特許 5943837 ＥＰＨＡ２受容体に特異的に結合する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5943837

(24)【登録日】2016年6月3日

(45)【発行日】2016年7月5日

(54)【発明の名称】ＥＰＨＡ２受容体に特異的に結合する抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20160621BHJP

   A61K 31/5365 20060101ALI20160621BHJP

   C07D 498/18 20060101ALI20160621BHJP

   C07D 519/00 20060101ALI20160621BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160621BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160621BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20160621BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20160621BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   A61K31/5365

   C07D498/18 311

   C07D519/00CSP

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   A61K39/395 L

   !C12P21/08

   !C12N15/00 A

【請求項の数】27

【全頁数】113

(21)【出願番号】特願2012-531543(P2012-531543)

(86)(22)【出願日】2010年9月30日

(65)【公表番号】特表2013-506654(P2013-506654A)

(43)【公表日】2013年2月28日

(86)【国際出願番号】IB2010054422

(87)【国際公開番号】WO2011039724

(87)【国際公開日】20110407

【審査請求日】2013年7月30日

(31)【優先権主張番号】09305938.4

(32)【優先日】2009年10月2日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】504456798

【氏名又は名称】サノフイ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ブシヤール，エルベ

(72)【発明者】

【氏名】コメルソン，アラン

(72)【発明者】

【氏名】フロモン，クローデイア

(72)【発明者】

【氏名】ミコル，バンサン

(72)【発明者】

【氏名】パルケー，フアビエンヌ

(72)【発明者】

【氏名】サソーン，アングリツド

(72)【発明者】

【氏名】タバレス，ダニエル

【審査官】 長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５０６６５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０１０１０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Mol. Biol.，２００９年 ５月，Vol.388，pp.541-558

【文献】 Protein Engineering, Design & Selection，２００４年，Vol.17, No.12，pp.847-860

【文献】 Nature Medicine，２００３年，Vol.9, No.1，pp.129-134

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合して、少なくとも１つの重鎖および少なくとも１つの軽鎖を備える抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、
前記重鎖が、配列番号１２から成るアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、配列番号１、２および３によって表されるアミノ酸配列を有する３個の連続相補性決定領域を含み、７４位にアルギニンを含み、
前記軽鎖が、配列番号１４から成るアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、配列番号４、５および６によって表されるアミノ酸配列を有する３個の連続相補性決定領域を含み、
但し、細胞傷害性剤にコンジュゲートされたとき、コンジュゲーションは抗体の親和性に影響を与えない、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項2】

細胞傷害性剤にコンジュゲートされたとき、Ｋ_Ｄが、５．６から８．４の範囲に及ぶ薬物対抗体比で、裸の抗体と有意に異なっていない、請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項3】

前記重鎖が、配列番号１２から成るアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有する配列を含み、前記軽鎖が、配列番号１４から成るアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項4】

前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントがヒト化もしくは表面再処理抗体またはそのエピトープ結合フラグメントである、請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項5】

前記重鎖が配列番号１２から成るアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖が配列番号１４から成るアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項6】

前記重鎖が配列番号１８のアミノ酸配列に存し、および前記軽鎖が配列番号１６のアミノ酸配列に存する、請求項１に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項7】

請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはエピトープ結合フラグメントのコンジュゲートであって、前記コンジュゲートが：
ａ）式（ＸＩＩＩ）のメイタンシノイド：

【化1】

ｂ）式（ＸＩＶ）のメイタンシノイド：

【化2】

ｃ）式（ＸＸＩＶ）のメイタンシノイド：

【化3】

ｄ）式（ＸＸＶ）のメイタンシノイド：

【化4】

ｅ）式（ＸＸＶＩ）のメイタンシノイド：

【化5】

ｆ）式（ＸＸＶＩＩ）のメイタンシノイド：

【化6】

の間で選ばれる細胞傷害性剤を備えるコンジュゲート。

【請求項8】

前記細胞傷害性剤が抗体に共有結合されている、請求項７に記載のコンジュゲート。

【請求項9】

細胞傷害性剤が式（ＸＩＩＩ）のメイタンシノイドである、請求項７または８のいずれかに記載のコンジュゲート。

【請求項10】

前記コンジュゲートが式（ＸＶ）の構造：

【化7】

および式（ＸＶＩ）の構造：

【化8】

（式中、Ａｂは請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体であり、およびｎは１から１５の間で構成される整数である。）
の間で選ばれる構造を有する、請求項７から９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項11】

ｎが４から７の間で構成される、請求項１０に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【請求項12】

式（ＸＶ）の構造を有する、請求項１１に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【請求項13】

コンジュゲートを調製する方法であって：
（ｉ）細胞結合剤の水溶液を細胞傷害性化合物の溶液と接触させるステップと；
（ｉｉ）次に、（ｉ）で形成されたコンジュゲートを未反応試薬および溶液中に存在し得るいずれの凝集体からも分離するステップと；を備え
該細胞結合剤が、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体であり、
細胞傷害性剤が、
式（ＸＶＩＩ）の化合物：

【化9】

（式中、Ｙは、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、Ｎ−スルホスクシンイミジルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−スルホフタルイミジルオキシ、２−ニトロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、２，４−ジニトロフェニルオキシ、３−スルホニル−４−ニトロフェニルオキシ、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルオキシ、イミダゾリル、またはハロゲン原子である。）；および
式（ＸＶＩＩＩ）の化合物：

【化10】

（式中、Ｙは、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、Ｎ−スルホスクシンイミジルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−スルホフタルイミジルオキシ、２−ニトロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、２，４−ジニトロフェニルオキシ、３−スルホニル−４−ニトロフェニルオキシ、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルオキシ、イミダゾリル、また
はハロゲン原子である。）
の間で選ばれる細胞傷害性剤である、方法。

【請求項14】

請求項１から６のいずれかに記載の抗体もしくはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項７から１２のいずれかに記載のコンジュゲート、ならびに医薬的に許容される担体または賦形剤を含有する、医薬組成物。

【請求項15】

医薬品としての使用のための、請求項１から６のいずれかに記載の抗体もしくはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項７から１２のいずれかに記載のコンジュゲート。

【請求項16】

癌を処置する医薬品を作製するための、請求項１から６のいずれかに記載の抗体もしくはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項７から１２のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。

【請求項17】

癌が膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸、甲状腺および皮膚の癌腫を含む；扁平上皮細胞癌腫を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含む、リンパ系の造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病を含む、骨髄系の造血器腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、奇形癌（ｔｅｔｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、神経芽細胞腫および神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫，神経膠腫および神経鞘腫を含む、中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒａｍａ）および骨肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫（ｋｅｒａｔｏａｃｔａｎｔｈｏｍａ）、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌を含む他の腫瘍の間から選ばれる、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントのパラトープが軽鎖内に：ループ１のＡｒｇ３５、Ｌ２のＴｙｒ５４、Ａｒｇ５８およびＡｓｐ６０を備える、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項19】

前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントのパラトープが重鎖内に：ループＨ１のＴｈｒ３０、Ａｌａ３１、Ｔｙｒ３２およびＴｙｒ３３、Ｈ２のＡｓｎ５２、Ｔｙｒ５４、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５７ならびにＨ３のＧｌｕ９９、Ｐｈｅ１００、Ｔｙｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｔｙｒ１０３およびＴｙｒ１０５を備える、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項20】

前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントのパラトープが位置：Ｔｈｒ Ｈ２８に変異を備える、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項21】

前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが軽鎖上の以下の幾つかの位置：３５、２６から３１、３４から３７、５５、５６、５７、５９および９４から１０２の１つに変異を備える、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項22】

前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが重鎖上の以下の幾つかの位置：２８、５４および５７の１つに変異を備える、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項23】

ＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインからのＬＢＤの残基Ｇｌｙ４９、Ｌｙｓ５０、Ｇｌｙ５１、Ａｓｐ５３、Ｃｙｓ７０、Ａｓｎ７１、Ｖａｌ７２、Ｍｅｔ７３、Ｓｅｒ７４、Ｇｌｙ７５、Ｇｌｎ７７、Ｐｈｅ１０８、Ｐｒｏ１０９、Ｇｌｙ１１０、Ｇｌｙ１１１、Ｓｅｒ１１３およびＳｅｒ１１４を備えるヒトＥｐｈＡ２受容体のエピトープ、またはその保存的置換形に特異的に結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。

【請求項24】

４を超える平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有する請求項７から１２のいずれかに記載のコンジュゲートであって、該ＤＡＲがＵＶ分光光度計を用いて測定され、および以下の等式ＤＡＲ＝ｃ_Ｄ／ｃ_Ａによって決定され、
式中：

【数1】

Ａ_２５２およびＡ_２８０がＵＶ分光光度計で２５２および２８０ｎｍにてそれぞれ測定されたコンジュゲートの吸光度である、コンジュゲート。

【請求項25】

４から１０または５から８の間で構成される平均ＤＡＲを有する、請求項２４に記載のコンジュゲート。

【請求項26】

５．９から７．５の間で構成される平均ＤＡＲを有する、請求項２４に記載のコンジュゲート。

【請求項27】

ａ）包装材料
ｂ）請求項１から６のいずれかに記載の抗体もしくはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項７から１２および２４から２６のいずれかに記載のコンジュゲート、ならびに
ｃ）前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが癌を処置するのに有効であることを指摘する、前記包装材料内に含有されたラベルまたは添付文書を備える、
製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合する抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントに関するものである。

【0002】

本発明は、抗体に共有結合する細胞傷害性剤を備えるコンジュゲートおよびこのようなコンジュゲートを調製する方法にさらに関する。

【背景技術】

【0003】

癌は、異常なシグナル伝達から生じる制御不能な増殖を特徴とする疾患である。癌の最も危険な形は、浸潤を通じた隣接組織への直接の成長、または転移による遠隔部位への移植性転移のどちらかによって伝播する能力を有する悪性細胞である。転移性細胞は、原発性腫瘍から脱離して、血流またはリンパ系を通じて遠隔部位まで転位置し、遠隔および外来性微小環境をコロニー形成する能力を獲得している。

【0004】

Ｅｐｈ分子が癌などの疾患状態に関与することが今や明らかである。Ｅｐｈ受容体は、８つの膜結合エフリンリガンドと相互作用する２つの群ＡおよびＢに分けられた１４の受容体から成る、ゲノム中で最大である受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の独自のファミリである（Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：４６２−４７５）。Ｅｐｈ受容体のこれのリガンドへの結合は、受容体のクラスター化、キナーゼ活性の活性化および続いて起こるチロシン残基の細胞質ドメインのリン酸基転移を誘発して、幾つかのシグナル伝達タンパク質の接合部位を生成する（Ｋｕｌｌａｎｄｅｒ，Ｋ．ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ，Ｒ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：４７５−４８６；Ｎｏｒｅｎ，Ｎ．Ｋ．ａｎｄ Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｅ．Ｂ．，２００４，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌ．，１６：６５５−６６６）。

【0005】

ＥｐｈＡ２受容体の過剰発現が卵巣癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、食道癌、腎細胞癌、子宮頸癌および黒色腫で報告されている。ＥｐｈＡ２が悪性細胞における細胞成長および生存の正の調節因子であることが示唆された（Ｌａｎｄｅｎ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，９（６）：１１７９−１１８７）。癌におけるＥｐｈＡ２の役割も記載されているのは、ＥｐｈＡ２過剰発現のみで乳房上皮細胞を悪性表現型に形質転換するのに十分であり（Ｚｅｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６１：２３０１−２３０６）、遠隔部位への自然転移を増加させるためである（Ｌａｎｄｅｎ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，９（６）：１１７９−１１８７）。

【0006】

さらにますます多くの証拠が、ＥｐｈＡ２が腫瘍新脈管形成に関与していることを示唆している（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：６０４３−６０５２；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１：２−１１；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，５（５）：４４５−４５６；Ｄｏｂｒｚａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６４：９１０−９１９）。

【0007】

ＥｐｈＡ２のリン酸化は、ＥｐｈＡ２の豊富さに結び付いていることが示されている。チロシンリン酸化ＥｐｈＡ２は急速に内部移行して分解される運命にあるのに対して、非リン酸化ＥｐｈＡ２は、代謝回転の低下を示し、ゆえに細胞表面に蓄積する。現在、この種のモデルが癌における高い頻度のＥｐｈＡ２過剰発現に寄与し得ることが考えられている（Ｌａｎｄｅｎ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，９（６）：１１７９−１１８７）。しかし現実がより複雑であり得るのは、最近のデータが腫瘍進行におけるＥｐｈＡ２キナーゼ依存性および非依存性機能の役割を示すと思われるためである（Ｆａｎｇ Ｗ．Ｂ．，２００５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２４：７８５９−７８６８）。

【0008】

ＥｐｈＡ２チロシンリン酸化および内部移行を促進して、腫瘍細胞成長の阻害を最終的に生じるアゴニスト抗体が開発された（Ｄｏｄｇｅ−Ｚａｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ，１０：６２９−６３８；ＷＯ０１／１２１７２、ＷＯ０３／０９４８５９、ＷＯ２００４／０１４２９２、ＷＯ２００４／１０１７６４、ＷＯ２００６／０２３４０３、ＷＯ２００６／０４７６３７、ＷＯ２００７／０３０６４２）。

【0009】

出願ＷＯ２００６／０８４２２６は、ＥｐｈＡ２キナーゼ活性を上昇も低下もさせないが、腫瘍細胞増殖を妨害することができる抗体を開示している。しかし、これらの抗体がエフリンＡ１の受容体への結合を防止して、エフリンＡ１誘起ＥｐｈＡ２リン酸化を阻害するという指摘がこの出願にはない。アンタゴニスト抗体の使用がＷＯ２００４／０９２３４３で提案されているが、ここでは実際の抗体は開示されなかった。真のアンタゴニストであるＥｐｈＡ２を認識する抗体、ならびにこれのヒト化バリアントおよびコンジュゲートはＷＯ２００８／０１０１０１に記載されている。これらの抗体およびこれの誘導体は、ＥｐｈＡ２キナーゼ依存性の腫瘍細胞成長を阻害する。

【0010】

これにもかかわらず、癌療法で使用できる新規の有効な医薬品への要求が、今でもまだある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】国際公開第０１／１２１７２号

【特許文献2】国際公開第０３／０９４８５９号

【特許文献3】国際公開第２００４／０１４２９２号

【特許文献4】国際公開第２００４／１０１７６４号

【特許文献5】国際公開第２００６／０２３４０３号

【特許文献6】国際公開第２００６／０４７６３７号

【特許文献7】国際公開第２００７／０３０６４２号

【特許文献8】国際公開第２００６／０８４２２６号

【特許文献9】国際公開第２００４／０９２３４３号

【特許文献10】国際公開第２００８／０１０１０１号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：４６２−４７５

【非特許文献2】Ｋｕｌｌａｎｄｅｒ，Ｋ．ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ，Ｒ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：４７５−４８６

【非特許文献3】Ｎｏｒｅｎ，Ｎ．Ｋ．ａｎｄ Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｅ．Ｂ．，２００４，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌ．，１６：６５５−６６６

【非特許文献4】Ｌａｎｄｅｎ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，９（６）：１１７９−１１８７

【非特許文献5】Ｚｅｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６１：２３０１−２３０６

【非特許文献6】Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：６０４３−６０５２

【非特許文献7】Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１：２−１１

【非特許文献8】Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，５（５）：４４５−４５６

【非特許文献9】Ｄｏｂｒｚａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６４：９１０−９１９

【非特許文献10】Ｆａｎｇ Ｗ．Ｂ．，２００５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２４：７８５９−７８６８

【非特許文献11】Ｄｏｄｇｅ−Ｚａｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ，１０：６２９−６３８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明の目的は、クラスＡ Ｅｐｈ受容体ファミリメンバ、例えばＥｐｈＡ２に特異的に結合して、受容体を拮抗することにより受容体の細胞活性を阻害する新たな薬剤を提供することである。このため本発明は、好ましくはヒトのＥｐｈＡ２受容体を認識して前記受容体のアンタゴニストとして機能する抗体またはこれのフラグメントを含む。これらの抗体には、いずれのアゴニスト活性もない。

【課題を解決するための手段】

【0014】

一実施形態において、本発明の抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは、少なくとも１つの重鎖および少なくとも１つの軽鎖を備え、前記重鎖は、配列番号１、２および３によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を備え、前記軽鎖は、配列番号４、５および６によって表されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を備える。好ましい実施形態において、前記抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは、ヒト化または表面再処理（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）抗体である。なおさらに好ましい実施形態において、前記抗体またはこれのエピトープ結合断片の重鎖は、配列番号１２から成るアミノ酸配列を備え、前記抗体またはこれのエピトープ結合断片の軽鎖は、配列番号１４から成るアミノ酸配列を備える。

【0015】

さらなる実施形態において、前記抗体の重鎖はアミノ酸配列 配列番号１８を有し、前記抗体の軽鎖はアミノ酸配列 配列番号１６を有する。

【0016】

別の実施形態において，前記抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは、細胞傷害性剤にコンジュゲートされている。ゆえに本発明の態様は、本発明の抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントのコンジュゲートを提供することであり、前記コンジュゲートは：
式（ＸＩＩＩ）の化合物：

【0017】

【化1】

式（ＸＩＶ）の化合物：

【0018】

【化2】

式（ＸＸＩＶ）の化合物：

【0019】

【化3】

式（ＸＸＶ）の化合物：

【0020】

【化4】

式（ＸＸＶＩ）の化合物：

【0021】

【化5】

および
式（ＸＸＶＩＩ）の化合物：

【0022】

【化6】

の間から選ばれる結合細胞傷害性剤を備える。

【0023】

好ましい実施形態において、コンジュゲートは細胞傷害性剤としての式（ＸＩＩＩ）の化合物を備える。さらに好ましい実施形態において、前記コンジュゲート中で抗体分子（ＤＡＲ）によって結合されたマイタンシノイド分子の数は、４から７個の間のマイタンシノイド分子／抗体分子で構成され、前記ＤＡＲは、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度の比を分光光度的に測定することによって決定される。

【0024】

別の態様において、コンジュゲートを調製する方法が提供され、該方法は：
（ｉ）細胞結合剤の場合により緩衝された水溶液を細胞傷害性化合物の溶液と接触させるステップと；
（ｉｉ）次に、（ｉ）で形成されたコンジュゲートを未反応試薬および溶液中に存在し得るいずれの凝集体からも場合により分離するステップとを備え、
ここで細胞結合剤は、請求項１から３に記載の抗体および：
式（ＸＶＩＩ）の化合物：

【0025】

【化7】

（式中、Ｙは、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、Ｎ−スルホスクシンイミジルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−スルホフタルイミジルオキシ、２−ニトロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、２，４−ジニトロフェニルオキシ、３−スルホニル−４−ニトロフェニルオキシ、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルオキシ、イミダゾリル、またはハロゲン原子である。）；および
式（ＸＶＩＩＩ）の化合物：

【0026】

【化8】

（式中、Ｙは、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、Ｎ−スルホスクシンイミジルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−スルホフタルイミジルオキシ、２−ニトロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、２，４−ジニトロフェニルオキシ、３−スルホニル−４−ニトロフェニルオキシ、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルオキシ、イミダゾリル、またはハロゲン原子である。）の間からから選ばれる細胞傷害性剤である。

【0027】

前記方法によって得ることができるコンジュゲートは、本発明の範囲内に含まれる。特にこのようなコンジュゲートは、式（ＸＶ）の構造：

【0028】

【化9】

および式（ＸＶＩ）の構造：

【0029】

【化10】

（式中、Ａｂは本発明による抗体であり、ｎは１から１５の間で構成される整数である。）の間から選ばれる構造を有する。好ましい実施形態において、ｎは４から７の間で構成される。別の好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、式（ＸＶ）の構造を有する。

【0030】

本発明の抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントの抗原に対する親和性は、コンジュゲーション方法に影響されない；他方、従来技術の細胞傷害性剤の抗体へのコンジュゲーションは、ＥｐｈＡ２に対する親和性の低下を生じる。本発明の前記抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは、細胞傷害性剤にコンジュゲートされているとき、より大きい効力を示し、従来技術のコンジュゲートよりもＥｐｈＡ２を発現する腫瘍細胞を死滅させることに選択的である。加えて本発明のコンジュゲートは、従来技術のコンジュゲートに優る好都合な薬物動態特性、例えばインビボでのコンジュゲートのより低速のクリアランス、より良好な曝露およびより高い安定性を示す。このような特性は、高い細胞傷害性有効性および選択性と共に、安全で有効でもある医薬品の開発に特に有用である。

【0031】

ゆえに本発明は、本発明の抗体もしくはこれのエピトープ結合フラグメント、またはこれのコンジュゲートおよび医薬的に許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物を含む。本発明の抗体もしくはこれのエピトープ結合フラグメント、またはこれのコンジュゲートは、医薬品として使用することができる。特にこれらは、癌を処置する医薬品を作製するために使用することができる。好ましい実施形態において、前記癌は、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸、甲状腺および皮膚の癌腫を含む；扁平上皮細胞癌腫を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含む、リンパ系の造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病を含む、骨髄系の造血器腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、奇形癌、甲状腺濾胞癌、色素性乾皮症、角化棘細胞腫（ｋｅｒａｔｏａｃｔａｎｔｈｏｍａ）を含む、他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および神経鞘腫を含む、中枢および末梢神経系の腫瘍の間から選ばれる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1A】ＣＤＲ、ｍｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ、ならびにｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＶ_ＨおよびＶ_Ｌの配列を示す。

【図1B】ＣＤＲ、ｍｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ、ならびにｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＶ_ＨおよびＶ_Ｌの配列を示す。

【図1C】ＣＤＲ、ｍｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ、ならびにｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＶ_ＨおよびＶ_Ｌの配列を示す。

【図2】方法Ｃを使用する、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４のＨＲＭＳスペクトル（実施例１ａ．１）。

【図3】方法Ｃを使用する、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４のＨＲＭＳスペクトル（実施例１ｂ．１）。

【図4】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＥｐｈＡ２のリン酸化の動態分析ＷＴ：野生型未処置細胞；ＭＷ：分子量マーカー；Ｐ−ＥｐｈＡ２：リン酸化Ｅｐｈａ２

【図5A】ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞でのエフリンＡ１／Ｆｃによる誘発後のＥｐｈＡ２のリン酸化の阻害；ＷＴ：野生型未処置細胞；ＭＷ：分子量マーカー；Ｐ−ＥｐｈＡ２：リン酸化ＥｐｈＡ２。

【図5B】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのエフリンＡ１／Ｆｃによる誘発後のＥｐｈＡ２のリン酸化の阻害；ＷＴ：野生型未処置細胞；ＭＷ：分子量マーカー；Ｐ−ＥｐｈＡ２：リン酸化ＥｐｈＡ２。

【図6】ｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４と比較した、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４の細胞傷害性活性（小さい黒丸：ＤＡＲ＝６．７；大きい黒丸：ＤＡＲ＝７．０）。

【図7】オスＣＤ−１マウスへのＨＧＳ中の２０ｍｇ／ｋｇのイムノコンジュゲートの単回用量静脈内投与後の、ｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の平均血漿濃度（ｎ＝２）の時間プロット（片対数スケール）表示。ヒトＩｇＧの総濃度（黒ひし形）およびコンジュゲート画分（白四角）を示す。

【図8】オスＣＤ−１マウスへのＨＧＳ中の２０ｍｇ／ｋｇのイムノコンジュゲートの単回用量静脈内投与後の、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の平均血漿濃度（ｎ＝２）の時間プロット（片対数スケール）表示。ヒトＩｇＧの総濃度（黒ひし形）およびコンジュゲート画分（白四角）を示す。

【図9A】各種のＤＡＲにおけるｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４のＰＫパラメータ、オスＣＤ−１マウス（ｎ＝４）への２０ｍｇ／ｋｇのＨＧＳ中のイムノコンジュゲートの単回用量静脈内投与後の、ＤＡＲの関数としての複数のＡＤＣへの曝露（ＡＵＣ（０−ｉｎｆ））の棒グラフ表示。

【図9B】各種のＤＡＲにおけるｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４のＰＫパラメータ、オスＣＤ−１マウス（ｎ＝４）への２０ｍｇ／ｋｇのＨＧＳ中のイムノコンジュゲートの単回用量静脈内投与後の、ＤＡＲの関数としての複数のＡＤＣのクリアランス（Ｃｌ）の棒グラフ表示。

【図10】Ｆａｂ２Ｈ１１へのＥｐｈＡ２エピトープのマッピングを示す。

【図11】濃いグレーの残基がエピトープ部分であり、薄いグレーの残基が結晶構造では見えない、ＥｐｈＡ２の配列。

【図12A】複合体の構造全体を表す。

【図12B】２つのＦａｂ変異を有する部分の拡大である。

【図13】パラトープの構造を表す。

【図14】ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＭｅＡｃ−ＤＭ４のＨＲＭＳスペクトル。

【図15】ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ８−ＮＨＡｃ−ＤＭ４のＨＲＭＳスペクトル。

【図16】ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−アリル−ＤＭ４のＨＲＭＳスペクトル。

【図17】ｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４のＨＲＭＳスペクトル。

【発明を実施するための形態】

【0033】

本明細書で別途定義しない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって普通に理解される意味を有するものとする。さらに、状況によって別途要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、細菌学、遺伝子学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される用語、ならびにこれらの技法は、当分野で周知であり、普通に使用されるものである。本発明の実施は、別途指摘しない限り、当業技術の範囲内である分子生物学（組換え技法を含む。）、細菌学、細胞生物学、生化学および免疫学の在来の技法を用いる。このような技法は、文献、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｈ，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，ｅｄ．，１９９４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）で十分に説明されている。

【0034】

酵素反応および精製技法は、当分野で普通に実現されるようにまたは本明細書に記載するように、製造者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および医薬化学に関連して使用される用語、ならびにこれの実験手順および技法は、当分野で周知であり、普通に使用されるものである。標準技法は、化学合成、化学分析、医薬調製物、製剤および送達、ならびに患者の処置に使用される。

【0035】

ＥｐｈＡ２受容体を特異的に結合して、前記受容体を拮抗することができる新たな抗体およびこれのフラグメントは、本明細書で提供される。特に、本発明の新規抗体またはフラグメントは、細胞表面上のＥｐｈ受容体を特異的に結合するが、いずれのアゴニスト活性も優先的に欠いている。他方、本発明の新規抗体またはフラグメントは受容体の細胞機能を、受容体のリガンドの存在下でも阻害することができる。

【0036】

本明細書で使用する場合、「ＥｐｈＡ２受容体」という用語は、Ｅｐｈ受容体ファミリに属して（Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，４６２−４７５にて総説されている。）、例えばＧｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００４４３１（ヒトＥｐｈＡ２）、ＮＭ＿０１０１３９（マウスＥｐｈＡ２）、またはＮＸＭ＿３４５５９６（ラットＥｐｈＡ２）のようなアミノ酸配列を備えるチロシンキナーゼを指す。ヒトＥｐｈＡ２は、好ましいＥｐｈＡ２受容体である。「ＥｐｈＡ２リガンド」という用語は本明細書で使用する場合、ＥｐｈＡ２受容体に結合して、場合によりこれを活性化する（例えばＥｐｈＡ２受容体の自己リン酸化を刺激する）タンパク質を指す。本明細書で好ましいＥｐｈＡ２リガンドは、「エフリンＡ１」であり、これはＥｐｈＡ２受容体に結合して、例えばＧｅｎｂａｎｋアクセションＮＭ＿００４４２８（ヒトエフリンＡ１）のようなアミノ酸配列を備える。

【0037】

「アンタゴニスト」という用語は本明細書で使用する場合、標的分子の１つ以上の生物活性を阻害することができる分子、例えばＥｐｈＡ２受容体を指す。アンタゴニストは、受容体のリガンドへの結合およびリガンドの受容体への結合を阻害することによって、リガンドによって誘発することができるＥｐｈＡ２リン酸化を低下させることによって、ならびに／またはこのようなリガンドの結合により誘発される細胞内経路を阻害することによって、ならびに／またはＥｐｈＡ受容体のホモ／ヘテロ−オリゴマー化を阻害することによって作用し得る。アンタゴニストは、受容体−リガンド相互作用を完全に遮断し得るか、またはこのような相互作用を実質的に低下し得る。アンタゴニストによるこのような介入点はすべて、本発明の目的のために同等と見なされるものとする。このためＥｐｈＡ２受容体、ＥｐｈＡ２リガンドまたはＥｐｈＡ２受容体およびＥｐｈＡ２リガンドの複合体に結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）；ＥｐｈＡ２受容体とＥｐｈＡ２リガンドとの間の相互作用を拮抗するＥｐｈＡ２受容体またはＥｐｈＡ２リガンドのアミノ酸配列バリアントまたは誘導体；免疫グロブリン領域（例えばイムノアドヘシン）などの異種分子に場合により融合する溶解性ＥｐｈＡ２受容体または溶解性ＥｐｈＡ２リガンド；ＥｐｈＡ２リガンドに会合したＥｐｈＡ２受容体を備える複合体；ＥｐｈＡ２受容体またはＥｐｈＡ２リンドに結合する合成または未変性配列ペプチドは、本発明の範囲に含まれる。好ましい実施形態において、アンタゴニストは抗体である。

