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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5958779
(24)【登録日】2016年7月1日
(45)【発行日】2016年8月2日
(54)【発明の名称】顕微鏡及び観察方法
(51)【国際特許分類】
G02B 21/06 20060101AFI20160719BHJP
【ＦＩ】
G02B21/06
【請求項の数】26
【全頁数】39
(21)【出願番号】特願2014-540879(P2014-540879)
(86)(22)【出願日】2013年10月9日
(86)【国際出願番号】JP2013077538
(87)【国際公開番号】WO2014057998
(87)【国際公開日】20140417
【審査請求日】2015年4月3日
(31)【優先権主張番号】特願2012-227503(P2012-227503)
(32)【優先日】2012年10月12日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000004112
【氏名又は名称】株式会社ニコン
(74)【代理人】
【識別番号】100098165
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 聡
(72)【発明者】
【氏名】嶽 文宏
【審査官】
堀井 康司
(56)【参考文献】
【文献】
特開平０７−３３５５２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平０８−２５０３９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平０８−１２４８３０（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０２Ｂ １９／００−２１／００
Ｇ０２Ｂ ２１／０６−２１／３６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
光源部から射出された光束の光路中に配置され、音波進行波が形成される進行波形成部と、前記進行波形成部から発生する複数の回折光の少なくとも一部の干渉による干渉縞を被観察面に形成する照明光学系とを有する照明装置と、
前記干渉縞が照射された前記被観察面の像を形成する結像光学系と、
前記結像光学系により形成された像を撮像する撮像素子と、
前記撮像素子により撮像された複数の像に基づいて、前記被観察面の像を得る演算部と
を備えることを特徴とする顕微鏡。
前記干渉縞が照射された前記被観察面の像を形成する結像光学系と、
前記結像光学系により形成された像を撮像する撮像素子と、
前記撮像素子により撮像された複数の像に基づいて、前記被観察面の像を得る演算部と
を備えることを特徴とする顕微鏡。
【請求項2】
前記光源部からパルス光が射出されることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項3】
前記光源部からの前記パルス光の射出と前記進行波形成部に形成される前記音波進行波の位相とを同期させる同期制御部を備えることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項4】
前記パルス光が前記進行波形成部に入射するタイミングを前記音波進行波に対して相対的に制御するタイミング制御部を備えることを特徴とする請求項２又は３に記載の顕微鏡。
【請求項5】
前記パルス光の繰り返し周波数は、前記音波進行波の周波数の１／Ｎ倍（Ｎは１以上の整数）であることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項6】
前記パルス光の繰り返し周波数は、前記音波進行波の周波数の整数倍であることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項7】
前記パルス光のうち所定タイミングのパルス光を選択するパルス光選択部を備えることを特徴とする請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項8】
前記進行波形成部から発生する複数の回折光のうち、少なくとも１つの回折光の位相を変調する位相変調部を備えることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項9】
前記進行波形成部は、前記照明光学系の光軸と直交する面内において互いに異なる複数の方向から音波進行波を形成可能な音響光学素子を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項10】
前記被観察面に形成される前記干渉縞の位相が互いに異なる複数の位相になったときに、それぞれ前記撮像素子によって前記結像光学系によって形成される像を検出させる撮像制御部を備えることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項11】
被観察面を観察する観察方法であって、
光源部から射出された光束の光路中に配置され、音波進行波が形成される進行波形成部から発生する複数の回折光の少なくとも一部の干渉による干渉縞を前記被観察面に形成し、
前記被観察面から発生する光から結像光学系を介して像を形成し、
前記結像光学系によって形成される像を検出し、
前記検出される複数の像に基づいて、前記被観察面の像を得ることを特徴とする観察方法。
光源部から射出された光束の光路中に配置され、音波進行波が形成される進行波形成部から発生する複数の回折光の少なくとも一部の干渉による干渉縞を前記被観察面に形成し、
前記被観察面から発生する光から結像光学系を介して像を形成し、
前記結像光学系によって形成される像を検出し、
前記検出される複数の像に基づいて、前記被観察面の像を得ることを特徴とする観察方法。
【請求項12】
前記光源部からパルス光が射出されることを特徴とする請求項１１に記載の観察方法。
【請求項13】
前記パルス光の射出に同期して前記音波進行波を形成することを特徴とする請求項１２に記載の観察方法。
【請求項14】
前記パルス光が前記進行波形成部に入射するタイミングを前記音波進行波に対して相対的に制御することを特徴とする請求項１２又は１３に記載の観察方法。
【請求項15】
前記パルス光の繰り返し周波数は、前記音波進行波の周波数の１／Ｎ倍（Ｎは１以上の整数）であることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項16】
前記パルス光の繰り返し周波数は、前記音波進行波の周波数の整数倍であることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項17】
前記パルス光のうち所定タイミングのパルス光を選択することを特徴とする請求項１６に記載の観察方法。
【請求項18】
前記複数の回折光のうち、少なくとも１つの回折光の位相を変調することを特徴とする請求項１１に記載の観察方法。
【請求項19】
前記被観察面に形成される前記干渉縞の位相が互いに異なる複数の位相になったときに、それぞれ撮像素子によって前記結像光学系によって形成される像を検出させることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の観察方法。
【請求項20】
前記パルス光の繰り返し周波数が、前記音波進行波の周波数のｍ倍（ｍは２以上の整数）になるように調整するために、
前記パルス光に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第１位相を検出し、
