【0028】
合成フィターゼの特に好ましい実施形態は、任意の突然変異ではなく、変異体を特定するための変異体の番号を表す「PhV-[番号]」を有する、配列番号24に対し以下の修飾の累積合計の一つを有する:
PhV-001 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T A123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N D398E
PhV-002 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92A Q121T A123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N D398E
PhV-003 D2E A4E A6S F8Y N33M R67L K76N N78T D92A Q121T A123V T152G S164E A200N D258N M260I S261H N270Q H374N D398E
PhV-004 D2E A4E A6S F8Y N33M R67L K76N N78T D92N Q109N Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N D398E
PhV-020 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-031 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-048 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76I N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-053 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q121T A123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N
PhV-055 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q Q276N H374N
PhV-058 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-059 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N D398E
PhV-060 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q109N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q I300L N346G H374N
PhV-064 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-065 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92T Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-066 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92V Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-067 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-068 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92E Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-069 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92T Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-070 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92V Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q H374
N
PhV-072 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92E Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-073 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76I N78T D92N Q109N Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N
PhV-074 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76I N78T D92N Q109N Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N D398E
PhV-075 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92N Q109N Q121T A144E S164E A200N S217G D258N S261H N270Q I300L H374N
PhV-076 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N
PhV-077 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92E Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N
PhV-078 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92T Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N
PhV-079 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92V Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N
PhV-081 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T A123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N D398E
PhV-083 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q Q276N I300L H374N D398E
PhV-084 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q121T S136K S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-085 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76I N78T D92A Q109N Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N
