ましくは、３１〜３３の自然数、最も好ましくは、自然数３２である。ｘとｙは、異なる自然数である。ｘおよびｙの数値は、用いるＤＮＡ結合モジュールの長さによって異なりうる。ｘは、好ましくは、３４のアミノ酸からなるＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸に相当する位置を示す数値である。ｙは、好ましくは、３４のアミノ酸からなるＤＮＡ結合モジュールにおける３２番目のアミノ酸に相当する位置を示す数値である。

【0045】

本発明の第５の態様のベクターセットに含まれるベクターとしては、１番目の制限酵素切断部位および２番目の制限酵素切断部位の組合せが、α型の制限酵素切断部位およびβ型の制限酵素切断部位の組合せであり、ＤＮＡ結合モジュールが、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣを認識するもの；１番目の制限酵素切断部位および２番目の制限酵素切断部位の組合せが、β型の制限酵素切断部位およびγ型の制限酵素切断部位の組合せであり、ＤＮＡ結合モジュールが、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣを認識するもの；１番目の制限酵素切断部位および２番目の制限酵素切断部位の組合せが、γ型の制限酵素切断部位およびδ型の制限酵素切断部位の組合せであり、ＤＮＡ結合モジュールが、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣを認識するもの；１番目の制限酵素切断部位および２番目の制限酵素切断部位の組合せが、δ型の制限酵素切断部位およびε型の制限酵素切断部位の組合せであり、ＤＮＡ結合モジュールが、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣを認識するものを例示することができる。ここで、制限酵素切断部位についてのα型〜ε型は、制限酵素切断部位の性質の相違を示すために本明細書において便宜的に設定した表記である。型が異なる場合には、制限酵素切断部位の性質が互いに異なり、および型が同一である場合には、制限酵素切断部位の性質が共通であることを示す。本発明の第５の態様のベクターセットは、好ましくは、上で例示した全てのベクターを含む。この場合、あらゆる態様の本発明の第４の態様のベクターライブラリーを作製することができる。

【0046】

本発明の第５の態様のベクターセットを用いれば、本発明の第４の態様のベクターライブラリーを簡便に作製することができる。具体的には、本発明の第４の態様のベクターライブラリーを構成するベクターに含まれる４つのＤＮＡ結合モジュールの組合せに基づき、本発明の第５の態様のベクターセットに含まれるベクターを４つ選択し、選択されたベクターを、１番目の制限酵素切断部位および２番目の制限酵素切断部位を切断する制限酵素によって消化し、消化によって得られたベクター断片を、接続することによって、本発明の第４の態様のベクターライブラリーを作製することができる。本発明の第５の態様のベクターセットに含まれる全てのベクターは、同一の制限酵素によって切断される制限酵素切断部位を２つ有し、かつ、その制限酵素切断部位は、当該酵素による切断によって互いに異なる切断末端を生じさせる。したがって、本発明の第４の態様のベクターライブラリーの作製において、選択したベクターの消化、およびベクター断片の接続は、それぞれ、同一の反応液において行うことができる。そのため、本発明の第５の態様のベクターセットを用いれば、極めて簡便に、本発明の第４の態様のベクターライブラリーを作製することができる。

【実施例】

【0047】

以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。

【0048】

実施例１ ベクターセットの作製：
図２に示した塩基配列の両端に制限酵素ＢｓａＩの認識サイトを付加した配列を、人工遺伝子合成により作製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ｖｅｃｔｏｒに挿入して、図１のＳＴＥＰ１に用いるベクターセット（ｐ１ＨＤ−ｐ４ＨＤ、ｐ１ＮＧ−ｐ４ＮＧ、ｐ１ＮＩ−ｐ４ＮＩ、ｐ１ＮＮ−ｐ４ＮＮ）を作製した。

【0049】

実施例２ ベクターライブラリーの作製：
ｐＦＵＳ＿Ｂ６ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型とし、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（クロンテック）によって、図１のＳＴＥＰ１に示すｐＦＵＳ２ベクターを作製した。図１のＳＴＥＰ１に示すように、作製したｐＦＵＳ２ベクターと、実施例１において作製したベクターセットを用いて、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応を行い、ベクターライブラリーを作製した。