前記第１位相を検出してからｊ・ｍ（ｊは１以上の整数）パルス目の前記パルス光に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第２位相を検出し、
前記第１位相と前記第２位相との差を低減させるように、前記パルス光の繰り返し周波数又は前記音波進行波の周波数を調整することを特徴とする請求項１６に記載の観察方法。
前記パルス光に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第１位相を検出し、
前記第１位相を検出してからｊ・ｍ（ｊは１以上の整数）パルス目の前記パルス光に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第２位相を検出し、
前記第１位相と前記第２位相との差を低減させるように、前記パルス光の繰り返し周波数又は前記音波進行波の周波数を調整することを特徴とする請求項１６に記載の観察方法。
【請求項21】
前記パルス光の繰り返し周波数が、前記音波進行波の周波数と同じになるように調整するために、
前記パルス光に同期して前記被観察面に形成される干渉縞を複数回検出して積算し、
該積算された干渉縞のコントラストを高めるように前記パルス光の繰り返し周波数又は前記音波進行波の周波数を調整することを特徴とする請求項１５に記載の観察方法。
前記パルス光に同期して前記被観察面に形成される干渉縞を複数回検出して積算し、
該積算された干渉縞のコントラストを高めるように前記パルス光の繰り返し周波数又は前記音波進行波の周波数を調整することを特徴とする請求項１５に記載の観察方法。
【請求項22】
前記光源部から射出される光は連続光であり、
前記音波進行波の周波数のほぼｍ倍（ｍは２以上の整数）の周波数のトリガ信号に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第１位相を検出し、
前記第１位相を検出してからｊ・ｍ（ｊは２以上の整数）パルス目の前記トリガ信号に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第２位相を検出し、
前記第１位相と前記第２位相との差を低減させるように、前記トリガ信号の周波数を調整することを特徴とする請求項１１に記載の観察方法。
前記音波進行波の周波数のほぼｍ倍（ｍは２以上の整数）の周波数のトリガ信号に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第１位相を検出し、
前記第１位相を検出してからｊ・ｍ（ｊは２以上の整数）パルス目の前記トリガ信号に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第２位相を検出し、
前記第１位相と前記第２位相との差を低減させるように、前記トリガ信号の周波数を調整することを特徴とする請求項１１に記載の観察方法。
【請求項23】
前記パルス光に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第１位相と、前記第１位相を検出してからｊ・ｍ（ｊは１以上の整数）パルス目の前記パルス光に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第２位相との差を低減させるように、前記パルス光の繰り返し周波数又は前記音波進行波の周波数を調整する駆動信号を出力する調整部を備えることを特徴とする請求項３又は４に記載の顕微鏡。
【請求項24】
前記パルス光に同期して前記被観察面に形成される干渉縞を複数回検出して積算された干渉縞のコントラストを高めるように前記パルス光の繰り返し周波数又は前記音波進行波の周波数を調整する駆動信号を出力する調整部を備えることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡。
【請求項25】
前記光源部から射出される光は連続光であり、
前記音波進行波の周波数のほぼｍ倍（ｍは２以上の整数）の周波数のトリガ信号に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第１位相と、前記第１位相を検出してからｊ・ｍ（ｊは２以上の整数）パルス目の前記トリガ信号に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第２位相との差を低減させるように、前記トリガ信号の周波数を調整する駆動信号を出力する調整部を備えることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
前記音波進行波の周波数のほぼｍ倍（ｍは２以上の整数）の周波数のトリガ信号に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第１位相と、前記第１位相を検出してからｊ・ｍ（ｊは２以上の整数）パルス目の前記トリガ信号に同期して前記被観察面に形成される干渉縞の第２位相との差を低減させるように、前記トリガ信号の周波数を調整する駆動信号を出力する調整部を備えることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項26】
前記進行波形成部は、所定の方向の音波進行波を形成する音響光学素子であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、標本又は試料の被観察面を照明する照明技術、並びに標本又は試料を観察する顕微鏡及び観察技術に関する。【背景技術】
【0002】
近年、光学顕微鏡の解像限界を超えた顕微鏡法が複数提案され、それらは総称して超解像光学顕微鏡と呼ばれている。超解像光学顕微鏡の一種に、いわゆる構造化照明を用いる顕微鏡（構造化照明顕微鏡）がある。この顕微鏡は、標本又は試料の被観察面（標本面又は試料面）にストライプ状の縞パターン（構造化照明）を投影し、それにより励起された蛍光（あるいは散乱など標本から発する何らかの光）を撮像素子で取得する。超解像画像を構築するには、縞パターン（構造化照明）の位相の異なる複数の画像を取得する必要がある。それら複数画像を解析することで観察用の結像光学系の解像限界を超える超解像画像を取得するものである。また、２次元面内において超解像を実現するには、構造化照明の方位も変化させる必要がある。【0003】
構造化照明を標本面に投影することで、構造化照明の空間周波数と標本の空間周波数はモアレ縞を生成する。このモアレ縞には、低い空間周波数に周波数変換された、結像光学系の解像限界を超える標本の空間周波数情報が含まれる。そのモアレ縞の空間周波数が通常の結像光学系の解像限界の空間周波数より低ければ、その情報はその結像光学系で検出することができる。従って、そのモアレ縞の情報を含む画像を取得し、構造化照明の位相を変えて取得した複数の画像を用いて演算処理を行うことにより、超解像を実現することが可能となる（例えば、特許文献１参照）。【0004】
特許文献１には、構造化照明顕微鏡を蛍光観察へ適用した例が開示されている。特許文献１の方法では、可干渉光源から射出した光束を回折格子によって２つの光束に分割し、それら２つの光束を対物レンズの瞳上の互いに異なる位置へ個別に集光させる。このとき２つの光束は対物レンズから角度の異なる平行光束として射出し、標本面上で重なり合いストライプ状の干渉縞（構造化照明）を形成する。そして、特許文献１の方法では、構造化照明の位相をステップ状に変化させながら標本の画像を繰り返し取得し、取得した複数の画像に対して、標本の構造と回折格子のパターンとを分離する演算（分離演算）と、分離された複数の画像から超解像画像を復調する演算（復調演算）とを施している。【0005】