PhV-088 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G T156G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N D398E
PhV-089 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N D398E
PhV-094 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q109N Q121T A123V T152G T156G S164E A200N D258N S261H N270Q Q276N I300L N346G H374N
PhV-095 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76I N78T D92N Q121T A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N D398E
PhV-096 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76I N78T D92A Q121T A123V S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-097 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q109N Q121T A123V Q159N S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-098 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R K76N N78T D92A Q121T S136K S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-099 D2E A4E A6S F8Y N33D K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-101 N33D K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N H374N
PhV-103 N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-104 N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-105 N33D D92N S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-106 N33D K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H H374N
PhV-107 N33D K76N N78T D92N Q121T S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-108 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N
PhV-109 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-110 N33D D92N Q121T T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-111 N33D D92A Q121T T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-112 S1- D2- T3Q A4G P5A N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-113 S1- D2- T3Q A4G P5A N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-114 A6D G7K F8M Q9K N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-115 N33D D92A Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-116 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-117 S1A D2S T3R A4N N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-118 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-119 N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-120 D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-121 S1- D2- T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-122 N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-123 D2E A4E A6S F8Y N33D D92N S164E A200N H374N
PhV-124 D2E A4E A6S F8Y N33D K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H H374N
PhV-125 N33D D92A Q121T A123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-126 N33D D92A Q121T A123V T152G S164E A200N D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-127 N33D D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-128 A4E A6S N33D D92N Q121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
PhV-129 N33D R67L D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-130 L16V N33D D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-131 K12R N33D D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-132 K12R L16V N33D D92N Q121T T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-133 N33D R67L D92N Q121T A123V T152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-134 N33D D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A166E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-135 N33D R67L D92N Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A166E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-136 N33D D92A Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A166E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N
