特許 5954315 変異体および該変異体の培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5954315

(24)【登録日】2016年6月24日

(45)【発行日】2016年7月20日

(54)【発明の名称】変異体および該変異体の培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20160707BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20160707BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12N1/19

【請求項の数】8

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2013-500987(P2013-500987)

(86)(22)【出願日】2012年2月16日

(86)【国際出願番号】JP2012053706

(87)【国際公開番号】WO2012114978

(87)【国際公開日】20120830

【審査請求日】2014年9月30日

(31)【優先権主張番号】特願2011-34964(P2011-34964)

(32)【優先日】2011年2月21日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、グリーン・サステイナブルケミカルプロセス基盤技術開発／研究開発項目４「化学品原料の転換・多様化を可能とする革新グリーン技術の開発／バイオマスを原料とした有機酸の高効率製造方法開発とその品種展開の研究開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】000000044

【氏名又は名称】旭硝子株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100094400

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 三義

(74)【代理人】

【識別番号】100106057

【弁理士】

【氏名又は名称】柳井 則子

(72)【発明者】

【氏名】竹川 薫

(72)【発明者】

【氏名】原 太志

(72)【発明者】

【氏名】東田 英毅

(72)【発明者】

【氏名】熊谷 博道

【審査官】 上條 肇

(56)【参考文献】

【文献】 KOTA J. et al.，Specialized membrane-localized chaperones prevent aggregation of polytopic proteins in the ER.，J.Cell Biol.，２００５年，Vol.168, No.1，p.79-88

【文献】 TANAKA N. et al.，Cell surface galactosylation is essential for nonsexual flocculation in Schizosaccharomyces pombe.，J.Bacteriol.，１９９９年，Vol.181, No.4，p.1356-1359

【文献】 ANDREISHCHEVA E.N. et al.，Five genes involved in biosynthesis of the pyruvylated Galbeta1,3-epitope in Schizosaccharomyces pom，J.Biol.Chem.，２００４年，Vol.279, No.34，p.35644-35655

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

Ｃ１２Ｎ １／１９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＧｅｎｅＣａｒｄｓ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、遺伝子工学的方法により、外来のｇｓｆ２遺伝子を組み込み、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１をコードする遺伝子を欠失する、若しくは該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異を導入することを特徴とする非性的に凝集する性質を有する変異体の製造方法。

【請求項2】

外来のｇｓｆ２遺伝子が組み込まれており、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１をコードする遺伝子が欠損している、若しくはピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異が導入されていることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）変異体。

【請求項3】

前記外来のｇｓｆ２遺伝子が、シゾサッカロミセス・ポンベが本来有するｇｓｆ２遺伝子である、請求項２に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。

【請求項4】

前記外来のｇｓｆ２遺伝子が、遺伝子工学的方法により宿主の染色体に組み込まれている、請求項２または３に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。

【請求項5】

ｐＨ２．０〜４．０において、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオン、および亜鉛イオンからなる群より選択される１種以上の陽イオンに依存して非性的に凝集する性質を有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。

【請求項6】

カルシウムイオン含有乳酸緩衝液（８０ｍＭ 乳酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム、ｐＨ２．０）中で非性的に凝集する性質を有し、乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、該カルシウムイオン含有乳酸緩衝液中における沈降速度が２．０ｍ／ｈ以上である、請求項２〜５のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。

【請求項7】

乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、前記カルシウムイオン含有乳酸緩衝液における沈降速度が６．０ｍ／ｈ以上である、請求項６に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体。

【請求項8】

請求項２〜７のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体を、ｐＨ５以下で培養することを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベ変異体の培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、酸性条件下でも非性的凝集性を有するシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）変異体、および該シゾサッカロミセス・ポンベ変異体の培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

酵母を宿主とした発現系を利用して、タンパク質および有機酸等の有用成分を製造する技術が開発されている。該発現系において酵母によって製造された有用成分を精製するためには、一般的に、遠心分離法等の固液分離処理によって酵母と培養液を分離する工程を要する。非性的凝集性（非性的に凝集する性質）を有する酵母は、培養終了後の培養液から凝集した酵母菌体と培養液とを容易に分離できるため、前記発現系においては、非性的凝集性を有する酵母を宿主とすることが好ましい。

【0003】

非性的凝集性を有する酵母としては、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてＦＬＯ変異株が知られている。また、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（以下、Ｓ．ポンベともいう）でも、非性的凝集性を有する変異株も報告されている（特許文献１）。

【0004】

Ｓ．ポンベは、出芽酵母とは系統進化的にきわめて異なる酵母であり、細胞増殖機構、染色体構造、ＲＮＡスプライシング機構、糖蛋白質糖鎖へのガラクトース残基の付加等の諸性質が複雑で動物細胞と類似している利点がある。そのため、前記発現系の良き宿主として近年注目されてきている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０００−１０６８６７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