また、特許文献１の方法の応用として、標本面内の方向と深さ方向との双方に亘って超解像効果を得るために、干渉縞に寄与する光束を３光束化する技術が提案されている。３光束を利用すれば、構造化照明のストライプパターンを標本面内の方向だけでなく深さ方向にも発生させることができるからである。【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国特許第６２３９９０９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、構造化照明の位相をステップ状に変化させる従来の方法のうち、回折格子等の光学素子をステップ移動させる方法では、移動していた光学素子を適当な位置で静止させるのに一定の時間を要するため、必要な画像を全て取得するまでの時間（観察時間）を短縮することが難しい。特に、標本が生体標本である場合は、標本の構造が時々刻々と変化する可能性があるため、画像取得はできるだけ高速に行われることが望ましい。【0008】
また、従来の３光束を利用して標本面内の方向と深さ方向との双方に亘って超解像効果を得る方法では、前述した分離演算に必要な画像の枚数が多くなるので、画像取得を高速化する必要性は特に高いと考えられる。【0009】
本発明の態様は、このように事情に鑑み、構造化照明を行う場合にその位相を高速にかつ高精度に切り換えることができるようにすることを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第１の態様によれば、光源部から射出した光束の光路中に配置され、その射出した光束を横切る方向に音波進行波が形成される進行波形成部と、その進行波形成部から発生する複数の回折光による位置可変の干渉縞を被観察面に形成する照明光学系と、を備える照明装置が提供される。また、第２の態様によれば、被観察面を観察する顕微鏡であって、その被観察面を照明する第１の態様の照明装置と、その被観察面から発生する光による像を形成する結像光学系と、その結像光学系によって形成される像を検出する撮像素子と、その撮像素子で検出される複数の像の情報を処理してその被観察面の像を求める演算部と、を備える顕微鏡が提供される。
【0011】
また、第３の態様によれば、被観察面を照明する照明方法であって、光源部から光を射出し、射出された光束の光路中に配置され、その射出された光束を横切る方向に音波進行波が形成される進行波形成部から発生する複数の回折光による位相可変の干渉縞をその被観察面に形成する照明方法が提供される。【0012】
また、第４の態様によれば、被観察面を観察する観察方法であって、第３の態様の照明方法でその被観察面を照明し、その被観察面から発生する光から結像光学系を介して像を形成し、その結像光学系によって形成される像を検出し、その検出される複数の像の情報を処理してその観察面の像を求める観察方法が提供される。【発明の効果】
【0013】
本発明の態様によれば、音波進行波を形成する進行波発生部から発生する複数の回折光による干渉縞を構造化照明として使用できるため、構造化照明を行う場合にその位相を高速にかつ高精度に切り換えることができる。【図面の簡単な説明】
【0014】
【図2】進行波及びパルス光の周期の関係の一例を示す図である。
【図3】時間経過中の進行波とパルス光との位置関係の一例を示す図である。
【図4】（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ時点ｔ1及びｔ4において標本面に形成される構造化照明（干渉縞）を示す図である。
【図5】（ａ）は３位相の構造化照明を行う場合の進行波及びパルス光の周期の関係を示す図、（ｂ）は３つの時刻における進行波とパルス光との位置関係を示す図、（ｃ）は３つの時点に標本面に形成される構造化照明を示す図である。
【図6】（ａ）は５位相の構造化照明を行う場合の進行波及びパルス光の周期の関係を示す図、（ｂ）は５つの時刻における進行波とパルス光との位置関係を示す図、（ｃ）は５つの時点に標本面に形成される構造化照明を示す図である。
【図7】３方向に進行波を発生できるＡＯＭ（音響光学素子）を示す図である。
【図8】第２の実施形態に係る顕微鏡の要部を示す図である。
【図9】スイッチング原理を説明するための図である。
【図10】（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）はそれぞれ位相１モード、位相２モード、及び位相３モードにおける入力パルス光と出力パルス光との関係を示す図である。
【図11】（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）はそれぞれ位相１モード、位相２モード、及び位相３モードにおける出力パルス光と進行波との関係を示す図、（ｄ）は３つのモードでの標本面における構造化照明を示す図である。
【図12】（ａ）は第３の実施形態の位相１モードでのスイッチング部を示す図、（ｂ）は標本面での構造化照明を示す図である。
【図13】（ａ）は位相２モードでのスイッチング部を示す図、（ｂ）は標本面での構造化照明を示す図である。
【図14】（ａ）は位相３モードでのスイッチング部を示す図、（ｂ）は標本面での構造化照明を示す図である。
【図15】第４の実施形態に係る顕微鏡の要部を示す図である。
【図16】（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はそれぞれ位相１モード、位相２モード、及び位相３モードにおける入力パルス光と出力パルス光との関係を示す図、（ｄ）は３つのモードでの標本面における構造化照明を示す図、（ｅ）は図１６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の状態を実現するための、ＥＯＭ（電気光学素子）の印加電圧と時間の関係を示す図である。
【図17】（ａ）は第５の実施形態のＡＯＭの動作を説明する図、（ｂ）はＡＯＭの制御部を示す図である。
【図18】（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）はそれぞれ位相１モード、位相２モード、及び位相３モードにおける光パルスと進行波との関係及び構造化照明を示す図である。
【図19】（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）はそれぞれ第６の実施形態のレーザー光、ＡＯＭの駆動信号、及び撮像素子の撮像タイミングを示す図である。
【図20】（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）はそれぞれ位相１モード、位相２モード、及び位相３モードにおける連続光と進行波との関係及び構造化照明を示す図である。
【図21】第７の実施形態に係る顕微鏡の要部を示す図である。
【図22】（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）はそれぞれ＋１次光、−１次光、及び構造化照明等の位相の関係を示す図である。
【図23】（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ−１次光を位相変調したときの＋１次光、−１次光、及び構造化照明の関係を示す図である。
【図24】（ａ）、（ｂ）は画像とフーリエ変換像との対応関係を示す図、（ｃ）は逆フーリエ変換によって画像を復元する方法の説明図である。
【図25】照明方法及び観察方法の一例を示すフローチャートである。
【図26】第８の実施形態に係る顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図28】（ａ）はパルス光の繰り返し周波数とＡＯＭ内の進行波の周波数との同期の状態を示す図、（ｂ）は画像取得数と位相差との関係の一例を示す図である。
【図29】（ａ）は周波数の制御方法の一例を示すフローチャート、（ｂ）は周波数の制御方法の他の例を示すフローチャートである。