【0038】

「アゴニスト」という用語は本明細書で使用する場合、標的分子の生物活性の１つ以上を活性化することができるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、コンジュゲート、大型分子、小型分子を含むいずれの化合物も指す。ＥｐｈＡ２アゴニストは、タンパク質のリン酸化を刺激して、これにより前記タンパク質の分解を引き起こすことによって作用する。

【0039】

このため好ましい実施形態において、本発明は、他の特徴の中でも、抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体、抗ＥｐｈＡ２ヒト化抗体および抗ＥｐｈＡ２抗体のフラグメントを提供する。本発明の抗体および抗体フラグメントはそれぞれＥｐｈＡ２受容体を特異的に認識および結合するように設計され、ＥｐｈＡ２受容体アンタゴニストとして作用して、ＥｐｈＡ２リガンドによって誘発されるリン酸化を阻害する。

【0040】

ＥｐｈＡ２受容体は、細胞質尾部のリン酸化が多種多様のアダプタおよびシグナル伝達タンパク質と相互作用するリガンド結合の後に増加して、異なる下流細胞シグナル伝達経路の活性化をもたらす、受容体のファミリに属する（Ｋｕｌｌａｎｄｅｒ，Ｋ．ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ，Ｒ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：４７５−４８６；Ｎｏｒｅｎ，Ｎ．Ｋ．ａｎｄ Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｅ．Ｂ．，２００４，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌ．，１６：６５５−６６６）。本明細書で使用する場合、「ＥｐｈＡ２介在シグナル伝達」という用語は、ＥｐｈＡ２によるリガンド結合に応答して発生するすべての細胞イベントを指す。従来技術で開示された抗体はＥｐｈＡ２受容体を作動させて、特にＥｐｈＡ２タンパク質のチロシンリン酸化を増加させるのに対して、本発明の抗体および抗体フラグメントは、このようないずれのアゴニスト特性も優先的に欠いている。特に、本発明の抗体および抗体フラグメントはＥｐｈＡ２リン酸化をこれらだけで刺激することはできない。ＷＯ２００８／０１０１０１に記載された抗体と同様に、本発明のアンタゴニスト抗体および抗体フラグメントは、いずれのアゴニスト活性も欠いている。詳細な実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体および抗体フラグメントは、従来技術に記載された他の抗体とは異なり、ＥｐｈＡ２のチロシンリン酸化を促進することができない（Ｄｏｄｇｅ−Ｚａｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ．，１０：６２９−６３８；ＷＯ０１／１２１７２、ＷＯ０３／０９４８５９、ＷＯ２００４／０１４２９２、ＷＯ２００４／１０１７６４、ＷＯ２００６／０２３４０３、ＷＯ２００６／０４７６３７、ＷＯ２００７／０３０６４２）。

【0041】

本発明は、実際のアンタゴニスト抗ＥｐｈＡ２抗体を提供する。本発明の抗体および抗体フラグメントは、前記ＥｐｈＡ２受容体のリガンド、例えばエフリンＡ１の存在下でも、ＥｐｈＡ２受容体の細胞機能を阻害する能力を有する。一実施形態において、本発明の抗体および抗体フラグメントは、リガンドのＥｐｈＡ２受容体への結合を阻害することができる。好ましい実施形態において、エフリンＡ１のＥｐｈＡ２への結合は、本発明により提供される抗体およびこれのフラグメントによって防止される。注目すべきことに、別の実施形態において、本発明の抗体および抗体フラグメントは、エフリンＡ１の存在下でも、ＥｐｈＡ２受容体のチロシンリン酸化を阻害することができる。

【0042】

抗体
「抗体」という用語は、最も広い意味にて本明細書で使用され、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなどの任意のアイソタイプのモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む。）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体および抗体フラグメントを特異的に対象とする。特異的抗原と反応性の抗体は、ファージもしくは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリの選択などの組換え方法により、または動物を抗原もしくは抗原コード核酸によって免疫化することにより生成することができる。

【0043】

代表的な抗体は、ジスルフィド結合によって接合された２個の同一の重鎖および２個の同一の軽鎖で構成されている。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する。本明細書で使用する場合、「Ｖ_Ｈ」または「ＶＨ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「Ｖ_Ｌ」または「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの軽鎖を含む、抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。各可変領域は、主として抗原のエピトープの結合に関与する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「高度可変領域」と呼ばれる３個のセグメントを含有する。これらのセグメントは通常、Ｎ末端から順にナンバリングされてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。可変領域のより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる。未変性重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ベータシート構造を結合するループを形成するおよび幾つかの場合においてベータシート構造の一部を形成する３個のＣＤＲによって結合されたベータシート配置を主にとる、４個のＦＲ領域を備える。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域と近接しておよび他の鎖のＣＤＲと共にひとまとめにされて、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１を参照）。

【0044】

定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関係していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与、Ｆｃγ受容体への結合による食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）による半減期クリアランス速度および補体カスケードのＣ１ｑ成分による補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの、各種のエフェクタ機能を示す。

【0045】

任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、これの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（Ｋ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類の一方に割当てることができる。

【0046】

抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）を異なるクラスに割当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに細分され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む（例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７，Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照）。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元配置は周知であり、一般に例えばＡｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００）に記載されている。抗体は、抗体と１個以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有会合によって形成された、より大きい融合分子の一部であり得る。

【0047】

「ポリクローナル抗体」は、１個以上の他の非同一抗体の間で、またはこの非同一抗体の存在下で産生された抗体である。概して、ポリクローナル抗体は、非同一抗体を産生する複数の他のＢリンパ球の存在下でＢリンパ球から産生される。通常、ポリクローナル抗体は免疫化動物から直接得られる。

【0048】

「モノクローナル抗体」は本明細書で使用する場合、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体であり、即ち本集団を形成する抗体は、わずかな量で存在するかもしれない考えられる天然型変異を除いて本質的に同一である。これらの抗体は単一のエピトープに向けられていて、ゆえに高度に特異的である。

【0049】

本明細書での目的の「裸の抗体」は、細胞傷害性部分または放射性標識にコンジュゲートしていない抗体である。

【0050】

「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の部位である。エピトープは、隣接残基によって、または抗原タンパク質の折畳みにより接近した非隣接残基によって形成することができる。隣接アミノ酸によって形成されたエピトープは変性溶媒への曝露時に通例保持されるのに対して、非隣接アミノ酸によって形成されたエピトープは、前記曝露下では通例失われる。

【0051】

本明細書で使用する場合、「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体／抗原相互作用の解離定数を指す。「結合親和性」は一般に、分子（例えば抗体）の単一結合部位とこれの結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。別途指摘しない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体および抗原）のメンバ間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのこれのパートナーＹに対する親和性は、一般にＫ_Ｄによって表される。親和性は、本明細書に記載するものを含む、当分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原を低速で結合して、ただちに解離する傾向があるのに対して、高親和性抗体は一般に、抗原をより高速で結合して、より長期間結合を保持する傾向がある。結合親和性を測定する多種多様の方法が当分野で公知であり、これのいずれも本発明の目的のために使用することができる。

【0052】

本発明はマウス抗ＥｐｈＡ２抗体、本明細書ではｍｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４から開始し、この抗体は軽鎖および重鎖の両方のアミノ酸配列、ＣＤＲの同定、表面アミノ酸の同定および抗体の組換え形での発現の手段に関して十分に特徴付けされている。

【0053】

本発明のマウス抗体は、例えば抗体５３．２Ｈ１１の部位特異的変異誘発によって得ることができる。５３．２Ｈ１１抗体は、ブダペスト条約の下で６月１６日に米国菌培養収集所（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にアクセション番号ＰＴＡ−７６６２で寄託されたハイブリドーマによって産生され、ＰＣＴ出願ＷＯ２００８／０１０１０１に記載されている。このため５３．２Ｈ１１の軽鎖および重鎖の両方のアミノ酸配列、ＣＤＲの同定、表面アミノ酸の同定、ならびに前記軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチド配列はすべて、ＷＯ２００８／０１０１０１に開示されている。

【0054】

抗体ｍｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４軽鎖および重鎖の、ならびにこれらのヒト化型の１次アミノ酸およびＤＮＡ配列は本明細書に開示されている。一実施形態において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する１個以上のＣＤＲを備えた抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントを提供する。

【0055】

好ましい実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも１個の重鎖および少なくとも１個の軽鎖を備え、前記重鎖は、配列番号１、２、３から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する３個の連続ＣＤＲを備え、前記軽鎖は、配列番号４、５、６から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する３個の連続ＣＤＲを備える。

【0056】

好ましい実施形態において、前記モノクローナル抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントのパラトープは軽鎖内に：ループＬ１のＡｒｇ３５、Ｌ２のＴｙｒ５４、Ａｒｇ５８およびＡｓｐ６０を備える。

【0057】

好ましい実施形態において、前記モノクローナル抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントのパラトープは重鎖内に：ループＨ１のＴｈｒ３０、Ａｌａ３１、Ｔｙｒ３２およびＴｙｒ３３、Ｈ２のＡｓｎ５２、Ｔｙｒ５４、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５７ならびにＨ３のＧｌｕ９９、Ｐｈｅ１００、Ｔｙｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｔｙｒ１０３およびＴｙｒ１０５を備える。

【0058】

前記抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは変異を：
位置：ＴｈｒＨ２８に
軽鎖の以下の位置の幾つかのうちの１つ：３５、２６から３１、３４から３７、５５、５６、５７、５９および９４から１０２に、ならびに／または
重鎖の以下の位置の幾つかのうちの１つ：２８、５４および５７に備える。

【0059】

別の実施形態において、本発明の抗体は、ＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインからのＬＢＤの残基Ｇｌｙ４９、Ｌｙｓ５０、Ｇｌｙ５１、Ａｓｐ５３、Ｃｙｓ７０、Ａｓｎ７１、Ｖａｌ７２、Ｍｅｔ７３、Ｓｅｒ７４、Ｇｌｙ７５、Ｇｌｎ７７、Ｐｈｅ１０８、Ｐｒｏ１０９、Ｇｌｙ１１０、Ｇｌｙ１１１、Ｓｅｒ１１３およびＳｅｒ１１４を備えるヒトＥｐｈＡ２受容体のエピトープ、またはこれの保存的置換形に特異的に結合する。

【0060】

別の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号８から成るアミノ酸配列を有するＶ_Ｈを備える。別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１０から成るアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを備える。

【0061】

ヒト化または表面再処理２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体を指す。「キメラ抗体」は本明細書で使用する場合、定常領域、またはこれの部分が改変、置換、または交換されているので、可変領域が異なる種の定常領域に連結されている、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属している抗体である。「キメラ抗体」は、可変領域、またはこれの部分が改変、置換、または交換されているので、定常領域が異なる種の可変領域に連結されている、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属している抗体も指す。

【0062】

ヒト化の目的は、抗体の完全な抗原結合親和性および特異性を維持しながら、ヒトへの導入のためのマウス抗体などの異種抗体の免疫原性を低下させることである。ヒト化抗体、または他の哺乳動物による非拒絶に適した抗体は、表面再処理およびＣＤＲ移植などの複数の技術を使用して産生され得る。本明細書で使用する場合、表面再処理技術は、分子モデル化、統計解析および変異誘発の組合せを使用して、抗体可変領域の非ＣＤＲ表面を標的宿主の公知の抗体の表面を似せて改変する。

【0063】

抗体の表面再処理のための戦略および方法、ならびに異なる宿主内で抗体の免疫原性を低下させる他の方法は、参照によりこれの全体が本明細書に組み入れられている、米国特許５，６３９，６４１に開示されている。簡潔には、好ましい方法において、（１）抗体重鎖および軽鎖可変領域のプールの位置アライメントは、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面露出位置のセットを与えるように生成され、すべての可変領域の位置アラインメントは少なくとも約９８％同一であり；（２）重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基のセットは、げっ歯類抗体（またはこれのフラグメント）について定義され；（３）げっ歯類表面露出アミノ酸残基のセットに最も厳密に同一である重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基のセットが同定され；（４）ステップ（２）で定義された重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基のセットは、げっ歯類抗体の相補性決定領域の任意の残基の任意の原子の５Å以内であるこのようなアミノ酸残基を除いて、ステップ（３）で同定された重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面露出アミノ酸残基によって置換され；ならびに（５）結合特異性を有するヒト化げっ歯類抗体が産生される。

【0064】

可撓性残基の同定に基づく抗体のヒト化の別の好ましい方法は、ＰＣＴ出願ＷＯ２００９／０３２６６１に記載されている。前記方法は以下の：（１）親ｍＡｂの相同モデルを構築して、分子力学シミュレーションを実行するステップと；（２）可撓性残基を解析して、非ヒト抗体分子の最も可撓性の残基を同定し、ならびに異質性または分解反応の原因となりそうな残基またはモチーフを同定するステップと；（３）親抗体と最も類似した認識範囲の集合を提示するヒト抗体を同定するステップと；（４）変異される可撓性残基を決定して、異質性および分解の原因となりそうな残基またはモチーフも変異されるステップと；（５）公知のＴ細胞またはＢ細胞エピトープの存在を確認するステップと；を備える。可撓性残基は、シミュレーションの期間にわたる水溶媒とタンパク質原子との相互作用を説明する暗（ｉｍｐｌｉｃｉｔ）溶媒モデルを用いた、分子力学計算を使用して見出すことができる。

【0065】

抗体は、ＣＤＲ移植（ＥＰ０２３９４００；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、ベニヤリングまたは表面再処理（ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：９６９−９７３）および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む多種多様の他の技法を使用してヒト化することができる。

【0066】

ある実施形態において、抗体、またはこれの抗原結合フラグメント、バリアント、もしくは誘導体の可変および定常領域はどちらも完全にヒトである。完全ヒト抗体は、当分野で公知である技法を使用して作製することができる。例えば、特異的抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原投与に応答してこのような抗体を産生するように修飾されているが、内因性遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。このような抗体を作製するために使用できる例示的な技法は、米国特許６，１５０，５８４；６，４５８，５９２；６，４２０，１４０に記載されている。他の技法は当分野で公知である。完全ヒト抗体は同様に、各種の提示技法、例えばファージ提示または他のウイルス提示系によって産生することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、第５，５４５，８０６号および５，８１４，３１８；ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９１／１０７４１も参照（前記参考文献は、これらの全体が参照により組み入れられている。）。

【0067】

本発明は、ＥｐｈＡ２受容体を認識して、アンタゴニストとして作用するヒト化抗体またはこれのフラグメントを提供する。好ましい実施形態において、ヒト化抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは、ＥｐｈＡ２受容体を発現する癌細胞の成長を阻害する追加の能力を有する。さらなる実施形態において、ヒト化抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは、ＥｐｈＡ２受容体を発現する転移性癌細胞の移動を阻害する追加の能力を有する。

【0068】

このようなヒト化抗体の好ましい実施形態は、ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体、またはこれのエピトープ結合フラグメントである。

【0069】

別の好ましい実施形態において、本発明のヒト抗体は、本明細書でｈｕ２Ｈ１１と呼ぶｈｕ５３．２Ｈ１１（ＷＯ２００８／０１０１０１）をコードするポリヌクレオチド配列の部位特異的変異誘発によって得られる。

【0070】

さらに好ましい実施形態において、抗体またはこれのフラグメントの表面露出残基が公知のヒト抗体表面により厳密に類似するように軽鎖および重鎖の両方で置換されている、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体の表面再処理またはヒト化型が提供される。本発明のヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは、改良された特性を有する。例えばヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは、ＥｐｈＡ２受容体を特異的に認識する。さらに好ましくは、ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは、ＥｐｈＡ２受容体発現細胞の成長を阻害する追加の能力を有する。

【0071】

２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体のヒト化型は、軽鎖および重鎖可変領域の両方のこの抗体のそれぞれのアミノ酸配列、軽鎖および重鎖可変領域についての遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、この抗体の表面アミノ酸の同定、ならびに組換え形でのこの抗体の発現のための手段の開示についても本明細書で十分に特徴付けられている。しかし本発明の範囲は、これらの配列を備える抗体およびフラグメントに限定されない。代わりに、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合するすべての抗体およびフラグメントが本発明に含まれる。好ましくは、ＥｐｈＡ２受容体に特異的に結合する抗体およびフラグメントは、受容体の生物活性を拮抗する。さらに好ましくは、このような抗体はさらに、アゴニスト活性を実質的に欠いている。このため、本発明の抗体およびエピトープ結合抗体フラグメントは、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのヒト化誘導体とはこれの足場、ＣＤＲ、ならびに／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が異なり得て、なお本発明の範囲に含まれる。

【0072】

２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体のＣＤＲは、ＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインと複合した２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＦａｂフラグメントの結晶構造を溶解（ｓｏｌｖｉｎｇ）することによって決定された。ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインと相互作用する２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４からの残基が同定された。従って、例えば本発明の抗体の親和性成熟によって産生される改良された特性を有する抗体およびフラグメントが提供される。

【0073】

５３．２Ｈ１１が由来しやすいマウス軽鎖ＩｇＶ_ＫおよびＪ_Ｋ生殖細胞系遺伝子ならびに重鎖ＩｇＶｈおよびＪｈ生殖細胞系遺伝子が同定され、ＷＯ２００８／０１０１０１に開示された。前記生殖細胞系配列のアクセション番号はそれぞれＭＭＵ２３１１９６およびＡＦ３０３８３３である。このような生殖細胞系遺伝子配列は、ＣＤＲを含めて抗体における体細胞変異を同定するのに有用である。

【0074】

２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列およびこれのＣＤＲの配列は、以前に公知ではなく、本出願で述べられている。このような情報は、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体のヒト化型を産生するために使用することができる。ｈｕ２Ｈ１１の部位特異的変異誘発によって、本発明のヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体を得ることも可能である。これらのヒト化抗ＥｐｈＡ２抗体またはこれの誘導体も、本発明のコンジュゲートの細胞結合剤として使用され得る。

【0075】

このため、一実施形態において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する１個以上のＣＤＲを備えたヒト化抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントを提供する。好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体は、少なくとも１個の重鎖および少なくとも１個の軽鎖を備え、前記重鎖は、配列番号１、２および３によって表されるアミノ酸配列を有する３個の連続ＣＤＲを備え、前記軽鎖は、配列番号４、５および６によって表されるアミノ酸配列を有する３個の連続ＣＤＲを備える。

【0076】

一実施形態において、本発明は配列番号１２から成るアミノ酸配列を有するＶ_Ｈを備えるヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのフラグメントを提供する。別の実施形態において、本発明は配列番号１４から成るアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを備えるヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのフラグメントを提供する。

【0077】

好ましい実施形態において、少なくとも１個の重鎖および少なくとも１個の軽鎖を備えるヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体が提供され、前記重鎖は、配列番号１、２および３によって表されるアミノ酸配列を有する３個の連続ＣＤＲを備え、前記軽鎖は、配列番号４、５および６によって表されるアミノ酸配列を有する３個の連続ＣＤＲを備え、前記重鎖は配列番号１２から成るアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は配列番号１４から成るアミノ酸配列を有する。

【0078】

ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明の抗ＥｐｈＡ２抗体をコードする核酸が提供される。一実施形態において、核酸分子は、抗ＥｐｈＡ２免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖をコードする。好ましい実施形態において、１つの核酸は抗ＥｐｈＡ２免疫グロブリンの重鎖をコードして、別の核酸分子は抗ＥｐｈＡ２免疫グロブリンの軽鎖をコードする。

【0079】

本発明の別の態様において、配列番号１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６および１８の群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：７、９、１１、１３、１５および１７から成る群より選択される。本発明は、前記ポリヌクレオチド自体に限定されないが、前記ポリヌクレオチドとの少なくとも８０％の同一性を提示するすべてのポリヌクレオチドも含む。

【0080】

「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書で言及される場合、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのどちらかの長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形、またはどちらかの種類のヌクレオチドの修飾形を意味する。該用語は、ＤＮＡの１本鎖形および２本鎖形を含む。

【0081】

「単離ポリヌクレオチド」という用語は本明細書で使用する場合、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源のポリヌクレオチドまたはこれの一部の組合せを意味するものとし、これの起源により「単離ポリヌクレオチド」は、（１）「単離ポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全体もしくは一部と会合していない、（２）天然では単離ポリペプチドが連結されていないポリヌクレオチドに操作可能に連結されている、または（３）より大型の配列の一部として天然には発生しない。

【0082】

本発明は、本発明のポリヌクレオチドを備えるベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは、抗ＥｐｈＡ２免疫グロブリンの重鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する。別の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、抗ＥｐｈＡ２免疫グロブリンの軽鎖をコードする。本発明は、融合タンパク質、修飾抗体、抗体フラグメントおよびこれらのプローブをコードするポリヌクレオチド分子を備えたベクターも提供する。

【0083】

本発明の抗ＥｐｈＡ２抗体の重鎖および／または軽鎖を発現するために、前記重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子が転写および翻訳配列に操作可能に連結されるように発現ベクター中に挿入される。

【0084】

「操作可能に連結された」配列は、興味のある遺伝子と隣接している発現制御配列およびトランスでまたは離れて作用して興味のある遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。「発現制御配列」という用語は本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド配列であって、これらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを行うために必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモータおよびエンハンサ配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（即ちコザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；ならびに所望の場合には、タンパク質分泌を向上させる配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる；原核生物において、このような制御配列は一般にプロモータ、リボソーム結合部位および転写終結配列を含む；真核生物において一般に、このような制御配列は、プロモータおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、存在が発現およびプロセシングに不可欠であるあらゆる構成要素を最低限含むことが意図され、存在が好都合である追加の構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。

【0085】

「ベクター」という用語は本明細書で使用する場合、核酸分子であって、これが連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指すことが意図される。１種類のベクターは「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントが中にライゲーションされ得る円形２本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターでは追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得る。あるベクターは、これらが導入される宿主細胞（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）において自律複製が可能である。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。

【0086】

あるベクターは、これらが操作可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることができる。このようなベクターは本明細書では、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。概して、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターはプラスミドの形である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も普通に使用される形であるため、互換的に使用され得る。しかし本発明は、このような形の発現ベクター、例えば細菌プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来エピソーム、ならびに本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖の発現を確実にするために好都合であることが当業者に公知となる他のすべてのベクターを含むことが意図される。当業者は、重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドが異なるベクター中へまたは同じベクターにクローニングできることを認識する。好ましい実施形態において，前記ポリヌクレオチドは、同じベクターにクローニングされる。

【0087】

本発明のポリヌクレオチドおよびこれらの分子を備えたベクターは、好適な哺乳動物宿主細胞、または当業者に公知である他のいずれの種類の宿主細胞の形質転換にも使用することができる。「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は本明細書で使用する場合、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことが意図される。このような用語は特定の対象細胞だけではなく、このような細胞の子孫も指すことが意図されることが理解されるべきである。ある修飾が変異または環境上の影響のどちらかのために次の世代で発生し得るので、このような子孫は実際には、親細胞と同一であり得ないが、本明細書で使用する場合の「宿主細胞」という用語の範囲になお含まれている。

【0088】

形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するためのいずれの公知の方法によってでもよい。このような方法は当業者に周知であり、デキストラン介在形質転換、リン酸カルシウム沈殿，ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、ＤＮＡの核中への微粒子銃注入および直接微量注入を含む。

【0089】

抗体フラグメント
本発明の抗体は、上で議論した全長抗体、ならびにエピトープ結合フラグメントの両方を含む。本明細書で使用する場合、「抗体フラグメント」は、全長抗体によって認識されたエピトープに結合する能力を保持する抗体のいずれかの部分を含み、一般に「エピトープ結合フラグメント」と呼ばれる。抗体フラグメントの例は、これらに限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）およびＶ_ＬまたはＶ_Ｈ領域のどちらかを備えたフラグメントを含む。単鎖抗体を含むエピトープ結合フラグメントは、単独のまたは以下の：ヒンジ領域、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの全体もしくは一部と組合された可変領域を備える。

【0090】

このようなフラグメントは、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメントの一方または両方を含有し得る。好ましくは、抗体フラグメントは全長抗体の６個すべてのＣＤＲを含有するが、このような領域すべてよりも少ない、例えば３、４または５個のＣＤＲを含有するフラグメントも機能する。さらにフラグメントは、以下の免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥおよびこれのサブクラスのいずれか１つのメンバであり得るか、またはメンバを組合せ得る。

【0091】

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメント）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント）などの酵素を使用してタンパク質分解的切断によって産生され得る。

【0092】

「単鎖ＦＶｓ」（「ｓｃＦｖｓ」）フラグメントは、抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）の少なくとも１個のフラグメントに連結された抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）の少なくとも１個のフラグメントを含有するエピトープ結合フラグメントである。リンカーは、単鎖抗体フラグメントが由来している全長抗体の標的分子結合特異性を維持するために（Ｖ_Ｌ）および（Ｖ_Ｈ）領域が連結されると（Ｖ_Ｌ）および（Ｖ_Ｈ）領域の適正な３次元折畳みが確実に発生するように選択された、短い可撓性のペプチドであり得る。（Ｖ_Ｌ）または（Ｖ_Ｈ）配列のカルボキシル末端は、リンカーによって相補的（Ｖ_Ｌ）または（Ｖ_Ｈ）配列のアミノ酸末端に共有結合的に連結され得る。

【0093】

本発明の単鎖抗体フラグメントは、本明細書に記載された少なくとも１個の全長抗体の可変性または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するアミノ酸配列を含有するが、これらの抗体の定常ドメインの一部または全部を欠いている。これらの定常ドメインは抗原結合には不要であるが、全長抗体の構造の主要な部分を構成する。単鎖抗体フラグメントはゆえに、定常ドメインの一部または全部を含有する抗体の使用に関連する問題の幾つかを克服し得る。例えば単鎖抗体フラグメントは、生体分子と重鎖定常領域との間の所望でない相互作用、または他の望ましくない生物活性を有さない傾向がある。さらに単鎖抗体フラグメントは、全長抗体よりもかなり小さく、ゆえに全長抗体よりも大きい毛細管透過性を有し得て、単鎖抗体フラグメントを局所化させて、標的抗原結合部位により効率的に結合させる。抗体フラグメントは、原核細胞において比較的大規模に産生することもでき、このためこれの産生が促進される。さらに単鎖抗体フラグメントのサイズが比較的小さいことにより、単鎖抗体フラグメントはレシピエント内で全長抗体よりも免疫応答を誘発しにくくなっている。

【0094】

単鎖抗体フラグメントは、分子クローニング、抗体ファージ提示ライブラリまたは当業者に周知の同様の技法によって生成され得る。これらのタンパク質は、例えば真核細胞または細菌を含む原核細胞において産生され得る。本発明のエピトープ結合フラグメントは、当分野で公知の各種のファージ提示方法を使用して生成することもできる。ファージ提示方法において、機能性抗体ドメインは、これらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に提示される。特にこのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えばヒトまたはマウス）から発現されたエピトープ結合ドメインを提示するために利用できる。興味のある抗原を結合するエピトープ結合ドメインを発現するファージは、抗原によって、例えば固体表面またはビーズに結合または捕捉された標識抗原を使用して選択または同定することができる。これらの方法で使用されるファージは通例、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のどちらかに組換え融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む線維状ファージである。

【0095】

本発明のエピトープ結合フラグメントを作製するために使用できるファージ提示方法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８２：４１−５０；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５７：１９１−２８０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号に開示されているものを含み；これらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み入れられている。

【0096】

ファージ選択の後、例えば下で詳細に記載するような組換えＤＮＡ技術を用いて、フラグメントをコードするファージの領域を単離し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む選ばれた宿主における発現によってエピトープ結合フラグメントを産生するために使用することができる。例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２フラグメントを組換え産生するための技法も、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２（６）：８６４−８６９；Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＡＪＲＩ，３４：２６−３４；およびＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１−１０４３；これらの全体が参照により組み入れられている前記参考文献に開示された方法などの、当分野で公知の方法を用いて使用することができる。単鎖Ｆｖｓおよび抗体を産生するために使用できる技法の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：７９９５−７９９９；Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０３８−１０４０に記載されているものを含む。

【0097】

機能的等価物
抗ＥｐｈＡ抗体およびヒト化抗ＥｐｈＡ２受容体抗体の機能的等価物も、本発明の範囲内に含まれる。「機能的等価物」という用語は、相同配列を有する抗体、キメラ抗体、人工抗体および修飾抗体を含み、例えば各機能的等価物は、ＥｐｈＡ２受容体を結合するこれの能力によって定義される。当業者は、「抗体フラグメント」と呼ばれる分子の群と「機能的等価物」と呼ばれる群とに重複があることを理解する。機能的等価物を産生する方法は当業者に公知であり、例えば参照によりこれらのそれぞれの全体が組み入れられている、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２１３１９、欧州特許番号ＥＰ０２３９４００；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０９６２２；欧州特許番号ＥＰ０３３８７４５；および欧州特許出願ＥＰ０３３２４２４に開示されている。