酵母の培養中に、培養液のｐＨが酸性にシフトしてしまうことがある。特に、前記発現系において、有機酸または分泌性の酸性蛋白質を大量に合成させた場合には、培養終了時の培養液のｐＨが２〜４の酸性となる場合が多い。このため、たとえばｐＨ５以上の比較的ｐＨの高い培養液中では凝集性を有するが、ｐＨ２〜４の酸性条件下では凝集しない場合には、酵母を凝集させるために、培養終了後にｐＨを中性付近に調整する中和処理を行わなくてはならない。

【0007】

特許文献１に記載の酵母は、非性的凝集性を有するＳ．ポンベ変異株であり、前記発現系の宿主として好適と考えられる。しかし、該Ｓ．ポンベ変異株は、ＹＰＤ培地（通常、ｐＨ５．６〜６．０）中で非性的に凝集することが確認されているものの、酸性条件下でも充分な凝集性を有しているか否か、不明である。

【0008】

そこで本発明では、ｐＨ２〜４の酸性条件下でも充分な凝集性を有するＳ．ポンベ変異体、および該Ｓ．ポンベ変異体の培養方法の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明のＳ．ポンベ変異体は、外来のｇｓｆ２遺伝子が組み込まれており、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１をコードする遺伝子が欠損している、若しくはピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異が導入されていることを特徴とする。
本発明のＳ．ポンベ変異体においては、前記外来のｇｓｆ２遺伝子は、シゾサッカロミセス・ポンベが本来有するｇｓｆ２遺伝子であることが好ましい。また、外来のｇｓｆ２遺伝子は、遺伝子工学的方法により宿主の染色体に組み込まれていることが好ましい。
また、本発明のＳ．ポンベ変異体は、ｐＨ２．０〜４．０において、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオン、および亜鉛イオンからなる群より選択される１種以上の陽イオンに依存して非性的に凝集する性質を有することが好ましい。
さらに、本発明のＳ．ポンベ変異体は、カルシウムイオン含有乳酸緩衝液（８０ｍＭ 乳酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム、ｐＨ２．０）中で非性的に凝集する性質を有し、乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、該カルシウムイオン含有乳酸緩衝液中における沈降速度が２．０ｍ／ｈ以上であることが好ましい。前記沈降速度は、６．０ｍ／ｈ以上であることが好ましい。

【0010】

また、本発明の非性的に凝集する性質を有する変異体の製造方法は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、遺伝子工学的方法により、外来のｇｓｆ２遺伝子を組み込み、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１をコードする遺伝子を欠失する、若しくは該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異を導入することを特徴とする。

【0011】

さらに、本発明のシゾサッカロミセス・ポンベ変異体の培養方法は、本発明のＳ．ポンベ変異体を、ｐＨ５以下で培養することを特徴とする。

【発明の効果】

【0012】

本発明のＳ．ポンベ変異体は、ｐＨ２〜４の酸性条件下でも充分な非性的凝集性を有している。このため、該Ｓ．ポンベ変異体を用いた本発明の培養方法により、培養終了時の培養液のｐＨが５以下になる場合であっても、アルカリによる中和を必要とせずに、酵母同士の凝集を利用して容易に酵母菌体と培養液とを分離できる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】例１において、各ｐＨ条件下の変異体の凝集の有無を示す写真図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明において、「非性的凝集性」とは、Ｓ．ポンベが本来有する性的に凝集する性質（性的凝集性）とは異なる凝集性を有する性質をいう。しかし、本来有する性的凝集性が失われていることを意味するものではない。また、「構成的凝集性」とは非性的凝集性と同一の性質をいうが、特に増殖過程において増殖と同時に（非性的に）凝集する性質を指していう。

【0015】

本発明において、「Ｇｓｆ活性」とは、Ｓ．ポンベが通常培養されるｐＨ（例えば、ｐＨ５〜６）において示される非性的凝集性を意味する。また、Ｇｓｆ活性に関連する遺伝子を凝集素遺伝子という。
ｇｓｆ２遺伝子は、Ｓ．ポンベにおいては凝集素遺伝子である。Ｓ．ポンベのｇｓｆ２遺伝子の正式名称はＳＰＣＣ１７４２．０１である。
Ｐｖｇ１は、ピルビン酸転移酵素である。Ｓ．ポンベのＰｖｇ１をコードするｐｖｇ１遺伝子の正式名称はＳＰＡＣ８Ｆ１１．１０ｃである。

【0016】

なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、サンガー研究所のデータベース「ＧｅｎｅＤＢ」に「Schizosaccharomyces pombe Gene DB（http://www.genedb.org/genedb/pombe/）」として、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは上記データベースから遺伝子名または系統名で検索して、入手できる。