【図30】第９の実施形態に係る顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図31】（ａ）は周波数誤差の検出方法の説明に供する図、（ｂ）はＡＯＭ内の進行波の周波数と画像のコントラストとの関係の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
［第１の実施形態］本発明の第１の実施形態につき図１（ａ）〜図７を参照して説明する。図１（ａ）は、本実施形態に係る顕微鏡８の概略構成を示す。一例として、顕微鏡８は、構造化照明（詳細後述）を用いて蛍光観察を行う顕微鏡であり、顕微鏡８による観察対象物は、蛍光試薬で標識された標本１２（例えば細胞等の生体標本）である。標本１２は位置決め可能なテーブル（不図示）に保持され、標本１２の蛍光試薬が塗布された表面（標本面１２ａ）が被観察面である。
【0016】
図１（ａ）において、顕微鏡８は、標本面１２ａを照明する照明装置１０と、標本面１２ａから発生する蛍光ＬＦによる像を形成する結像光学系３６と、その像を検出するＣＣＤ型又はＣＭＯＳ型の２次元の撮像素子３８と、撮像素子３８で検出される複数の像の情報を記憶する記憶装置４２と、記憶装置４２から読み出した情報を処理して結像光学系３８の解像度を超える構造（超解像）を有する像の情報を求める演算装置４４と、を備えている。演算装置４４で求められた像は、一例として表示装置４６に表示される。【0017】
照明装置１０は、蛍光試薬を励起可能な波長域で可干渉性を持つ光パルスＬＢを射出する光源系１４と、射出された光パルスＬＢを回折する音波の進行波１９を発生する音響光学素子（Acousto-Optic Modulator: AOM）１８と、音響光学素子１８から発生する複数の回折光（例えば±１次光ＬＢ１，ＬＢ２又は０次光ＬＢ０及び±１次光ＬＢ１，ＬＢ２等）を標本面１２ａに導き、位相が可変の干渉縞よりなる構造化照明ＩＦを形成する集光光学系２０（照明光学系）と、を備えている。集光光学系２０の光軸をＡＸとする。以下、音響光学素子又は音響光学変調器をＡＯＭという。ＡＯＭ１８は、一例として、２酸化テルル、モリブデン酸鉛、又は水晶など光弾性を有する結晶の基板に、音波（超音波）を発生する圧電素子を付加したものである。照明装置１０は、光源系１４及びＡＯＭ１８の動作を制御する制御装置４０を備え、制御装置４０には例えば所定周波数の交流信号（周期的信号）を出力可能な信号発生器４１が接続されている。また、可干渉性を持つ光パルスＬＢとしては、ＹＡＧレーザーの２倍若しくは３倍高調波（波長３００〜５００ｎｍ程度）、又はパルス発振型の金属蒸気レーザー（波長４００〜５００ｎｍ程度）などのパルス発振されるレーザー光が使用できる。【0018】
また、光源系１４は、可干渉性を持つ光パルス（パルス光）ＬＢを発生するレーザー光源等の可干渉性光源１５Ａと、光パルスＬＢを伝送する光ファイバ１５Ｂと、光ファイバ１５Ｂの端部１５Ｂａから射出される光パルスＬＢをＡＯＭ１８の進行波１９が生成されている基板に入射させるレンズ１６とを有する。ＡＯＭ１８は、進行波１９によって音波の周波数で屈折率分布を生成するため、所定方向に移動する位相型の回折格子として機能する。光パルスＬＢとＡＯＭ１８との相互作用についての詳細は後述する。【0019】
ＡＯＭ１８によって回折を受けた光パルスＬＢによって０次光ＬＢ０、±１次光ＬＢ１，ＬＢ２、及びより高次の回折光（不図示）が発生する。これらの回折光は、レンズ２２により、マスク２４上で回折角に応じた位置（マスク位置）に集光される。マスク２４上での光軸ＡＸからの高さ（集光位置）をｙ、レンズ２２の焦点距離をｆ2、回折角をθとすると、ｙ＝ｆ2 sinθという関係式が成立する。マスク２４は所望の位置に結像する回折光のみを選択的に通過させるように構成されており、図１（ａ）の場合では±１次光ＬＢ１，ＬＢ２のみを通過させている。この場合、図１（ｂ）に示すように、マスク２４には１対の開口２４ａが形成されている。また、例えば光軸の回りに等角度間隔で設定される３つの方向に周期性を持つ構造化照明ＩＦを順次生成する場合には、ＡＯＭ１８を回転可能として、３対の開口２４Ａａ，２４Ａｂ，２４Ａｃが形成されたマスク２４Ａを使用してもよい。このマスク２４Ａは固定した状態でよいため、集光光学系２０が簡素化できる。ただし、余分な回折光や迷光が存在する場合はマスク２４を回転可能としてもよい。これは以下の３光束干渉の場合でも同様である。【0020】
マスク２４は、後述の第１対物レンズ３２の瞳面Ｐ１と共役な位置に配置されており、マスク２４を通過した複数の回折光が１対のレンズ２６，２８及び波長選択性を持つダイクロイックミラー３０を介して第１対物レンズ３２の瞳面Ｐ１（瞳）にリレーされている。従って、瞳面Ｐ１では図１（ａ）中の図Ａに示すような強度分布が形成される。ダイクロイックミラー３０は、光パルスＬＢ（回折光）を反射して標本面１２ａで発生する蛍光ＬＦを透過させるという波長選択性を持つ。瞳面Ｐ１に入射した複数の回折光は、第１対物レンズ３２によって標本面１２ａに集光され、標本面１２ａは、複数の回折光によって形成される干渉縞よりなる構造化照明ＩＦで照明される。標本面１２ａでは、構造化照明ＩＦによって励起された蛍光ＬＦが発生する。【0021】
レンズ２２、マスク２４、レンズ２６，２８、ダイクロイックミラー３０、及び第１対物レンズ３２より集光光学系２０が構成されている。集光光学系２０によって、ＡＯＭ１８の進行波１９の形成面と標本面１２ａとは光学的に共役となっている。なお、可干渉性光源１５Ａからの光パルスＬＢを伝送する光学系は、光ファイバ１５Ｂに限定されることはなく、複数のミラー等を介してパルス光に空間を伝播させる光学系でも良い。また、マスク２４での回折光の選択として±１次光のみを選択しているが、本実施形態はこの用途に限定されるものではない。さらに、０次光ＬＢ０も追加して、３光束干渉で構造化照明ＩＦを生成してもよい。３光束干渉で構造化照明ＩＦを生成することで、光軸方向にも超解像効果を持たせることができる。０次光及び±１次光を選択するマスクとしては、図１（ｂ）の一列に３個の開口２４Ｂａが形成されたマスク２４Ｂを使用できる。また、例えば光軸の回りに等角度間隔で設定される３つの方向に周期性を持つ構造化照明ＩＦを順次生成する場合には、ＡＯＭ１８を回転可能として、３対の開口２４Ｃａ，２４Ｃｂ，２４Ｃｃが形成されたマスク２４Ｃを固定した状態で使用してもよい。
【0022】
ここで、２光束干渉を用いた構造化照明を２光束モード、３光束干渉を用いた構造化照明を３光束モードと定義し、以下の説明ではこの定義を用いることとする。構造化照明ＩＦにより励起された標本１２の蛍光試薬は蛍光を発する。蛍光は等方的に発光するが、標本１２から発生した蛍光のうち、第１対物レンズ３２によって検出された蛍光ＬＦは、ダイクロイックミラー３０を透過して第２対物レンズ３４により撮像素子３８の受光面に標本面１２ａの像を形成し、この像が撮像素子３８によって撮像される。このときの画像は、構造化照明ＩＦの空間周波数と標本１２が持つ空間周波数とによって生成されるモアレパターンが混入した画像となっている。対物レンズ３２，４３及びダイクロイックミラー３０から結像光学系３６が構成されている。結像光学系３６に関して標本面１２ａと撮像素子３８の受光面とは光学的に共役となっている。制御装置４０は、駆動信号Ｓ１等を介してＡＯＭ１８及び可干渉性光源１５Ａを同期して駆動し、制御信号Ｓ４を介して撮像素子３８の撮像動作を制御する。
【0023】