PhV-137 N33D D92A Q121T T152G Q159N S164E A166E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N D398E
PhV-138 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G Q159N S164E A166E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N D398E
PhV-139 N33D D92N Q121T A144E T152G Q159N S164E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N
PhV-140 K12R N33D R67L D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N
PhV-141 L16V N33D R67L D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N
PhV-142 N33D R67L D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A166E A200N S217G D258N S261H N270Q H374N
PhV-143 N33D D92N Q121T A123V A144E T152G S164E A166E A200N S217G D258N S261H N270Q I300L H374N
PhV-144 N33D D92N I120L Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q I300L H374N
PhV-145 N33D D92N I120L Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q L371A H374N
PhV-146 N33D R67L D92N I120L Q121T A123V A144E T152G S164E A166E A200N S217G D258N S261H N270Q L371A H374N又は
PhV-147 N33D D92N I120L Q121T A123V A144E T152G S164E A200N S217G D258N S261H N270Q I300L L371A H374N。
【実施例】
【0047】
Hafnia属LU11047のフィターゼのクローニング
文献(Huang et al. (2006) A novel phytase with preferable characteristics from Yersinia intermedia. Biochem Biophys Res Commun 350: 884-889、Shi et al. (2008) A novel phytase gene appA from Buttiauxella sp. GC21 isolated from grass carp intestine. Aquaculture 275:70-75、及びWO2008116878(実施例1))に類似する方法で、変性オリゴHaf1090 5’-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3’(配列番号 1)及びHaf1092 5’-GGNGTRTTRTCNGGYTG-3’(配列番号 2)を用いて、アニーリング温度40℃〜50℃で、PCRを用いて、フィターゼを一連の腸内細菌において探索する。形成されるPCR産物を、同一のアニーリング条件下の、オリゴHaf1090 5’-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3’(配列番号1)及びHaf1091 5’-GCDATRTTNGTRTCRTG-3’(配列番号3)を用いるセミネステッド(semi-nested)PCRの鋳型として用いる。断片を、Hafnia属の菌株(Hafnia属LU11047)から単離し得る。単離された断片を、製造業者のインストラクションに従って、「TOPO TA Cloning(登録商標)Kit(Invitrogen)」によりサブクローニングし、その後、配列決定する。この部分配列から始めて、フィターゼの完全長配列をいわゆるTAIL-PCR法(Yao-Guang Liu and Robert F. Whittier (1995) Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking. Genomics 25, 674-681)により増幅する。この目的のため、以下のオリゴヌクレオチドを用いる。
【0048】
3'末端の増幅:
1.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’、配列番号4)及び
Haf1167(5’-CTTCGAGAGCCACTTTATTACCGTCG-3’、配列番号 5)
2.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’、配列番号 4)及び
Haf1168(5’-CCAATGTTGTGCTGCTGACAATAGG-3’、配列番号 6)
3.Haf1165(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’、配列番号 4)及び
Haf1169(5’-CCGAACTCATCAGCGCTAAAGATGC-3’、配列番号 7)
5'末端の増幅:
1.Haf1077(5’- CAWCGWCNGASASGAA-3’、配列番号 8)及び
Haf1170(5’- CGCAGTTTGACTTGATGTCGCGCACG-3’、配列番号 9)
2.Haf1077(5’- CAWCGWCNGASASGAA-3’、配列番号 8)及び
Haf1171(5’- GTCGCGCACGCCCTATATCGCCAAGC-3’、配列番号 10)
3.Haf1077(5’- CAWCGWCNGASASGAA-3’、配列番号 8)及び
Haf1172(5’- CTGCAAACCATCGCACACGCACTGG-3’、配列番号 11)。
【0049】
得られるDNA断片を「TOPO TA Cloning(登録商標)Kit(Invitrogen)」によりクローニングし、配列決定する。そのヌクレオチド配列は、Hafnia属LU11047のフィターゼをコードする配列番号12の遺伝子である。それに由来する配列番号13のアミノ酸配列は、WO200811678のHafnia alvei(ハフニア・アルベイ)フィターゼのフィターゼ配列と98%の同一性を有する。SignalP 2.0のソフトウェアを用いて、アミノ酸1〜33がシグナルペプチドであると予測される。従って、成熟酵素は34位のセリンから始まる。