【0017】

本発明のＳ．ポンベ変異体は、Ｓ．ポンベの遺伝子の少なくとも一部が改変された結果、Ｇｓｆ活性が増大しており、かつピルビン酸転移酵素Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活している変異体である。Ｓ．ポンベにおいて、Ｇｓｆ活性が増大し、かつＰｖｇ１の酵素活性が低下または失活すると、ｐＨ２〜４において非性的に凝集する形質が獲得される。以下、「ｐＨ２〜４において非性的に凝集する性質」を、耐酸性非性的凝集性ともいう。すなわち、本発明のＳ．ポンベ変異体は、耐酸性非性的凝集性を獲得した変異体である。

【0018】

Ｓ．ポンベは本来フェロモンで誘導される性的凝集性を有する。たとえば、増殖過程において栄養不足をきたすと性的凝集を生じやすい。しかし、タンク培養等による人工的大量培養においては通常充分な量の栄養を有する培養液中で培養が行われることより性的凝集を起こすことは少ない。一方、本発明のＳ．ポンベ変異株は非性的凝集性を有すため、充分な量の栄養を有する培養液中で培養が行われても、増殖とともに凝集（構成的凝集）を起こす。

【0019】

Ｓ．ポンベのＧｓｆ活性は、例えば、ｇｓｆ２遺伝子の発現量を増大させることにより、増大させられる。また、Ｓ．ポンベのＰｖｇ１の酵素活性は、Ｐｖｇ１をコードするｐｖｇ１遺伝子を欠失する、若しくは該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異を導入することにより、低下または失活させられる。このため、本発明のＳ．ポンベ変異株は、遺伝子工学的方法により、野生株等の耐酸性非性的凝集性を有さないＳ．ポンベを宿主とし、遺伝子工学的方法により、外来のｇｓｆ２遺伝子を組み込み、かつＰｖｇ１をコードする遺伝子を欠失する、若しくは該遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下若しくは失活する変異を導入することで製造できる。

【0020】

ｇｓｆ２遺伝子の発現量は、遺伝子工学的方法で外来のｇｓｆ２遺伝子を組み込むことにより、増大させられる。また、ｍｂｘ２遺伝子を過剰発現させることよりｇｓｆ２遺伝子の発現量を増大させることもできる。Ｍｂｘ２遺伝子（ｐｖｇ４遺伝子の別名）は他の遺伝子の転写を制御する転写活性化因子と考えられ、ｇｓｆ２遺伝子はこの転写活性化因子によりその発現が制御さていると考えられる。
宿主にｇｓｆ２遺伝子を新たに導入することが好ましく、導入されるｇｓｆ２遺伝子は、宿主の内在性のｇｓｆ２遺伝子と同種であってもよく、異種生物由来のｇｓｆ２遺伝子であってもよい。なお、宿主に内在するｇｓｆ２遺伝子と同一のｇｓｆ２遺伝子を遺伝子工学的方法で宿主に組み込む場合、組み込む当該ｇｓｆ２遺伝子も本発明においては外来のｇｓｆ２遺伝子という。

【0021】

遺伝子工学的方法で宿主にｇｓｆ２遺伝子を導入する方法としては公知の方法を使用できる。Ｓ．ポンベを宿主としてこれに外来の構造遺伝子を導入する方法としては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、国際公開第９５／０９９１４号、特開平１０−２３４３７５号公報、特開２０００−２６２２８４号公報、特開２００５−１９８６１２号公報、国際公開第２０１０／０８７３４４号等に記載の方法を使用できる。

【0022】

ｇｓｆ２遺伝子はＳ．ポンベの染色体に導入することが好ましい。染色体にｇｓｆ２遺伝子を導入することにより継代の維持安定性に優れた形質転換体が得られる。また、ｇｓｆ２遺伝子は染色体に複数導入することもできる。ｇｓｆ２遺伝子を複数導入することにより、ｇｓｆ２遺伝子の発現効率を高めることができる。本発明のＳ．ポンベ変異体において、染色体に組み込まれたｇｓｆ２遺伝子の数は１〜２０が好ましく、特に１〜８が好ましい。

【0023】

染色体にｇｓｆ２遺伝子を導入する方法としては公知の方法を使用できる。たとえば、前記特開２０００−２６２２８４号公報に記載の方法で染色体にｇｓｆ２遺伝子を複数導入できる。また、この方法で染色体にｇｓｆ２遺伝子を１個導入することもできる。また、後述のように、染色体の複数の箇所に１個または複数のｇｓｆ２遺伝子を導入することもできる。
ｇｓｆ２遺伝子をＳ．ポンベの染色体に導入する方法としては、ｇｓｆ２遺伝子を有する発現カセットと組換え部位とを有するベクターを用い、相同組換え法により導入する方法が好ましい。

【0024】

ベクターは、ｇｓｆ２遺伝子を有する発現カセットと組換え部位を有する。
発現カセットとは、Ｇｓｆ２を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、ｇｓｆ２遺伝子とＳ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターを含む。さらに、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、ｇｓｆ２遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、栄養要求性相補マーカーを含む発現カセットである。発現カセットには複数のｇｓｆ２遺伝子が存在していてもよい。発現カセット中のｇｓｆ２遺伝子の数は１〜８が好ましく、１〜５がより好ましい。