このとき、制御装置４０が、撮像素子３８のフレームレートを光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrep に同期させることで、異なる縞位相の構造化照明ＩＦで励起された標本像を高速に（例えば繰り返し周波数ｆrepより数倍高速に）取得することができる。このタイミング同期についての詳細は後述する。構造化照明ＩＦの位相及び方位を変えて、超解像画像を生成するために必要な枚数の標本１２の画像を取得し、演算装置４４で所定の画像処理を施すことで、超解像画像を生成することができる。構造化照明ＩＦの位相変化の方法は、撮像素子３８と光パルスＬＢとのタイミングを同期する方法と合わせて後述する。構造化照明ＩＦの方位を変化させる方法についても後述する。
【0024】
次に、光パルスＬＢとＡＯＭ１８との相互作用について詳述する。本実施形態では、図２に示すように、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrep と、ＡＯＭ１８の進行波１９（音波）の周波数ｆAOM とを同期させる。ＡＯＭ１８は光弾性効果により、音波の周波数で屈折率分布の粗密を生成する。その屈折率分布の粗密は位相型の回折格子とみなすことができる。そして、進行波型のＡＯＭ１８ではその屈折率分布が時間によって変化する。つまり、空間を固定して時間を変化させると、時間によって屈折率の粗密が連続的かつ周期的に変化する。その屈折率分布変化の時間周期をＴとすると、Ｔ＝１／ｆAOMとなる。ＡＯＭ１８内の音速をｖとすると、ＡＯＭ１８内の音波によって形成される位相型の回折格子のピッチｐは、次のように、音波の速度ｖ及び音波の周波数ｆAOMによって決定される。 ｐ＝ｖ・Ｔ＝ｖ／ｆAOM (1)【0025】
ここで、図２のように、ｆrep ＝ｆAOMであるとすると、光パルスＬＢの繰返し周期も当然Ｔとなる。この場合、個々の光パルスＬＢがＡＯＭ１８に到達したときに、光パルスＬＢが感じる回折格子の位相は常に一定となる。すなわち、光パルスＬＢにとって回折格子は静止しているようにみえる。図２の１周期Ｔの間に等時間間隔で設定される時点t1,t2,t3,t4で発生する光パルスＬＢが、ＡＯＭ１８に入射したときの様子を図３に示す。時間が変わることによって、ＡＯＭ１８が生成する位相型回折格子（進行波１９）が光軸と垂直な方向にシフトしている。つまり、回折格子の位相が変化していることがわかる。時点t1とt4とは時間差がＡＯＭ１８の位相型回折格子の１周期の移動時間Ｔに等しいため、時点t1とt4における光パルスＬＢにとって回折格子の縞の位相は同一となる。なお、例えば時点t1で発生する光パルスＬＢとは、時点t1,t1＋Ｔ,t1＋２Ｔ，…で発生する一連の光パルスＬＢを含むものである。【0026】
ＡＯＭ１８の回折格子の形成面と標本面１２ａとは共役関係にあるため、標本面１２ａには回折格子の位相に応じた正弦波状の強度パターン（構造化照明ＩＦ）が生成される。図３の時点t1, t4の光パルスＬＢが標本面１２ａ上に生成する構造化照明のパターンを、図４（ａ）及び（ｂ）に示す。時点t1, t4における光パルスＬＢは、互いに全く同一の構造化照明を形成していることがわかる。このように、ＡＯＭ１８の進行波１９の周波数ｆAOMと光パルスＬＢの周波数ｆrepとを同期させることで、ＡＯＭ１８内で周波数ｆAOMで変化する回折格子を光パルスＬＢに対してあたかも静止させることができ、この場合には構造化照明ＩＦも静止する。そして、光パルスＬＢの位相を変えることで、光パルスＬＢがＡＯＭ１８内の回折格子に入射するタイミングを変えることができ、これにより回折格子の位相を変化させて、標本面１２ａ上に形成される構造化照明ＩＦの位相を変化させることができる。
【0027】
次に、構造化照明の縞位相を高速に可変する方法、及び光パルスＬＢの繰り返し周波数と撮像素子３８の撮像タイミングとの関係について説明する。ここで、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepを次のようにＡＯＭ１８の周波数ｆAOMの整数倍に設定する。ただし、ｍは整数である。ｆrep ＝ｍ・ｆAOM (2)
さらに、一例として、構造化照明によって生成される干渉縞の位相を１／３周期ずつ変えて、位相の異なる３枚の画像を取得する場合を考える。ＡＯＭ１８内に生成される位相型回折格子のピッチをｐとすると、１／３周期間での位置の変化量はｐ／３であり、これを位相量に換算すると、２π／３［ｒａｄ］となる。以下、［ｒａｄ］の単位は省略する。 なお、このとき、図１（ａ）の０次光ＬＢ０はブロックされている状態であるとする。つまり２光束モードを考える。
【0028】
この位相変調を実現するために、式(2)においてｍ＝３とすると、ｆrep＝３ｆAOMとなる。このときの光パルスＬＢとＡＯＭ１８の関係を図５（ａ）に示す。回折格子の時間周期をＴとすると、各光パルスＬＢが発生する時点t1, t2, t3の時間間隔はＴ／３となっている。従って、ＡＯＭ１８内を回折格子が１周期分進行する間に、３つの光パルスＬＢがＡＯＭ１８に入射し、ＡＯＭ１８によって回折されることになる。各光パルスＬＢとＡＯＭ１８の相互作用の様子を図５（ｂ）に示す。各光パルスＬＢの時間間隔がＴ／３であるために、各光パルスＬＢが感じるＡＯＭ１８内の回折格子の位相が１／３周期ずつ、つまり２π／３ずつずれていることがわかる。その時点t1, t2, t3で発生するパルス光が標本面１２ａに生成する構造化照明ＩＦのパターンを図５（ｃ）のパターンＣ１，Ｃ２，Ｃ３で示す。このように、光パルスＬＢとＡＯＭ１８のタイミングに応じて、標本面上で所望の縞位相の構造化照明を生成することができる。【0029】
なお、ここでは２光束モードによる構造化照明を考えたため、標本面上での構造化照明のピッチｐsは、ＡＯＭ１８内の回折格子のピッチをｐ、ＡＯＭ１８から標本面１２ａまでの光学系の投影倍率をβとすると、次のようになる。ｐs ＝（１／２）β・ｐ (3)
従って、今回のようにＡＯＭ１８において回折格子の位相を２π／３ずつ変位させた場合、標本面１２ａでの構造化照明ＩＦの位相変位は２倍の４π／３となる。
【0030】
このようにして、標本１２は位相の異なる構造化照明パターンで励起されるので、それによる蛍光ＬＦを撮像素子３８で撮像することで、構造化照明を用いる顕微鏡８に必要な画像を、回折格子又は光学素子等の機械的な駆動を必要とせずに、高速に取得することが可能となる。ここで、撮像素子３８のフレームレートと光パルスＬＢの繰り返し周波数の制御について述べる。位相の異なる画像を取得するには、図５（ａ）〜（ｃ）を用いて説明したように、撮像素子３８で個々のパルス光を独立に検出する必要がある。従って、撮像素子３８のフレームレートｆrは光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepと等しくする必要がある。
【0031】
これを実現させるためには、例えば、光パルスＬＢの繰り返し周波数をマスター周波数として用いればよい。この場合、光パルスＬＢの一部を周波数帯域の広い光検出器、例えばフォトダイオードで検出し、それを電気信号に変換し、その信号を制御装置４０で処理して得られるトリガ信号を制御信号Ｓ４の一部として撮像素子３８に供給することで、撮像素子３８は光パルスＬＢに同期して撮像を行うことができる。制御装置４０は、信号発生器４１から交流信号（例えば周波数ｆAOM及びｍ・ｆAOMの交流信号を含む）を受信し、その交流信号を用いてＡＯＭ１８を駆動する。また、制御装置４０を用いて、信号発生器４１の発振周波数を可変にすれば、ＡＯＭ１８が生成する回折格子のピッチを可変にすることもできる。
【0032】
次に、３光束干渉を用いて構造化照明を生成する場合（３光束モード）について説明する。この場合、図１（ａ）において、 ０次光ＬＢ０が通過するように、マスク２４を例えば図１（ｂ）のマスク２４Ｂ又は２４Ｃに交換する必要がある。また、超解像画像を構築するためには、一方向につき５位相の画像を取得する必要がある。従って、式(2)においてｍ＝５となるため、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepは５ｆAOMとなる。図６（ａ）〜（ｃ）を参照して、３光束モードの概要を説明する。ｍの値が変わるために、光パルスＬＢの繰り返し周波数が変わり、それに伴って、撮像素子３８のフレームレートｆrが変わる以外は、２光束モードと同様の構成、処理で実現することができる。ここでは同様の事項の説明については省略する。