【0098】

相同配列を有する抗体は、本発明の抗ＥｐｈＡ抗体およびヒト化抗ＥｐｈＡ抗体のアミノ酸配列との配列相同性を有するアミノ酸配列を持つ抗体である。好ましくは、相同性は本発明の抗ＥｐｈＡ抗体およびヒト化抗ＥｐｈＡ抗体の可変領域のアミノ酸配列との相同性である。本明細書でアミノ酸配列に適用されるような「配列相同性」は、例えばＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：２４４４−２４４８に従ったＦＡＳＴＡサーチ法によって決定されるような、別のアミノ酸に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％配列相同性およびさらに好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列相同性を持つ配列として定義される。

【0099】

キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来している抗体である。例えばヒト免疫グロブリン定常領域と対になった、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域を有する抗体。キメラ抗体を産生する方法は当分野で公知である。例えばこれらの全体が参照により本明細書に組み入れられている、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６，３９７号を参照のこと。

【0100】

キメラ抗体のヒト化型は、マウス抗体の相補性決定領域をヒトフレームワークドメイン中に置換することによって作製される、例えばＰＣＴ公開番号Ｗ０９２／２２６５３を参照のこと。ヒト化キメラ抗体は好ましくは、対応するヒト抗体領域から実質的にまたは排他的に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト以外の哺乳動物から実質的にまたは排他的に由来するＣＤＲ以外の定常領域および可変領域を有する。

【0101】

人工抗体は、ｓｃＦｖフラグメント、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびｍｒｕ（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３−２９９；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１：５４８−５５７による総説を参照のこと）を含み、これらのそれぞれは抗体結合能力を有する。単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）において、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは可撓性ペプチドによって連結されている。通例、本リンカーペプチドは約１５アミノ酸残基長である。リンカーがはるかに小さい、例えば５アミノ酸である場合、２価ｓｃＦｖダイマーであるダイアボディが形成される。リンカーが３アミノ酸残基未満に縮小されている場合、トリマーおよびテトラマー構造が形成され、トリアボディおよびテトラボディと呼ばれる。抗体の最小結合単位はＣＤＲであり、通例、重鎖のＣＤＲ２は十分な特異的認識および結合を有するので、これを個別に使用することができる。このようなフラグメントは分子認識単位またはｍｒｕと呼ばれる。複数のこのようなｍｒｕは短いリンカーペプチドと共に連結することができ、ゆえに単一のｍｒｕよりも高いアビディティを持つ人工結合タンパク質を形成する。

【0102】

本出願の機能的等価物は、修飾抗体、例えばいずれかの種類の分子の抗体への共有結合によって修飾された抗体も含む。例えば，修飾抗体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって修飾された抗体を含む。共有結合は、抗体が抗イディオタイプ応答を生成するのを防止しない。これらの修飾は、これらに限定されるわけではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む公知の技法によって行われ得る。さらに修飾抗体は、１個以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。

【0103】

機能的等価物は、異なるフレームワーク内の異なる鎖上の異なるＣＤＲを交換することによって産生され得る。このため，例えば異なるクラスの抗体は、異なる重鎖の置換により所与のＣＤＲのセットについて可能であり、これにより例えばＩｇＧ１−４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１−２、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体タイプおよびアイソタイプが産生され得る。同様に本発明の範囲内の人工抗体は、合成フレームワーク全体の中に所与のＣＤＲのセットを埋め込むことによって産生され得る。

【0104】

機能的等価物は、当分野で公知の多種多様の方法を使用して、特定のＣＤＲのセットに隣接する可変および／または定常領域配列内の変異、欠失および／または挿入によってただちに産生され得る。

【0105】

本発明の抗体フラグメントおよび機能的等価物は、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体と比較したときに、ＥｐｈＡ２への検出可能な結合度を持つ分子を含む。検出可能な結合度は、ＥｐｈＡ２に対するマウス２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体の結合能力の、少なくとも１０から１００％の範囲のすべての値、好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を含む。

【0106】

改良抗体
ＣＤＲは、エピトープ認識および抗体結合にとって最も重要である。しかし、抗体がこれの同族エピトープを認識および結合する能力を妨害することなく、ＣＤＲを備える残基への変化がもたらされ得る。例えばエピトープ認識に影響せず、さらにエピトープに対する抗体の結合親和性を上昇させる変化が生じ得る。

【0107】

このため、好ましくは親和性の上昇を有する、またＥｐｈＡ２を特異的に認識および結合する、マウスおよびヒト化抗体両方の改良型も本発明の範囲に含まれる。

【0108】

複数の研究が１次抗体配列の知識に、結合および発現のレベルなどの抗体の特性に基づいて、１個以上のアミノ酸変化を抗体の配列内の各種の位置に導入する効果を調査した（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３；Ｒａｄｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：８９１０−８９１５；Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９）。

【0109】

これらの研究において、１次抗体の等価物は、オリゴヌクレオチド介在部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング、Ｅ．コリの変異誘発株などの方法を使用して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはフレームワーク領域における重鎖および軽鎖遺伝子の配列を変化させることによって生成された（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９；Ａｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ １６，ｐｐ．２７７−２９１，ｉｎ「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｅｄｓ．Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。１次抗体の配列を変化させるこれらの方法は、２次抗体の親和性の改良をもたらした（Ｇｒａｍ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３５７６−３５８０；Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７：１０７０１−１０７０５；Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，２：１６９−１７９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６：７７−８８；Ｓｈｏｒｔ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１６３６５−１６３７０；Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２７６２２−２７６２８）。

【0110】

抗体の１個以上のアミノ酸残基を変化させる同様の定方向戦略により、本発明に記載された抗体配列を使用して、ＥｐｈＡ２に対する改良された親和性を含む、改良された機能を持つ抗ＥｐｈＡ２抗体を発生させることができる。

【0111】

好ましいアミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を改変するおよび（４）このような類似体の他の物理化学または機能特性を付与または修飾する置換である。類似体は、天然型ペプチド配列以外の配列の各種のムテインを含むことができる。例えば単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）を、天然型配列で（好ましくは分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分で）作製することができる。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば置換アミノ酸は、親配列で発生するらせんを切断する、または親配列を特徴付ける他の種類の２次構造を破壊する傾向があるべきではない。）。当分野で認識されたポリペプチド２次および３次構造の例は、参照によりそれぞれ組み入れられている、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：１０５に記載されている。

【0112】

改良抗体は、動物免疫化、ハイブリドーマ形成および特異的特徴を持つ抗体の選択の標準技法によって調製される改良された特徴を有する抗体も含む。

【0113】

抗体の定常領域と各種のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との間の相互作用は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体の固定、食作用および抗体の半減期／クリアランスを含む抗体のエフェクタ機能に介在すると考えられる。本発明の抗体の定常領域に対する各種の修飾は、所望の特性に応じて行われ得る。例えばそうでなければ溶解性の抗体を非溶解性にする定常領域における特異的変異は、ＥＰ０６２９２４０Ｂ１およびＥＰ０３０７４３４Ｂ２で詳説され、または特異的変異はサルベージ受容体結合エピトープを抗体中に包含して血清半減期を延長し得る（ＵＳ５，７３９，２７７を参照のこと）。現在認識されている５つのヒトＦｃγ受容体、ＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび新生児ＦｃＲｎがある。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７：６５９１−６６０４，２００１）は、ＩｇＧＩ残基の共通セットがすべてのＦｃγＲの結合に関与しているが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩはこの共通セットの外部の別の部位を利用することを示している。ＩｇＧＩ残基の１群は、アラニンに対して改変されたときに、すべてのＦｃγＲへの結合を低下させた：Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−２３９。すべてがＩｇＧＣＨ２ドメイン内にあり、ＣＨ１およびＣＨ２を接合するヒンジ付近に密集している。ＦｃγＲＩは結合のためにＩｇＧＩ残基の共通セットのみを利用するが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、共通セットに加えて別個の残基と相互作用する。

【0114】

幾つかの残基の改変は、ＦｃγＲＩＩ（例えばＡｒｇ−２９２）またはＦｃγＲＩＩＩ（例えばＧｌｕ−２９３）のみへの結合を低下させた。幾つかのバリアントは、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩへの結合の改良を示したが、他の受容体への結合には影響を及ぼさなかった（例えばＳｅｒ−２６７ＡｌａはＦｃｇＲＩＩへの結合を改良したが、ＦｃγＲＩＩＩへの結合は影響されなかった。）。他のバリアントは、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩへの結合の改良を示し、他の受容体への結合は低下した（例えばＳｅｒ−２９８Ａｌａは、ＦｃγＲＩＩＩへの結合を改良して、ＦｃγＲＩＩへの結合を低下させた。）。ＦｃγＲＩＩＩａでは、最良の結合ＩｇＧＩバリアントは、Ｓｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３およびＬｙｓ−３３４に組合されたアラニン置換を有していた。新生児ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランスおよび組織を通じたトランスサイトーシスの両方に関与すると考えられる（Ｊｕｎｇｈａｎｓ Ｒ．Ｐ，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，１６：２９−５７ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９−７６６を参照のこと）。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用することが断定されたヒトＩｇＧＩ残基は、Ｎｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５を含む。本節に記載されたこのような位置のいずれにおけるスイッチも、本発明の抗体の血清半減期の延長および／またはエフェクタ特性の改変を可能にし得る。

【0115】

他の修飾は、本発明の抗体のグリコシル化バリアントを含む。抗体の定常領域中の保存位置での抗体のグリコシル化は、抗体機能、特に上記のようなエフェクタ機能に対して顕著な効果を有することが公知である、例えばＢｏｙｄ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，．３２：１３１１−１３１８，１９９６）を参照のこと。１個以上の炭水化物部分が付加、置換、欠失または修飾されている、本発明の抗体またはこれの抗原結合フラグメントのグリコシル化バリアントが検討される。アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−トレオニンモチーフの導入は、炭水化物部分の酵素結合の可能性のある部位を生成し、ゆえに抗体のグリコシレートを操作するために使用され得る。Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：８８６８−８８７６，２００１）において、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアリル化は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｃｅ）および／またはアルファ２，３シアリルトランスフェラーゼを使用する再ガラクトシル化および／または再シアリル化の過程によって増加した。末端シアリル化を増加させることは、免疫グロブリンの半減期を延長すると考えられる。抗体は、大半の糖タンパク質に共通して、通例、グリコフォームの混合物として産生される。本混合物は特に、抗体が真核、特に哺乳動物細胞で産生されるときに明らかである。定義されたグリコフォームを製造するための多種多様の方法が開発されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：３７１；Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３４４；Ｗａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：５７９；Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７を参照のこと）。このため本発明は、前記抗体またはこれの抗原結合フラグメントの定義された数（例えば７以下、例えば２または１などの５以下）のグリコフォームを備えた、本明細書に記載するような（ＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧＩの抗体であり得る）複数の（モノクローナル）抗体を検討する。

【0116】

ゆえに本発明による改良抗体は特に、機能特性が向上した抗体を含む。特に興味深いのは、ＡＤＣＣなどの細胞傷害性エフェクタ機能に介在する能力が向上した抗体である。このような抗体は、抗体の定常フレームワークにおける単一または複数の置換を作製することによって得られ、このためＦｃ受容体との抗体の相互作用を改変する。このような変異体を設計する方法は、例えばＬａｚａｒ ｅｔ ａｌ．（２００６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３（１１）：４００５−４０１０）およびＯｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６（５）：１２３９−４９）に見出すことができる。ＷＯ０３／０７４６７９、ＷＯ２００４／０２９２０７、ＷＯ２００４／０９９２４９、ＷＯ２００６／０４７３５０、ＷＯ２００６／０１９４４７、ＷＯ２００６／１０５３３８、ＷＯ２００７／０４１６３５も参照のこと。改良抗体を産生するために特異的に操作された株化細胞を使用することも可能である。特にこれらの株化細胞は、グリコシル化経路の調節を改変し、例えばフコシル化が不十分であるまたは完全に脱フコシル化された抗体さえ生じる。抗体を操作するためのこのような株化細胞および方法は、例えばＳｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−３４７３）、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（８）：５０３２−５０３６；２００６、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３（５）：８５１−６１）、ＥＰ１２７２５２７Ｂ１、ＥＰ１３３１２６６、ＥＰ１４９８４９０、ＥＰ１４９８４９１、ＥＰ１６７６９１０、ＥＰ１７９２９８７およびＷＯ９９／５４３４２に開示されている。

【0117】

本発明のさらなる実施形態は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの非タンパク性（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｅｏｕｓ）ポリマーに結合された本発明の抗体またはこれの抗原結合フラグメントを含む。タンパク質のＰＥＧへのコンジュゲーションは、タンパク質の半減期を延長すると共に、タンパク質の抗原性および免疫原性を低下させる確立された技法である。異なる分子量およびスタイル（直鎖または分枝）を持つＰＥＧ化の使用は、無傷の抗体ならびにＦａｂ’フラグメントを用いて調査されてきた（Ｋｏｕｍｅｎｉｓ Ｉ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．１９８：８３−９５）。

【0118】

本発明は、細胞傷害性コンジュゲート、または抗体薬物コンジュゲート、またはコンジュゲートも含む。本明細書で使用する場合、これらの用語はすべて同じ意味を有し、交換可能である。

【0119】

これらの細胞傷害性コンジュゲートは、２つの主要な成分、細胞結合剤および細胞傷害性剤を備える。

【0120】

本明細書で使用する場合、「細胞結合剤」という用語は、細胞表面のＥｐｈＡ２受容体を特異的に認識および結合する薬剤を指す。一実施形態において、細胞結合剤はＥｐｈＡ２受容体を特異的に認識して、コンジュゲートを標的化された方式で作用させ、副作用は非特異的結合からほとんど生じない。

【0121】

別の実施形態において、本発明の細胞結合剤はまたＥｐｈＡ２受容体を特異的に認識するので、コンジュゲートは標的細胞と、コンジュゲートの細胞傷害薬部分を細胞に作用させるのにおよび／またはコンジュゲートが細胞により内部移行されるのに十分な期間にわたって接触する。

【0122】

好ましい実施形態において、細胞傷害性コンジュゲートは、抗ＥｐｈＡ２抗体を細胞結合剤として、さらに好ましくはマウス２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４モノクローナル抗体を備える。さらに好ましい実施形態において、細胞傷害性コンジュゲートは、ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントを備える。２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体は、ＥｐｈＡ２などのＥｐｈＡ受容体を特異的に認識することができ、細胞傷害性剤を標的化された方式で癌細胞などの異常細胞または組織に方向付ける。

【0123】

本発明の細胞傷害性コンジュゲートの第２の構成要素は細胞傷害性剤である。「細胞傷害性剤」という用語は本明細書で使用する場合、細胞の機能、もしくは成長を低下もしくは遮断するおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。

【0124】

好ましい実施形態において、細胞傷害性剤は、タキソイド、ＤＭ１またはＤＭ４などのマイタンシノイド、小型薬物、トマイマイシン誘導体、プロドラッグ、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体である。好ましい実施形態において、本発明の細胞結合剤は、直接または切断可能なもしくは切断可能でないリンカーを介して間接的に細胞傷害性剤に共有結合される。「リンカー」は本明細書で使用する場合、共有結合を備えた化学的部分または抗体を薬物部分に共有結合する原子の鎖を意味する。

【0125】

このため本発明は、（１）ＥｐｈＡ２受容体を認識および結合する細胞結合剤と、（２）細胞傷害性剤との間のコンジュゲートの使用を検討する。細胞傷害性コンジュゲートにおいて、細胞結合剤はＥｐｈＡ２受容体に対して高い親和性を有し、細胞傷害性剤はＥｐｈＡ２受容体を発現する細胞に対して高度の細胞傷害性を有するので、本発明の細胞傷害性コンジュゲートは有効な死滅剤（ｋｉｌｌｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を形成する。

【0126】

アンタゴニストＥｐｈＡ２抗体のコンジュゲートは先に記載されている。例えばＷＯ２００８／０１０１０１は、ＳＰＤＢ（４−［２−ピリジルジチオ］ブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）リンカーを使用した、Ｌ−ＤＭ４，Ｎ２’デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシンにコンジュゲートされたヒト化３７．３Ｄ７およびヒト化５３．２Ｈ１１抗体を開示した（ＷＯ２００８／０１０１０１の実施例１０を参照のこと；ｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）。

【0127】

本発明の抗体は、細胞傷害性剤にコンジュゲートされたとき、従来技術の抗体を超える幾つかの好都合の特性を示す。特にコンジュゲーションは、本発明の抗体のＥｐｈＡ２受容体に対する親和性に影響を及ぼさないが、５３．２Ｈ１１のＥｐｈＡ２への結合は、細胞傷害性剤の前記５３．２Ｈ１１抗体への結合によって悪影響が及ぼされる。細胞結合剤、細胞傷害性剤およびリンカーは、下でさらに詳細に議論されている。

【0128】

細胞結合剤
本発明の化合物の治療剤としての有効性は、適切な細胞結合剤の慎重な選択によって変わる。細胞結合剤は、現在公知である、または公知になるいずれの種類でもよく、ペプチドおよび非ペプチドを含む。細胞結合剤は、特異的または非特異的な様式のどちらかで細胞を結合することができるいずれの化合物でもよい。一般にこれらは、抗体（とりわけモノクローナル抗体）、リンフォカイン、ホルモン、成長因子、ビタミン、栄養素輸送分子（トランスフェリンなど）、または他のいずれかの細胞結合分子もしくは物質であることができる。

【0129】

使用できる細胞結合剤のさらに詳細な例は：
ポリクローナル抗体；
モノクローナル抗体；
Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２、Ｆｖなどの抗体のフラグメント（Ｐａｒｈａｍ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２８９５−２９０２；Ｓｐｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ，１９７４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１３：４７０−４７８；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０−２４４）を含む。

【0130】

好ましくは、ヒト化抗ＥｐｈＡ２抗体は本発明の細胞結合剤として使用される。さらに好ましくは、ヒト化抗ＥｐｈＡ２抗体はヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体である。

【0131】

細胞傷害性剤
別の実施形態において、ヒト化抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントは、メイタンシノイド、トマイマイシン誘導体またはデュオカルマイシン誘導体などの薬剤にコンジュゲートされて、薬物をＥｐｈＡ２受容体に標的化することにより抗原発現細胞に対して特異的な細胞傷害性を有するプロドラッグを形成することができる。このような抗体および小型の高毒性薬（例えばメイタンシノイド、トマイマイシン誘導体、ならびにＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体）を備える細胞傷害性コンジュゲートは、例えば，乳腺および卵巣腫瘍などの腫瘍の処置のための治療薬として使用できる。

【0132】

本発明の細胞傷害性コンジュゲートで使用される細胞傷害性剤は、細胞死を生じる、または細胞死を誘発する、または幾つかの様式において細胞生存度を低下させるいずれの化合物でもよい。好ましい細胞傷害性剤は、下で定義する例えば，メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、トマイマイシン誘導体、ならびにＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体である。これらの細胞傷害性剤は、本明細書で開示するような抗体、抗体フラグメント、機能的等価物、改良抗体およびこれらの類似体にコンジュゲートされる。

【0133】

細胞傷害性コンジュゲートは、インビトロ方法によって調製され得る。薬物またはプロドラッグを抗体に連結するために、連結基が使用される。好適な連結基は当分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基を含む。

【0134】

例示的な連結基はジスルフィド基およびチオエーテル基である。例えばコンジュゲートは、ジスルフィド交換反応を使用して、または抗体と薬物もしくはプロドラッグとの間にチオエーテル結合を形成することによって構築できる。このような連結基を担持するリンカーの例は、Ｎ−スクシンイミジルピリジルジチオプロピオナート（ＳＰＤＰ）およびＮ−スクシンイミジルピリジルジチオブチラート（ＳＰＤＢ）を含み、これらのジチオピリジル反応性基（Ｂｏｕｒｄｏｎ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３−７３７，１９７８；ＵＳ５２０８０２０を参照のこと）は、−ＳＨなどの細胞傷害性化学反応性基と反応して新たな結合−Ｓ−Ｓ−を形成する。Ｎ−スクシンイミジルオキシ基は次に、アミド結合を形成するために抗体に存在するアミノ基と優先的に反応する。

【0135】

別の好ましい実施形態において、細胞傷害性剤はＵＳ６，７１６，８２１に記載されているように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）連結基を使用して細胞結合剤に連結される。

【0136】

例示的なＰＥＧ連結基は、一端の官能性スルフヒドリルまたはジスルフィド基および他端の活性エステルを通じて、細胞傷害性剤および細胞結合剤に結合するヘテロ２官能性ＰＥＧリンカーを含む（ＵＳ６，７１６，８２１）。官能性スルフヒドリルまたはジスルフィド基を通じて細胞傷害性剤に結合しないＰＥＧリンカーを使用することも可能である。

【0137】

式（Ｉ）の、末端活性エステルを有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）連結基を持つ細胞傷害性剤が特に検討される：

【0138】

【化11】

式中、Ｚは前記細胞傷害性剤であり、前記細胞傷害性剤は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、トマイマイシン誘導体、ならびにＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体の群から選択され、
式中、Ｙは、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、Ｎ−スルホスクシンイミジルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−スルホフタルイミジルオキシ、２−ニトロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、２，４−ジニトロフェニルオキシ、３−スルホニル−４−ニトロフェニルオキシ、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルオキシ、イミダゾリル、またはハロゲン原子である。別の好ましい実施形態において、細胞傷害性剤が提供され、前記細胞傷害性剤は、末端活性エステルを有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）連結基を持ち、式（ＩＩ）であり：

【0139】

【化12】

式中、Ｚは前記細胞傷害性剤であり、前記細胞傷害性剤は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、トマイマイシン誘導体、ならびにＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体の群から選択され、
式中、Ｙは、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、Ｎ−スルホスクシンイミジルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−スルホフタルイミジルオキシ、２−ニトロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、２，４−ジニトロフェニルオキシ、３−スルホニル−４−ニトロフェニルオキシ、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルオキシ、イミダゾリル、またはハロゲン原子である。

【0140】

コンジュゲートの調製
概して、コンジュゲートは：
（ｉ）細胞結合剤の場合により緩衝された水溶液を細胞傷害性化合物の溶液と接触させるステップと；
（ｉｉ）次に、（ｉ）で形成されたコンジュゲートを未反応試薬および溶液中に存在し得るいずれの凝集体からも場合により分離するステップと；
を備えた方法によって得ることができる。

【0141】

一態様において、細胞結合剤は抗体である；さらに明確には、細胞結合剤は、ｍｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのヒト化型である。別の態様において、細胞傷害性剤は、Ｚがメイタンシノイドである式（Ｉ）または（ＩＩ）のどちらかの化合物である；特にＺはＤＭ４である。

【0142】

本方法によって得られるコンジュゲートは本発明の範囲内に含まれることが理解されている。

【0143】

細胞結合剤の水溶液は、例えばリン酸カリウムまたはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ緩衝剤）などの緩衝剤によって緩衝することができる。緩衝剤は、細胞結合剤の性質によって変わる。細胞傷害性化合物は、有機極性溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解している。

【0144】

反応温度は通常、２０から４０℃の間に含まれる。反応時間は、１から２４時間まで変化することができる。細胞結合剤と細胞傷害性剤との間の反応は、屈折率および／またはＵＶ検出器を備えたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって監視することができる。コンジュゲート収率が低すぎる場合、反応時間を延長することができる。

【0145】

幾つかの異なるクロマトグラフィー方法は、ステップ（ｉｉ）の分離を行うために当業者に使用されることが可能であり：コンジュゲートは、例えばＳＥＣ、吸着クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、ＩＥＣなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの混合担体クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製することができる。透析またはダイアフィルトレーションによる精製も使用することができる。

【0146】

使用できる方法の例は、実施例Ｉ．ｂ．１に記載されている。

【0147】

本明細書で使用する場合、「凝集体」という用語は、２つ以上の細胞結合剤の間で形成することができる会合を意味し、前記細胞結合剤はコンジュゲーションによって修飾されているか、または修飾されていない。凝集体は、溶液中の細胞結合剤の高い濃度、溶液のｐＨ、高い剪断力、結合ダイマーの数およびこれらの疎水性特徴、温度などの多数のパラメータの影響下で形成される（Ｗａｎｇ ＆ Ｇｏｓｈ，２００８，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．，３１８：３１１−３１６およびこれで引用された参考文献を参照のこと）；これらのパラメータの幾つかの相対的な影響は明確に確立されていないことに注目する。タンパク質および抗体の場合、当業者はＣｒｏｍｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６，ＡＡＰＳ Ｊｏｕｎａｌ，８（３）：Ｅ５７２−Ｅ５７９）を参照する。凝集体の内容は、ＳＥＣなどの当業者に周知の技法を用いて決定することができる（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１２（２）：４６９−４８０を参照のこと）。

【0148】

ステップ（ｉ）または（ｉｉ）の後、コンジュゲート含有溶液に、限外濾過および／またはダイアフィルトレーションの追加のステップ（ｉｉｉ）を受けさせることができる。

【0149】

コンジュゲートは、水溶液中でこれらのステップの終わりに回収される。

【0150】

メイタンシノイド
細胞傷害性コンジュゲートを形成するために本発明に使用され得る細胞傷害性剤には、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体がある。好適なメイタンシノイドの例は、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体を含む。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に対して高い毒性である薬物である。

【0151】

好適なメイタンシノール類似体の例は、修飾芳香族環を有するものおよび他の位置に修飾を有するものを含む。このような好適なメイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号；第４，２５６，７４６号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６２，６６３号；第４，３６４，８６６号；第４，４５０，２５４号；第４，３２２，３４８号；第４，３７１，５３３号；第６，３３３，４１０号；第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号；および第５，８４６，５４５号に開示されている。

【0152】

修飾芳香族環を有するメイタンシノールの好適な類似体の詳細な例は：
（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシン（ａｎｓａｍｙｔｏｃｉｎ）Ｐ２のＬＡＨ還元によって調製）；
（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および第４，３０７，０１６号）（ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）もしくはアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を使用する脱メチル化またはＬＡＨを使用する脱塩素）；および
（３）Ｃ−２０−デメトキシ，Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（Ｕ．Ｓ．Ｎｏ ４，２９４，７５７）（塩化アシルを使用するアシル化によって調製）を含む。

【0153】

他の位置の修飾を有するメイタンシノールの好適な類似体の詳細な例は：
（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ_２ＳまたはＰ_２Ｓ_５との反応によって調製）；
（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ_２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ_２ＯＨまたはＣＨ_２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製）；
（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（メイタンシノールのストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）による変換によって調製）；
（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および第４，３１５，９２９号）（トレウィア・ヌディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離）；
（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（Ｕ．Ｓ．Ｎｏｓ．４，３６２，６６３および４，３２２，３４８）（ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるメイタンシノールの脱メチル化によって調製）；および
（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの３塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製）を含む。

【0154】

好ましい実施形態において、本発明の細胞傷害性コンジュゲートは、正式にはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンと呼ばれるチオール含有メイタンシノイド（ＤＭ１）を細胞傷害性剤として利用する。ＤＭ１は、以下の構造式（ＩＩＩ）によって表される：

【0155】

【化13】

【0156】

別の好ましい実施形態において、本発明の細胞傷害性コンジュゲートは、正式にはＮ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシンと呼ばれるチオール含有メイタンシノイドＤＭ４を細胞傷害性剤として利用する。ＤＭ４は、以下の構造式（ＩＶ）によって表される：

【0157】

【化14】

本発明のさらなる実施形態において、硫黄原子を持つ炭素原子上にモノまたはジアルキル置換を持つチオールおよびジスルフィドメイタンシノイドを含む他のメイタンシンが使用され得る。これらはＣ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチルに、ヒンダードスルフヒドリル基を持つアシル基を備えたアシル化アミノ酸側鎖を有するメイタンシノイドを含み、チオール官能基を持つアシル基の炭素原子は、１または２個の置換基を有し、前記置換基はＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、さらに置換基の１個はＨであることができ、アシル基はカルボニル官能基と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を有する。

【0158】

このような追加のメイタンシンは、式（Ｖ）によって表される化合物を含む：

【0159】

【化15】

式中：
Ｙ’は
（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_９＝ＣＲ_１０）_ｐ（Ｃ≡Ｃ）_ｑＡ_ｒ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍＤ_ｕ（ＣＲ_１１＝ＣＲ_１２）_ｒ（Ｃ≡Ｃ）_ｓＢ_ｔ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺを表し、式中：
Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ独立して、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり加えてＲ_２はＨであることができ；
Ａ、Ｂ、Ｄは、３から１０個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換アリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_１１およびＲ_１２はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔは、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔの少なくとも２つが一度にゼロでないという条件で、それぞれ独立して０または１から５の整数であり；ならびに
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルである。

【0160】

式（Ｖ）の好ましい実施形態は、式（Ｖ）の化合物を含み、式中：
Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２はＨでありおよびＺはＨである。
Ｒ_１およびＲ_２はメチルであり、ならびにＺはＨである。
Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２はＨでありおよびＺは−ＳＣＨ_３である。
Ｒ_１およびＲ_２はメチルであり、ならびにＺは−ＳＣＨ_３である。