【0025】

Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターは、ｐＨ２〜４の酸性条件下においても形質転換により得られる変異体内で機能してＧｓｆ２の発現を維持できるものであればよい。Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）またはＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーター等）を使用できる。プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照）等が挙げられる。Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーター等が挙げられる。該プロモーターのうち、発現効率が良好なｎｍｔ１遺伝子プロモーターおよびその改変プロモーター（たとえば、ｎｍｔ１^＋、ｎｍｔ４１）、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。

【0026】

Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するターミネーターまたはＳ．ポンベが本来有しないターミネーターを使用できる。ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
ターミネーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。

【0027】

ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定できる。
前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。このような組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
組換え部位の長さ（塩基数）は、２０〜２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。

【0028】

ベクターは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域、抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）等が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、上記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターであり、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。

【0029】

ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる。
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００−２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
また、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号、特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターおよびその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。

【0030】

ベクターを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体に組み込まれるベクターを２箇所以上にできる。また、発現かセット中のｇｓｆ２遺伝子を複数とした場合には、標的部位の１箇所に複数のｇｓｆ２遺伝子を組み込むことができる。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。該方法で、Ｓ．ポンベの染色体に複数のｇｓｆ２遺伝子を組み込むことができ、これにより乳酸脱水素酵素の発現量を増大させ、乳酸の生産性を向上させることができる。

【0031】

１箇所の標的部位に発現カセットを組み込む場合、たとえば特開２０００−２６２２８４号公報に記載の方法記載の標的部位を使用できる。異なる組込み部位を有する２種以上のベクターを用いて、異なる標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができる。しかし、染色体の２箇所以上にベクターを組み込む場合、この方法は煩雑である。

【0032】

染色体中に複数箇所存在する互いに実質的に同一の塩基配列部分を標的部位として、この複数箇所の標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができれば、１種類のベクターを使用して染色体の２箇所以上にベクターを組み込むことができる。互いに実質的に同一の塩基配列とは、塩基配列の相同性が９０％以上であることを意味する。標的部位同士の相同性は９５％以上であることが好ましい。また、互いに実質的に同一である塩基配列の長さは、前記ベクターの組換え部位を包含する長さであり、１０００ｂｐ以上であることが好ましい。１箇所の標的部位に複数のｇｓｆ２遺伝子が組み込まれている場合に比較して、ｇｓｆ２遺伝子の組み込み数が同一であっても、複数存在する標的部位にｇｓｆ２遺伝子が分散して組み込まれている場合には、形質転換体が増殖する際にｇｓｆ２遺伝子が染色体から１度に脱落することが少なくなり、形質転換体の継代における維持安定性が向上する。

【0033】

染色体中に複数箇所存在する標的部位としては、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２が好ましい。Ｔｆ２は、Ｓ．ポンベの３本（一倍体）の染色体それぞれに合計１３箇所存在するトランスポゾン遺伝子であり、長さ（塩基数）は約４９００ｂｐであり、それらの遺伝子間における塩基配列相同性は９９．７％であることが知られている（下記文献参照）。
Nathan J. Bowen et al, “Retrotransposons and Their Recognition of pol II Promoters: A Comprehensive Survey of the Transposable Elements From the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe”, Genome Res. 2003 13: 1984-1997
染色体に１３箇所存在するＴｆ２の１箇所のみにベクターを組み込むことができる。この場合、２個以上のｇｓｆ２遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、２個以上のｇｓｆ２遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。また、Ｔｆ２の２箇所以上にベクターを組み込むことにより、２個以上のｇｓｆ２遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。この場合、２個以上のｇｓｆ２遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、さらに多くのｇｓｆ２遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。Ｔｆ２の１３箇所すべてにベクターが組み込まれると、形質転換体の生存や増殖に対する負荷が大きくなりすぎるおそれがある。１３箇所のＴｆ２の８箇所以下にベクターが組み込まれることが好ましく、５箇所以下にベクターが組み込まれることがより好ましい。

【0034】

遺伝子工学的方法により本発明のＳ．ポンベ変異株を製造する場合に宿主として使用するＳ．ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体は宿主の栄養要求性が消失する。この宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
たとえば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。

【0035】

通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの菌体当たりのｇｓｆ２遺伝子の発現量を調べ、該発現量がより多い変異体を選択する。また、それら選択した変異体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数および発現カセットの数を調べることができる。
染色体に組み込まれるベクターの数は組み込み条件等を調整することによりある程度は調整できるが、ベクターの大きさ（塩基数）および構造により、組み込み効率および組み込み数も変化すると考えられる。

【0036】

遺伝子工学的方法でｐｖｇ１遺伝子を欠損させる、またはｐｖｇ１遺伝子にＰｖｇ１の酵素活性が低下または失活する変異を導入することにより、宿主であるＳ．ポンベのＰｖｇ１の酵素活性を低下または失活できる。確実にＰｖｇ１の酵素活性を失活できるため、ｐｖｇ１遺伝子自身を染色体から欠損させることが好ましい。