【0050】

実施例３ ＴＡＬＥＮ発現ベクターの作製：
ｐＴＡＬＥＮ＿ｖ２およびｐｃＤＮＡ−ＴＡＬ−ＮＣ２（共にＡｄｄｇｅｎｅ）を用いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングによって、作製した後、モジュールを組込むＢｓｍＢＩサイト周辺配列をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングによって調製し、更に開始コドンの上流にｇｌｏｂｉｎ ｌｅａｄｅｒ配列をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングによって挿入して、図１のＳＴＥＰ２に示すｐｔＣＭＶベクターを作製した。作製したｐｔＣＭＶベクター、実施例２において作製したベクターライブラリー、およびＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｌａｂ ＴＡＬＥＮ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐａｃｋ（共にＡｄｄｇｅｎｅ）に含まれるベクター類を用いて、図１のＳＴＥＰ２に示すように、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法によって、ＤＮＡ結合ドメインを挿入し、ＴＡＬＥＮ発現ベクターを作製した。ｐｔＣＭＶベクターとしては、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端側に隣接する領域（ＴＡＬＥＮ−Ｎ’）のアミノ酸数が１５３であり、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端側とＤＮＡ切断ドメインに挟まれた領域（ＴＡＬＥＮ−Ｃ’）のアミノ酸数が４７であるものを用いた。作製したＴＡＬＥＮの塩基配列ならびにアミノ酸配列の一例を、図３に示す。
図３に示すように、実施例３のＴＡＬＥＮ発現用ベクターにおけるＤＮＡ結合モジュール（全３４アミノ酸）の４番目および３２番目のアミノ酸は、４ｎ−３番目、４ｎ−２番目、４ｎ−１番目、および４ｎ番目（ｎは自然数）のＤＮＡ結合モジュールにおいて、それぞれ異なっていた。また、４ｎ−３番目（ｎは自然数）のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目および３２番目のアミノ酸は、それぞれのＤＮＡ結合モジュールにおいて共通であった。このことは、４ｎ−２番目、４ｎ−１番目、および４ｎ番目（ｎは自然数）のＤＮＡ結合モジュールにおいても、同様であった。このように、実施例１のベクターセットおよび実施例２のベクターライブラリーを用いることによって、４つのＤＮＡ結合モジュールごとに繰り返し様式を呈するＴＡＬＥＮ発現ベクターを作製することができた。

【0051】

比較例１ ＴＡＬＥＮ発現ベクターの作製：
実施例１において作製したベクターセットの代わりに、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ａｄｄｇｅｎｅ）に含まれるｐＨＤ１−６、ｐＮＧ１−６、ｐＮＩ１−６、ｐＮＮ１−６を使用し、また、反応に使用するｐＦＵＳベクターとして、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｌａｂ ＴＡＬＥＮ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐａｃｋ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用した他は、実施例２と同様にＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応を行い、ベクターライブラリーを作製した。作製したベクターライブラリーを用いて、実施例３と同様の方法によってＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応を行い、ＴＡＬＥＮ発現ベクターを作製した。

【0052】

比較例２ ＴＡＬＥＮ発現ベクターの作製：
ｐｔＣＭＶベクターとして、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端側に隣接する領域（ＴＡＬＥＮ−Ｎ’）のアミノ酸数が１３６でありＤＮＡ結合ドメインのＣ末端側とＤＮＡ切断ドメインに挟まれた領域（ＴＡＬＥＮ−Ｃ’）のアミノ酸数が６３であるものを用いた他は、実施例３と同様の方法を行い、ＴＡＬＥＮ発現ベクターを作製した。

【0053】

比較例３ ＴＡＬＥＮ発現ベクターの作製：
ｐｔＣＭＶベクターとして、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端側に隣接する領域（ＴＡＬＥＮ−Ｎ’）のアミノ酸数が１３６でありＤＮＡ結合ドメインのＣ末端側とＤＮＡ切断ドメインに挟まれた領域（ＴＡＬＥＮ−Ｃ’）のアミノ酸数が６３であるものを用いた他は、比較例１と同様の方法を行い、ＴＡＬＥＮ発現ベクターを作製した。

【0054】

試験例１ ＴＡＬＥＮの認識特異性の評価：
図４Ｂに示すとおりの部位を認識するＴＡＬＥＮ発現ベクター（Ｌ１４〜Ｌ２０、およびＲ１４〜Ｒ２０）を、実施例３、または比較例１〜３と同様の方法によって作製した。作製したＬ１４〜Ｌ２０から１種と、Ｒ１４〜Ｒ２０から１種とを、図４Ｃの表に示すように組み合わせて左右のＴＡＬＥＮ発現ベクターとし、図４Ｂに示す配列をＴＡＬＥＮの標的配列として用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたシングル・ストランド・アニーリングアッセイ（非特許文献５参照）によって、ＴＡＬＥＮ活性評価を行った。
シングル・ストランド・アニーリングアッセイは、具体的には、以下のようにして行った。まず、ＣＭＶプロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を分断化して連結したレポーターベクター（ｐＧＬ４−ＳＳＡ；Ａｄｄｇｅｎｅ）に、目的のＴＡＬＥＮの標的配列を挿入したレポーターベクターを作製した。この際、ＴＡＬＥＮの標的配列は、合成オリゴをアニーリングして作製し、ＢｓａＩ処理したｐＧＬ４−ＳＳＡベクターにＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ニッポンジーン）を用いて挿入した。その後、作製したレポーターベクターを、ＴＡＬＥＮ発現ベクター、およびウミシイタケルシフェラーゼの発現ベクターであるｐＲＬ−ＣＭＶベクター（プロメガ）と共に、９６ウェルプレート上で、リポフェクション法によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、２４時間培養した後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてレポーター活性を測定した。導入したＤＮＡ量は、左右のＴＡＬＥＮ発現ベクターは、それぞれ２００ｎｇ、レポーターベクターが１００ｎｇ、ｐＲＬ−ＣＭＶベクターが２０ｎｇである。化学発光の計測にはＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ ９４１ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ベルトールド）を用いた。
実施例３、および比較例１〜３における各左右のＴＡＬＥＮ発現ベクターの組合せのそれぞれの場合について、比較例１のＬ２０およびＲ１７の組合せの場合と比較したレポーター活性の相対値を図４Ｃに示す。各左右のＴＡＬＥＮの組合せについての左右のＴＡＬＥＮの認識部位に挟まれるスペーサー領域の長さ（塩基数）を、図４Ｂの表に示す。
図４Ｃに示すように、実施例３および比較例１の場合には、スペーサー領域が、１２〜１５などの限られた場合において、特異的に高い活性が得られ、限られたスペーサー領域に対する特異的な切断が可能であることが分かる。これに対して、比較例２および比較例３の場合には、活性の高さは、スペーサー領域の長さと特に関係がなく、スペーサー配列の長さが異なる配列をも認識して切断する可能性が高いことが分かる。このことから、実施例３のＴＡＬＥＮ発現ベクターを用いることによって、スペーサー領域の異なる配列に対する非特異的切断の少ない効果的なＤＮＡ切断を行うことができることが分かる。