【0161】

このような追加のメイタンシンは、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）、または（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）によって表される化合物も含み：

【0162】

【化16】

式中：
Ｙは（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺであり、
式中：
Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ独立して、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、および加えて、Ｒ_２はＨであることができ；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎはそれぞれ独立して、１から５の整数であり、ならびに加えてｎは０であることができ；
Ｚは、Ｈ，ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは、１から１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；ならびに
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチルに側鎖を持つメイタンシノイドを表す。

【0163】

式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）および（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態は、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）および（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）の化合物を含み、式中：
Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれＨであり、ｌおよびｍはそれぞれ１であり、ｎは０であり、ならびにＺはＨである。

【0164】

Ｒ_１およびＲ_２はメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれＨであり、ｌおよびｍは１であり、ｎは０であり、ならびにＺはＨである。

【0165】

Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれＨであり、ｌおよびｍはそれぞれ１であり、ｎは０であり、ならびにＺは−ＳＣＨ_３である。

【0166】

Ｒ_１およびＲ_２はメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれＨであり、ｌおよびｍはそれぞれ１であり、ｎは０であり、ならびにＺは−ＳＣＨ_３である。

【0167】

好ましくは、細胞傷害性剤は式（Ｖｌ−Ｌ）によって表される。

【0168】

このような追加のメイタンシンは、式（ＶＩＩ）によって表される化合物も含み：

【0169】

【化17】

式中：
Ｙは（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺを表し、
式中：
Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ独立して、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり加えてＲ_２はＨであることができ；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎはそれぞれ独立して、１から５の整数であり、および加えてｎは０であることができ；ならびに
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルである。

【0170】

式（ＶＩＩ）の好ましい実施形態は、式（ＶＩＩ）の化合物を含み、式中：
Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２はＨであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８はそれぞれＨであり；ｌおよびｍはそれぞれ１であり；ｎは０であり；ならびにＺはＨである。

【0171】

Ｒ_１およびＲ_２はメチルであり；Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれＨであり；ｌおよびｍは１であり；ｎは０であり；ならびにＺはＨである。

【0172】

Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれＨであり、ｌおよびｍはそれぞれ１であり、ｎは０であり、ならびにＺは−ＳＣＨ_３である。

【0173】

Ｒ_１およびＲ_２はメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８はそれぞれＨであり、ｌおよびｍは１であり、ｎは０であり、ならびにＺは−ＳＣＨ_３である。

【0174】

このような追加のメイタンシンは、式（ＶＩＩＩＩ−Ｌ）、（ＶＩＩＩ−Ｄ）、または（ＶＩＩＩ−Ｄ，Ｌ）によって表される化合物をさらに含み：

【0175】

【化18】

式中：
Ｙ_２は（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺ_２を表し、
式中：
Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ独立して、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり加えてＲ_２はＨであることができ；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖環式アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎはそれぞれ独立して、１から５の整数であり、および加えてｎは０であることができ；
Ｚ_２は、ＳＲまたはＣＯＲであり、ここでＲは、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；ならびにＭａｙはメイタンシノイドである。

【0176】

このような追加のメイタンシンは、式（ＩＸ）によって表される化合物も含み：

【0177】

【化19】

式中：
Ｙ_２’は
（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_９＝ＣＲ_１０）_ｐ（Ｃ≡Ｃ）_ｑＡ_ｒ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍＤ_ｕ（ＣＲ_１１＝ＣＲ_１２）_ｒ（Ｃ≡Ｃ）_ｓＢ_ｔ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺ_２を表し、式中：
Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ独立して、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、加えてＲ_２はＨであることができ；
Ａ、ＢおよびＤはそれぞれ独立して、３から１０個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換アリールまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_１１およびＲ_１２はそれぞれ独立して、Ｈ，ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔは、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔの少なくとも２つが一度にゼロでないという条件で、それぞれ独立して、０または１から５の整数である；ならびに
Ｚ_２はＳＲまたは−ＣＯＲであり、ここでＲは、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、または単純もしくは置換アリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルである。

【0178】

式（ＩＸ）の好ましい実施形態は、式（ＩＸ）の化合物を含み、式中：Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２はＨである。

【0179】

上述のメイタンシノイドは、抗ＥｐｈＡ抗体２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４またはこれのホモログもしくはフラグメントにコンジュゲートすることができ、ここで抗体は、メイタンシノイドのＣ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチルに見出されるアシル化アミノ酸側鎖のアシル基状に存在するチオールまたはジスルフィド官能基を使用してメイタンシノイドに連結され、ならびにここでアシル化アミノ酸側鎖のアシル基は、１または２個の置換基を有する炭素原子に位置するこれのチオールまたはジスルフィド官能基を有し、前記置換基は、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり、ならびに加えて置換基の１個がＨであることができ、ならびにここでアシル基は、カルボニル官能基と硫黄原子との間に少なくとも３個の炭素原子の直鎖長を有する。

【0180】

本発明の好ましいコンジュゲートは、式（Ｘ）のメイタンシノイドにコンジュゲートされた、または式（Ｘ）のメイタンシノイドとのコンジュゲーションによって得ることができる、抗ＥｐｈＡ抗体２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４またはこれのホモログもしくはフラグメントを備えるものであり：

【0181】

【化20】

式中：
Ｙ_１’は、
（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_９＝ＣＲ_１０）_ｐ（Ｃ≡Ｃ）_ｑＡ_ｒ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍＤ_ｕ（ＣＲ_１１＝ＣＲ_１２）_ｒ（Ｃ≡Ｃ）_ｓＢ_ｔ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２Ｓ−を表し、
式中：
Ａ、ＢおよびＤはそれぞれ独立して、３から１０個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換アリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１０、Ｒ_１１およびＲ_１２はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；ならびに
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔは、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓおよびｔの少なくとも２つが一度にゼロでないという条件で、それぞれ独立して、０または１から５の整数である。

【0182】

好ましくは、Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２はＨであり、またはＲ_１およびＲ_２はメチルである。

【0183】

本発明のなおさらに好ましいコンジュゲートは、式（ＸＩ−Ｌ）、（ＸＩ−Ｄ）、もしくは（ＸＩ−Ｄ，Ｌ）のメイタンシノイドにコンジュゲートされた、抗ＥｐｈＡ抗体２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４またはこれのホモログもしくはフラグメントを備えるものであり：

【0184】

【化21】

式中：
Ｙ_１は（ＣＲ_７Ｒ_８）_ｌ（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｍ（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２Ｓ−を表し、
式中：
Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ独立して、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルまたはアルケニル、フェニル、置換フェニル、複素環式芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり加えてＲ_２はＨであることができ；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１から１０個の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３から１０個の炭素原子を有する分枝もしくは環式アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎはそれぞれ独立して、１から５の整数であり、ならびに加えてｎは０であることができ；ならびに
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチルに側鎖を持つメイタンシノールを表す。

【0185】

式（ＸＩ−Ｌ）、（ＸＩ−Ｄ）および（ＸＩ−Ｄ，Ｌ）の好ましい実施形態は、式（ＸＩ−Ｌ）、（ＸＩ−Ｄ）および（ＸＩ−Ｄ，Ｌ）の化合物を含み、式中：
Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２はＨであり、またはＲ_１およびＲ_２はメチルであり、
Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれＨであり；ｌおよびｍはそれぞれ１であり；ｎは０であり、
Ｒ_１およびＲ_２はメチルであり；Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれＨであり；ｌおよびｍは１であり；ｎは０である。

【0186】

好ましくは、細胞傷害性剤は式（ＸＩ−Ｌ）によって表される。

【0187】

本発明のさらに好ましいコンジュゲートは、式（ＸＩＩ）のメイタンシノイドにコンジュゲートされた、抗ＥｐｈＡ抗体２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４またはこれのホモログもしくはフラグメントを備えるものである：

【0188】

【化22】

式中、置換基は上の式（ＸＩ）で定義された通りである。

【0189】

Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍがそれぞれ１であり、ならびにｎが０である、上記の化合物のいずれもとりわけ好ましい。

【0190】

Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８がそれぞれＨであり、ｌおよびｍが１であり、ならびにｎが０である、上記の化合物のいずれもさらにとりわけ好ましい。

【0191】

さらにＬ−アミノアシル立体異性体が好ましい。

【0192】

２００４年５月２０日に出願された係属中の米国特許出願第１０／８４９，１３６号で教示されたメイタンシノイドもそれぞれ、本発明の細胞傷害性コンジュゲートで使用され得る。米国特許出願第１０／８４９，１３６号の開示全体は、参照により本明細書に組み入れられている。

【0193】

ジスルフィド含有連結基
メイタンシノイドを細胞結合剤、例えば２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体に連結するために、メイタンシノイドは連結部分を備える。連結部分は、特定部位での完全活性メイタンシノイドの放出を可能にする化学結合を含有する。好適な化学結合は当分野で周知であり、ジスルフィド結合、酸不安定性結合、光不安定性結合、ペプチダーゼ不安定性結合およびエステラーゼ不安定性結合を含む。

【0194】

連結部分は、反応性化学基も備える。好ましい実施形態において、反応性化学基は、ジスルフィド結合連結部分を介してメイタンシノイドに共有結合するために使用される。

【0195】

特に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。

【0196】

反応性化学基を含有する連結部分を備えた特に好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノールおよびこれの類似体のＣ−３エステルであり、連結部分はジスルフィド結合を含有しおよび化学反応性基はＮ−スクシンイミジルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステルを備える。

【0197】

メイタンシノイド上の多くの位置は、連結部分を化学的に連結する位置として作用することができる。例えばヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルによって修飾されたＣ−１４位置、ヒドロキシによって修飾されたＣ−１５位置およびヒドロキシ基を有するＣ−２０位置はすべて有用であることが予想される。しかしＣ−３位置が好ましく、メイタンシノールのＣ−３位置がとりわけ好ましい。

【0198】

連結部分を有するメイタンシノールのエステルの合成はジスルフィド結合含有連結部分に関して記載されているが、当業者は、（上記のような）他の化学結合を備えた連結部分も、他のメイタンシノイドができるように、本発明によって使用できることを理解する。他の化学結合の詳細な例は、酸不安定性結合、光不安定性結合、ペプチダーゼ不安定性結合およびエステラーゼ不安定性結合を含む。本明細書に組み入れられている米国特許第５，２０８，０２０号の開示は、このような結合を持つメイタンシノイドの産生を教示する。

【0199】

反応性基を持つジスルフィド部分を有するメイタンシノイドおよびメイタンシノイド誘導体の合成は、米国特許第６，４４１，１６３号および第６，３３３，４１０号ならびに米国特許出願第１０／１６１，６５１号に記載され、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み入れられている。

【0200】

ＰＥＧ含有連結基
メイタンシノイドはまた、米国特許第６，７１６，８２１号に記載されるように、ＰＥＧ連結基を使用して細胞結合剤に連結され得る。これらのＰＥＧ連結基は水および非水性溶媒の両方に水溶性であり、１つ以上の細胞傷害性剤を細胞結合剤に接合するために使用することができる。例示的なＰＥＧ連結基は、ヘテロ２官能性ＰＥＧリンカーであって、一端の官能性スルフヒドリルまたはジスルフィド基および他端の活性エステルを通じて、リンカーの対向端に細胞傷害性剤および細胞結合剤を結合するヘテロ２官能性ＰＥＧリンカーを含む。

【0201】

ＰＥＧ連結基を使用する細胞傷害性コンジュゲートの合成の一般的な例として、具体的な詳細については米国特許第６，７１６，８２１号が再度参照される。合成は反応性ＰＥＧ部分を持つ１つ以上の細胞傷害性剤と細胞結合剤との反応により開始して、各反応性ＰＥＧ部分の末端活性エステルの、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体などの細胞結合剤のアミノ酸残基による置換をもたらし、ＰＥＧ連結基を通じて細胞結合剤に共有結合された１つ以上の細胞傷害性剤を備える細胞傷害性コンジュゲートを生じる。官能性スルフヒドリルまたはジスルフィド基を通じて細胞傷害性剤に結合しないＰＥＧ連結基を使用することも可能である。

【0202】

このため本明細書でＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４と呼ばれる式（ＸＩＩＩ）のメイタンシノイドは、本発明の範囲に含まれる：

【0203】

【化23】

【0204】

本明細書でＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４と呼ばれる式（ＸＩＶ）のメイタンシノイドも、本発明の意味に含まれる：

【0205】

【化24】

【0206】

本明細書でＳＰＤＢ−ＤＭ４と呼ばれる式（ＸＸＩＶ）のメイタンシノイドも、本発明の意味に含まれる：

【0207】

【化25】

【0208】

本明細書でＰＥＧ４−ＮＭｅＡｃ−ＤＭ４と呼ばれる式（ＸＸＶ）のメイタンシノイドも、本発明の意味に含まれる：

【0209】

【化26】

【0210】

本明細書でＰＥＧ８−ＮＨＡｃ−ＤＭ４と呼ばれる式（ＸＸＶＩ）のメイタンシノイドも、本発明の意味に含まれる：

【0211】

【化27】

【0212】

本明細書でＰＥＧ４−アリル−ＤＭ４と呼ばれる式（ＸＸＶＩＩ）のメイタンシノイドも、本発明の意味に含まれる：

【0213】

【化28】

【0214】

反応性基含有メイタンシノイド、例えばＤＭ４は抗体、例えば２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体と反応して細胞傷害性コンジュゲートを産生し、該細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）は抗体に共有結合されている。これらのコンジュゲートは、ＨＰＬＣまたはゲル濾過によって精製され得る。

【0215】

本発明の好ましい実施形態は、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体の、またはこれのヒト化型のコンジュゲートであり、前記コンジュゲートは前記２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体に共有結合された細胞傷害性剤を備え、前記細胞傷害性剤は式（ＸＩＩＩ）のメイタンシノイドと式（ＸＩＶ）のメイタンシノイドとの間で選ばれる。さらに好ましい実施形態において、式（ＸＩＩＩ）のメイタンシノイドの本発明の２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体へのコンジュゲーションは、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４コンジュゲートを生じる。別のさらなる好ましい実施形態において、式（ＸＩＶ）のメイタンシノイドは本発明の２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体にコンジュゲートされて、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートを生じる。

【0216】

このため好ましい実施形態は、式（ＸＶ）の構造から成る構造を有する抗体薬物コンジュゲートに関する：

【0217】

【化29】

（式中、Ａｂは本発明の抗体であり、ｎは１から１５の間で構成される整数である。）。優先的に、ｎは１から１０の間で構成される。なおさらに優先的に、ｎは５から７の間で構成される。別のさらなる好ましい実施形態において、本発明の抗体は２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのヒト化型であり、コンジュゲートは２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４コンジュゲートである。

【0218】

このため別の好ましい実施形態は、式（ＸＶＩ）の構造から成る構造を有する抗体薬物コンジュゲートに関する：

【0219】

【化30】

（式中、Ａｂは本発明の抗体であり、ｎは１から１５の間で構成される整数である。）。優先的に、ｎは１から１０の間で構成される。なおさらに優先的に、ｎは５から７の間で構成される。別のさらなる好ましい実施形態において、本発明の抗体は２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのヒト化型であり、コンジュゲートは２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートである。

【0220】

このような抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを産生するための複数の優れたスキームは、米国特許第第６，３３３，４１０号、ならびに米国特許出願第０９／８６７，５９８号、第１０／１６１，６５１号および第１０／０２４，２９０号で提供され、これらのそれぞれはその全体が本明細書に組み入れられている。

【0221】

上で説明したように、概してコンジュゲートは：
（ｉ）抗体の場合により緩衝された水溶液をメイタンシノイドの溶液と接触させるステップと；
（ｉｉ）次に、（ｉ）で形成されたコンジュゲートを未反応試薬および溶液中に存在し得るいずれの凝集体からも場合により（ｏｐｔｉｏｎｎａｌｌｙ）分離するステップと；
を備えた方法によって得ることができる。

【0222】

さらに詳細には、水性緩衝液による抗体の溶液は、反応性基を持つジスルフィド部分を有するモル過剰のメイタンシノイドによりインキュベートされ得る。反応混合物は、過剰のアミン（例えばエタノールアミン、タウリンなど）の添加によって反応停止させることができる。メイタンシノイド抗体コンジュゲートは次に、ゲル濾過によって精製され得る。

【0223】

方法の一態様において、抗体はｍｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのヒト化型である。この方法の別の態様において、細胞傷害性剤は：
式（ＸＶＩＩ）の化合物：

【0224】

【化31】

（式中、Ｙは、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、Ｎ−スルホスクシンイミジルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−スルホフタルイミジルオキシ、２−ニトロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、２，４−ジニトロフェニルオキシ、３−スルホニル−４−ニトロフェニルオキシ、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルオキシ、イミダゾリル、またはハロゲン原子である。）および式（ＸＶＩＩＩ）の化合物：

【0225】

【化32】

（式中、Ｙは、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、Ｎ−スルホスクシンイミジルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−スルホフタルイミジルオキシ、２−ニトロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、２，４−ジニトロフェニルオキシ、３−スルホニル−４−ニトロフェニルオキシ、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルオキシ、イミダゾリル、またはハロゲン原子である。）の間で選ばれる細胞傷害性剤である。

【0226】

抗体および式（ＸＶＩＩ）または（ＸＶＩＩＩ）のどちらかの化合物と共に使用することができる方法の例を、実施例１で与える。

【0227】

抗体分子１個当りに結合されたメイタンシノイド分子の数（「薬物対抗体比」または「ＤＡＲ」）は、実質的に精製された（即ちステップ（ｉｉ）の後の）コンジュゲートの溶液の２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度の比を測定することによって分光光度的に決定することができる。特に前記ＤＡＲは、抗体について２８０および２５２ｎｍでそれぞれ測定された消衰係数：ε_Ａ２８０＝２２４，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１およびε_Ａ２５２＝８２，８８０Ｍ^−１ｃｍ^−１を使用して；抗体およびメイタンシノイドの平均１６０，０００分子量をε_Ｄ２８０＝５，１８０Ｍ^−１ｃｍ^−１およびε_Ｄ２５２＝２６，１５９Ｍ^−１ｃｍ^−１と仮定して、分光光度的に決定することができる。）。計算方法は、Ａｎｔｏｎｙ Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ（ｅｄ），ＬＬＣ，２００９，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ ５２５，４４５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅから導かれ、下でさらに詳細に記載する：
２５２ｎｍ（Ａ_２５２）および２８０ｎｍ（Ａ_２８０）におけるコンジュゲートの吸光度は、ＳＥＣ分析の単量体ピーク（「ＤＡＲ（ＳＥＣ）」パラメータを計算させる。）で、または古典的な分光光度装置を使用して（「ＤＡＲ（ＵＶ）」パラメータを計算させる。）のどちらかで測定する。吸光度は以下のように表すことができ：

【0228】

【数1】

式中：
ｃ_Ｄおよびｃ_Ａはそれぞれ、メイタンシノイドおよび抗体の溶液中での濃度であり、
ε_Ｄ２５２およびε_Ｄ２８０はそれぞれ、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるメイタンシノイドのモル消衰係数であり、
ε_Ａ２５２およびε_Ａ２８０はそれぞれ、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける抗体のモル消衰係数である。

【0229】

２個の未知数を用いたこれらの２つの等式の解によって、以下の等式がもたらされる：

【0230】

【数2】

次に平均ＤＡＲを、薬物濃度の抗体濃度に対する比から計算する：

【0231】

【数3】

ＵＶ分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）によって測定した平均ＤＡＲ（ＤＡＲ（ＵＶ））はさらに詳細には４より大、さらに詳細には４から１０の間、なおさらに詳細には４から７の間、なおさらに詳細には５．５から８の間およびなおさらに詳細には５．９から７．５の間である。

【0232】

またさらなる好ましい実施形態において、本発明は、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体の、またはこれのヒト化型コンジュゲートおよび式（ＸＶＩＩ）または（ＸＶＩＩＩ）のどちらかの化合物を備え、ＤＡＲは４から７の間のメイタンシノイド分子／抗体分子で構成され、前記ＤＡＲは、実質的に精製されたコンジュゲートの溶液の２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度の比を分光光度的に測定することによって決定される。

【0233】

上の方法によって得ることができるコンジュゲートは、本発明の範囲内に含まれる。特定の態様において、このようなコンジュゲートは、Ａｂが本発明の抗体であり、ｎが４から１０の間で構成される式（ＸＶ）および式（ＸＶＩ）の間で選ばれる構造を有する。好ましい実施形態において、ｎは４から７の間で構成される。別の好ましい実施形態において、前記コンジュゲートは、式（ＸＶ）の構造を有する。

【0234】

抗体のメイタンシノイド薬とのコンジュゲートは、インビトロでの各種の望ましくない株化細胞の増殖を抑制するこれの能力について評価することができる。例えばヒト類表皮癌系統Ａ−４３１、ヒト小細胞肺癌株化細胞ＳＷ２、ヒト乳房腫瘍系統ＳＫＢＲ３およびバーキットリンパ腫株化細胞ナマルバなどの株化細胞は、これらの化合物の細胞傷害性の影響評価について容易に使用できる。評価される細胞は、化合物に２４時間曝露させて、細胞の生存画分を公知の方法による直接アッセイで測定できる。次にＩＣ_５０値をアッセイの結果から計算することができる。

【0235】

トマイマイシン誘導体
本発明による細胞傷害性は、トマイマイシン誘導体でもあり得る。トマイマイシン誘導体は、ＤＮＡの副溝におけるグアニンのＮ２への共有結合によって、これの生物特性を及ぼす公知のクラスの化合物であるピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。ＰＢＤは、アントラマイシン、ネオトラマイシンおよびＤＣ−８１などの幾つかの副溝結合剤を含む。

【0236】

高度の細胞傷害性を保持して、細胞結合剤に効果的に連結することができる新規トマイマイシン誘導体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００１４２に開示され、これの内容は参照により本明細書に組み入れられている。細胞結合剤−トマイマイシン誘導体複合体は、トマイマイシン誘導体の十分な細胞傷害性作用を標的化された方式で望ましくない細胞のみに対して適用されるようにし、ゆえに標的化されていない健常細胞に対する損傷による副作用を回避する。

【0237】

本発明による細胞傷害性剤は、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体などの細胞結合剤に連結基を介して連結された１個以上のトマイマイシン誘導体を備える。連結基は、トマイマイシン誘導体に在来の方法によって共有結合されている化学的部分の一部である。好ましい実施形態において、化学的部分は、ジスルフィド結合を介してトマイマイシン誘導体に共有結合することができる。

【0238】

本発明で有用なトマイマイシン誘導体は、下に示す式（ＸＸ）を有する：

【0239】

【化33】

式中：

【0240】

【化34】

は、任意の単結合を表し；

【0241】

【化35】

は、単結合または２重結合のどちらかを表し；

【0242】

【化36】

が単結合を表すとき、同じまたは異なるＵおよびＵ’は独立してＨを表し、同じまたは異なるＷおよびＷ’は独立して、ＯＨ、−ＯＲなどのエーテル、−ＯＣＯＲなどのエステル（例えばアセテート）、−ＯＣＯＯＲなどのカーボネート、−ＯＣＯＮＲＲ’などのカルバメート、Ｎ１０およびＣ１１が環の一部であるような環式カルバメート、−ＮＲＣＯＮＲＲ’などの尿素、−ＯＣＳＮＨＲなどのチオカルバメート、Ｎ１０およびＣ１１が環の一部であるような環式チオカルバメート、−ＳＨ、−ＳＲなどのスルフィド、−ＳＯＲなどのスルホキシド、−ＳＯＯＲなどのスルホン、−ＳＯ３−などのスルホナート、−ＮＲＳＯＯＲなどのスルホンアミド、−ＮＲＲ’などのアミン、場合によりＮ１０およびＣ１１が環の一部であるような環式アミン、−ＮＲＯＲ’などのヒドロキシルアミン誘導体、−ＮＲＣＯＲなどのアミド、−Ｎ３などのアジド、シアノ、ハロ、トリアルキルまたはトリアリールホスホニウム、アミノ酸誘導基から成る群より選択され；好ましくはＷおよびＷ’は同じでありまたは異なり、ＯＨ、ＯＭｅ、ＯＥｔ、ＮＨＣＯＮＨ_２、ＳＭｅであり；
ならびに

【0243】

【化37】

が２重結合を表すとき、ＵおよびＵ’は存在せず、ＷおよびＷ’はＨを表し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’は同じでありもしくは異なり、ハライドもしくは１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ_３、ＯＲ、アリール、Ｈｅｔ、Ｓ（Ｏ）_ｑＲによって場合により置換されたアルキルから独立して選択され、またはＲ１およびＲ２ならびにＲ１’およびＲ２’は、基＝Ｂおよび＝Ｂ’をそれぞれ含有する２重結合を共に形成する。

【0244】

好ましくは、Ｒ１およびＲ２ならびにＲ１’およびＲ２’は、基＝Ｂおよび＝Ｂ’をそれぞれ含有する２重結合を共に形成する。

【0245】

ＢおよびＢ’は同じでありもしくは異なり、１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ_３、ＯＲ、アリール、Ｈｅｔ、Ｓ（Ｏ）_ｑＲによって場合により置換されたアルケニルから独立して選ばれ、またはＢおよびＢ’は酸素原子を表す。

【0246】

好ましくはＢ＝Ｂ’である。

【0247】

さらに好ましくはＢ＝Ｂ’＝、＝ＣＨ_２または＝ＣＨ−ＣＨ_３であり、
Ｘ、Ｘ’は同じでありまたは異なり、１個以上の−Ｏ−、−ＮＲ−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_ｑ−から独立して選ばれる。

【0248】

好ましくはＸ＝Ｘ’である。

【0249】

さらに好ましくはＸ＝Ｘ’＝０である。

【0250】

Ａ、Ａ’は同じでありまたは異なり、１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ_３、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）_ｑＲ、アリール、Ｈｅｔ、アルキル、アルケニルによってそれぞれ場合により置換された、酸素、窒素または硫黄原子を場合により含有するアルキルまたはアルケニルから独立して選ばれる。

【0251】

好ましくはＡ＝Ａ’である。

【0252】

さらに好ましくはＡ＝Ａ’＝直鎖非置換アルキルである。

【0253】

Ｙ、Ｙ’は、同じでありまたは異なり、Ｈ、ＯＲから独立して選ばれ；
好ましくはＹ＝Ｙ’である。

【0254】

さらに好ましくはＹ＝Ｙ’＝Ｏアルキル、さらに好ましくはＯメチルである。

【0255】

Ｔは、−ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）_ｑ−、または１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ_３、Ｒ、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）_ｑＲおよび／もしくはリンカーによってそれぞれ場合により置換された４から１０員アリール、シクロアルキル、複素環式もしくはヘテロアリール、または１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ_３、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）_ｑＲおよび／もしくはリンカーによって場合により置換された分枝アルキル、または１個以上のＨａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ_３、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）_ｑＲおよび／もしくはリンカーによって置換された直鎖アルキルである。

【0256】

Ｔは、好ましくは４から１０員アリールまたはヘテロアリール、さらに１個以上のリンカーによって場合により置換された好ましくはフェニルまたはピリジルである。

【0257】

前記リンカーは連結基を備える。好適な連結基は当分野で周知であり、チオール基、スルフィド基、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基を含む。好ましいのはジスルフィド基およびチオエーテル基である。

【0258】

連結基がチオール、スルフィド（もしくはいわゆるチオエーテル−Ｓ−）またはジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）含有基であるとき、チオール、スルフィドまたはジスルフィド基を担持する側鎖は、直鎖または分枝、芳香族または複素環式であることができる。当業者は好適な側鎖をただちに確認することができる。

【0259】

好ましくは、前記リンカーは式：
−Ｇ−Ｄ−（Ｚ）ｐ−Ｓ−Ｚ’
（式中
Ｇは、単結合または２重結合、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ−であり；
Ｄは、単結合または−Ｅ−、−Ｅ−ＮＲ−、−Ｅ−ＮＲ−Ｆ−、−Ｅ−Ｏ−、−Ｅ−Ｏ−Ｆ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＯ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＯ−Ｆ−、−Ｅ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｅ−、−Ｅ−ＣＯ−Ｆ、−Ｅ−Ｓ−、−Ｅ−Ｓ−Ｆ−、−Ｅ−ＮＲ−Ｃ−Ｓ−、−Ｅ−ＮＲ−ＣＳ−Ｆ−であり；
ここでＥおよびＦは同じでありまたは異なり、直鎖または分枝−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−アルキル−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉシクロアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ複素環式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉヘテロアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉシクロアルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉ複素環式（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−アルキル（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｉヘテロアリール（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、−シクロアルキル−アルキル−、−アルキル−シクロアルキル−、−複素環式−アルキル−、−アルキル−複素環式−、−アルキル−アリール−、−アリール−アルキル−、−アルキル−ヘテロアリール−、−ヘテロアリール−アルキル−から独立して選ばれ；
ここで同じであるまたは異なるｉおよびｊは、整数であり、０、１から２０００より独立して選ばれ；
Ｚは、直鎖または分枝−アルキル−であり；
ｐは０または１であり；
Ｚ’は、Ｈ、ＣＯＲ、Ｒ２０またはＳＲ２０などのチオール保護基を表し、ここでＲ２０は、Ｚ’がＨであるとき、前記化合物がＰＢＤ部分の１つのイミン結合−ＮＨ＝へのチオール基−ＳＨの付加から生じる分子内環化によって形成された対応する化合物と平衡であるという条件で、Ｈ、メチル、アルキル、場合により置換されたシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環式を表す。