【0033】
３光束モードでは、標本面上での構造化照明のピッチｐsは、ＡＯＭ１８内の回折格子のピッチをｐ、集光光学系２０の投影倍率をβとすると、次の関係がある。ｐs ＝β・ｐ (4)
従って、ＡＯＭ１８において回折格子の位相を２π／５ずつ変位させた場合、標本面１２ａでの構造化照明ＩＦの位相変位も同様に２π／５となる。
【0034】
従って、３光束モードでは、図６（ａ）に示すように、回折格子（進行波１９）の時間周期をＴとすると、各光パルスＬＢが発生する時点t1, t2, t3, t4, t5の時間間隔はＴ／５となる。このため、ＡＯＭ１８内を回折格子が１周期分進行する間に、５つの光パルスＬＢがＡＯＭ１８に入射して回折される。各光パルスＬＢの時間間隔がＴ／５であるために、図６（ｂ）に示すように、各光パルスＬＢが感じるＡＯＭ１８内の回折格子の位相が１／５周期ずつ、つまり２π／５ずつずれている。その時点t1〜 t5で発生するパルス光が標本面１２ａに生成する構造化照明ＩＦのパターンを図６（ｃ）のパターンＣ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５で示す。このように、３光束モードでも、標本面上で所望の縞位相の構造化照明を生成することができる。【0035】
ここまで、本実施形態における構造化照明ＩＦの位相の高速切り替えについて説明してきた。次に、構造化照明ＩＦの方向切り替えについて説明する。このためには、図７に示すように、ほぼ正６角形のＡＯＭ効果を持つ基板１８Ａａに対して互いにほぼ１２０°ずつ異なる３つの方向Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３に圧電素子（電極）１８Ａｂ，１８Ａｃ，１８Ａｄを設けた構成のＡＯＭ１８Ａを用いることが好ましい。このＡＯＭ１８Ａは圧電素子１８Ａｂ，１８Ａｃ，１８Ａｄのそれぞれに電気信号を印加することで、基板１８Ａａ内の光パルスＬＢの光路を横切るように、各方向Ｄ１〜Ｄ３に屈折率の粗密（進行波）を生成し、結果として位相が変化する位相型回折格子を生成することができる。どの方向に回折格子を生成するかという選択は、制御装置４０中に圧電素子１８Ａｂ〜１８Ａｄに選択的に電気信号を印加する切り替えスイッチ４０ａを設けることで実現できる。また、３方向ではなく、２方向に又は４方向以上の方向に進行波を生成するようにしたＡＯＭを使用することもできる。【0036】
このような複数方向に進行波を発生可能なＡＯＭ１８Ａ等ではなく、図１（ａ）のＡＯＭ１８を用いて回折格子の方位の回転を実現するには、ＡＯＭ１８を機械的に回転させても良い。この場合、物理的な駆動が必要となるため、速度は遅くなるが、製造コストを低減でき、ＡＯＭが入手し易くなる。また、ある特定の一方向のみで超解像効果を得たい場合は、ＡＯＭ１８の回転は不要であるため、一般的なＡＯＭを用いて、本実施形態の高速位相切り替えを適用すればよい。
【0037】
ここで、本実施形態によって実現可能な位相切り替えの高速化についてその所要時間を見積もる。ＡＯＭ１８の音波の周波数ｆAOM を１０MHzとすると、要求される光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepは式(2)より、２光束モードの場合３０MHz、３光束モードの場合は５０MHzとなる。本実施形態の方法では、光パルスＬＢの繰り返し周波数で位相変化が可能となる。撮像素子３８のフレームレートは光パルスＬＢの繰り返し周波数と同様となる。これは、個々の光パルスＬＢを独立に検出する必要性を考えれば、自明である。現状、このようなフレームレートを有する撮像素子３８としては例えば高速度撮影カメラ用のものを使用できる。一般的な撮像素子のフレームレートを鑑みると，本実施形態による高速位相切り替えの律速条件は撮像素子３８のフレームレートであり、構造化照明ＩＦの位相の切り替えはそれ以上の高速で行うことができる。
【0038】
ＡＯＭ１８の周波数を選択する際には、その周波数ｆAOMとＡＯＭ１８内の位相型回折格子によって生じる回折現象との関係に注意する必要がある。周波数ｆAOMが小さい(例えば １０MHz程度)とラマンナス（Raman-Nath）回折が支配的になり、周波数ｆAOMが大きい(例えば１００MHz程度)とブラッグ（Bragg）回折が支配的になる。周波数ｆAOMを大きくすることで、より高速化を実現できるが、ブラッグ回折では、回折光が非対称に生じるという問題がある。つまり、±１次光のうち、どちらか一方しか生じないのである。これはブラッグ条件を満たす光のみが回折することに由来する。従って、３光束モードでは、ラマンナス回折の周波数帯域にＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを設定する必要がある。２光束モードでは、ラマンナス回折だけでなくブラッグ回折も用いることが可能となるため、より高速な位相変調が可能となる。
【0039】
ここで、光パルスＬＢの時間幅について検討する。進行波型回折格子は常に移動しているので、それをあたかも静止させるには、パルス光の時間幅は短いことが望ましい。例えば、回折格子が静止しているとする条件を、パルス幅τpが回折格子の時間周期Ｔの１／１０００と仮定する。このとき、ｆAOM＝１０MHzとすると、Ｔ＝１／ｆAOM ＝１００ｎｓとなる。従って、τp＝Ｔ／１０００＝１００ｐｓとなる。つまり、光パルスＬＢとしては、時間幅が１００ｐｓのパルスレーザーを用いればよい。
【0040】
次に、本実施形態の顕微鏡８において、照明装置１０により構造化照明ＩＦで照明された標本１２の超解像画像を得る方法の一例につき、図２５のフローチャート及び図２４（ａ）〜（ｃ）を参照して説明する。まず、ＡＯＭ１８内で進行波１９を発生し（図２５のステップ１０２）、光源系１４からＡＯＭ１８に光パルスＬＢを照射する（ステップ１０４）。これにより、ＡＯＭ１８から複数の回折光が発生し（ステップ１０６）、これらの回折光が集光光学系２０を介して標本面１２ａに干渉縞よりなる構造化照明ＩＦを形成し（ステップ１０８）、標本１２からの蛍光ＬＦが結像光学系３６を介して撮像素子３８上に標本像を形成し、その像が所定のタイミングで撮像素子３８によって撮像される（ステップ１１０）。【0041】
この場合、簡単のため１次元で考えると、標本１２（試料）上での計測方向の位置をｘとして、蛍光物質密度をＩ0（ｘ）、標本面１２ａでの構造化照明ＩＦの強度分布をＫ（ｘ）とする。標本１２からの蛍光が照明強度に比例すると仮定すると、蛍光密度分布Ｉfl（ｘ）は次のようになる。Ｉfl（ｘ）＝Ｉ0（ｘ）Ｋ（ｘ） (21)
標本１２の各点での蛍光はインコヒーレントであるため、その蛍光密度分布を結像光学系３６で捉えた像Ｉ（ｘ）は、インコヒーレント結像の式に従い次のようになる。なお、ＰＳＦ（ｘ）は結像光学系３６の点像分布関数である。
Ｉ（ｘ）＝∬dx’ＰＳＦ（ｘ−ｘ’）Ｉfl（ｘ） (22)
【0042】
ここで、関数ｆ（ｘ）のフーリエ変換をＦ［ｆ（ｘ）］として、像Ｉ（ｘ）のフーリエ変換を以下の式(22F)で表し、関数ＰＳＦ（ｘ）のフーリエ変換をＯＴＦ（ξ）とすると、式(22)は以下の式(23)となる。ただし、式(22)の右辺の２番目の関数（蛍光密度分布Ｉfl（ｘ）のフーリエ変換）は、式(21)にコンボリューション定理を適用して以下の式(24)で表される。【0043】
【0044】
【0045】