【0055】

試験例２ ＴＡＬＥＮの活性の評価：
図５Ａに示すとおりの部位を認識するＴＡＬＥＮ発現ベクターの左右のペア（ＡＴＭ（左としてＬ１７、右としてＲ１７）、ＡＰＣ（左としてＬ１７、右としてＲ１７）、およびｅＧＦＰ（左としてＬ２０、右としてＲ１８））を、実施例３、または比較例１〜３と同様の方法によって作製した。それぞれの方法によって作製した左右のペアを左右のＴＡＬＥＮ発現ベクターとして用いて、図５Ａに示す配列をＴＡＬＥＮの標的配列として用いて、試験例１と同様の方法を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたシングル・ストランド・アニーリングアッセイ（非特許文献５）を行い、ＴＡＬＥＮ活性評価を行った。
結果を図５Ｂに示す。図５Ｂにおいて、縦軸の数値は、試験例１において作製した比較例１のＬ２０およびＲ１７の組合せの場合と比較したレポーター活性の相対値である。図５Ｂに示すように、実施例３の場合には、ＡＴＭ、ＡＰＣ、およびｅＧＰＦのいずれの場合においても、比較例１に比して高いＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断活性が観察された。このことから、ＤＮＡ結合モジュールについての本発明の繰り返し構造を持たせることによって、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ切断活性を向上させることができることが分かった。

【0056】

試験例３ ＴＡＬＥＮの認識特異性の評価：
図６Ａに示すとおりの部位を認識するＴＡＬＥＮ発現ベクターの左右のペア（左としてＬ１９および右としてＲ１８）を、実施例３、または比較例１〜３と同様の方法によって作製した。それぞれの方法によって作製した左右のペアを左右のＴＡＬＥＮ発現ベクターとして用いて、図６Ａに示す配列（ミスマッチなし（ｎｏ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、左１ミスマッチ右０ミスマッチ（Ｌ：１ｍｉｓｍａｔｃｈ／Ｒ：０ｍｉｓｍａｔｃｈ）、左１ミスマッチ右１ミスマッチ（Ｌ：１ｍｉｓｍａｔｃｈ／Ｒ：１ｍｉｓｍａｔｃｈ）、または左２ミスマッチ右２ミスマッチ（Ｌ：２ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ／Ｒ：２ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ））をＴＡＬＥＮの標的配列として用いて、試験例１と同様の方法を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたシングル・ストランド・アニーリングアッセイ（非特許文献５）を行い、ＴＡＬＥＮ活性評価を行った。ＴＡＬＥＮの標的配列として図６Ａ中のそれぞれの配列を用いた場合には、図６Ａにおける小文字の部分においてミスマッチが生じるため、用いたＴＡＬＥＮの標的配列についてＴＡＬＥＮ活性評価の結果を比較することによって、用いたＴＡＬＥＮの認識特異性の高さを比較することができる。
結果を図６Ｂに示す。図６Ｂの縦軸の数値は、ホタルルシフェラーゼ活性の測定値をウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定値で割った相対活性を示す。図６Ｂに示すように、比較例２のＴＡＬＥＮ発現ベクターを用いた場合には、左２ミスマッチ右２ミスマッチの配列を用いた場合であっても、高い活性が観察され、比較例２のＴＡＬＥＮ発現ベクターの認識特異性は、低かった。これに対して、実施例３のＴＡＬＥＮ発現ベクターを用いた場合には、左２ミスマッチ右２ミスマッチの配列を用いた場合には、活性のほぼ完全な消失が観察された。このことから、実施例３のＴＡＬＥＮ発現ベクターは、試験例２に示すような高い切断活性を保持しつつ、特異性の高いＤＮＡ切断を行うことができるものであり、実施例３のＴＡＬＥＮ発現ベクターを用いることによって、目的とする標的ＤＮＡを高確率で安全に切断できることが分かった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]