【0037】

ｐｖｇ１遺伝子の欠失または失活は、公知の方法で行うことができる。たとえば、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｒｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号等に記載）を用いることによりｐｖｇ１遺伝子を欠失させることができる。
また、ｐｖｇ１遺伝子の塩基配列の一部に欠失、挿入、置換、付加を起こすことにより、該ｐｖｇ１遺伝子を失活させることもできる。該遺伝子の欠失、挿入、置換、付加による変異は、それらのいずれか１つのみを起こしてもよく、２つ以上を起こしてもよい。

【0038】

ｐｖｇ１遺伝子の一部に前記変異を導入する方法は、公知の方法を用いることができる。たとえば、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）、ＰＣＲを利用したランダム変異法（ピーシーアール・メソッズ・アプリケーション（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．）、１９９２年、第２巻、ｐ．２８−３３．）等が挙げられる。

【0039】

本発明のＳ．ポンベ変異株は、たとえば非性的凝集性を有しない通常のＳ．ポンベから人工的突然変異手段によっても取得できる。すなわち、非性的凝集性を有しないＳ．ポンベを突然変異処理し、処理されたＳ．ポンベから、野生株よりもＧｓｆ活性が増大しており、かつＰｖｇ１の酵素活性が低下または失活している菌を選択し、さらに選択された菌からＧｓｆ活性増大やＰｖｇ１の酵素活性の低下等が優性変異であるものを選択することにより作製できる。

【0040】

Ｓ．ポンベに対する突然変異処理は、ＥＭＳ（メタンスルホン酸エチル）等の突然変異誘発物質を用いてもよく、紫外線等の短波長の光を照射してもよい。また、突然変異処理後のＳ．ポンベからの耐酸性非性的凝集性を有する菌の選抜は、カルシウムイオン等の陽イオンの存在下で行ってもよい。

【0041】

Ｓ．ポンベのＧｓｆ活性は、沈降速度を指標として評価することができる。このため、突然変異処理されたＳ．ポンベを固体培地上で培養し、形成されたコロニーを適当な溶媒中に投入した場合に、野生株のコロニーよりも有意に早く沈降した（沈降速度が速い）場合には、該コロニーを形成する菌は、野生株よりもＧｓｆ活性が増大していると評価できる。野生株のコロニーと突然変異処理された菌のコロニーをほぼ同時に溶媒へ投入し、沈降の速さを比較してもよく、特定の条件における野生株の沈降速度を予め測定し、得られた結果から決定された閾値と、突然変異処理された菌のコロニーの沈降速度とを比較してもよい。コロニーの沈降試験に用いる溶媒は、酵母が生存可能な溶液であれば特に限定されるものではないが、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオン、および亜鉛イオンからなる群より選択される１種以上の陽イオンを含むバッファーであることが好ましい。例えば、乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、カルシウムイオン含有乳酸緩衝液（８０ｍＭ 乳酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム、ｐＨ６．０）中における沈降速度が１．０ｍ／ｈ以上である菌を、Ｇｓｆ活性が増大した変異株として選抜できる。

【0042】

たとえば、以下の操作により耐酸性非性的凝集株を得る事が出来る。まず、Ｓ．ポンベに対してＥＭＳを用いて突然変異を誘発した後、それらを単離し培養する。その後、上清を除去して回収された菌体を、乳酸−水酸化ナトリウム緩衝液（８０ｍＭ 乳酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム、ｐＨ２．０）に乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌとなるよう懸濁させ、沈降速度を測り、沈降速度が２．０ｍ／ｈを超える菌株を、耐酸性非性的凝集株として選択する。

【0043】

Ｇｓｆ活性が増大した変異体は、ｇｓｆ２遺伝子の発現量を指標として選抜することもできる。ｇｓｆ２遺伝子の発現量は、Ｓ．ポンベのｇｓｆ２遺伝子の発現量は、ＲＴ−ＰＣＲ、標識済みプローブを用いたノザンブロッティング等の遺伝子発現解析に通常用いられる測定方法により測定できる。

【0044】

Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活すると、細胞表層のピルビン酸の存在量が有意に低下する傾向がある。このため、Ｓ．ポンベのＰｖｇ１の酵素活性は、細胞表層ピルビン酸の存在量を指標として評価できる。すなわち、突然変異処理されたＳ．ポンベから、細胞表層ピルビン酸が欠失している菌を、Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活している変異体として選抜できる。

【0045】

細胞表層ピルビン酸の欠失変異体は、Andreishchevaらの方法（The Journal of biological chemistry 2004 Aug 20;279(34):35644-55）を参考にして作製できる。まず、ポンベに対してＥＭＳを用いて突然変異を誘発した後、それらを適切な液体培地で４８時間培養する。その後、培養物から陽電荷を帯びたＱ−セファロースを用いて吸着する菌体を取り除き、上清に残った菌体を回収する。該Ｑ−セファロースによる選別を何度か繰返した後、得られた培養液上清をプレートに塗布し、単離培養する事で、細胞表層ピルビン酸の欠失変異体が得られる。