その式(27)で表される像Ｉ（ｘ）のフーリエ変換は、図２４（ａ）に示すように、構造化照明ＩＦによって励起された蛍光像を撮像素子３８で撮像し、その像をフーリエ変換（ＦＴ）することで得られる。ここで、未知数は式(27)の右辺の３つの関数（式(28A)〜(28C)）である。従って、例えば図５（ａ）に示すように、時点t1, t2, t3の光パルスＬＢをＡＯＭ１８に照射して、式(25)の構造化照明ＩＦの位相φをφ1, φ2, φ3と変化させて（フリンジスキャンして）得られる位相の異なる像を撮像素子３８で撮像する（ステップ１１２）。そして、演算装置４４では、得られた複数の像に以下の演算を施して標本１２の超解像画像を復元する（ステップ１１４）。すなわち、まず得られた標本１２の複数の像をフーリエ変換することで、以下の式(29)，(30)，(31)及び図２４（ｂ）で表されるフーリエ変換像を得る。ただし、式(25)で位相シフト量をφとしたときの像をＩφと表記した。【0046】
【0047】
式(29)，(30)，(31)を行列式の形に書き直すと上記の式(32)が得られる。そこで、演算装置４４では、式(32)を解いて、式(28A)〜(28C)のフーリエ変換像を求めることができ、これらの像を用いて画像復元を行う。このためには、図２４（ｃ）に示すように、式(32)より算出した３つのフーリエ変換像を空間周波数座標上で重ね合わせる。このとき、式(28B)，(28C)に残っている構造化照明の空間周波数成分が式(28A)のフーリエ変換像の原点に来るように重ね合わせる。これにより、ＯＴＦ(Optical Transfer Function)が結像光学系３６のＯＴＦのほぼ２倍まで拡大していることがわかる。演算装置４４で、その重ね合わせたフーリエ変換像を逆フーリエ変換することで、標本１２の超解像画像を取得できる。この画像は例えば表示装置４６に表示される。【0048】
これまでの説明はある特定の一方向のみにおいて超解像を実現する方法である。２次元的な超解像画像を得るためには、例えば図７のＡＯＭ１８Ａを用いて、異なる方向に進行波（位相型の回折格子）を発生して、上述の動作を繰り返せばよい。そして、最終的に空間周波数座標上で方向の異なるフーリエ変換像を合成し、それを逆フーリエ変換することで２次元の超解像画像を取得することができる。【0049】
上述のように、本実施形態の顕微鏡８は、被観察面としての標本面１２ａ（標本１２）を照明する照明装置１０を備えている。そして、照明装置１０は、光源系１４から射出したレーザー光よりなる可干渉性を持つ光パルスＬＢ中に配置され、射出した光パルスＬＢを横切る方向に音波の進行波１９を形成するＡＯＭ１８と、ＡＯＭ１８から発生する複数の回折光ＬＢ１，ＬＢ２（又はＬＢ０，ＬＢ１，ＬＢ２）による位相可変の干渉縞よりなる構造化照明ＩＦを標本面１２ａに形成する集光光学系２０（照明光学系）と、を備えている。【0050】
また、照明装置１０による照明方法は、標本面１２ａを照明する照明方法であって、光源系１４からレーザー光よりなる可干渉性を持つ光パルスＬＢを射出し（ステップ１０４）、射出された光パルスＬＢ中に配置され、その射出された光パルスＬＢを横切る方向に音波の進行波１９を形成するＡＯＭ１８から発生する複数の回折光ＬＢ１，ＬＢ２（又はＬＢ０，ＬＢ１，ＬＢ２）による位相可変の干渉縞よりなる構造化照明ＩＦを標本面１２ａに形成するものである（ステップ１０２，１０８）。この照明装置１０又は照明方法によれば、進行波を用いて形成される干渉縞を構造化照明として使用できるため、構造化照明を行う場合にその位相を高速にかつ高精度に切り換えることができる。
【0051】
また、顕微鏡８は、標本面１２ａ（被観察面）を照明する照明装置１０と、標本面１２ａから発生する蛍光ＬＦによる像を形成する結像光学系３６と、その像を検出する撮像素子３８と、撮像素子３８で検出される複数の像の情報を処理して例えば結像光学系３６の解像度を超える構造を有する像を求める演算装置４４と、を備えている。【0052】
また、顕微鏡８による観察方法は、その照明方法によって標本面１２ａを照明し（ステップ１０２〜１０８）、標本面１２ａから発生する蛍光ＬＦから結像光学系３６を介して像を形成してその像を検出し（ステップ１１０，１１２）、その検出される複数の像の情報を処理して例えば結像光学系３６の解像度を超える構造を有する像を求めるものである（ステップ１１４）。この顕微鏡８又は観察方法によれば、照明装置１０又はその照明方法によって、標本面１２ａ上で構造化照明ＩＦの位相を高速にかつ高精度に切り換えることができるため、標本面１２ａの像を用いて標本１２の超解像画像を高速にかつ高精度に求めることができる。
なお、本実施形態において、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepをＡＯＭ１８の周波数ｆAOMの１／Ｎ（Ｎは１以上の整数）に設定し、制御装置４０（タイミング制御部）で光パルスＬＢがＡＯＭ１８に入射するタイミングを相対的に制御してもよい。この構成によっても、標本面１２ａ上で構造化照明ＩＦの位相を高速にかつ高精度に切り換えることができる。
【0053】
［第２の実施形態］第２の実施形態につき図８〜図１１（ｄ）を参照して説明する。
上述の第１の実施形態では、個々の光パルスＬＢを検出することで構造化照明ＩＦの位相可変の高速化を実現した。しかしながら、場合によっては、位相切り替えが高速すぎて通常の撮像素子のフレームレートが追いつかない恐れもある。また、一つの光パルスＬＢのみから画像を取得する場合、１画像当たりの光量が少ないため、ＳＮ比が低下する恐れもある。そこで、この実施形態は、そのような場合においても、複数のパルス光を積算することで、構造化照明によって標本面に生成される縞の位相切り替えを一般的な撮像素子のフレームレートに合わせ、十分な高速化を実現するとともに、ＳＮ比を向上する。
【0054】
図８は、本実施形態に係る照明装置１０Ａを備えた顕微鏡８Ａの概略構成を示す。なお、図８において、図１（ａ）に対応する部分には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。図８において、照明装置１０Ａは、光ファイバの端部１５Ｂａから射出される光パルスＬＢをコリメートするレンズ１６と、光パルスＬＢが入射するＡＯＭ１８との間に配置されて、光パルスＬＢをスイッチングするためのＡＯＭ（音響光学素子）４８と、駆動信号Ｓ１及びＳ２でそれぞれＡＯＭ１８及びＡＯＭ４８を駆動する制御装置４０Ａとを備えている。この他の構成は第１の実施形態と同様である。【0055】
ここでは、光パルスＬＢからＡＯＭ１８によって発生する±１次光を用いて標本面１２ａに構造化照明ＩＦを生成する２光束モードを例に挙げて説明する。この場合、ＡＯＭ１８内の進行波１９の周波数をｆAOMとすると、光パルスＬＢの周波数ｆrepは３ｆAOMとなる。ＡＯＭ４８は入射してくる光パルスＬＢのうち、ある特定の時間間隔のパルス光のみを選択する役割を果たす。ＡＯＭ４８を周波数ｆAOMの電気信号で変調し、図９に示すように、ＡＯＭ４８から発生する回折光のうち、１次光のみを光路Ｅ１に沿ってＡＯＭ１８に導き、その他の回折光（図９では０次光）を光路Ｅ２に沿って遮光部４９に導く。駆動信号Ｓ２がオンの時には１次回折光が発生するが、オフの時には１次回折光は発生しない。これにより、ある時間間隔(Ｔ＝１／fAOM)の光パルスのみを選択することができ、ＡＯＭ４８に入射するときに３ｆAOMだった光パルスＬＢの繰り返し周波数をｆAOMに変換して、ＡＯＭ１８への入射光とすることができる。図９の例では、ＡＯＭ４８は、駆動信号Ｓ２がオン（ハイレベル）の期間で、１次回折光を選択して光パルスＬＢとしてＡＯＭ１８に導光している。【0056】