【0050】
1.合成フィターゼFus5#2
フィターゼFus5#2のクローニング
Hafnia属LU11047の染色体DNAから、フィターゼの1〜1074塩基の断片(配列番号14)をPCRによる増幅する。ヌクレオチド1057〜1323を増幅するためのオリゴヌクレオチドは、Yersinia mollaretii ATCC43969の推定フィターゼ(又は酸性ホスファターゼ)のDNA配列であるNCBI Sequence ID ZP_00824387に由来する。これを、Yersinia mollaretii ATCC43969の染色体DNAから第二のフィターゼ断片(配列番号15)を増幅するために用いる。二つのフィターゼ断片の増幅において、用いるオリゴにより、Hafniaの断片の3'末端及びYersiniaの断片の5'末端の両方で、互いのフィターゼ断片に対し20bpの重複が生じる。この方法では、該二つの断片をPCR融合により組み合わせて、合成フィターゼFus5#2をコードする配列番号16のフィターゼ配列を得ることができる。該フィターゼに由来する配列番号17のアミノ酸配列では、SignalP 2.0のソフトウェアによりアミノ酸1〜33がシグナルペプチドになると予測される。成熟フィターゼFus5#2(配列番号18)は、配列番号19のヌクレオチド配列によりコードされる。
【0051】
E. coliの発現プラスミドにクローニングするために、NdeI制限切断部位を配列番号16のフィターゼDNA断片の5'末端に付加し、HindIII制限切断部位及び終止コドンを3'末端に付加する。このために追加的に必要な配列は、配列番号16のフィターゼを鋳型として用い、使用するプライマーを介してPCR反応により導入する。これらの切断部位を用いて、フィターゼをコードする遺伝子をE. coli 発現ベクターpET22b(Novagen)にクローニングする。NdeI制限切断部位を用いる事により、及び終止コドンを導入することにより、pelBシグナル配列をベクターから除き、プラスミドに存在する6×Hisタグのリードスルーが阻まれる。このようにして得られるプラスミドpFus5#2(配列番号20)を、E. coli BL21(DE3)株(Invitrogen)に形質転換する。
【0052】
フィターゼタンパク質の精製の改善のために、N末端6×Hisタグを有するフィターゼ変異体をクローニングする。6×Hisタグだけでなく、BamHI切断部位も導入し、かつ成熟フィターゼタンパク質をコードする配列番号19の配列のための鋳型として作用するセンスオリゴプライマーH6:5’-ctatggatccgcatcatcatcatcatcacagtgataccgcccctgc-3’(配列番号21)を用いて、PCR産物を増幅する。PCR産物の3'末端に、終止コドン及びNdeI制限切断部位を同じアンチセンスオリゴを用いて再度導入する。このようにして生じる断片を、BamHI/NdeIによりpET22bベクターにクローニングし、プラスミドpH6-Fus5#2(配列番号22)を得、これをE. coli BL21(DE3)に同様に形質転換する。この構築物の場合には、pET22bに含まれるpelBシグナル配列を、ペリプラズムへの輸送のために用いる。
【0053】
フィターゼアッセイ
フィターゼ活性をマイクロタイタープレートにおいて決定する。酵素サンプルを反応緩衝液(250mM酢酸Na、1mM CaCl
2、0.01%ツイーン20、pH5.5)において希釈する。10μLの酵素溶液を、37℃で1時間、140μLの基質溶液(反応緩衝液中に6mMフィチン酸Na(Sigma P3168)を含む)と共にインキュベートする。反応を、150μlのトリクロロ酢酸溶液(15% w/w)の添加により停止させる。遊離したリン酸を検出するために、20μlの反応停止した反応溶液を280μLの調製したばかりの呈色試薬(60 mM L-アスコルビン酸(Sigma A7506)、2.2 mMモリブデン酸アンモニウム四水和物、325 mM H
2SO
4)で処理し、50℃で25分間インキュベートし、その後820nmの吸光度を決定した。ブランク値のために、基質緩衝液自身を、37℃でインキュベートし、トリクロロ酢酸による反応停止後に10μLの酵素サンプルのみを添加する。呈色反応を、残りの測定と類似の方法で行う。遊離したリン酸の量は、既知濃度のリン酸溶液を用いる呈色反応の検量線により決定する。
【0054】
Escherichia coli(大腸菌)での発現
フィターゼ発現カセットを含むプラスミドを有するE. coli BL21(DE3)株を、アンピシリン(100mg/L)を補ったLB培地において37℃で増殖させる。フィターゼの発現を、0.6のOD(600nm)で、1mMのIPTGの添加により誘導する。4時間の誘導後、10%(v/v)の10×BugBuster溶液(Novagen)を添加し、混合物を15分間室温でインキュベートする。遠心後、上清をフィターゼ活性の決定の為に用いる。
【0055】
Niアフィニティークロマトグラフィーによる精製
6×Hisラベルしたフィターゼ変異体を精製するために、誘導されたフィターゼを発現するE. coli培養ブロスを300mM NaCl、(製造業者であるRoche Applied Scienceのインストラクションに従って)EDTAを含まないComplete
TMプロテアーゼインヒビター、及び10%(v/v)10×BugBuster溶液(Novogen)で処理し、混合物を室温で15分間インキュベートする。遠心後、上清を製造業者のインストラクションに従ってNi-NTAカラム/KIT(Qiagen)に結合させる。洗浄ステップ後の溶出を、冷たい溶出緩衝液(50mM酢酸Na緩衝液、300mM NaCl、500mMイミダゾール、1 mM CaCl
2)を用いて行う。タンパク質含量の決定の前に、サンプルを、透析によるpH 5.5の2mMクエン酸ナトリウムへの緩衝液交換に供する。
【0056】
Aspergillus niger(クロコウジカビ)での発現
フィターゼFus5#2をAspergillus nigerにおいて発現させるために、非コード3'-glaA領域に隣接する、A. nigerのグルコアミラーゼ(glaA)プロモーターの制御下にフィターゼ遺伝子を含む発現構築物を最初に調製する。この方法では、構築物はA. nigerの3'-glaA領域への挿入が意図される。細胞外タンパク質の分泌のために用いられるシグナル配列は、A. ficuumフィターゼのシグナル配列である。発現構築物の為に用いられるベースは、EP0635574B1においてより詳細に記載されるプラスミドpGBGLA-53(WO9846772ではpGBTOPFYT-1とも呼ばれる)である。当業者に公知のPCRベースのクローニング技術により、pGBGLA-53中の、アミノ酸配列ASRNQSSから始まる成熟フィターゼタンパク質をコードするA. ficuumフィターゼの遺伝子断片を、成熟Fus5#2フィターゼをコードする配列番号19の遺伝子断片に置換する。これにより、プラスミドpGLA53-Fus5#2(配列番号23)が生じる。生じるプラスミドからHindIIIを用いて単離される直線状発現カセットと、プラスミドpGBLA50(EP0635574B1)/pGBAAS-1(同じプラスミドのWO9846772での名前)から単離されるamdSマーカーカセットの、glaA欠損A. niger発現株への共形質転換、及びその後の振盪フラスコでのフィターゼの発現を、該二つの引用特許の明細書に記載されている通りに行う。培養上清におけるフィターゼ活性を、細胞の遠心除去後に毎日決定する。最大活性は3日目〜6日目の間に達成される。