【0260】

等しいまたは異なるｎ、ｎ’は、０または１である。

【0261】

ｑは０、１または２である。

【0262】

Ｒ，Ｒ’は、等しいまたは異なり、Ｈａｌ、ＣＮ、ＮＲＲ’、ＣＦ３、Ｒ、ＯＲ、Ｓ（Ｏ）ｑＲ、アリール、Ｈｅｔによってそれぞれ場合により置換されたＨ、アルキル、アリールから独立して選ばれる。）；またはこれの医薬的に許容される塩、水和物、もしくは水和物塩、またはこれらの化合物の多形結晶構造もしくはこれらの光学異性体、ラセミ化合物、ジアステレオマーまたはエナンチオマーである。

【0263】

幾何および立体異性体を有する一般式（ＸＸ）の化合物も本発明の一部である。

【0264】

式（ＸＸ）のトマイマイシン誘導体のＮ−１０、Ｃ−１１の２重結合は、水、アルコール、チオール、１級または２級アミン、尿素および他の求核試薬の存在下で対応するイミン付加体に可逆的様式でただちに変換できることが公知である。本方法は可逆的であり、脱水剤の存在下、非プロトン性有機溶媒（ｓｏｌｖａｎｔ）中で真空中または高温にて、対応するトマイマイシン誘導体を容易に再生することができる（Ｚ．Ｔｏｚｕｋａ，１９８３，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３６：２７６）。

【0265】

このため一般式（ＸＸＩ）のトマイマイシン誘導体の可逆性誘導体も本発明で使用できる：

【0266】

【化38】

式中、Ａ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ｔ、Ａ’、Ｘ’、Ｙ’、ｎ’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’は式（ＸＸ）で定義した通りであり、Ｗ、Ｗ’は同じであるかまたは異なり、ＯＨ、−ＯＲなどのエーテル、−ＯＣＯＲ、−ＣＯＯＲなどのエステル（例えばアセテート）、−ＯＣＯＯＲなどのカーボネート、−ＯＣＯＮＲＲ’などのカルバメート、Ｎ１０およびＣ１１が環の一部であるような環式カルバメート、−ＮＲＣＯＮＲＲ’などの尿素、−ＯＣＳＮＨＲなどのチオカルバメート、Ｎ１０およびＣ１１が環の一部であるような環式チオカルバメート、−ＳＨ、−ＳＲなどのスルフィド、ＳＯＲなどのスルホキシド、−ＳＯＯＲなどのスルホン、−ＳＯ３−などのスルホナート、−ＮＲＳＯＯＲなどのスルホンアミド、−ＮＲＲ’などのアミン、場合によりＮ１０およびＣ１１が環の一部であるような環式アミン、−ＮＲＯＲ’などのヒドロキシルアミン誘導体、−ＮＲＣＯＲなどのアミド、−ＮＲＣＯＮＲＲ’、−Ｎ３などのアジド、シアノ、ハロ、トリアルキルまたはトリアリールホスホニウム、アミノ酸誘導基から成る群より選択される。好ましくはＷおよびＷ’は、同じでありまたは異なり、ＯＨ、Ｏｍｅ、Ｏｅｔ、ＮＨＣＯＮＨ２、ＳＭｅである。

【0267】

式（ＸＸＩ）の化合物はこのため、溶媒が水であるときの水を含めて、溶媒和物と見なされ得る；これらの溶媒和物は特に有用であり得る。

【0268】

好ましい化合物は、式（ＸＸＩＩ）または（ＸＸＩＩＩ）の化合物であり：

【0269】

【化39】

式中、Ｘ、Ｘ’、Ａ、Ａ’、Ｙ、Ｙ’、Ｔ、ｎ、ｎ’は、上で定義した通りである。

【0270】

式（ＸＸ）の化合物は、当業者に周知の幾つかの方法で調製され得る。化合物は例えば、後述の方法の適用もしくは改変、または当業者によって認識されるような方法に対する変形によって合成することができる。適切な修飾および置換は、当業者にはただちに明らかで周知となり、または科学文献からただちに入手でできる。特にこのような方法は、Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９に見出すことができる。

【0271】

本発明で使用され得るトマイマイシン誘導体を合成する方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００１４２に記載されている。本発明の化合物は、多種多様の合成経路によって調製され得る。試薬および開始物質は市販されているか、または当業者に周知の技法によりただちに合成される（例えばＷＯ００／１２５０８、ＷＯ００／１２５０７、Ｗ０２００５／０４０１７０、ＷＯ２００５／０８５２６０、ＦＲ１５１６７４３、Ｍ．Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４２：３７９３−３８０６を参照のこと。）。

【0272】

本発明のコンジュゲート分子は、いずれの技法を使用しても形成され得る。本発明のトマイマイシン誘導体は、抗体または他の細胞結合剤に、酸不安定性リンカーを介して、または光不安定性リンカーによって連結され得る。誘導体を、好適な配列を有するペプチドと縮合させ、続いて細胞結合剤に連結させて、ペプチダーゼ不安定性リンカーを産生することができる。コンジュゲートは１級ヒドロキシル基を含有するように調製することができ、１級ヒドロキシル基をアシル化して、次に細胞結合剤に連結させ、細胞内エステラーゼによって切断されて遊離誘導体を遊離できるコンジュゲートを産生することができる。好ましくは、誘導体は遊離または保護チオール基を含有するように合成され、次に１個以上のジスルフィドまたはチオール含有誘導体は、細胞結合剤にそれぞれジスルフィド結合またはチオールリンクを介してそれぞれ共有結合的に連結される。

【0273】

コンジュゲーションの多くの方法は、ＵＳＰ５，４１６，０６４およびＵＳＰ５，４７５，０９２で教示されている。トマイマイシン誘導体は遊離アミノ基を生じるように修飾され、次に抗体または他の細胞結合剤に酸不安定性リンカーまたは光不安定性リンカーを介して連結することができる。遊離アミノまたはカルボキシル基を備えたトマイマイシン誘導体は、ペプチドと縮合されて、続いて細胞結合剤に連結され、ペプチダーゼ不安定性リンカーを産生することができる。リンカー上に遊離ヒドロキシル基を備えたトマイマイシン誘導体はアシルされて、次に細胞結合剤に連結され、細胞内エステラーゼによって切断されて遊離薬を遊離できるコンジュゲートを産生することができる。最も好ましくは、トマイマイシン誘導体は遊離または保護チオール基を生成するように処理され、次にジスルフィドまたはチオール含有トマイマイシンダイマーは細胞結合剤にジスルフィド結合を介して連結される。

【0274】

好ましくは、モノクローナル抗体または細胞結合剤−トマイマイシン誘導体コンジュゲートは、トマイマイシン誘導体を送達することができる、上で議論したようなジスルフィド結合を介して接合されているコンジュゲートである。このような細胞結合コンジュゲートは、モノクローナル抗体をスクシンイミジルピリジル−ジチオプロピオナート（ＳＰＤＰ）によって修飾することなどの公知の方法によって調製される（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３−７３７）。得られたチオピリジル基は次にチオール含有トマイマイシン誘導体を用いた処置によって置換されて、ジスルフィド連結コンジュゲートを産生する。またはアリールジチオトマイマイシン誘導体の場合、細胞結合コンジュゲートの形成は、トマイマイシン誘導体のアリールチオールの、抗体分子中に先に導入されたスルフヒドリル基による直接置換によって行われる。ジスルフィド架橋を介して連結された１から１０個のトマイマイシン誘導体薬を含有するコンジュゲートは、どちらかの方法によってただちに調製される。

【0275】

さらに詳細には、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する、ｐＨ７．５の０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液による２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のジチオニトロピリジル修飾抗体の溶液を、チオール含有トマイマイシン誘導体（１．３モル当量／ジチオピリジル基）によって処置する。修飾抗体からのニトロピリジンチオンの放出は、分光光度的に３２５ｎｍにて監視され、約１６時間で完了する。抗体−トマイマイシン誘導体コンジュゲートは、未反応薬および他の低分子量材料から、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５またはＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００のカラムを通じてゲル濾過によって精製および遊離される。抗体分子１個当りに結合されたトマイマイシン誘導体部分の数は、２３０ｎｍおよび２７５ｎｍにおける吸光度の比を測定することによって決定できる。本方法により平均で１から１０個のトマイマイシン誘導体分子／抗体分子を、ジスルフィド結合を介して連結することができる。

【0276】

抗原発現細胞への結合親和性に対するコンジュゲーションの効果は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：８６１８−８６２３によって先に記載された方法を使用して決定することができる。トマイマイシン誘導体およびこれの抗体コンジュゲートの株化細胞に対する細胞傷害性は、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：３６４８−３６５１に記載されたような細胞増殖曲線の逆外挿によって測定することができる。これらの化合物の接着性株化細胞に対する細胞傷害性は、Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０２：１３１２−１３１９で記載されたようなクローン原性アッセイによって決定することができる。

【0277】

ＣＣ−１０６５類似体
本発明による細胞傷害性コンジュゲートで使用される細胞傷害性剤は、ＣＣ−１０６５またはこれの誘導体でもあり得る。

【0278】

ＣＣ−１０６５は、ストレプトミセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離された強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、普通に使用される抗癌薬、例えばドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンクリスチンよりも、インビトロで約１０００倍強力である（Ｂ．Ｋ．Ｂｈｕｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４２，３５３２−３５３７）。ＣＣ−１０６５およびこれの類似体は、米国特許第６，３７２，７３８号、第６，３４０，７０１号、第５，８４６，５４５号および第５，５８５，４９９号に開示されている。

【0279】

ＣＣ−１０６５の細胞傷害性効力は、これのアルキル化活性およびこれのＤＮＡ結合またはＤＮＡ挿入活性と相関してきた。これらの２つの活性は、分子の別個の部分に存在する。このためアルキル化活性はシクロプロパピロロインドール（ＣＰＩ）サブユニットに含有され、ＤＮＡ−結合活性は２個のピロロインドールサブユニットに存在する。

【0280】

ＣＣ−１０６５は細胞傷害性剤としてある魅力的な特徴を有するが、これは治療的使用での制限を有する。ＣＣ−１０６５のマウスへの投与により遅延肝毒性が引き起こされ、１２．５μｇ／ｋｇの単回静脈内投薬の後、第５０日に死亡に至った（Ｖ．Ｌ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ＸＸＩＸ：３１９−３３４）．このことにより遅延毒性を生じない類似体を開発する取り組みが促進され、ＣＣ−１０６５でモデル化されたより単純な類似体の合成について記載されている（Ｍ．Ａ．Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３１：５９０−６０３）。

【0281】

別の一連の類似体において、ＣＰＩ部分はシクロプロパ［ｃ］ベンズ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）部分によって置換された（Ｄ．Ｌ．Ｂｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：５８２３−５８３３；Ｄ．Ｌ．Ｂｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＢｉｏＯｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１：１１５−１２０）。これらの化合物は、マウスにおける遅延毒性を引き起こすことなく、親薬物の高いインビトロ効力を維持している。ＣＣ−１０６５と同様に、これらの化合物は、ＤＮＡの副溝に共有結合的様式で結合して細胞死を引き起こすアルキル化剤である。しかし、最も有望な類似体であるアドゼレシンおよびカルゼルシンの臨床評価は、期待はずれの結果に至っている（Ｂ．Ｆ．Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ，１３：３２１−３２６；Ｉ．Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２：１７１７−１７２３）。これらの薬物は、これの高い全身毒性のために、不十分な治療効果を提示する。

【0282】

ＣＣ−１０６５類似体の治療有効性は、腫瘍部位への標的化送達を通じてインビボ分布を変化させることによって大幅に改善することができ、非標的化組織へのより低い毒性、このためより低い全身毒性を生じる。本目標を達成するために、ＣＣ−１０６５の類似体および誘導体と腫瘍細胞を特異的に標的化する細胞結合剤とのコンジュゲートについて記載されている（米国特許５，４７５，０９２；５，５８５，４９９；５，８４６，５４５）。これらのコンジュゲートは通例、インビトロでの高い標的特異的な細胞傷害性およびマウスでのヒト腫瘍異種移植モデルにおける例外的な抗腫瘍活性を提示する（Ｒ．Ｖ．Ｊ．Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：４０７９−４０８４）。

【0283】

最近、水性媒体での溶解度が向上したＣＣ−１０６５類似体のプロドラッグについて記載されている（欧州特許出願番号０６２９０３７９．４）。これらのプロドラッグでは、分子のアルキル化部のフェノール基は、薬物を酸性水溶液中での貯蔵時に安定にして、未保護類似体と比較して薬物に対する水溶解度の向上を付与する、官能基によって保護されている。保護基は、生理学的ｐＨにおいてインビボでただちに切断されて、対応する活性薬を与える。ＥＰ０６２９０３７９．４に記載されたプロドラッグでは、フェノール置換基は、生理学的ｐＨにおいて電荷を所有するフェニルカルバメートを含有するスルホン酸として保護され、このため水溶解度が向上している。水溶解度をさらに向上させるために、任意のポリエチレングリコールスペーサを、インドリルサブユニットとジスルフィド基などの切断可能な連結との間にリンカーに導入することができる。本スペーサの導入は、薬物の効力を改変しない。

【0284】

本発明の細胞傷害性コンジュゲートにおいて使用され得るＣＣ−１０６５類似体を合成する方法は、類似体を抗体などの細胞結合剤にコンジュゲートする方法と共に、ＥＰ０６２９０３７９．４（この内容は参照により本明細書に組み入れられている。）ならびに米国特許第５，４７５，０９２号、第５，８４６，５４５号、第５，５８５，４９９号、第６，５３４，６６０号および第６，５８６，６１８号ならびに米国特許出願第１０／１１６，０５３号および第１０／２６５，４５２号に記載されている。

【0285】

他の薬物
メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、レプトマイシン誘導体、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリケアマイシン、チューブリシンおよびチューブリシン類似体、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似体、ドラスタチンおよびアウリスタチンなどのドラスタチン類似体などの薬物も、本発明のコンジュゲートの調製に好適である。薬物分子は、血清アルブミンなどの中間担体分子を通じて抗体分子に連結することもできる。例えば米国特許第６，６３０，５７９号に記載されたドキソルビシンおよびダウノルビシン化合物も、有用な細胞傷害性剤であり得る。

【0286】

治療組成物
本発明は、治療的有効量の本発明の化合物および医薬的に許容される担体を備える、哺乳動物における過剰増殖障害の処置のための治療組成物にも関する。一実施形態において、前記医薬組成物は、（限定されるわけではないが）以下の：膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸、甲状腺および皮膚の癌腫を含む；扁平上皮細胞癌腫を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含む、リンパ系の造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病を含む、骨髄系の造血器腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、奇形癌（ｔｅｔｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、神経芽細胞腫および神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫，神経芽細胞腫，神経膠腫および神経鞘腫を含む、中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒａｍａ）および骨肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫（ｋｅｒａｔｏａｃｔａｎｔｈｏｍａ）、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌を含む他の腫瘍、ならびにＥｐｈＡ２が主に発現される未確認の他の癌を含む、癌の処置のためである。好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、卵巣、子宮頸およびリンパ器官の癌、骨肉腫、滑膜肉腫、肉腫、頭頸部、神経膠腫、胃癌、肝臓癌、またはＥｐｈＡ２が発現される他の癌腫の処置に使用される。特に癌は、転移性癌である。別の実施形態において、前記医薬組成物は、例えば全身性狼瘡、関節リウマチおよび多発性硬化症などの自己免疫疾患；腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心移植拒絶および骨髄移植拒絶などの移植片拒絶；移植片対宿主疾患；ｍＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなどのウイルス感染症；ならびにランブル鞭毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症などの寄生虫感染症などの他の疾患ならびに当業者によって決定された他の疾患に関する。

【0287】

本発明は、医薬組成物であって：
有効量の本発明の抗体、抗体フラグメントまたは抗体コンジュゲートおよび
不活性であり得るまたは生理学的に活性であり得る医薬的に許容される担体を備えた医薬組成物を提供する。

【0288】

本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに生理学的に適合性であるものを含む。好適な担体、希釈剤および／または賦形剤の例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ以上、ならびにこれらの組合せを含む。多くの場合、組成物中に糖、ポリアルコール、または塩化ナトリウムなどの等張性剤を含むことが好ましい。特に、好適な担体の関連する例は：（１）約１ｍｇ／ｍｌから２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するまたは含有しないダルベッコリン酸緩衝食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースを含み；ならびにトリプタミンなどの抗酸化剤およびツイン２０などの安定化剤も含有し得る。

【0289】

本明細書の組成物は、処置されている特定の障害に必要であるような、さらなる治療剤も含有し得る。好ましくは、本発明の抗体、抗体フラグメントまたは抗体コンジュゲート、および補助活性化合物は、相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有する。好ましい実施形態において、さらなる治療剤は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、組織因子（ＴＦ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、またはＨＥＲ２受容体のアンタゴニストである。

【0290】

本発明の組成物は、多種多様の形であり得る。これらは例えば液体、半固体および固体剤形を含むが、好ましい形は投与および治療用途の意図した方式によって変わる。代表的な好ましい組成物は、注射用または輸液用液剤の形である。好ましい投与方式は、非経口（例えば静脈内、筋肉内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｎｏｎｅａｌ）、皮下）である。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ボーラスとしてまたは連続輸液によりある期間にわたって静脈内投与される。別の好ましい実施形態において、組成物は筋肉内、皮下、関節内、滑液嚢内、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、または病変周囲経路によって、局所ならびに全身治療効果を及ぼす。これらは噴霧によっても投与することができる。

【0291】

非経口投与用の滅菌組成物は、本発明の抗体、抗体フラグメントまたは抗体コンジュゲートを要求される量で適切な溶媒に包含させて、続いての精密濾過による滅菌によって調製することができる。溶媒またはビヒクルとして、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せが使用され得る。多くの場合、組成物中に糖、ポリアルコール、または塩化ナトリウムなどの等張性剤を含むことが好ましい。これらの組成物はアジュバント、特に湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散化剤および安定化剤も含有し得る。非経口投与用の滅菌組成物は、滅菌水または他のいずれかの注射用滅菌培地中での使用時に溶解され得る滅菌固体組成物の形でも調製され得る。

【0292】

用量は、期待される効果、処置期間および使用される投与経路によって変わる；用量は一般に成人１日当り５ｍｇから１０００ｍｇの間であり、単位用量は活性成分１ｍｇから２５０ｍｇの範囲に及ぶ。概して、医師は、処置される対象に固有である年齢、体重および他のいずれかの因子に応じて適切な用量を決定する。

【0293】

治療的使用方法
別の実施形態において，本発明は、ＥｐｈＡ２受容体活性を阻害する方法であって、前記ＥｐｈＡ２受容体と拮抗する抗体を、これが必要な患者に投与することによる方法を提供する。本発明のいずれの種類の抗体、抗体フラグメント、または細胞傷害性コンジュゲートも治療的に使用され得る。本発明はこのため、アンタゴニスト抗ＥｐｈＡ２抗体、これのフラグメント、またはこれの細胞傷害性コンジュゲートの医薬品としての使用を含む。好ましい実施形態において、アンタゴニスト抗ＥｐｈＡ２抗体は、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体またはこれのヒト化バリアントである。

【0294】

好ましい実施形態において、本発明の抗体、抗体フラグメント、または細胞傷害性コンジュゲートは、哺乳動物の過剰増殖障害の処置に使用される。さらに好ましい実施形態において、上で開示した本発明の抗体、抗体フラグメント、または細胞傷害性コンジュゲートを含有する医薬組成物の１つは、哺乳動物の過剰増殖障害の処置に使用される。本発明の抗体、抗体フラグメントおよび細胞傷害性コンジュゲートが哺乳動物の前記過剰増殖障害を処置する医薬品を作製するためにも使用できることも、本発明の実施形態である。一実施形態において、障害は癌である。特に癌は、転移性癌である。本発明の抗体、抗体フラグメントおよび細胞傷害性コンジュゲートは、前記癌腫瘍の新生血管形成を処置するためにも使用できる。

【0295】

従って、本発明の医薬組成物は、（これらに限定されるわけではないが）以下の：膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸、甲状腺および皮膚の癌腫を含む；扁平上皮細胞癌腫を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含む、リンパ系の造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病を含む、骨髄系の造血器腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、奇形癌（ｔｅｔｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、神経芽細胞腫および神経膠腫を含む他の腫瘍；神経芽細胞腫および神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫，神経芽細胞腫，神経膠腫および神経鞘腫を含む、中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒａｍａ）および骨肉腫を含む、間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫（ｋｅｒａｔｏａｃｔａｎｔｈｏｍａ）、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌を含む他の腫瘍、ならびにＥｐｈＡ２が主に発現される未確認の他の癌を含む、多種多様の癌の処置または予防に有用である。好ましい実施形態において、癌は肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、子宮、卵巣、子宮頸およびリンパ器官の癌、骨肉腫、滑膜肉腫、肉腫、頭頸部、神経膠腫、胃癌、肝臓癌またはＥｐｈＡ２が発現される他の癌腫である。別の実施形態において、前記医薬組成物は、例えば全身性狼瘡、関節リウマチおよび多発性硬化症などの自己免疫疾患；腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心移植拒絶および骨髄移植拒絶などの移植片拒絶；移植片対宿主疾患；ｍＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳなどのウイルス感染症；ならびにランブル鞭毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症などの寄生虫感染症などの他の疾患ならびに当業者によって決定された他の疾患に関する。

【0296】

同様に本発明は、標的細胞、または標的細胞を含有する組織を、単独で、または他の細胞傷害性剤もしくは治療剤との組合せのどちらかで有効量の本発明の抗体、抗体フラグメントまたは抗体コンジュゲートの、または細胞傷害性コンジュゲートを備えた抗体、抗体フラグメントもしくは治療剤と接触させることを備えた選択された細胞集団の成長を阻害する方法を提供する。

【0297】

選択された細胞集団の成長を阻害する方法は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで実施することができる。本明細書で使用する場合、「成長を阻害すること」は、長期にわたる、または短期にわたるかにかかわらず、細胞の成長を低速化すること、細胞生存度を低下させること、細胞の死を引き起こすこと、細胞を溶解させることおよび細胞死を誘発することを意味する。

【0298】

インビトロ使用の例は、自家骨髄の、同じ患者へのこれの移植前の、疾患または悪性細胞を死滅させるための処置；骨髄のこれの移植前の、コンピテントＴ細胞を死滅させて、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するための処置；標的抗原を発現しない所望のバリアントを除くすべての細胞を死滅させるための；または所望でない抗原を発現するバリアントを死滅させるための、細胞培養物の処置を含む。

【0299】

非臨床的インビトロ使用の条件は、当業者によってただちに決定される。

【0300】

臨床的エクスビボ使用の例は、癌処置におけるもしくは自己免疫疾患の処置における自家移植の前に骨髄から腫瘍細胞もしくはリンパ系細胞を除去すること、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するために移植前に自家もしくは同種異系骨髄または組織からＴ細胞および他のリンパ系細胞を除去することである。処置は以下のように行うことができる。骨髄は、患者または他の個体から収集され、次に本発明の細胞傷害性剤が添加される血清を含有する培地中でインキュベートされる。濃度は、約３０分から約４８時間にわたって約３７℃にて、約１０μＭから１ｐＭの範囲に及ぶ。インキュベーションの濃度および時間の正確な条件、即ち用量は、当業者によってただちに決定される。インキュベーション後、骨髄細胞は公知の方法に従って、血清を含有する培地で洗浄され、静脈内注入によって患者に戻される。骨髄の収集の時間と処置細胞の再注入との間に、患者が除去化学療法または全身照射のコースなどの他の処置を受ける状況では、処置された骨髄細胞は、標準医療装置を使用して液体窒素中で凍結貯蔵される。

【0301】

臨床的インビボ使用では、本発明の抗体、エピトープ結合抗体フラグメント、または細胞傷害性コンジュゲートは、滅菌および内毒素レベルについて試験される液剤として供給される。細胞傷害性コンジュゲート投与の好適なプロトコルの例は、次の通りである。コンジュゲートは、週ごとに静脈内ボーラスとして、４週間にわたって毎週投与される。ボーラス用量は、ヒト血清アルブミン５から１０ｍｌを添加できる生理食塩水５０から１００ｍｌで与えられる。投薬量は、静脈内投与当り１０μｇから１００ｍｇ（１日当り１００ｎｇから１ｍｇ／ｋｇの範囲）である。さらに好ましくは、投薬量は５０μｇから３０ｍｇの範囲に及ぶ。最も好ましくは、投薬量は１ｍｇから２０ｍｇの範囲に及ぶ。

【0302】

４週間の処置後、患者は引き続き週ごとに処置を受けることができる。投与経路、賦形剤、希釈剤、投薬量、時間などに関する詳細な臨床プロトコルは、臨床状況によって当業者が決定することができる。

【0303】

診断
本発明の抗体または抗体フラグメントを使用して、インビトロまたはインビボで生体試料中のＥｐｈＡ２を検出することもできる。一実施形態において、本発明の抗ＥｐｈＡ２抗体を使用して、組織中または組織に由来する細胞中のＥｐｈＡ２のレベルを決定する。好ましい実施形態において、組織は罹患組織である。方法の好ましい実施形態において、組織は腫瘍またはこれの生検である。方法の好ましい実施形態において、組織またはこれの生検は最初に患者から切除され、次に組織または生検中のＥｐｈＡ２のレベルを本発明の抗体または抗体フラグメントを用いたイムノアッセイで決定することができる。組織またはこれの生検は、凍結または固定することができる。同じ方法を使用して、ＥｐｈＡ２タンパク質の他の特性、例えばチロシンリン酸化のこれのレベル、細胞表面レベル、または細胞局在化を決定することができる。

【0304】

上記の方法を使用して、癌を有することが公知のまたは癌を有することが疑われる対象において癌を診断することができ、ここでは前記患者にて測定されたＥｐｈＡ２のレベルを正常な参照対象または標準のレベルと比較する。前記方法を使用して次に、腫瘍がＥｐｈＡ２を発現するかを決定することができ、このことは本発明の抗体、抗体フラグメントまたは抗体コンジュゲートによる処置に十分に応答することを示唆し得る。好ましくは、腫瘍は肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、子宮、卵巣、子宮頸およびリンパ器官の癌、骨肉腫、滑膜肉腫、肉腫、神経膠腫、胃癌、肝臓癌、頭頸部またはＥｐｈＡ２が発現される他の癌腫およびＥｐｈＡ２が主に発現される未確認の他の癌である。

【0305】

本発明は、研究または診断用途での使用のためにさらに標識されるモノクローナル抗体、ヒト化抗体およびこれらのエピトープ結合フラグメントをさらに提供する。好ましい実施形態において、標識は放射性標識、フルオロフォア、発色団、造影剤または金属イオンである。

【0306】

前記標識抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントが癌を有することが疑われる対象に投与され、対象体内での標識の分布が測定または監視される診断方法も提供される。

【0307】

キット
本発明は、特定の細胞種を死滅させるための、記載した細胞傷害性コンジュゲートおよび細胞傷害性コンジュゲートの使用説明書を備えるキットも含む。説明書は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで細胞傷害性コンジュゲートを使用するための指示も含み得る。

【0308】

通例、キットは細胞傷害性コンジュゲートを含有するコンパートメントを有する。細胞傷害性コンジュゲートは凍結乾燥形、液体形、またはキットに含まれるように修正できる他の形であり得る。キットは、キット中の説明書に記載された方法を実施するのに必要な追加の要素、例えば凍結乾燥粉末を再構成するための滅菌溶液、患者に投与する前に細胞傷害性コンジュゲートと組合せるための追加の薬剤および患者へのコンジュゲートの投与を補助するツールも含有し得る。

【0309】

本発明は：
ａ）包装材料
ｂ）抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントまたはコンジュゲートおよび
ｃ）前記抗体またはこれのエピトープ結合フラグメントが癌を処置するのに有効であることを指摘する、前記包装材料内に含有されたラベルまたは添付文書
を備えた製品にも関する。

【実施例】

【0310】

［実施例１］
コンジュゲートの調製
２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＤＭ４へのコンジュゲーション
一般合成スキーム

【0311】

実施例１ａ：ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４

【0312】

【化40】

【0313】

実施例１ｂ：ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４

【0314】

【化41】

【0315】

方法Ａ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ−ＳＱＤシステムにて正および／または負エレクトロスプレーモード（ＥＳ＋／−）で得られている。クロマトグラフィー条件は以下の通りである：カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８、１．７μｍ−２．１×３０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ギ酸）Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ（０．１％ギ酸）；カラム温度：４５℃；流速：０．６ｍｌ／分；勾配（２分）：１分：５から５０％のＢ；１．３分：１００％のＢ；１．４５分：１００％のＢ；１．７５分：５％のＢ。