【0046】

Ｐｖｇ１の酵素活性が低下または失活している変異体は、突然変異処理された各菌のＰｖｇ１の酵素活性を測定することによっても選抜できる。Ｓ．ポンベのＰｖｇ１の酵素活性は、標識した基質を用いた測定方法等、他の転移酵素の酵素活性の測定に通常用いられる測定方法により測定できる。

【0047】

本発明のＳ．ポンベ変異株は、遺伝子工学的方法と突然変異処理とを組み合わせて製造してもよい。例えば、突然変異処理によりｇｓｆ２遺伝子の発現量が増大した変異株に対して、遺伝子工学的方法によりＰｖｇ１の酵素活性を低下または失活させてもよく、突然変異処理によりＰｖｇ１の酵素活性が低下または失活した変異株に対して、遺伝子工学的方法によりｇｓｆ２遺伝子の発現量を増大させてもよい。遺伝子工学的方法によりＰｖｇ１の酵素活性を低下または失活させた変異体に対して突然変異処理を行い、ｇｓｆ２遺伝子の発現量が増大した変異株を選抜してもよい。

【0048】

本発明のＳ．ポンベ変異株は、耐酸性非性的凝集性を維持し得る限り、その他の遺伝子に変異を有していてもよく、さらに、染色体中または染色体外に外来の構造遺伝子が導入されていてもよい。

【0049】

本発明のＳ．ポンベ変異株が備える耐酸性非性的凝集性は、培養液中の酸の種類には影響されない。すなわち、培養液のｐＨを２〜４にたらしめている酸が乳酸、クエン酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸であろうと、塩酸および硫酸等の鉱酸であろうと、本発明のＳ．ポンベ変異株は非性的に凝集する。

【0050】

本発明のＳ．ポンベ変異株が備える非性的凝集性の強さは、たとえば、沈降速度を指標にできる。酵母の沈降速度は、たとえば、試験管等の透明な容器に分注した酵母菌体を懸濁処理後に静置して沈降を開始させた後、液表面から固液界面（沈降した酵母菌体と上清との界面）までの距離を沈降開始からの経過時間で除することにより、求められる。本明細書における沈降速度の単位ｍ／ｈは、１時間あたりのメートルで表わした距離をいう。

【0051】

本発明のＳ．ポンベ変異株は、カルシウムイオン含有乳酸緩衝液（８０ｍＭ 乳酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム、ｐＨ２．０）中で非性的に凝集する性質を有する。本発明のＳ．ポンベ変異株の該カルシウムイオン含有乳酸緩衝液中における沈降速度は、乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、２．０ｍ／ｈ以上であることが好ましく、４．０ｍ／ｈ以上であることがより好ましく、６．０ｍ／ｈ以上であることがさらに好ましい。

【0052】

また、本発明のＳ．ポンベ変異株は、カルシウムイオン含有乳酸緩衝液（８０ｍＭ 乳酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム、ｐＨ４．０）中で非性的に凝集する性質を有する。本発明のＳ．ポンベ変異株の該カルシウムイオン含有乳酸緩衝液中における沈降速度は、乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌの場合に、２．０ｍ／ｈ以上であることが好ましく、４．０ｍ／ｈ以上であることがより好ましく、８．０ｍ／ｈ以上であることがさらに好ましい。ｐＨ４．０における沈降速度が８．０ｍ／ｈ以上であることにより、ｐＨ４よりもさらに低いｐＨにおいても、充分な凝集性が示される。

【0053】

本発明のＳ．ポンベ変異株が備える耐酸性非性的凝集性は、カルシウムイオン、リチウムイオン、マンガンイオン、銅イオン、および亜鉛イオンからなる群より選択される１種以上の陽イオンに依存していてもよい。耐酸性非性的凝集性がカルシウムイオン等に依存する場合には、ＥＤＴＡ等のキレート剤を培養液に添加することにより、本発明のＳ．ポンベ変異株の凝集を阻害できる。

【0054】

本発明のＳ．ポンベ変異株が備える耐酸性非性的凝集性は、ガラクトースにより阻害される性質であってもよい。耐酸性非性的凝集性がガラクトースにより阻害される場合には、培養液中に最終濃度が５ｍＭ以上となるようにガラクトースを添加することにより、本発明のＳ．ポンベ変異株の凝集を阻害できる。

【0055】

本発明のＳ．ポンベ変異株は、酸性（たとえば、ｐＨ２〜４）条件下で強力な非性的凝集性を示す。このため、本発明のＳ．ポンベ変異株は、特に、酸性蛋白質および有機酸等を合成するための発現系の宿主として好適である。本発明のＳ．ポンベ変異株への外来の構造遺伝子の導入は、ｇｓｆ２遺伝子の導入と同様にして行える。