【0057】
2.フィターゼFus5#2のフィターゼ変異体
フィターゼの変異体を、配列番号19の遺伝子配列のPCRによる突然変異により作製する。「Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit」(Stratagene)を、特異的突然変異を行うために用いる。配列番号19のコーディング配列全体、あるいはその一部のみでのランダム突然変異を、「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」(Stratagene)により行う。突然変異率は、用いる鋳型DNAの量により1-5個の突然変異の所望の量に設定する。複数の突然変異を、各突然変異の目標の組み合わせにより、又は幾つかの突然変異サイクルの連続的な実行により作製する。
【0058】
作製されるフィターゼ変異体を、フィターゼ活性及び温度安定性について、ハイスループットな能力を有するアッセイにおいて試験する。このために、pET22bベースの発現構築物による形質転換後に得られるE. coli BL21(DE3)クローンを、96ウェルマイクロタイタープレートにおいてLB培地(2%グルコース、100mg/Lアンピシリン)中でインキュベート(30°C、900 rpm、振盪機の可動域2 mm)する。誘導を、約0.5のOD(600 nm)において1 mM IPTGで4時間行う。その後、10%(v/v)の10×BugBuster溶液(Novogen)を添加し、混合物を15分間室温でインキュベートする。フィターゼ活性、及び20分の温度ストレス後の残効性を決定する。
【0059】
用語「配列番号24」は、配列番号18とは以下の突然変異:A89T D138N A142T H143Y N202S K207E A209Q H228Y K234V T242N Q244S D247K K251N Q256H T277A A279S H280N G283N S284P I286A A287T S288E R289S P290K S314G T320N F356I H413Qにより異なる、フィターゼ変異体を意味する。さらなる変異体の全て(表1を参照されたい)が、配列番号24をベースとするものと考えられ、配列番号24のアミノ酸配列位置に基づく修飾と関連して特徴づけられる。これらのフィターゼ変異体を、前記セクションに記載の手順と類似する方法でE. coli発現ベクターpET22b(Novagen)にクローニングし、その後、E. coli BL21(DE3)株により発現させる。さらに、Aspergillus nigerのための好適な発現構築物を、A. nigerへの形質転換後にフィターゼが発現され得るようにクローニングする。
【0060】
熱安定性(T50)の決定
熱不活性化曲線を記録するために、反応緩衝液(250mM酢酸Na、1mM CaCl
2、0.01%ツイーン20、pH 5.5)に希釈した酵素サンプルを、各温度で20分間加熱し、その後4℃まで冷却する。熱処理を経ていない参照サンプルを20分間室温で放置し、その後同様に4℃まで冷却する。熱による前処理の後に、サンプルの酵素活性をフィターゼアッセイにより決定する。参照サンプルの活性を100%に標準化する。様々なフィターゼ変異体の熱安定性を、いわゆるT
50値により特徴づける。T
50は、熱処理を経ていない参照サンプルと比べて、熱不活性化後に50%の残効性がまだ存在している温度を示す。℃で表される、二つのフィターゼ変異体の熱安定性の変化はそれぞれのT
50値の差に起因する。
【0061】
表1:フィターゼ変異体の℃における熱安定性(T
50)(
図1もまた参照されたい)。配列番号24中の変化は、[もとのアミノ酸][位置][新しいアミノ酸]の形態でそれぞれのアミノ酸の置換により特定される。この場合における記号「-」は、該当アミノ酸の欠失を示す。アミノ酸の位置の番号は、常に配列番号24に関する。
【0062】
【0063】
pHプロフィールの決定
pHプロフィールを決定するために、希釈塩酸を用いてpH値1.5〜7の範囲にした、改変反応緩衝液(100mM酢酸Na、100mMグリシン、100mMイミダゾール、1mM CaCl
2、0.01%ツイーン20)を、フィターゼアッセイのために用いる。相対活性を決定するために、pH5.5で測定された活性を100%に設定する。結果を表2及び3に示す。
【0064】
表2:幾つかのフィターゼ変異体のpHプロフィール。フィターゼをA.nigerで発現させ、培養上清から直接測定する。フィターゼ活性を、pH5.5で決定した活性の相対値として%で示す(
図2Aを参照されたい)。
【0065】
表3:幾つかのフィターゼ変異体のpHプロフィール。フィターゼを大腸菌で発現させ、Niアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。フィターゼ活性を、pH5.5で決定した活性の相対値として%で示す(
図2Bを参照されたい)。
【0066】
pH2での安定性の決定
pH2での安定性を決定するために、フィターゼサンプルを緩衝液(250mMグリシン、3mg/mL BSA、pH2)において30U/mLまで希釈する。サンプルを37℃で30分間インキュベートする。その後、サンプルを直接、反応緩衝液(250mM酢酸Na、1mM CaCl
2、0.01%ツイーン20、pH5.5)でフィターゼ活性決定の最適測定範囲(約0.6 U/mL)まで希釈し、フィターゼ活性を測定する。参照のために、サンプルを同時に30U/mLの濃度で反応緩衝液において37℃で30分間インキュベートし、フィターゼ活性を同様に分析する。pHストレスを与えたサンプルの活性を、100%の安定性として設定する参照値により標準化する。Natuphos(登録商標)(BASF)を、市販のフィターゼとの比較の為に、アッセイにおいて同様に用いる。
【0067】
表4:幾つかのフィターゼ変異体、並びにフィターゼFus5#2及び市販のフィターゼNatuphos(登録商標)のpH2での安定性の決定。>90%の安定性を有するサンプルを、「安定」として表す。不安定なサンプル間のより段階的な区別のためには、測定された安定性を%で示す。
【0068】
ペプシンに対する安定性の決定
ペプシンに対する安定性を決定するために、ペプシンを含む緩衝液(250mMグリシン、3mg/mL BSA、pH2、10 mg/mLペプシン(Sigma P-7000、445U/mg))においてフィターゼサンプルを30U/mLまで希釈する。サンプルを37℃で30分間インキュベートする。その後、サンプルを直接、反応緩衝液(250mM酢酸Na、1 mM CaCl
2、0.01%ツイーン20、pH5.5)でフィターゼ活性決定の最適測定範囲(約0.6U/mL)まで希釈し、フィターゼ活性を決定する。参照のために、サンプルを同時に30U/mLの濃度でpH5.5の反応緩衝液において37℃で30分間インキュベートし、フィターゼ活性を同様に分析する。ペプシン処理したサンプルの活性を100%の安定性として設定する参照値により標準化する。Natuphos(登録商標)(Natuphos(登録商標) 10000L、BASF)を、市販のフィターゼとの比較の為に、同様にアッセイにおいて用いる。
【0069】
表5:幾つかのフィターゼ変異体、並びにフィターゼFus5#2及び市販のフィターゼNatuphos(登録商標)のペプシンへの安定性の決定。>80%の安定性を有するサンプルを、「安定」として表す。不安定なサンプル間のより段階的な区別のためには、測定された安定性を%で示す。