【0316】

方法Ｂ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ ＺＱシステムにて正および／または負エレクトロスプレーモード（ＥＳ＋／−）で得られている。クロマトグラフィー条件は以下の通りである：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ２．５μｍ ３×５０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ギ酸）Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ（０．１％ギ酸；カラム温度：７０℃；流速：０．９ｍｌ／分；勾配（７分）：５．３分で５から１００％のＢ；５．５分：１００％のＢ；６．３分：５％のＢ。

【0317】

方法Ｃ：イムノコンジュゲートの脱グリコシル化および高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）
脱グリコシル化は、グリコシダーゼによる酵素消化の技法である。脱グリコシル化は、コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）５００μｌ＋トリス緩衝液ＨＣｌ ５０ｍＭ １００μｌ＋グリカナーゼ−Ｆ酵素１０μｌ（１００単位のフリーズドライ酵素／水１００μｌ）から作製される。培地をボルテックス処理して、３７℃にて一晩維持する。ここで脱グリコシル化試料は、ＨＲＭＳでの分析の準備が整っている。質量スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ Ｑ−Ｔｏｆ−２システムにてエレクトロスプレー正モード（ＥＳ＋）で得た。クロマトグラフィー条件は以下の通りである：カラム：４μｍ ＢｉｏＳｕｉｔｅ ２５０ ＵＲＨ ＳＥＣ ４．６×３００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）；溶媒：Ａ：ギ酸アンモニウム２５ｍＭ＋１％ギ酸：Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ；カラム温度：３０℃；流速０．４ｍｌ／分；定組成溶離７０％Ａ＋３０％Ｂ（１５分）。

【0318】

方法Ｄ：分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
＞カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ ５μｍカラム、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ，ＬＬＣ部品＃：０８５４１
＞移動相：ＫＣｌ（０．２Ｍ）、ＫＨ_２ＰＯ_４（０．０５２Ｍ）Ｋ_２ＨＰＯ_４（０．１０７Ｍ）、ｉＰｒＯＨ（体積で２０％）
＞分析条件：０．５ｍｌ／分にて３０分間の定組成溶離

【0319】

方法Ｅ：質量分析（ＭＳ）
スペクトルは、システムのＷＡＴＥＲＳ ＧＣＴ（ＬＣなしの直接導入）にて化学イオン化（反応ガス：アンモニア性）によって得られている。

【0320】

方法Ｆ：高圧液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）
スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ−ＳＱＤシステムにて正および／または負エレクトロスプレーモード（ＥＳ＋／−）で得られている。クロマトグラフィー条件は以下の通りである：カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ−２．１×５０ｍｍ；溶媒：Ａ：Ｈ_２Ｏ（０．１％ギ酸）Ｂ：ＣＨ_３ＣＮ（０．１％ギ酸）；カラム温度：５０℃；流速：１ｍｌ／分；勾配（２分）：０．８分で５から５０％のＢ；１．２分：１００％のＢ；１．８５分：１００％のＢ；１．９５：５％のＢ。

【0321】

省略形：
ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル；ＡＬＫ：（Ｃ_１−Ｃ_１２）アルキレン基、特に（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキレン；ＤＡＲ：薬物抗体比；ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン；ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＣＭ：ジクロロメタン；ＤＥＡＤ：ジエチルアゾジカルボキシラート；ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド；ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン；ＤＭＥ：ジメトキシエタン；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ε：モル消衰係数；ＥＥＤＱ：２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン；ＥＤＣＩ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド；ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸；Ｆｍｏｃ：フルオレニルメトキシカルボニル；Ｈａｌ：ハロゲン原子；ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸；ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ｉＰｒＯＨ：イソプロピルアルコール（ａｌｃｏｏｌ）；ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリジノン；Ｒｆ：保持因子；ＲＰ：減圧；ＲＴ：室温；ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー；ＴＢＤＭＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；ＴＦＡＡ：無水トリフルオロ酢酸；ＴＦＦ：接線流濾過；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ＴＩＰＳ：トリイソプロピルシリル；ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー；ｔ_Ｒ：保持時間。

【0322】

緩衝液含有物：
＞緩衝液Ａ（ｐＨ６．５）：ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＫＰｉ（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）
＞緩衝液ＨＧＳ（ｐＨ５．５）：ヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース５％（ｗ／ｖ）、ＨＣＩ（８ｍＭ）

【0323】

ＡｂおよびＬ−ＤＭ４濃度計算のパラメータ（計算方法についての参考文献：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ ５２５，４４５）：
＞抗体の平均分子量を１６００００と仮定した、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４（２８０ｎＭにて２２４０００；２５２ｎＭにて８２８８０）およびＬ−ＤＭ４（２８０ｎＭにて５１８０；２５２ｎＭにて２６１５９）のモル消衰係数。

【0324】

実施例１ａ
１ａ．１． ＰＥＧ４−アセトアミドと連結されたコンジュゲートの調製：

【0325】

【化42】

【0326】

室温にて磁気撹拌しながら、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４ ９ｍｌ（１４．３６ｍｇ／緩衝液Ａ １ｍｌ）、次に緩衝液Ａ １６．８５ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １Ｍ ３．２３ｍｌ、ＤＭＡ １．５９ｍｌ、続いてＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ ＤＭＡ溶液１．６４ｍｌを添加する。室温にて１時間３０分後、Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ ＤＭＡ溶液０．０８５ｍｌをさらに添加する。室温にて１時間４５分後、粗コンジュゲーション培地をＨＧＳ緩衝液６０ｍｌで希釈して、ＴＦＦによりＰｅｌｌｉｃｏｎ ３カセットで精製する。試料を、試料の体積の約１０倍のＨＧＳ緩衝液でダイアフィルトレーションして、次に収集する。ＴＦＦタンクおよびラインをさらに添加のＨＧＳ緩衝液１０ｍｌで洗浄する。２つの溶液を混合して、ＰＶＤＦ ０．２２μｍでフィルタ滅菌し、Ａｍｉｃｏｎ １５で濃縮して、ＰＶＤＦ ０．２２μｍでフィルタ滅菌する。このためｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４イムノコンジュゲート１７ｍｌ（ｃ＝５．７６ｍｇ／ｍｌ）が得られた。次にイムノコンジュゲートを最終薬物負荷およびモノマー純度について分析する。

【0327】

ＳＥＣ分析（方法Ｄ）：ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．４；ＲＴ＝１６．７５７；モノマー純度＝９９．５％
ＨＲＭＳデータ（方法Ｃ）：図２を参照のこと。

【0328】

１ａ．２．Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの調製：

【0329】

【化43】

【0330】

室温にて磁気撹拌しながら、Ｌ−ＤＭ４ １５４．３ｍｇをガラスバイアルに導入する。次に３−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル９０ｍｇのＤＭＡ ０．９４ｍｌによる溶液を、続いてＤＩＥＡ ３６μｌを添加する。室温にて２３時間時間後、反応媒体をＡｃＯＥｔ ５ｍｌで希釈して、水７ｍｌで洗浄する。水相をＡｃＯＥｔ ５ｍｌで抽出する。合せた有機相を硫酸マグネシウムで脱水して、減圧下で濃縮乾固する。薄黄色粘性油２２８ｍｇを得て、この生成物を最小量のＤＭＡで希釈して、フラッシュクロマトグラフィーによりＣ１８−グラフトシリカゲル３０ｇで精製する（溶離勾配 水：アセトニトリル 体積で９５：５から５：９５）。減圧下での画分２および３の濃縮後、無色粘性油を得て、この生成物を最小量のＤＭＡで希釈して、フラッシュクロマトグラフィーによりＣ１８−グラフトシリカゲル３０ｇで精製する（溶離勾配 水：アセトニトリル 体積で９５：５から５：９５）。減圧下での画分３３から３５の濃縮後、Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステル４１ｍｇが白色メレンゲ様生成物の形で得られ、これの特徴は次の通りである：
質量スペクトル：方法Ｂ
保持時間（分）＝４．０６
［Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ］＋：ｍ／ｚ １１６４；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ １１８２；
［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ １２２６

【0331】

ＮＭＲ分析 １Ｈ（５００ＭＨｚ，ｐｐｍでのδ，クロロホルム−ｄ）：０，８０（ｓ，３Ｈ）；１，２１（ｓ，３Ｈ）；１，２２（ｓ，３Ｈ）；１，２５（ｍ，１Ｈ）；１，２９（ｄ，Ｊ＝６，７Ｈｚ，６Ｈ）；１，４６（ｍ，１Ｈ）；１，５７（ｄ，Ｊ＝１３，４Ｈｚ，１Ｈ）；１，６４（ｓ，３Ｈ）；１，７６ ｔｏ １，８３（ｍ，１Ｈ）；１，８８ ｔｏ １，９６（ｍ，１Ｈ）；２，１８（ｄｄ，Ｊ＝２，５ ｅｔ １４，３Ｈｚ，１Ｈ）；２，３６（ｍ，１Ｈ）；２，５３（ｍ，１Ｈ）；２，６１（ｄｄ，Ｊ＝１２，５ ｅｔ １４，３Ｈｚ，１Ｈ）；２，８２ ｔｏ ２，９２（ｍ，１０Ｈ）；２，９８（ｄ，Ｊ＝１６，７Ｈｚ，１Ｈ）；３，０３（ｄ，Ｊ＝９，６Ｈｚ，１Ｈ）；３，１５（ｄ，Ｊ＝１２，９Ｈｚ，１Ｈ）；３，２２（ｓ，３Ｈ）；３，３２（ｓ ｌａｒｇｅ，１Ｈ）；３，３６（ｓ，３Ｈ）；３，４２（ｍ，２Ｈ）；３，５０（ｄ，Ｊ＝９，１Ｈｚ，１Ｈ）；３，５３（ｔ，Ｊ＝５，２Ｈｚ，２Ｈ）；３，５８ ｔｏ ３，６７（ｍ，１３Ｈ）；３，８４（ｔ，Ｊ＝６，４Ｈｚ，２Ｈ）；３，９９（ｓ，３Ｈ）；４，２７（ｍ，１Ｈ）；４，７７（ｄｄ，Ｊ＝２，９ ｅｔ １ １，９Ｈｚ，１Ｈ）；５，４２（ｑ，Ｊ＝６，７Ｈｚ，１Ｈ）；５，６６（ｄｄ，Ｊ＝９，１ ｅｔ １５，４Ｈｚ，１Ｈ）；６，２３（ｓ，１Ｈ）；６，４３（ｄｄ，Ｊ＝１１，３ ｅｔ １５，４Ｈｚ，１Ｈ）；６，６４（ｄ，Ｊ＝１，１Ｈｚ，１Ｈ）；６，７４（ｄ，Ｊ＝１１，３Ｈｚ，１Ｈ）；６，８５（ｄ，Ｊ＝１，１Ｈｚ，１Ｈ）；７，０８（ｔ，Ｊ＝５，２Ｈｚ，１Ｈ）．

【0332】

１ａ．３．３−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの調製：

【0333】

【化44】

【0334】

室温にて磁気撹拌しながら、３−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸（ＣＡ（ＰＥＧ）４，Ｐｉｅｒｃｅ）６７１．４ｍｇをガラスバイアルに導入する。ブロモ酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル５９７．４ｍｇのジクロロメタン１４ｍｌによる溶液を次に添加する。室温にて１５分後、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）０．３９６ｍｌを添加する。１時間３０分後、粗反応媒体を焼結ガラスで濾過して、濾液をフラッシュクロマトグラフィーによりＣＮ−グラフトシリカゲル１００ｇで精製する（溶離勾配 ｉＰｒＯＨ部を増加させながらｎ．ヘプタン／ｉＰｒＯＨ／ＡｃＯＥｔ）。減圧下での画分３０から４５の濃縮後、３−［２−（２−｛２−［２−（２−ブロモ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル７６１ｍｇが無色油の形で得られ、これの特徴は次の通りである：
質量スペクトル：方法Ａ
保持時間（分）＝０．７４
［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ ４８３／４８５
［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ ５２７／５２９
ブロモ酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルは、公開されたプロトコルに従って調製できる（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７４，４８１）。

【0335】

［実施例１ｂ］
１ｂ．１． ＰＥＧ４−Ｍａｌと連結されたコンジュゲートの調製：

【0336】

【化45】

【0337】

室温にて磁気撹拌しながらｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４ ４ｍｌ（１４．３６ｍｇ／緩衝液Ａ １ｍｌ）、次に緩衝液Ａ ７．５ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １Ｍ １．４５ｍｌ、ＤＭＡ １．１５ｍｌ、続いてＬ−ＤＭ４−Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ ＤＭＡ溶液０．３０５ｍｌを添加する。室温にて７時間後、粗コンジュゲーション培地をＨＧＳ緩衝液７０ｍｌで希釈して、ＴＦＦによりＰｅｌｌｉｃｏｎ ３カセットで精製する。試料を、試料の体積の約１０倍のＨＧＳ緩衝液でダイアフィルトレーションして、次に収集する。ＴＦＦタンクおよびラインをさらに添加のＨＧＳ緩衝液１０ｍｌで洗浄する。２つの溶液を混合して、Ａｍｉｃｏｎ １５で濃縮し、ＰＶＤＦ ０．２２μｍでフィルタ滅菌する。このためｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４イムノコンジュゲート８．０ｍｌ（ｃ＝５．０９ｍｇ／ｍｌ）が得られた。次にイムノコンジュゲートを最終薬物負荷およびモノマー純度について分析する。

【0338】

ＳＥＣ分析（方法Ｄ）：ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．３；ＲＴ＝１６．６８０；モノマー純度＝９９．５％
ＨＲＭＳデータ（方法Ｃ）：図３を参照

【0339】

１ｂ．２． Ｌ−ＤＭ４−Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの調製：

【0340】

【化46】

【0341】

室温にて磁気撹拌しながら、Ｌ−ＤＭ４ ５０ｍｇ、担持ＤＩＥＡ １７．２ｍｇ（３．７２ｍｍｏｌ／ｇ）および３−｛２−［２−（２−｛２−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−プロピオニルアミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル３６．２ｍｇ（市販、ＳＭ（ＰＥＧ）４，Ｐｉｅｒｃｅ）のＤＭＡ ３６０μｌによる溶液を連続して添加する。室温にて１時間３０分後、反応媒体を濾過して、固体をＡｃＯＥｔで洗浄し、合せた濾液をフラッシュクロマトグラフィーによりＣＮグラフトシリカゲル１４ｇで直接精製する（溶離勾配 ｉＰｒＯＨの寄与を上昇させながら、ヘプタン：ＡｃＯＥｔ：ｉＰｒＯＨ）。予想生成物を含有する画分の減圧下での濃縮後、Ｌ−ＤＭ４−Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステル２９．８ｍｇが無色ガラスの形で得られ、これの特徴は次の通りである：
質量スペクトル：方法Ａ
保持時間（分）＝１．２４／１．２５（２ジアステレオマー）
［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ １２９３
［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ １３３７

【0342】

実施例１ｃ：ＳＰＤＢと連結されたコンジュゲートの調製：

【0343】

【化47】

【0344】

他のｈｕ２Ｈ１１抗体を用いたＷＯ２００８０１０１０１Ａ９で前述されたのと同じプロトコルを使用して、ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体をＬ−ＤＭ４ Ｎ２’デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシンにＳＰＤＢ（４−［２−ピリジルジチオ］ブタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｈｙｄｒｏｘｓｕｃｃｉｎｉｍｄｅ）エステル）リンカーを使用してコンジュゲートした。簡潔には、抗体を８ｍｇ／ｍＬにて、ｈｕ２Ｈ１１およびｈｕ３７．３Ｄ７それぞれに対して５．５または６．５倍モル過剰のＳＰＤＢを用いて修飾した。反応を室温で９０分間にわたって、ＥｔＯＨ（５％ｖ／ｖ）を有する緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＫＰｉ／５０ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５、９５％ｖ／ｖ）中で行った。次に修飾抗体をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５脱塩カラムにより緩衝液Ａで精製した。次に修飾抗体をＳＰＤＢリンカー上で１．７倍モル過剰のＤＭ４と反応させた。反応を室温で２０時間にわたって、２．５ｍｇ／ｍＬ抗体にて緩衝液Ａ（９７％ｖ／ｖ）およびＤＭＡ（ジメチルアセトアミド、３％ｖ／ｖ）中で行った。コンジュゲートをＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５脱塩カラムにより１０ｍＭヒスチジン、１３０ｍＭグリシン、５％スクロース、ｐＨ５．５で精製した。薬物対抗体比はｈｕ３７．３Ｄ７−ＳＰＤＢ−ＤＭ４では４．０、ｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４では３．１であった。

【0345】

実施例１ｄ：コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＭｅＡｃ−ＤＭ４の調製

【0346】

【化48】

【0347】

１ｄ．１ コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＭｅＡｃ−ＤＭ４の調製
ＲＴにて磁気撹拌しながら、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４ ４ｍｌ（１４．３６ｍｇ／緩衝液Ａ １ｍｌ）、次に緩衝液Ａ ７．５ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １Ｍ １．４５ｍｌ、ＤＭＡ １．０５ｍｌ、続いてＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ ＤＭＡ溶液０．３９ｍｌを添加する。ＲＴにて３０分後、Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ ＤＭＡ溶液０．１９ｍｌをさらに添加する。ＲＴにて３時間後、粗コンジュゲーション培地をＨＧＳ緩衝液６５ｍｌで希釈して、ＴＦＦによりＰｅｌｌｉｃｏｎ ３カセットで精製する。試料を、試料の体積の約１０倍のＨＧＳ緩衝液でダイアフィルトレーションして、次に収集する。ＴＦＦタンクおよびラインをさらに添加のＨＧＳ緩衝液１０ｍｌで洗浄する。２つの溶液を混合して、Ａｍｉｃｏｎ １５で濃縮し、ＰＶＤＦ ０．２２μｍでフィルタ滅菌する。このためｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＭｅＡｃ−ＤＭ４コンジュゲート８．５ｍｌ（ｃ＝６．０１ｍｇ／ｍｌ）を得た。次にコンジュゲートを最終薬物負荷およびモノマー純度について分析する。

【0348】

ＳＥＣ分析（Ｄ）：ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．５；ＲＴ＝１６．７分；モノマー純度＝９９．４％；ＨＲＭＳデータ：図１４を参照のこと。

【0349】

１ｄ．２ Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの調製
ＲＴにて磁気撹拌しながら、Ｌ−ＤＭ４ １３３．４ｍｇをガラスバイアルに導入する。次に３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ブロモ−アセチル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル８５ｍｇのＤＭＡ ０．２ｍｌによる溶液を、続いてＤＩＥＡ ３２．９μｌを添加する。ＲＴにて１時間後、反応媒体をフラッシュクロマトグラフィーによりＣ１８−グラフトシリカゲル３０ｇで精製する（溶離勾配 水：アセトニトリル 体積で９５：５から５：９５）。ＲＰでの所望の生成物を含有する画分の濃縮後、Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステル７１．３ｍｇが無色ガラス様生成物の形で得られた。質量スペクトル（Ｄ）：ＲＴ＝０．９８分；［Ｍ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］＋：ｍ／ｚ １１７８（主シグナル）；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ １２１８；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ_２Ｈ］−：ｍ／ｚ １２４０；１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｐｐｍでのδ，クロロホルム−ｄ）：０，８１（ｓ，３Ｈ）；１，２０ ｔｏ １，３３（ｍ，１３Ｈ）；１，４２ ｔｏ １，５２（ｍ，１Ｈ）；１，５６ ｔｏ １，６１（ｍ，１Ｈ）；１，６５（ｓ，３Ｈ）；１，７３ ｔｏ １，８３（ｍ，１Ｈ）；１，９６ ｔｏ ２，０４（ｍ，１Ｈ）；２，１９（ｄｄ，Ｊ＝２，８ ａｎｄ １４，４Ｈｚ，１Ｈ）；２，２９ ｔｏ ２，４１（ｍ，１Ｈ）；２，５５ ｔｏ ２，６６（ｍ，２Ｈ）；２，８３ ｔｏ ２，９３（ｍ，１２Ｈ）；３，０４（ｄ，Ｊ＝９，８Ｈｚ，１Ｈ）；３，１２（ｄ，Ｊ＝１２，７Ｈｚ，１Ｈ）；３，１８ ｔｏ ３，２５（ｍ，５Ｈ）；３，３７（ｓ，３Ｈ）；３，４７ ｔｏ ３，５４（ｍ，３Ｈ）；３，５７ ｔｏ ３，６８（ｍ，１５Ｈ）；３，８５（ｔ，Ｊ＝６，６Ｈｚ，２Ｈ）；３，９９（ｓ，３Ｈ）；４，２９（ｍ，１Ｈ）；４，７９（ｄｄ，Ｊ＝２，８ ａｎｄ １２，２Ｈｚ，１Ｈ）；５，４１（ｑ，Ｊ＝６，７Ｈｚ，１Ｈ）；５，６８（ｄｄ，Ｊ＝９，３ ｅｔ １５，２Ｈｚ，１Ｈ）；６，２３（ｓ，１Ｈ）；６，４３（ｄｄ，Ｊ＝１１，０ ａｎｄ １５，２Ｈｚ，１Ｈ）；６，６６（ｓ，１Ｈ）；６，７４（ｄ，Ｊ＝１１，０Ｈｚ，１Ｈ）；６，８３（ｓ，１Ｈ）．

【0350】

１ｄ．３ ３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ブロモ−アセチル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの調製

【0351】

【化49】

【0352】

丸底フラスコ中でＲＴにて磁気撹拌しながら、３−（２−｛２−［２−（２−メチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸１１５．１ｍｇ、ＤＣＭ １．５ｍｌ、ブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル９７．３ｍｇを連続して導入する。２時間後、ＤＩＥＡ ７２μｌを添加して、さらにＲＴにて１時間後、ＤＩＣ ７０．２μｌを添加する。粗反応媒体をＲＴにて４時間、−２０℃にて１６時間維持して、次にフラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲル３０ｇで精製する（溶離勾配 ＤＣＭ：メタノール 体積で０：１００から３：９７）。ＲＰでの所望の生成物を含有する画分の濃縮後、３−｛２−［２−（２−｛２−［（２−ブロモ−アセチル）−メチル−アミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル８５．８ｍｇが白色固体の形で得られた。質量スペクトル（Ａ）：ＲＴ＝０．８４分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ ４９７／４９９

【0353】

１ｄ．４ ３−（２−｛２−［２−（２−メチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸の調製

【0354】

【化50】

【0355】

丸底フラスコ中のアルゴンの不活性雰囲気下にて磁気撹拌しながら、３−［２−（２−｛２−［２−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステル１２０．１ｍｇ、無水ＴＨＦ １ｍｌおよびＣＨ_３Ｉ ５９．８μｌを連続して導入する。反応媒体を約０℃の氷／水浴で冷却して、ＮａＨ １６．１ｍｇ（油中５０％純度）を少量ずつゆっくり添加する。０℃にて１５分およびＲＴにて１時間後、粗反応媒体をＲＰにて濃縮乾固させて、ＴＨＦ ０．５ｍｌおよび水０．８ｍｌで希釈する。次に、ＲＴにてＬｉＯＨ ３０．６ｍｇを反応媒体に添加する。粗反応媒体をＲＴにて２時間、−２０℃にて１６時間維持して、次にフラッシュクロマトグラフィーによりＣ１８−グラフトシリカゲル３０ｇで精製する（溶離勾配 水：アセトニトリル 体積で９５：５から５：９５）。ＲＰにて所望の生成物を含有する画分の濃縮後、３−（２−｛２−［２−（２−メチルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸１１５．３ｍｇが黄色油の形で得られる。

【0356】

１ｄ．５ ３−［２−（２−｛２−［２−（２．２．２−トリフルオロ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステルの調製

【0357】

【化51】

【0358】

丸底フラスコ中のアルゴンの不活性雰囲気下にて磁気撹拌しながら、３−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸２３０ｍｇ（ＣＡ（ＰＥＧ）４，Ｐｉｅｒｃｅ）、ＤＣＭ ２ｍｌおよびメタノール１ｍｌを連続して導入する。ＲＴにて、トリメチルシリルジアゾメタン１ｍｌ（ヘキサン中２Ｍ溶液）を反応媒体にゆっくり添加する。ＲＴにて２時間後、過剰のトリメチルシリルジアゾメタンを酢酸の添加により中和する。次に粗反応媒体をＲＰにて蒸発乾固させる。得られた残渣をＤＣＭ ２ｍｌで希釈して、水氷浴で０℃まで冷却し、次にＴＥＡ ３６３μｌおよびＴＦＡＡ ３００μｌを続けて添加する。ＲＴにて２時間３０分および−２０℃にて１９時間の後、ＴＥＡ ３６３μｌおよびＴＦＡＡ ３００μｌを続けて添加する。ＲＴにて４時間３０分後、粗媒体を−２０℃にて貯蔵して、次にフラッシュクロマトグラフィーによりＣ１８−グラフトシリカゲル３０ｇで精製する（溶離勾配 水：アセトニトリル 体積で９５：５から５：９５）。ＲＰでの所望の生成物を含有する画分の濃縮後、３−［２−（２−｛２−［２−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸メチルエステル１２３ｍｇが薄黄色油の形で得られる。質量スペクトル（Ａ）：ＲＴ＝０．９０分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ ３７６；［Ｍ−Ｈ］−：ｍ／ｚ ３７４。

【0359】

実施例１ｅ：コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ８−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の調製

【0360】

【化52】

【0361】

１ｅ．１ コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ８−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の調製
ＲＴにて磁気撹拌しながら、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４ ４ｍｌ（１４．３６ｍｇ／緩衝液Ａ １ｍｌ）、次に緩衝液Ａ ７．５ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １Ｍ １．４５ｍｌ、ＤＭＡ １．０５ｍｌ、続いてＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ８−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ ＤＭＡ溶液０．４０５ｍｌを添加する。ＲＴにて３０分後、Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＭｅ−ＰＥＧ８−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ ＤＭＡ溶液０．１ｍｌをさらに添加する。ＲＴにて１時間４５分後、粗コンジュゲーション培地ＨＧＳ緩衝液６０ｍｌで希釈して、ＴＦＦによりＰｅｌｌｉｃｏｎ ３カセットで精製する。試料を、試料の体積の約１０倍のＨＧＳ緩衝液でダイアフィルトレーションして、次に収集する。ＴＦＦタンクおよびラインをさらに添加のＨＧＳ緩衝液１０ｍｌで洗浄する。２つの溶液を混合して、Ａｍｉｃｏｎ １５で濃縮し、ＰＶＤＦ ０．２２μｍでフィルタ滅菌する。このためｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ８−ＡｃＮＭｅ−ＤＭ４コンジュゲート７．０ｍｌ（ｃ＝６．９５ｍｇ／ｍｌ）が得られた。次にコンジュゲートを最終薬物負荷およびモノマー純度について分析する。ＳＥＣ分析（Ｄ）：ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．０；ＲＴ＝１６．５９３分；モノマー純度＝９９．５％；ＨＲＭＳデータ：図１５を参照のこと。

【0362】

１ｅ．ｆ Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ８−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの調製
ＲＴで磁気撹拌しながら、３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（３−ブロモ−プロピオニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル６５ｍｇをガラスバイアルに、続いてＬ−ＤＭ４ ６７．７ｍｇのＤＭＡ ０．８５ｍｌおよびＤＩＥＡ １６．５μｌによる溶液を導入する。ＲＴにて４８時間後、反応媒体をフラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲル１０ｇで精製する（溶離勾配 ＤＣＭ：ＭｅＯＨ体積で１００：０から９０：１０）。ＲＰでの画分１８から２６の濃縮後、Ｌ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ８−ＣＯＮＨＳ活性化エステル１７ｍｇが無色ガラスの形で得られた。質量スペクトル（Ｂ）：ＲＴ＝４．０８分；［Ｍ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ］＋：ｍ／ｚ １３４０（主シグナル）；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ １３８０；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ_２Ｈ］−：ｍ／ｚ １４０２；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｐｐｍでのδ，クロロホルム−ｄ）：０．８１（ｓ，３Ｈ）；１，２２（ｓ，３Ｈ）；１，２３（ｓ，３Ｈ）；１，２６（ｍ，１Ｈ）；１，３０（ｄ，Ｊ＝６，８Ｈｚ，６Ｈ）；１，４１ ｔｏ １，５２（ｍ，１Ｈ）；１，６５（ｓ，３Ｈ）；１，８０（ｍ，１Ｈ）；１，８９ ｔｏ １，９９（ｍ，１Ｈ）；２，１９（ｍ，１Ｈ）；２，３７（ｍ，１Ｈ）；２，４７ ａ ２，６７（ｍ，２Ｈ）；２，８１ ａ ２，９３（ｍ，１０Ｈ）；２，９９（ｄ，Ｊ＝１６，６Ｈｚ，１Ｈ）；３，０４（ｄ，Ｊ＝９，８Ｈｚ，１Ｈ）；３，１６（ｄ ｂｒｏａｄ，Ｊ＝１３，７Ｈｚ，１Ｈ）；３，２３（ｓ，３Ｈ）；３，３２（ｓ ｂｒｏａｄ，１Ｈ）；３，３７（ｓ，３Ｈ）；３，４４（ｍ，２Ｈ）；３，５１（ｄ，Ｊ＝９，１Ｈｚ，１Ｈ）；３，５４（ｔ，Ｊ＝５，４Ｈｚ，２Ｈ）；３，５９ ａ ３，７３（ｍ，２９Ｈ）；３，８６（ｔ，Ｊ＝６，６Ｈｚ，２Ｈ）；４，００（ｓ，３Ｈ）；４，２２ ｔｏ ４，３３（ｍ，１Ｈ）；４，７８（ｄｄ，Ｊ＝２，９ ａｎｄ １２，２Ｈｚ，１Ｈ）；５，４３（ｑ，Ｊ＝６，８Ｈｚ，１Ｈ）；５，６７（ｄｄ，Ｊ＝９，０ ｅｔ １５，２Ｈｚ，１Ｈ）；６，２３（ｓ，１Ｈ）；６，４４（ｄｄ，Ｊ＝１１，２ ｅｔ １５，２Ｈｚ，１Ｈ）；６，６５（ｄ，Ｊ＝１，５Ｈｚ，１Ｈ）；６，７５（ｄ，Ｊ＝１１，２Ｈｚ，１Ｈ）；６，８６（ｄ，Ｊ＝１，５Ｈｚ，１Ｈ）；７，０２ ａ ７，１３（ｍ，１Ｈ）．