【0056】

本発明のＳ．ポンベ変異株を宿主として酸性蛋白質および有機酸等を大量製造するための形質転換体を作製し、該形質転換体をタンク培養等で培養した場合に、培養終了時に培養液のｐＨが２〜４となった場合でも、遠心分離、濾過等の固液分離処理や中和反応等を行うことなく、菌体を凝集させることができ、それにより菌体と培養液を容易に分離できる。なお、本発明のＳ．ポンベ変異株は、酸性条件下のみならず、弱酸性〜アルカリ性（たとえば、ｐＨ５〜１０）条件下でも非性的に凝集可能であってもよい。

【0057】

本発明のＳ．ポンベ変異株およびその形質転換体は、公知の酵母培養方法によって培養でき、たとえば振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。培養温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。培養時間は適宜決定できる。培養培地は、ＭＡ培地、ＥＭＭ培地、ＭＭ培地、ＹＥＳ培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地等の酵母の培養に通常用いられる培地またはそれらの改変培地を使用できる。

【実施例】

【0058】

以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。

【0059】

［例１］
＜ｇｓｆ２^＋株（ｇｓｆ２遺伝子発現増大株）の作製＞
Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３−９５１頁）に従い、Ｓ．ポンベのウラシル要求性株（ＡＲＣ０１０、遺伝子型：ｈ⁻ ｌｅｕ１−３２ ｕｒａ４−Ｄ１８、東京大学大学院理学系研究科附属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）にｎｍｔ４１プロモーターを含む遺伝子断片を導入し、形質転換した。形質転換後に得られた変異体を培養し、パルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行い、ｇｓｆ２遺伝子が組み込まれたことを確認した。ｎｍｔ４１プロモーターの情報はナショナルバイオリソースプロジェクトのホームページ（アドレス：http://yeast.lab.nig.ac. jp/nig/index.html）より入手できる。

【0060】

ｎｍｔ４１プロモーターを含む遺伝子断片は、以下の様に作製した。まず、ｎｍｔ４１プロモーターの５’−末端側にｇｓｆ２プロモーター配列とＵｒａ４配列とを含み、３’−末端側にｇｓｆ２−ＯＲＦを含む配列を鋳型とし、上記遺伝子断片をＰＣＲによって増幅した。

【0061】

＜Δｐｖｇ１ｇｓｆ２^＋株（ｐｖｇ１遺伝子欠損＋ｇｓｆ２遺伝子発現増大株）の作製＞
ｇｓｆ２^＋株をＬａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号に記載）に従って形質転換し、ｐｖｇ１遺伝子を削除したΔｐｖｇ１ｇｓｆ２^＋株を作製した。得られた変異体を培養し、パルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行い、ｐｖｇ１遺伝子が欠損したことを確認した。

【0062】

削除断片の作製には、Ｓ．ポンベの野生株であるＡＲＣ０３２株（遺伝子型：ｈ⁻、東京大学大学院理学系研究科附属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）よりＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により行った。より具体的には、削除断片をＵＰ領域、ＯＬ領域、およびＤＮ領域に分け、各領域のＤＮＡ断片をそれぞれＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって作製したのち、さらにそれらを鋳型として、同様のＰＣＲ法によって全長の削除断片を作製した。

【0063】

＜培養試験＞
得られた各変異体をロイシン含有ＭＡ液体培地に植菌して、温度３０℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２０時間培養した。培養後の菌体をＥＤＴＡ（１０ｍＭ）で洗浄した後、滅菌水でさらに洗浄した。洗浄後の菌体を９６ウェルプレートの２０ウェルに等量ずつ分注した。各ウェルに、ｐＨ２．０〜６．０のクエン酸バッファー（１００ｍＭ）、ｐＨ６．５〜８．０のＭＯＰＳバッファー（１００ｍＭ）、ｐＨ５．０または６．０のＥＤＴＡ含有クエン酸バッファー（１００ｍＭ クエン酸、１００ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．５〜１２．５のグリシンバッファー（１００ｍＭ）のいずれかを分注した。その後、全てのウェルに、最終濃度が１００ｍＭとなるように塩化カルシウムを添加し、菌体の凝集の有無を観察した。
図１に、各ウェルの写真を示す。この結果、ｐＨ２．０〜５．０では、Δｐｖｇ１ｇｓｆ２^＋株は酵母の凝集塊がウェルの底に沈殿しているのが観察されたのに対して、ｇｓｆ２^＋株はほとんど凝集が観察されなかった。ｐＨ５．５〜１２．５では、両株とも凝集が観察されたが、Δｐｖｇ１ｇｓｆ２^＋株のほうがｇｓｆ２^＋株よりもより凝集性が強かった。また、ＥＤＴＡ（１００ｍＭ）を含有させたバッファーでは、両株とも凝集は観察されず、両株の非性的凝集性がカルシウムイオン依存性であることが確認された。