【0363】

１ｅ．ｇ ３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（３−ブロモ−プロピオニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの調製：

【0364】

【化53】

【0365】

ＲＴにて磁気撹拌しながら、３−（２−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸１００ｍｇ（ＣＡ（ＰＥＧ）４，Ｐｉｅｒｃｅ）、ＤＣＭ ２ｍｌおよびブロモ−酢酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル５３．５ｍｇをガラスバイアル中に続けて導入する。ＲＴにて１時間後、ＤＩＣ ３５．１μｌを添加する。１時間後、粗反応媒体を焼結ガラスで濾過して、ＲＰで濃縮乾固させ、ＡｃＯＥｔ １０ｍｌで希釈し、焼結ガラスで濾過して、ＲＰにて濃縮乾固させる。３−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（３−ブロモ−プロピオニルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル７６．５ｍｇが無色油の形で得られた。質量スペクトル（Ａ）：ＲＴ＝０．８０分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ ６５９／６６１；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ_２Ｈ］−：ｍ／ｚ ７０３／７０５

【0366】

実施例１ｆ：コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−アリル−ＤＭ４の調製

【0367】

【化54】

【0368】

１ｆ．１ コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−アリル−ＤＭ４の調製
ＲＴにて磁気撹拌しながら、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４ ４ｍｌ（１４．３６ｍｇ／緩衝液Ａ １ｍｌ）、次に緩衝液Ａ ７．５ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １Ｍ １．４５ｍｌ、ＤＭＡ １．１４ｍｌ、続いてＬ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ ＤＭＡ溶液０．３ｍｌを添加する。ＲＴにて３０分後、Ｌ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ ＤＭＡ溶液０．１２５ｍｌをさらに添加する。ＲＴにて１時間２５分後、粗コンジュゲーション媒体をＨＧＳ緩衝液６５ｍｌで希釈して、ＴＦＦによりＰｅｌｌｉｃｏｎ ３カセットで精製する。試料を、試料の体積の約１０倍のＨＧＳ緩衝液でダイアフィルトレーションして、次に収集する。ＴＦＦタンクおよびラインをさらに添加のＨＧＳ緩衝液１０ｍｌで洗浄する。２つの溶液を混合して、Ａｍｉｃｏｎ １５で濃縮し、ＰＶＤＦ ０．２２μｍでフィルタ滅菌する。このためｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−アリル−ＤＭ４コンジュゲート８．０ｍｌ（ｃ＝５．２２ｍｇ／ｍｌ）が得られた。次にコンジュゲートを最終薬物負荷およびモノマー純度について分析する。ＳＥＣ分析（Ｈ）：ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．３；ＲＴ＝１６．７６７分；モノマー純度＝９９．４％；ＨＲＭＳデータ：図１６を参照のこと。

【0369】

１ｆ．２ Ｌ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの調製
ＲＴにて磁気撹拌しながら、Ｌ−ＤＭ４ ７０ｍｇ、３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（ブロモ−アリル−ＰＥＧ_４−ＣＯＮＨＳ）４５ｍｇ、ＤＭＡ ０．５ｍｌおよびＤＩＥＡ ２３．５μｌをガラスバイアルに連続して導入する。ＲＴにて２時間および−２０℃にて１７時間の後、ＤＩＥＡ ５０μｌを添加する。ＲＴにて２４時間後、反応媒体をフラッシュクロマトグラフィーによりＣ１８−グラフトシリカゲル３０ｇで精製する（溶離勾配 水：アセトニトリル 体積で９５：５から５：９５）。予想生成物を含有する画分のＲＰでの濃縮後、Ｌ−ＤＭ４−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステル４７．１ｍｇが白色固体の形で得られる。質量スペクトル（Ｄ）：ＲＴ＝１．０６分；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ １１７３：１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｐｐｍでのδ，クロロホルム−ｄ）：０．８１（ｓ，３Ｈ）；１，１８ ａ １，３９（ｍ，１３Ｈ）；１，４２ ｔｏ １，５２（ｍ，１Ｈ）；１，５８（ｄ，Ｊ＝１３，４Ｈｚ，１Ｈ）；１，６５（ｓ，３Ｈ）；１，７３ ｔｏ １，８２（ｍ，１Ｈ）；１，８６ ａ １，９５（ｍ，１Ｈ）；２，１９（ｄ，Ｊ＝１４，３Ｈｚ，１Ｈ）；２，４０（ｍ，１Ｈ）；２，５１ ｔｏ ２，６５（ｍ，２Ｈ）；２，８２ ｔｏ ２，９５（ｍ，９Ｈ）；２，９８ ｔｏ ３，０７（ｍ，２Ｈ）；３，１２（ｄ，Ｊ＝１２，６Ｈｚ，１Ｈ）；３，１８ ｔｏ ３，２７（ｍ，１Ｈ）；３，２３（ｓ，３Ｈ）；３，３６（ｓ，３Ｈ）；３，５１（ｄ，Ｊ＝９，１Ｈｚ，１Ｈ）；３，５４ ａ ３，８２（ｍ，１３Ｈ）；３，８６（ｔ，Ｊ＝６，４Ｈｚ，２Ｈ）；３，９１ ａ ３，９５（ｍ，２Ｈ）；３，９９（ｓ，３Ｈ）；４，２８（ｔ，Ｊ＝１１，０Ｈｚ，１Ｈ）；４，７８（ｄｄ，Ｊ＝２，６ ｅｔ １１，９Ｈｚ，１Ｈ）；５，４４（ｑ，Ｊ＝６，７Ｈｚ，１Ｈ）；５，４９ ｔｏ ５，６３（ｍ，２Ｈ）；５，６８（ｄｄ，Ｊ＝９，１ ａｎｄ １５，０Ｈｚ，１Ｈ）；６，２４（ｓ，１Ｈ）；６，４３（ｄｄ，Ｊ＝１１，１ ａｎｄ １５，０Ｈｚ，１Ｈ）；６，６６（ｓ，１Ｈ）；６，７７（ｄ，Ｊ＝１１，１Ｈｚ，１Ｈ）；６，８３（ｓ，１Ｈ）．

【0370】

１ｆ．３ ３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの調製

【0371】

【化55】

【0372】

ＲＴにて、３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸２００ｍｇ、ＤＣＭ ４ｍｌおよび担持ＤＣＣ ２３２．３ｍｇ（２当量）をガラスバイアルに続けて導入する。ＲＴにて１時間後、ＮＨＳ ６４．８ｍｇを添加する。ＲＴにて５時間後、粗反応媒体を焼結ガラスで濾過して、固体をＤＣＭで洗浄し、合せた濾液をＲＰにて濃縮乾固させる。フラッシュクロマトグラフィーによるシリカゲル１５ｇでの精製（溶離勾配 ＭｅＯＨ：ＤＣＭ 体積により０：１００から１０：９０）およびＲＰでの予想生成物を含有する画分の濃縮により、３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（ブロモ−アリル−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ）４６ｍｇが薄黄色油の形で得られる。質量スペクトル（Ａ）：ＲＴ＝１．０２分；［Ｍ＋Ｈ］＋：ｍ／ｚ ４５４／４５６；［Ｍ＋Ｎａ］＋：ｍ／ｚ ４７６／４７８；［Ｍ−Ｈ＋ＨＣＯ２Ｈ］−：ｍ／ｚ ４９８／５００。

【0373】

１ｆ．４ ３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸の調製

【0374】

【化56】

【0375】

ＲＴにて３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル１ｇ（市販）、ＴＦＡ ６ｍｌおよびＤＣＭ ３ｍｌの溶液を３時間撹拌して、次にＲＰにて濃縮乾固する。油性残渣をトルエンで希釈して、ＲＰにて濃縮乾固させて、３−（２−｛２−［２−（４−ブロモ−ブタ−２−エニルオキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸８５３ｍｇが褐色油の形で得られる。

【0376】

実施例１ｇ：コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の調製
コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４は、実施例１に似た様式で調製できる：ＲＴにて撹拌しながら、ｈｕ２Ｈ１１ １ｍｌ（８．５２ｍｇ／緩衝液Ａ １ｍｌ）、次に緩衝液Ａ ０．７ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １Ｍ ０．２１３ｍｌ、ＤＭＡ ０．７ｍｌ、続いてＤＭＡ ０．１２８ｍｌで希釈したＬ−ＤＭ４−ＡｃＮＨ−ＰＥＧ４−ＣＯＮＨＳ活性化エステルの１０ｍＭ ＤＭＡ溶液０．０８５ｍｌを添加する。ＲＴにて２時間後、粗培地をＡｍｉｃｏｎ ４で７０００Ｇにて濃縮し、Ｎａｐ−１０カラムにてＨＧＳ緩衝液により緩衝液交換して、最後に５ｍｌ Ｚｅｂａカラムで精製する。このためｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４コンジュゲート１．１５ｍｌ（ｃ＝３．７８ｍｇ／ｍｌ）が得られた。次にコンジュゲートを最終薬物負荷およびモノマー純度について分析する。ＳＥＣ分析（方法Ｄ）：ＤＡＲ（ＵＶ）＝６．６；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝５．６；ＲＴ＝１５．３８７分；モノマー純度＝９９．７％；ＨＲＭＳデータ：図１７を参照のこと。

【0377】

［実施例２］
ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４によるＥｐｈＡ２自己リン酸化活性の阻害
物質および方法
株化細胞および抗体
乳腺癌株化細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１をＥＣＡＡＣ（参照＃ ９２０２０４２４）から入手した。非小細胞肺癌株化細胞ＮＣＩ−Ｈ１２９９をＡＴＣＣ（参照＃ ＣＲＬ−５８０３）から入手した。両方の株化細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清および２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｎを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。組換えマウスエフリン−Ａ１細胞外ドメイン／Ｆｃキメラ（エフリンＡ１／Ｆｃ）をＳｉｇｍａ（参照＃ Ｅ９９０２）またはＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（参照＃ ６０２−Ａ１）から入手した。抗Ｅｃｋ／ＥｐｈＡ２クローンＤ７抗体（Ａｂ）および抗ホスホチロシンＡｂ４Ｇ１０をＭｉｌｌｉｐｏｒｅから入手した（それぞれ参照＃ ０５−４８０および０５−３２１）。ｃｈＫＴＩアイソタイプ対照Ａｂは、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ Ｉｎｃ．にて生成された。これはＩｇ重鎖および軽鎖定常領域がヒトκ軽鎖およびヒトγ１重鎖によって置換された、キメラ型の抗Ｋｕｎｉｔｚ ＳｏｙｂｅａｎトリプシンインヒビタＡｂ（ＫＴＩ，ＡＴＣＣ 参照＃ ＨＢ９５１５）に相当する。組換えＡｂは、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ（ｃｈＫＴＩ ロット＃ ２５３９−９１）にて、重鎖および軽鎖について発現プラスミドを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養物上清から精製した。ヒト化抗ＥｐｈＡ２ Ａｂｓ ｈｕ２Ｈ１１（ロット＃ ＬＰ０８１９１）およびｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４（ロット＃ ＬＰ０９０７７）は、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓにて安定的にトランスフェクトされたロンザ・チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）／ＧＳ株化細胞から産生した。どちらのＡｂも標準手順に従って、タンパク質Ａ ｓｅｐｈａｒｏｓｅでの親和性クロマトグラフィーと、続くアニオン交換ロマトグラフィーにより培養物上清から精製した。追加のクロマトグラフィーステップは、セラミックのヒドロキシアパタイトで行った。すべての調製物を４℃の１×ＰＢＳ中で貯蔵して、動態ＬＡＬ法を使用して低い内毒素レベルについて試験した。抗アクチン抗体クローンＣ４は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（参照＃ ＭＡＢ１５０１）から得た。ペルオキシダーゼ（ＰＯ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｂは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（参照＃ １１５−０３５−００３）から得た。

【0378】

リン酸化の誘発
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＰ１００ペトリ皿（試料当り５皿）の完全培地中で、１皿当り３×１０^６細胞にて播種して、ＣＯ_２インキュベータ内で３７℃にて４８時間インキュベートした。細胞は１８時間にわたって血清を欠乏させ、続いて１０ｇ／ｍＬ ｈｕ２Ｈ１１またはｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５／Ｒ７４ または２μｇ／ｍＬエフリンＡ１／Ｆｃによって３７℃にて１０分間から２時間処置した。

【0379】

リン酸化の阻害
血清が欠乏したＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞をｃｈＫＴＩ、ｈｕ２Ｈ１１またはｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４（１０μｇ／ｍＬ）によって３７℃にて１時間インキュベートした。次に１μｇ／ｍＬエフリンＡ１／Ｆｃを添加して、細胞を３７℃にてさらに１０分から３０分間インキュベートした。

【0380】

細胞抽出物の調製
細胞試料を掻爬によって氷上で収集して、１５ｍＬ円錐管に移し、１３００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ １４１９０）で１回洗浄した後、細胞を１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１×プロテアーゼ・インヒビタ・カクテル（Ｓｉｇｍａ参照＃ Ｐ２７１４）および１×Ｈａｌｔホスファターゼインヒビタ（Ｐｉｅｒｃｅ参照＃ ７８４２０）を即時添加した溶解緩衝液３００μＬ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ参照＃ ＦＮＮ００１１）に再懸濁させた。細胞抽出物をときどきボルテックス処理しながら氷上で４５分間維持して、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、さらに使用するまで−８０℃にて維持した。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅによるキット（参照＃ ２３２２７）を使用して、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）によって決定した。

【0381】

免疫沈降
細胞抽出物（試料当り０．３から０．５ｍｇ）のプレクリーニングステップは、溶解緩衝液中で先に平衡させた（ローテータ上で４℃にて１時間）、タンパク質Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ参照＃ １７−０６１８−０１）を添加することによって行った。インキュベーションは、ローテータ上で４℃にて３０分間行った。試料を１５００ｒｐｍにて２分間遠心分離して、上清を収集し、抗ＥｐｈＡ２ ＡｂクローンＤ７（試料当り４μＬ）と共にローテータ上で一晩インキュベーションした。免疫沈降は、タンパク質Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いてローテータ上で４℃にて４時間行った。試料を１５００ｒｐｍで４℃にて２分間遠心分離して、溶解緩衝液１００μＬによって５分間、３回洗浄した。免疫沈降したビーズは、ＮｕＰＡＧＥ還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ参照＃ ＮＰ０００９）を添加した４×ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液５０μＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ参照＃ ＮＰ０００７）に再懸濁させて、９５℃にて５分間加熱し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して、−２０℃にて維持するか、電気泳動を行った。

【0382】

免疫ブロット
免疫沈降物または細胞抽出物を基準分子量マーカー（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ参照＃ ＲＰＮ８００）と共に４から１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｍｉｄｉゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ ＮＰ０３２２ＢＯＸ）に投入して、電気泳動をＭＯＰＳ−ＳＤＳ緩衝液１×（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ参照＃ ＮＰ０００１）中で１５０Ｖにて３時間行った。電気ブロットは、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ参照＃ ＬＣ２００７）上で、ｉ−ｂｌｏｔ（商標）装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりプログラム３を使用して行った。膜のブロッキングは、５％ウシ血清アルブミンを添加したＴＢＳＴ １×（即ちトリス緩衝食塩水 Ｓｉｇｍａ参照＃ Ｔ５９１２、０．１％ツイン２０ Ｓｉｇｍａ参照＃ Ｐ１３７９）中で行った。抗ＥｐｈＡ２ ＡｂクローンＤ７または抗ホスホチロシン４Ｇ１０ Ａｂによる標識を、同じ緩衝液中で４℃にて一晩行った。抗アクチンＡｂクローンＣ４による標識を室温にて１時間行った。続いての１×ＴＢＳＴによる膜の洗浄後に、ＰＯ−コンジュゲートヤギ抗マウスＡｂおよびＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒによるＥＣＬキット（参照＃ ＮＥＬ １０４００１ＥＡ）を使用して、免疫ブロットの展開を行った。発光はＦｕｊｉ４０００装置で読み取った。
結果
組換えエフリンＡ１／Ｆｃを正の対照として使用して、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞におけるｈｕ２Ｈ１１またはｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４ ＡｂによるＥｐｈＡ２のリン酸化の誘発について調査した。結果を図４に示す。リン酸化の誘起は、２つのＡｂのいずれによっても１０分間から２時間で検知することができなかったが、組換えエフリンＡ１／Ｆｃは、１０分にてＥｐｈＡ２受容体の強いリン酸化を誘発し、シグナルの低下は１時間後に開始し、受容体の分解が２時間後に見られ始めた。

【0383】

エフリンＡ１／Ｆｃによる誘起後のＥｐｈＡ２のリン酸化の阻害を、ＮＣＩ−Ｈ１２９９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において調査した。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。どちらの場合でも、２つのＡｂのいずれかによる細胞のプレインキュベーションは、エフリンＡ１／ＦｃによるＥｐｈＡ２受容体のリン酸化を阻害した。

【0384】

我々は、ｈｕ２Ｈ１１およびｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４がＥｐｈＡ２受容体に対して類似の阻害活性を有すると結論付けることができる。

【0385】

［実施例３］
コンジュゲート抗ＥｐｈＡ２抗体、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４およびｈｕ２Ｈ１１の結合キャラクタリゼーション
裸であるかまたはＰＥＧ４−ＮＨＡｃリンカーによってＤＭ４にコンジュゲートされているかのどちらかの、抗ＥｐｈＡ２抗体ｈｕ２Ｈ１１およびｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４の固定されたＥｐｈＡ２−Ｆｃとの相互作用を、表面プラスモン共鳴検出によりＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｎ°ＣＨ３２１）を使用して監視した。ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−［ジメチル−アミノプロピル］カルボジイミド）／ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）による標準アミン・カップリング・プロトコルを使用して、ＥｐｈＡ２−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ；酢酸塩緩衝液ｐＨ＝４．５）をＣ１センサチップのマトリクス（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ−１００５−４０）に１０μｌ／分にてカップリングした。動的結合実験では、密度は応答レベルを約１００応答単位（ＲＵ）上昇させて制御した。ＩｇＧは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００５％ Ｐ２０を含有する０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４で希釈した。続いての希釈物はすべて同じ緩衝液で作製した。すべての結合実験は、２５℃にて通例５０から０．２ｎＭの範囲に及ぶＩｇＧ濃縮物を流速５０μｌ／分で用いて行った。

【0386】

データをおよそ１２分間収集して（２分間の会合時間および１０分間の解離時間）、３０μｌ／分にて１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＨの１分間パルスを使用して表面を再生した。ＩｇＧも未コーティング細胞上に流し、ブランクランによるセンサグラムをＥｐｈＡ２−Ｆｃカップリングチップによって得られたセンサグラムから引いた。変動ベースラインを有する１：１ラングミュア結合モデルにデータを適合させた。本アルゴリズムはｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆの両方を計算し、これから見かけの平衡解離定数Ｋ_Ｄを２つの速度定数の比（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）として推定する。得られた値を表Ｉに示す。

【0387】

親和性定数は最初に、裸のｈｕ２Ｈ１１およびｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４の両方を用いて測定される。ｈｕ２Ｈ１１のＥｐｈＡ２−Ｆｃへの結合データの分析により、０．３０ｎＭのＫ_Ｄが得られる；本値は、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＫ_Ｄ（０．２２ｎＭ）と類似していた。しかしコンジュゲート抗体がアッセイで使用されるとき、結果は劇的に異なった：７．５などの高い薬物対抗体比を有するコンジュゲートｈｕ２Ｈ１１は、裸の抗体と比較したときに、５．４倍上昇したＫ_Ｄを呈した（１．６２ｎＭ対０．３０ｎＭ）。他方、７．４の薬物対抗体比でコンジュゲートされたｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＫ_Ｄは、裸の抗体の一方とは異なっていなかった（０．２７ｎＭ対０．２２ｎＭ）。加えてＫ_Ｄは、５．６から８．４の範囲に及ぶ薬物対抗体比で有意には異なっていなかった。

【0388】

我々は、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４抗体の親和性が高い薬物対抗体比においてもコンジュゲーションによって影響されないことを結論付けた。

【0389】

［実施例４］
ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４による腫瘍細胞を発現するＥｐｈＡ２の成長の阻害
Ｌｏｖｏ腫瘍細胞の阻害
Ｌｏｖｏ腫瘍細胞（ウェル当り２０００）を、完全血清含有培地中の９６ウェル組織培養プレートに播種した。コンジュゲートを１０^−７から１０^−１２Ｍの間の範囲に及ぶ濃度で段階希釈して３組のウェルに添加した。細胞を３７℃／５％ ＣＯ_２にて抗体−細胞傷害性化合物コンジュゲートの存在下で５日間培養して、この時間の後、４時間のＷＳＴ８アッセイを製造者の説明書（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８，カタログ＃ＣＫ０４）に従って行い、細胞の生存および成長を評価した。無細胞試薬ブランクを試験ウェル読み取り値から引いて、コンジュゲート処置細胞の読み取り値をビヒクル処置細胞の対照ウェルからの読み取り値の平均で割ることにより得られたデータを、生存画分としてプロットした。

【0390】

高いメイタンシン／抗体比（６．７０Ｄ／Ａおよび７．００Ｄ／Ａ）におけるｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４の２つのロットの細胞傷害性効力を、匹敵するメイタンシン／抗体比（６．９９Ｄ／Ａ）を有する野生型ｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートの細胞傷害性効力と比較した。図７で見られるように、２つのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートは、ＥｐｈＡ２陽性Ｌｏｖｏ株化細胞に対して野生型ｈｕ２Ｈ１１の対応するコンジュゲートよりも高い効力を示した（表ＩＩ）。

【0391】

［実施例５］
ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４による腫瘍細胞を発現するＥｐｈＡ２の成長の阻害
ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＳＫＭＥＬ２８の成長の阻害
対数成長期にある細胞をトリプシン処理して、これのそれぞれの培養培地に再懸濁させた（ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞にはＤＭＥＭ／Ｆ１２ Ｇｉｂｃｏ ＃２１３３１；１０％ ＳＶＦ Ｇｉｂｃｏ＃ １０５００−０５６；２ｎＭグルタミンＧｉｂｃｏ＃ ２５０３０；ＳＫＭＥＬ−２８細胞にはＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃ １１９６０）１０％ＳＶＦ Ｇｉｂｃｏ＃ １０５００−０５６；２ｎＭグルタミンＧｉｂｃｏ＃ ２５０３０）。完全血清含有培地中の９６ウェルＣｙｔｏｓｔａｒ培養プレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ，＃ＲＰＮＱ０１６３）に、細胞懸濁物を５０００細胞／ウェルの密度で（ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＳＫＭＥＬ−２８）分散させた。４時間コーティングした後、コンジュゲートの１０−７から１０^−１２Ｍの間の範囲に及ぶ濃度の段階希釈物を３組のウェルに添加した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２にて抗体−細胞傷害性化合物コンジュゲートの存在下で３日間培養した。第４日に、１４Ｃチミジンの溶液１０μｌ（０．１μＣｉ／ウェル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ ＮＥＣ５６８２５０００）を各ウェルに添加する。実験を開始して９６時間後に、１４Ｃチミジンの吸収をｍｉｃｒｏｂｅｔａ放射線カウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。無細胞試薬ブランクを試験ウェル読み取り値から引いて、コンジュゲート処置細胞の読み取り値をビヒクル処置細胞の対照ウェルからの読み取り値の平均で割ることにより得られたデータを、生存画分としてプロットした。多くの実験において、裸の抗体（２Ｈ１１または２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４）を実験開始時に１μＭの濃度でウェルに添加して増殖の阻害を上記のように測定した。

【0392】

結果
表ＩＩＩに報告した結果は、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４ならびに２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ４コンジュゲートが以前のコンジュゲートよりも、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞に対するインビトロ増殖阻害および抗原マイナス細胞（ＳＫＭＥＬ−２８）に対する選択性が良好であることを示唆する。

【0393】

［実施例６］
薬物動態研究
本研究は、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４コンジュゲート（ＤＡＲ＝５．５）の薬物動態挙動を、ＣＤ−１マウス中のｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート（ＤＡＲ＝３．９）と比較して評価するために設計された。動物に各コンジュゲート２０ｍｇ／ｋｇを静脈内経路により投与して、血液を注射の０、８、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、５０４、６７２時間後に収集した。抗体薬物コンジュゲートの血漿レベルを測定して、標準条件下で基本単回用量薬物動態パラメータを制定した。コンジュゲートおよびこれの抗体構成要素（全抗体、コンジュゲート抗体および任意の脱コンジュゲート抗体の和）の血漿濃度を特異的ＥＬＩＳＡ技法によって測定した。

【0394】

ｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（全体）の抗体構成要素のクリアランス関連薬物動態パラメータは、０．０００４３Ｌ／時／ｋｇのＣｌ（クリアランス）、１６０時間のＴ１／２（終末半減期）、４７，０００，０００ｎｇ時／ｍＬのＡＵＣ０−ｉｎｆ（時間ゼロから無限大までの濃縮時間曲線下面積）、０．０９５Ｌ／ｋｇのＶｄｓｓ（分布の定常状態体積）および２７０，０００ｎｇ／ｍＬのＣ０（時間０における濃度）として計算した。

【0395】

ｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの薬物動態パラメータを、０．０００７０Ｌ／時／ｋｇのＣｌ、８７時間のＴ１／２、２８，０００，０００ｎｇ時／ｍＬのＡＵＣ０−ｉｎｆ、０．０８０Ｌ／ｋｇのＶｄｓｓおよび３６０，０００ｎｇ／ｍＬのＣ０として計算した。

【0396】

ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４（全体）の抗体構成要素のＰＫパラメータは、０．０００２７Ｌ／時／ｋｇのＣｌ、１９０時間のＴ１／２、７３，０００，０００ｎｇ時／ｍＬのＡＵＣ０−ｉｎｆ、０．０６８Ｌ／ｋｇのＶｄｓｓおよび５３０，０００ｎｇ／ｍＬのＣ０であった。

【0397】

最後に、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４コンジュゲートは、０．０００３６Ｌ／時／ｋｇのクリアランス、１５０時間のＴ１／２、５６，０００，０００ｎｇ時／ｍＬのＡＵＣ０−ｉｎｆ、０．０６９Ｌ／ｋｇのＶｄｓｓおよび６００，０００ｎｇ／ｍＬのＣ０の値を示した。

【0398】

結論として、ｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートはｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４よりも高速に除去される。さらにｈｕ２Ｈ１１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４と比較して、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４は、全コンジュゲート抗体と全抗体曲線との間で、より良好な曝露（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）およびより狭い分離を示した（図７および８を比較）。

【0399】

[実施例７]
メスＳＣＩＤマウスに移植された原発性結腸腫瘍ＣＲ−ＬＲＢ−００４Ｐに対する、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４およびｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍効果
物質および方法
コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価のために、動物の体重を毎日測定し、腫瘍をカリパスにより週２回測定した。腫瘍の重量は、塊体（ｍｇ）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）^２］／２の式を使用して計算した。抗腫瘍活性の評価は、最大非毒性用量（ＨＮＴＤ）にて行った。

【0400】

最下点（群の平均）において２０％体重減少（ｂｗｌ）または１０％以上の薬物死を生じる投薬量を過剰毒性投薬量と見なした。動物の体重は腫瘍の重量を含んでいた。主要有効性エンドポイントは、ΔＴ／ΔＣ、中央値回帰パーセント、部分および完全回帰（ＰＲおよびＣＲ）および無腫瘍生存者（ＴＦＳ）である。

【0401】

各処置（Ｔ）および対照（Ｃ）の腫瘍体積の変化は、第１の処置日（ステージング日）の腫瘍体積を規定観察日の腫瘍体積から引くことによって、各腫瘍について計算する。中央値（ｍｅｄｉａｎ）ΔＴを処置群について計算して、中央値ΔＣを対照群について計算する。次に比ΔＴ／ΔＣを計算して、パーセンテージとして表す：

【0402】

【数4】

用量は、ΔＴ／ΔＣが４０％未満であるときに治療的に活性であると、およびΔＴ／ΔＣが１０％未満であるときに非常に活性であると見なされる。ΔＴ／ΔＣが０未満である場合、用量は高度に活性であると見なされ、回帰（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）パーセンテージに日付が付けられる（参考文献１）：
％腫瘍回帰は：規定の観察日の処置群における、第１の処置の第１日の腫瘍体積（ｖｏｌｕｍｅ）と比較した腫瘍体積減少％として定義する。特定の時点および各動物について、％回帰を計算する。次に群の中央値％回帰を計算する。

【0403】

【数5】

【0404】

部分回帰（ＰＲ）：回帰は、処置開始時の腫瘍体積の５０％にまで減少した場合には部分的として定義される。

【0405】

完全回帰（ＣＲ）：完全回帰は、腫瘍体積＝０ｍｍ^３のときに達成される（腫瘍体積が記録できないときに、ＣＲが考慮される。）。

【0406】

ＴＦＳ：無腫瘍は、研究の終了時に検出不能な腫瘍を有する動物として定義される（最終処置後＞１００日）

【0407】

結果
ｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４−コンジュゲートおよびｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の抗腫瘍効果を、メスＳＣＩＤマウスに皮下移植された、標的を強力に発現する測定可能な原発性結腸腫瘍ＣＲ−ＬＲＢ−００４Ｐに対する２つの用量レベルにて評価した。対照群は未処置のままであった。用量を１ｋｇ当りのタンパク質のミリグラムで表した。第１５日に静脈内（ＩＶ）ボーラス注射によって、４０および１０ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４を投与した。ＤＭ４と等用量を与えるために、ｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４を４４および１１ｍｇ／ｋｇで投与した。

【0408】

ＣＲ−ＬＲＢ−００４Ｐ腫瘍の単回投与スケジュールを使用して表Ｖに示すように、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４は４０および１０ｍｇ／ｋｇにてそれぞれで２８および３９％のΔＴ／ΔＣで活性であったが、ｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４は４４ｍｇ／ｋｇのみにて２６％のＡＴ／ＡＣで活性であった。１０ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４は本モデルでは活性ではなかった。

【0409】

これらの結果から、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４−コンジュゲートは、ｈｕ２Ｈ１１−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４コンジュゲートよりも低い用量でより良好な活性を示した。

【0410】

［実施例８］
ＳＣＩＤメスマウスにおける前立腺腺癌ＰＣ−３に対するｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の抗腫瘍活性へのＤＡＲの影響
抗体薬物コンジュゲートの抗腫瘍活性に対するＤＡＲの効果
ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４を、メスＳＣＩＤに皮下移植された前立腺ＰＣ−３腫瘍に対して、６つの異なる薬物抗体比（ＤＡＲ）で２つの低い有効用量を比較して評価した。対照群は未処置のままであった。用量を１ｋｇ当りのタンパク質のミリグラムで表した。ＤＡＲをＵＶ法によって決定した。第１６日に、１０および５ｍｇ／ｋｇのｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４をそれぞれ３．４、４．４、５．９、６．２、７．４および８．４のＤＡＲにて、静脈内（ＩＶ）ボーラス注射により投与した。

【0411】

物質および方法
コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価のために、動物の体重を毎日測定し、腫瘍をカリパスにより週２回測定した。腫瘍の重量は、塊体（ｍｇ）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）^２］／２の式を使用して計算した。抗腫瘍活性の評価は、最大非毒性用量（ＨＮＴＤ）にて行った。

【0412】

最下点（群の平均）において２０％体重減少（ｂｗｌ）または１０％以上の薬物死を産生する投薬量を過剰毒性投薬量と見なした。動物の体重は腫瘍の重量を含んでいた。主要有効性エンドポイントは、ΔＴ／ΔＣ、中央値回帰パーセント、部分および完全回帰（ＰＲおよびＣＲ）および無腫瘍生存者（ＴＦＳ）である。

【0413】

各処置（Ｔ）および対照（Ｃ）の腫瘍体積の変化は、第１の処置日（ステージング日）の腫瘍体積を規定観察日の腫瘍体積から引くことによって、各腫瘍について計算する。中央値ΔＴを処置群について計算して、中央値ΔＣを対照群について計算する。次に比ΔＴ／ΔＣを計算して、パーセンテージとして表す：

【0414】

【数6】

【0415】

用量は、ΔＴ／ΔＣが４０％未満であるときに治療的に活性であると、およびΔＴ／ΔＣが１０％未満であるときに非常に活性であると見なされる。ΔＴ／ΔＣが０未満である場合、用量は高度に活性であると見なされ、回帰パーセンテージに日付が付けられる（参考文献１）：
％腫瘍回帰は：規定の観察日の処置群における、第１の処置の第１日の腫瘍体積と比較した腫瘍体積減少％として定義する。特定の時点および各動物について、％回帰を計算する。次に群の中央値％回帰を計算する。

【0416】

【数7】

部分回帰（ＰＲ）：回帰は、処置開始時の腫瘍体積の５０％にまで減少した場合には部分的として定義される。

【0417】

完全回帰（ＣＲ）：完全回帰は、腫瘍体積＝０ｍｍ^３のときに達成される（腫瘍体積が記録できないときに、ＣＲが考慮される。）。

【0418】

ＴＦＳ：無腫瘍は、研究の終了時に検出不能な腫瘍を有する動物として定義される（最終処置後＞１００日）

【0419】

結果
単回投与スケジュールを使用して表ＶＩに示すように、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４は１０ｍｇ／ｋｇにて、４．４のＤＡＲから８．４のより高いＤＡＲまで活性を示した。

【0420】

ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４は５ｍｇ／ｋｇにて、５．９のＤＡＲから８．４のより高いＤＡＲまで活性を示した。

【0421】

結論として、ＤＡＲはｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の腫瘍活性に効果を有し、これらの結果からｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の最適ＤＡＲは少なくとも５．９に等しいことが推定できる。

【0422】

［実施例９］
ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４のＰＫパラメータへのＤＡＲの影響
オスＣＤ−１マウスにおける異なる薬物抗体比（ＤＡＲ）のｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の薬物動態特性を、コンジュゲート２０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後に評価した。コンジュゲートの血漿レベルを測定して、標準条件下で基本単回用量薬物動態パラメータを制定した。ＰＫパラメータを親抗体のＰＫパラメータと比較した。コンジュゲートおよびこれの抗体構成要素（全抗体、コンジュゲート抗体および任意の脱コンジュゲート抗体の和）の血漿濃度を特異的ＥＬＩＳＡ技法によって測定した。

【0423】

結果（図９Ａおよび９Ｂを参照のこと。）は、ＤＡＲ値と全抗体構成要素への曝露との間に逆相関を示し、０、３、４、４．３、５．９、６．６および７．４のＤＡＲに対してそれぞれ、８３，０００，０００、６１，０００，０００、４８，０００，０００、４６，０００，０００、４１，０００，０００および２７，０００，０００ｎｇ時／ｍＬのＡＵＣ０−ｉｎｆ値である。

【0424】

同様に、ＤＡＲ値とコンジュゲートへの曝露との間に逆相関があり、３．４、４．３、５．９、６．６および７．４のＤＡＲに対してそれぞれ、３９，０００，０００、３０，０００，０００、２７，０００，０００、２９，０００，０００および２０，０００，０００ｎｇ時／ｍＬのＡＵＣ０−ｉｎｆ値である。

【0425】

ＤＡＲ値と抗体構成要素の排除の間には完全な相関があり、０、３．４、４．３、５．９、６．６および７．４のＤＡＲに対してそれぞれ、０．０００２４、０．０００３３、０．０００４２、０．０００４３、０．０００４９および０．０００７４Ｌ／時／ｋｇのＣｌ値である。

【0426】

同様に、ＤＡＲ値とコンジュゲートの排除との間にはほぼ完全な相関があり、３．４、４．３、５．９、６．６および７．４のＤＡＲに対してそれぞれ、０．０００５１、０．０００６６、０．０００７５、０．０００６９、０．０００９９Ｌ／時／ｋｇのＣｌ値である。

【0427】

結論として、ＤＡＲはＰＫパラメータに対して影響を有し、ＤＡＲが上昇するときに曝露が減少し、排除が増加する。

【0428】

有効性およびＰＫ評価からの結果に従って、最適ＤＡＲは５．９と７．４との間に含まれる。

【0429】

［実施例１０］
ＳＣＩＤメスマウスにおける前立腺腺癌ＰＣ−３に対するｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の評価
抗体薬物コンジュゲートｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４の抗腫瘍効果を、メスＳＣＩＤマウスに皮下移植された、標的を強力に発現する測定可能な前立腺ＰＣ−３腫瘍に対して８つの用量レベルで評価した。対照群は未処置のままであった。用量を１ｋｇ当りのタンパク質のミリグラムで表した。

【0430】

これらを第１７日に静脈内（ＩＶ）ボーラス注射により、１６０、１２０、８０、４０、２０、１０、５および２．５ｍｇ／ｋｇで投与した。

【0431】

物質および方法
コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価のために、動物の体重を毎日測定し、腫瘍をカリパスにより週２回測定した。腫瘍の重量は、塊体（ｍｇ）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）^２］／２の式を使用して計算した。抗腫瘍活性の評価は、最大非毒性用量（ＨＮＴＤ）にて行った。

【0432】

最下点（群の平均）において２０％体重減少（ｂｗｌ）または１０％以上の薬物死を産生する投薬量を過剰毒性投薬量と見なした。動物の体重は腫瘍の重量を含んでいた。主要有効性エンドポイントは、ΔＴ／ΔＣ、中央値回帰パーセント、部分および完全回帰（ＰＲおよびＣＲ）および無腫瘍生存者（ＴＦＳ）である。

【0433】

各処置（Ｔ）および対照（Ｃ）の腫瘍体積の変化は、第１の処置日（ステージング日）の腫瘍体積を規定観察日の腫瘍体積から引くことによって、各腫瘍について計算する。中央値ΔＴを処置群について計算して、中央値ΔＣを対照群について計算する。次に比ΔＴ／ΔＣを計算して、パーセンテージとして表す：

【0434】

【数8】

【0435】

用量は、ΔＴ／ΔＣが４０％未満であるときに治療的に活性であると、およびΔＴ／ΔＣが１０％未満であるときに非常に活性であると見なされる。ΔＴ／ΔＣが０未満である場合、用量は高度に活性であると見なされ、回帰パーセンテージに日付が付けられる（参考文献１）：
％腫瘍回帰は：規定の観察日の処置群における、第１の処置の第１日の腫瘍体積と比較した腫瘍体積減少％として定義する。特定の時点および各動物について、％回帰を計算する。次に群の中央値％回帰を計算する。

【0436】

【数9】

【0437】

部分回帰（ＰＲ）：回帰は、処置開始時の腫瘍体積の５０％にまで減少した場合には部分的として定義される。

【0438】

完全回帰（ＣＲ）：完全回帰は、腫瘍体積＝０ｍｍ^３のときに達成される（腫瘍体積が記録できないときに、ＣＲが考慮される。）。

【0439】

ＴＦＳ：無腫瘍は、研究の終了時に検出不能な腫瘍を有する動物として定義される（最終処置後＞１００日）

【0440】

結果
単回投与スケジュールを使用して、試験したコンジュゲートの最大用量（１６０ｍｇ／ｋｇ）が毒性であり、体重減少および薬物関連死を誘発することが見出された。

【0441】

表ＶＩＩＩに示すように、ＨＮＴＤ（１２０ｍｇ／ｋｇ）および他の最小用量において、化合物は高度に活性であった。ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４は、２．５ｍｇ／ｋｇを除くすべての用量で、部分回帰を誘発し、１２０、８０および２０ｍｇ／ｋｇでは、これは完全回帰を誘発した。加えて腫瘍モデルは悪液質であり、化合物の投与は、最下点における体重減少を対照と比較して低下させた。

【0442】

結論として、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＮＨＡｃ−ＤＭ４は、高い活性を前立腺ＰＣ−３腫瘍モデルに対する良好な用量効果と共に示した。

【0443】

［実施例１１］
２．１Å分解能でのｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５−Ｒ７４からのＦａｂフラグメントと複合したＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインの結晶構造の構造決定による、エピトープのマッピングおよびパラトープの同定
物質および方法
ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５−７４のＦａｂと複合したＥｐｈＡ２受容体−Ｆｃのグリコシル化細胞外ドメインに対して、所期結晶化の試験を行った。トリプシンの存在下のみで結晶が得られた。これらの結晶を分析し、ペプチドマッピングはこれらがＦａｂを含有し、ＥｐｈＡ２およびＦｃの細胞外ドメインのＮ末端ドメインのある部分を含有していることを示した。複合体の別のバッチを産生し、今回はｈｕ２Ｈ１１Ｒ３４−Ｒ７４−Ｈｉｓからの組換えＦａｂフラグメントと複合した末端Ｈｉｓタグを有するＥｐｈＡ２受容体のグリコシル化細胞外ドメインを使用した。ＥｐｈＡ２受容体のどちらの構築物も、ＥｐｈＡ２受容体とｈｕ２Ｈ１１Ｒ３４−Ｒ７５との間の複合体の同じ構造を提供する。

【0444】

ＥｐｈＡ２受容体の細胞外領域は４つのドメイン：ＬＢＤ（リガンド結合ドメイン）、ＣＲＤ（システイン・リッチ・ドメイン）および２つのフィブロネクチン反復、ｎＦＮ３およびｃＦＮ３で作製され、非常に可撓性であることが示されている。異なるドメインを分子置換計算の検索モデルとして単独または組合せのどちらかで使用した；Ｆａｂの可変および定常ドメインのモデルも、Ｆｃ（ｐｄｂコード１ＩＧＴ）のモデルに加えて、結晶構造を解析するために作製および使用した。

【0445】

各種の結晶化条件を試験して、ＥＳＲＦにて収集された２．１Åデータセットを使用し、複合体の構造を解析した。我々がＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインとｈｕ２Ｈ１１Ｒ３４−Ｒ７４との間の界面を分析することが可能となった。

【0446】

全長ＥｐｈＡ２細胞外領域（２５−５３４）が最初に存在していたとしても、結晶はタンパク質のＬＢＤおよびＣＲＤドメインのみを含有している（結晶に応じて、残基２５−３２５または３２７（ここでは連続ナンバリングを使用する。）。

【0447】

結果
エピトープマッピング
図１０：ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３４−Ｒ７５のＥｐｈＡ２受容体エピトープの細胞外ドメインのマッピングを示す（エピトープ残基は、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３４−Ｒ７４ ＦａｂフラグメントのＣＤＲ残基のいずれかの原子から４Å以内に存在する原子を含有する残基として定義されている。）。

【0448】

ＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインのエピトープは、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３４−Ｒ７４のＦａｂフラグメントに結合されたときに、ＬＢＤドメインＧｌｙ４９、Ｌｙｓ５０、Ｇｌｙ５１、Ａｓｐ５３、Ｃｙｓ７０、Ａｓｎ７１、Ｖａｌ７２、Ｍｅｔ７３、Ｓｅｒ７４、Ｇｌｙ７５、Ｇｌｎ７７、Ｐｈｅ１０８、Ｐｒｏ１０９、Ｇｌｙ１１０、Ｇｌｙ１１１、Ｓｅｒ１１３およびＳｅｒ１１４の残基を含む立体配座エピトープである。

【0449】

図１１：エピトープの一部であるＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインからの残基を示す（ダークグレーで表す。）；ライトグレーの残基は結晶構造中では見えない。

【0450】

図１２Ａ：複合体の構造全体を表し、図１１Ｂは、位置３５および７４に導入された２つの変異を有する部分の拡大である。

【0451】

ｈｕ２Ｈ１１のコンジュゲーションは、表面リジン残基に発生する。これらの２つはアルギニンに変異された。これらの２つの残基、重鎖Ｒ７４および軽鎖Ｒ３５を図１２Ｂに示す：
Ｒ７４はインタフェースの近くに存在して、ＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインの外方を向き、最も近い細胞外ドメインから約１０Å離れている。Ｒ３５はパラトープ残基の１つであり、これはＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインからのＡｓｐ５３とＨ結合を作製する。リジン残基は抗原との同じ相互作用を非常に生じやすく、これのコンジュゲーションは抗体結合にとって明らかに有害である。

【0452】

パラトープ分析
ＥｐｈＡ２受容体の細胞外ドメインとｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５−Ｒ７４との間の界面は、ＣＤＲループをすべて含むわけではない。図１２からわかるように、主に重鎖ＣＤＲが結合に関与している。このことは、ｈｕ２Ｈ１１のＣＤＲにおける、特に軽鎖における変化が、ただし排他的ではないが、ＥｐｈＡ２受容体への結合に悪影響を及ぼさずに導入できることを示唆している。軽鎖のループ３はインタフェースに全く関与していないが、Ｌ１末端の１残基（Ａｒｇ３５）のみがＥｐｈＡ２の細胞外ドメインと相互作用する。このことは、ループＬ３の変化がＥｐｈＡ２への結合に影響するはずがないことと、アミノ酸残基の変異／挿入がＡｒｇ３５残基の立体配座および向きを不安定化させない限り、ループＬ１がアミノ酸残基の変異／挿入に耐えるはずであることを暗示している。

【0453】

ＥｐｈＡ２受容体のｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５−Ｒ７４のパラトープは、以下の軽鎖の残基：ループ１のＡｒｇ３５、Ｌ２のＴｙｒ５４、Ａｒｇ５８およびＡｓｐ６０を含む。これは重鎖に以下の残基：ループＨ１のＴｈｒ３０、Ａｌａ３１、Ｔｙｒ３２およびＴｙｒ３３、Ｈ２のＡｓｎ５２、Ｔｙｒ５４、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５７、ならびにＨ３のＧｌｕ９９、Ｐｈｅ１００、Ｔｙｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｔｙｒ１０３およびＴｙｒ１０５を含む。連続ナンバリングスキームを軽鎖および重鎖に使用する。

【0454】

構造データを使用して、例えばＣｌａｒｋ ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６），１５：９４９−９６０）またはＬｉｐｐｏｗ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００７），１０：１１７１−７６）に記載された手法によって、ＥｐｈＡ２受容体に対するｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５−Ｒ７４抗体の親和性を改良することが可能かもしれない。

【0455】

ループＨ１：Ｔｈｒ Ｈ２８の適切な変異により、例えばＡｓｐ７６との追加の相互作用を生成することが可能かもしれない。

【0456】

軽鎖とＥｐｈａ２受容体との間の相互作用は、多くの残基を含まない。これにもかかわらず、新たな相互作用を生成することにはおそらく、ループＬ１またはＬ３のどちらかへの大幅な挿入を必要とする。

【0457】

これらのループとＥｐｈＡ２受容体との間の相互作用は、むしろ大型のまたは長い残基によって発生する：この環境でのいずれの変化も結合親和性の損失を生じるかもしれない。

【0458】

本Ｘ線構造は、変異させることができ、ＥｐｈＡ２への結合に影響を与えるはずがないＣＤＲからの残基を強調している。

【0459】

以下の記述では、パラトープからの残基がＥｐｈＡ２受容体への結合を保存するために修飾されるように規定されていない限り、修飾されるはずがない。ＣＤＲの変異は、ＥｐｈＡ２受容体への結合を保存するためにパラトープからの残基の立体配座および向きに影響するはずがないことも理解される。残基ナンバリングは連続的であり、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３，９２７−９４８）で使用されているようなカバット法に従わない。「Ｘ」は「いずれの残基」も表すが、「−」は、どの修飾もこの位置で作製されるはずがないことを示す。

【0460】

Ｄ３３およびＲ３５を除くＣＤＲ Ｌ１（配列番号４）において、ループの長さが保存され、これがＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２）２２７：７９９−８１７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２）２２７：７７６−７９８およびＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（上で引用）に記載されたような基準構造Ｌ１−カッパ４を取る限り、配列には何の制限もない。このことは、ペプチド結合のねじれ角がＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（上で引用）の図５に定義された許容範囲内に含まれることを意味する。

【0461】

Ａｒｇ３５は変異されて、本残基へのコンジュゲーションを防止した。これにもかかわらずＬｙｓはＥｐｈＡ２との同じ相互作用を作製し、このため親ｈｕ２Ｈ１１抗体がＥｐｈＡ２受容体との同じ相互作用を作製して、ＥｐｈＡ２受容体の同じエピトープを結合することが予測される。

【0462】

Ａｓｐは位置３３の好ましい残基である。

【0463】

【表1】

【0464】

ＣＤＲ Ｌ２（配列番号５）において、どちらのＬｅｕもＩｌｅなどの保存的置換によって置換することができる。ＶａｌはＩｌｅによって置換されるかもしれない（あまり好ましくない。）。ループの最初のＳｅｒはいずれの残基によっても置換できるが、第２のＳｅｒは別の親水性／荷電残基によって置換されるかもしれない。Ｔｙｒ残基（５４）は変更されるはずがない。

【0465】

【表2】

【0466】

ＣＤＲ Ｌ３（配列番号６）において、これがＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（上で引用）で定義されたような基準構造Ｌ３−カッパ１を取る限り、配列またはループ長に何の制限もない。

【0467】

【表3】

【0468】

ＣＤＲ Ｈ１（配列番号１）ＧＹＴＦＴＡＹＹ）の周囲にて、ループの最初のＴｈｒ（Ｔｈｒ２８）は親和性成熟の潜在的な位置である。

【0469】

【表4】

【0470】

ＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）において、ＰｈｅおよびＴｙｒは、いずれの芳香族残基（Ｆ／Ｙ／Ｗ）によっても置換することができる。

【0471】

【表5】

【0472】

ＣＤＲ Ｈ３（ＥＦＹＧＹＲＹＦＤＶ）では、本ループには何の変化も作製されるはずがない。

【0473】

【表6】

【0474】

エフリン結合部位
ｈｕ２Ｈ１１抗体は機能活性を示す：これはＥｐｈＡ２のエフリン−Ａ１結合およびエフリンＡ１誘発リン酸化を阻害する。エフリン−Ａ１と複合したＥｐｈＡ２受容体のＬＢＤおよびＣＲＤドメインの構造は公開されている（ＰＤＢコード３ＭＢＷ）。本構造をｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＦａｂフラグメントと複合したＥｐｈＡ２の構造に重ね合せるとき、２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４のＦａｂフラグメントの軽鎖がＥｐｈＡ２上のエフリン−Ａ１の結合範囲と重複し、このためｈｕ２Ｈ１１抗体の競合的性質が確認されることが明確に考えられる。

【0475】

［実施例１２］
ヒト化２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−ＤＭ４コンジュゲートによる、腫瘍細胞を発現するＥｐｈＡ２の成長の阻害
対数成長期にあるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞をトリプシン処理して、培養培地に再懸濁させた（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ Ｇｉｂｃｏ ＃２１３３１；１０％ ＳＶＦ Ｇｉｂｃｏ＃ １０５００−０５６；２ｎＭグルタミン Ｇｉｂｃｏ＃）。完全血清含有培地中の９６ウェルＣｙｔｏｓｔａｒ培養プレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ，＃ＲＰＮＱ０１６３）に、細胞懸濁物を５０００細胞／ウェルの密度で分散させた。４時間コーティングした後、コンジュゲートの１０^−７から１０^−１２Ｍの間の範囲に及ぶ濃度の段階希釈物を３組のウェルに添加した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２にて抗体−細胞傷害性化合物コンジュゲートの存在下で３日間培養した。第４日に、１４Ｃチミジンの溶液１０μｌ（０．１μＣｉ／ウェル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃ ＮＥＣ５６８２５０００）を各ウェルに添加する。実験を開始して９６時間後に、１４Ｃチミジンの吸収をｍｉｃｒｏｂｅｔａ放射線カウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。無細胞試薬ブランクを試験ウェル読み取り値から引いてコンジュゲート処置細胞の読み取り値をビヒクル処置細胞の対照ウェルからの読み取り値の平均で割ることにより得られたデータを、生存画分としてプロットした。多くの実験において、裸の抗体（２Ｈ１１または２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４）を実験開始時に１μＭの濃度でウェルに添加して増殖の阻害を上記のように測定した。

【0476】

結果
表ＩＸに報告された結果は、試験した２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４ＤＭ４コンジュゲートはすべて、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の成長を阻害するのに、ｈｕ２Ｈ１１Ｒ３５Ｒ７４−Ｐｅｇ４−ＡｃＮＨ−ＤＭ４と同じくらい強力であることを示唆した。

【0477】

［実施例１３］
ＳＣＩＤメスマウスにおける結腸腺癌Ｌｏｖｏに対する２ｈ１１−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍活性についての異なるリンカーの評価
物質および方法
コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価のために、動物の体重を毎日測定し、腫瘍をカリパスにより週２回測定した。腫瘍の重量は、塊体（ｍｇ）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）^２］／２の式を使用して計算した。抗腫瘍活性の評価は、最大非毒性用量（ＨＮＴＤ）にて行った。

【0478】

最下点（群の平均）において２０％体重減少（ｂｗｌ）または１０％以上の薬物死を産生する投薬量を過剰毒性投薬量と見なした。動物の体重は腫瘍の重量を含んでいた。主要有効性エンドポイントは、ΔＴ／ΔＣ、中央値回帰パーセント、部分および完全回帰（ＰＲおよびＣＲ）ならびに無腫瘍生存者（ＴＦＳ）である。

【0479】

各処置（Ｔ）および対照（Ｃ）の腫瘍体積の変化は、第１の処置日（ステージング日）の腫瘍体積を規定観察日の腫瘍体積から引くことによって、各腫瘍について計算する。中央値ΔＴを処置群について計算して、中央値ΔＣを対照群について計算する。次に比ΔＴ／ΔＣを計算して、パーセンテージとして表す：

【0480】

【数10】

用量は、ΔＴ／ΔＣが４０％未満であるときに治療的に活性であると、およびΔＴ／ΔＣが１０％未満であるときに非常に活性であると見なされる。ΔＴ／ΔＣが０未満である場合、用量は高度に活性であると見なされ、回帰パーセンテージに日付が付けられる（参考文献１）：
％腫瘍回帰は：規定の観察日の処置群における、第１の処置の第１日の腫瘍体積と比較した腫瘍体積減少％として定義する。特定の時点および各動物について、％回帰を計算する。次に群の中央値％回帰を計算する。

【0481】

【数11】

【0482】

部分回帰（ＰＲ）：回帰は、処置開始時の腫瘍体積の５０％にまで減少した場合には部分的として定義される。

【0483】

完全回帰（ＣＲ）：完全回帰は、腫瘍体積＝０ｍｍ^３のときに達成される（腫瘍体積が記録できないときに、ＣＲが考慮される。）。

【0484】

ＴＦＳ：無腫瘍は、研究の終了時に検出不能な腫瘍を有する動物として定義される（最終処置後＞１００日）

【0485】

結果
異なる切断不能なリンカーｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＡｃＮＨ−ＤＭ４、ｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ８−ＡｃＮＨ−ＤＭ４、ｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＡｃＮＭｅ−ＤＭ４、ｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−アリル−ＤＭ４およびｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５Ｒ７４−アセチル−ＤＭ４を有する抗体薬物２ｈ１１−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍活性は、メスＳＣＩＤに皮下移植された結腸Ｌｏｖｏ腫瘍に対する同じ用量のＤＭ４／ｋｇ ６００μｇを比較して評価した。対照群は未処置のままであった。用量を１ｋｇ当りのＤＭ４のマイクログラムで表した。コンジュゲートを静脈内（ＩＶ）注射により第１４日に投与した。

【0486】

単回投与スケジュールを使用して表Ｘに示すように、５つのコンジュゲートはすべて、ΔＴ／ΔＣ＜０を有するＬｏｖｏ腫瘍モデルに対する同じ高い活性および体重減少に対する同じ影響を示した（対照群において−１３．３％対処置群において−９．５％から１１．２％）。ｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＡｃＮＨ−ＤＭ４は、ＣＲを有せず、ｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−ＡｃＮＭｅ−ＤＭ４、ｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５Ｒ７４−アセチル−ＤＭ４、ｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ４−アリル−ＤＭ４およびｈｕ２Ｈ１１−Ｒ３５Ｒ７４−ＰＥＧ８−ＡｃＮＨ−ＤＭ４についてそれぞれ７２％、６９％、４１％および３３％の腫瘍回帰と比較して、８２％および１ＣＲの腫瘍回帰で最良の有効性を示した。

【0487】

【表7】

【0488】

【表8】

【0489】

【表9】

【0490】

【表10】

【0491】

【表11】

【0492】

【表12】

【0493】

【表13】

【0494】

【表14】

【0495】

【表15】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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