【0064】

［例２］
＜沈降速度の測定＞
例１で得られたｇｓｆ２^＋株およびΔｐｖｇ１ｇｓｆ２^＋株、Ｓ．ポンベＡＲＣ０３２株（野生株）、並びに特許文献１に記載のＳ．ポンベＡＲＣ０２８株（非性的凝集性を有する変異株）について、ｐＨ２．０、４．０、６．０、および９．５の緩衝液、水、ガラクトース溶液、酢酸溶液、並びにＬ−乳酸溶液中における沈降速度をそれぞれ測定した。測定用溶液としては、ｐＨ２．０の乳酸−水酸化ナトリウム緩衝液（８０ｍＭ 乳酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム）、ｐＨ４．０の乳酸−水酸化ナトリウム緩衝液（８０ｍＭ 乳酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム）、ｐＨ６．０のクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（８０ｍＭ クエン酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム）、ｐＨ９．５のグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（８０ｍＭ グリシン、１００ｍＭ 塩化カルシウム）、塩化カルシウム水溶液（１００ｍＭ 塩化カルシウム）、ガラクトース溶液（１００ｍＭ ガラクトース、１００ｍＭ 塩化カルシウム）、酢酸溶液（８００ｍＭ 酢酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム）およびＬ−乳酸溶液（１Ｍ Ｌ−乳酸、１００ｍＭ 塩化カルシウム）を用いた。

【0065】

ＡＲＣ０３２株およびＡＲＣ０２８株は、ＹＥＳ固体培地で７２時間培養後、コロニーを５ｍＬのＹＥＳ液体培地に植菌して２４時間前培養した後、得られた前培養液を１００ｍＬのＹＥＳ液体培地に植菌して２４時間培養したものを、沈降速度の測定に用いた。
ｇｓｆ２^＋株およびΔｐｖｇ１ｇｓｆ２^＋株は、ロイシン含有ＭＡ固体培地で７２時間培養後、コロニーを５ｍＬのＥＭＭ液体培地に植菌して２４時間前培養した後、得られた前培養液を１００ｍＬのＥＭＭ液体培地に植菌して２４時間培養したものを、沈降速度の測定に用いた。
各株の培養物をＥＤＴＡ溶液（１００ｍＭ）で洗浄した後、乾燥菌体重量を測定した。菌体を水で洗浄した後、２倍希釈したときに乾燥菌体の濃度が３．６ｇ／Ｌとなるように、透明な試験管に高さ２５ｍｍまで分注した。その後、沈降速度の測定用溶液の２倍濃縮液をそれぞれ添加した。各試験管を充分に懸濁させた後静置して沈降を開始させた後、液表面から固液界面（沈降した酵母菌体と上清との界面）までの領域を９５％沈降済み領域とし、液表面から固液界面までの距離を沈降開始からの経過時間で除することにより沈降速度（ｍ／ｈ）を算出した。

【0066】

沈降速度の測定結果を表１に示す。また、表２に、ｐＨ６．０の時の沈降速度に対する、ｐＨ２．０、４．０、９．５における沈降速度の相対値を示す。この結果、ＡＲＣ０２８株は、ｐＨ９．５および６．０では沈降速度が８ｍ／ｈ以上であり、非常に強い凝集性を示したが、ｐＨ２．０では１ｍ／ｈ程度であり、凝集性が小さく、乳酸溶液では０．０７ｍ／ｈしかなく、ほとんど凝集しなかった。一方でｇｓｆ２^＋株は、ｐＨ４．０〜９．５ではいずれも２．５ｍ／ｈ程度であり、弱い凝集性を示した。また、ｐＨ６．０の沈降速度に対する相対沈降速度はｐＨ２〜９．５においていずれも７０％以上であり、ｐＨによる影響はあまり観察されなかった。しかし、ｐＨ２．０および酢酸バッファー中では、０．５未満でしかなく、ほとんど凝集しなかった。これに対してΔｐｖｇ１ｇｓｆ２^＋株では、ｐＨ２．０〜９．５ではいずれも６．０ｍ／ｈ以上であり、酸性条件下で充分な凝集性を示した。また、酢酸溶液およびＬ−乳酸溶液中でも４．５ｍ／ｈ以上であり、充分な凝集性を有していた。但し、ガラクトース溶液中では、ｇｓｆ２^＋株およびΔｐｖｇ１ｇｓｆ２^＋株はいずれも凝集が阻害されており、両株の非性的凝集性はガラクトースにより阻害されることが確認された。

【0067】

【表1】

【0068】

【表2】

【産業上の利用可能性】

【0069】

本発明のＳ．ポンベ変異体および該Ｓ．ポンベ変異体の培養方法は、酸性条件下でも強い凝集性を有するため、特に、酵母を利用した発現系の宿主として好適に用いることができる。
なお、２０１１年２月２１日に出願された日本特許出願２０１１−０３４９６４号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

【図1】