このスイッチングの原理を図１０（ａ）〜（ｃ）に示す。ＡＯＭ４８の駆動信号Ｓ２として、周波数ｆAOMの周期的な２値信号を用いる。この２値信号のデューティー比（１周期内のオン期間の比率）は１／３に設定する。この信号は矩形波であることが望ましい。図１０（ａ），（ｂ），（ｃ）に示すように、その２値信号（駆動信号Ｓ２）の位相を０°（例えば１周期を３６０°として駆動信号Ｓ１と同じ位相）、１２０°、２４０°と変えることで、ＡＯＭ４８に入力される光パルスＬＢから所望の光パルスＬＢを選択して周期Ｔ（ＡＯＭ１８内の進行波１９と同じ周期）で出力することができる。このスイッチングにより、ＡＯＭ１８に入射するときの周波数ｆrep’がｆAOMで位相の異なる光パルスＬＢの列を生成することができる。説明の便宜上、上記の異なる３つの位相（例えば０°、１２０°、２４０°）で光パルスＬＢを選択する条件をそれぞれ位相１、２、３モードと呼ぶことにする。位相１、２、３モードは、それぞれ図９の時点t1, t2, t3で生成される光パルスＬＢを選択して出力する条件でもある。【0057】
図１１（ａ），（ｂ），（ｃ）に示すように、位相モード１、２、３でＡＯＭ４８で選択される光パルスＬＢは、出力されるときの繰り返し周波数ｆrep’がＡＯＭ１８の周波数ｆAOMに一致しているため、光パルスＬＢにとってＡＯＭ１８内に生成される回折格子は静止しているように見える。従って、各位相モードにおいて標本面１２ａで光パルスＬＢからの回折光よりなる構造化照明ＩＦを積算しても、同一位相の構造化照明の積算となる。このように、位相モード１、２、３の光パルスＬＢが標本面１２ａに生成する構造化照明のパターンは、図１１（ｄ）のパターンＣ１１，Ｃ１２，Ｃ１３で示すように各モードで同一であるため、撮像素子３８では構造化照明ＩＦによって得られる蛍光の像を積算することが可能となる。【0058】
ここで、撮像素子３８による画像取得時間を見積もると、周波数ｆAOMが１０MHzであったときに、光パルスＬＢ毎の画像を１０００枚積算したとすると、超解像画像１枚を構築するのに必要な画像取得時間は１００μｓとなる。このように、パルス光の積算を可能とすることで、一般的なフレームレートの撮像素子３８の利用とＳＮ比の向上が可能となる。ある位相の縞画像をパルス積算により取得した後は、ＡＯＭ４８によるスイッチングにより、別の位相の画像を取得する。これを必要な枚数だけ繰り返すことで、構造化照明を用いる顕微鏡８Ａに必要な複数の画像を高速に取得することができる。
【0059】
本実施形態において、図８の制御装置４０Ａは、信号発生器４１から周波数ｆAOMの交流信号を受信し、それを用いてＡＯＭ１８を駆動する。制御装置４０Ａは、それに加えて、信号発生器４１から周波数ｆAOMの矩形の交流信号を受け取り、その信号でＡＯＭ４８を駆動する。さらに、制御装置４０Ａは、その駆動信号の位相を変調して、上述のスイッチングを実現するとともに、その駆動信号から撮像素子３８のトリガ信号を含む制御信号Ｓ４を生成する。この際に各信号が常に同期するように制御することが望ましい。【0060】
なお、本実施形態においても、第１の実施形態と同様に信号発信器４１の発振周波数を可変にすることで、ＡＯＭ１８が生成する回折格子のピッチを可変にすることもできる。これは以下で説明する第３〜第７の実施形態でも同様である。また、機械的な駆動機構を用いることなく高速に構造化照明ＩＦの方位を複数の方位（例えば３つの方位）に設定するためには、図７の３方向に進行波を発生可能なＡＯＭ１８Ａを用いるのが望ましい。なお、第１の実施形態と同様に、ＡＯＭ１８Ａを用いる代わりにＡＯＭ１８を機械的に回転させても良い。これは以下で説明する第３〜第７の実施形態でも同様である。
【0061】
なお、ここでは２光束モードを例に挙げて説明したが、３光束モードにおいても本実施形態は適用可能である。その際は、構造化照明の縞位相を５位相変化させる必要があるため、可干渉性光源から射出される光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepを５ｆAOMとし、スイッチング用のＡＯＭ４８に周波数ｆAOMでデューティー比が１／５の駆動信号を付与して光パルスＬＢを選択すればよい。また、本実施形態では、スイッチング素子としてＡＯＭ４８を用いたが、チョッパのような回転シャッターを用いても、本実施形態は適用可能である。その際は、制御装置４０Ａを用いて、チョッパの回転数と位相を制御することが望ましい。
【0062】
［第３の実施形態］第３の実施形態につき図１２（ａ）〜図１４（ｂ）を参照して説明する。この第３の実施形態は、簡単かつ安価な構成で標本面の構造化照明の位相切り替えを高速化するものである。第２の実施形態ではＡＯＭ４８を用いて光パルスＬＢのスイッチングを行い、パルス光毎の画像の積算を実現した。これに対して、本実施形態では、ＡＯＭ１８の音波の周波数ｆAOMと光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepを等しくし、ガルバノミラー（振動ミラー）を用いて光パルスＬＢの光路を切り替えることで、構造化照明の位相切り替えを行う。そのために、光路長の差を利用して光パルスＬＢの位相差を可変にし、ＡＯＭ１８内の位相型回折格子と光パルスＬＢとの時間的タイミングを制御する。
【0063】
図１２（ａ）、図１３（ａ）、図１４（ａ）はそれぞれ本実施形態の顕微鏡の照明装置の要部（光源系５０の要部及びＡＯＭ１８）を示す。なお、図１２（ａ）〜図１４（ａ）において、図１（ａ）に対応する部分には同一の符号を付すとともに、ＡＯＭ１８以降の光学系及び演算装置等は第１の実施形態と同様であるため省略してある。ここでは一例として２光束モードについて説明する。２光束モードでは、ＡＯＭ１８から発生する２つの回折光によって標本面上に形成される構造化照明として、３位相分の干渉縞を生成させる必要がある。【0064】
図１２（ａ）の照明装置の光源系５０において、光ファイバの端部１５Ｂａから射出した光パルスＬＢは、レンズ１６によりコリメートされ、入力パルス光としてハーフミラー５２に入射する。ハーフミラー５２を透過した光はガルバノミラー５４により反射される。ガルバノミラー５４により反射された光はレンズ５６（焦点距離をｆ1とする）により、レンズ５６の焦点位置に集光される。ここで、ガルバノミラー５４はレンズ５６の前側焦点位置に設置されているため、ガルバノミラー５４及びレンズ５６はテレセントリック光学系を構成している。従って、レンズ５６で集光された光の主光線はレンズ５６の光軸に平行となる。【0065】
レンズ５６で集光された光は、３つのレンズ５８ａ，５８ｂ，５８ｃ（各焦点距離をｆ2とする）から構成されるレンズ群５８に入射する。レンズ群５８の前側焦点位置は、レンズ５６の集光位置に一致させてあるため、レンズ５６からの光はレンズ群５８によりコリメートされ、コリメートされた光はミラー６０Ａ，６０Ｂ，６０Ｃのうちのいずれかで反射されて、再び、レンズ群５８に入射する。レンズ群５８に戻された光は、レンズ群５８により、レンズ５６の後側焦点位置に集光され、レンズ５６でコリメートされて、ガルバノミラー５４で再び反射される。ガルバノミラー５４で再び反射された光は、ハーフミラー５２で反射されて出力光パルスＬＢとしてＡＯＭ１８へ導かれる。【0066】
ここで、ガルバノミラー５４を用いた位相切り替えの方法につき説明する。ガルバノミラー５４の角度を変えることで、ガルバノミラー５４で反射される光をレンズ群５８（レンズ５８ａ，５８ｂ，５８ｃ）のうちどのレンズに導くかを選択する。レンズ群５８の各レンズによりコリメートされた光はミラー６０Ａ〜６０Ｃで反射され、再びレンズ群５８に入射するが、このミラー６０Ａ〜６０Ｃを、ミラー６０Ａ，６０Ｂ，６０Ｃと対応するレンズ５８ａ，５８ｂ，５８ｃとの距離が順次ｄだけ異なるように配置する。このミラー間の間隔dは、光パルスＬＢの繰り返し周波数をｆrep (ここではｆAOMに等しい）、必要な位相可変数をｍ、光速をｃとすると、次のようになる。ｄ＝ｃ／（２ｍｆrep） (5)
【0067】
これは、光が２ｄ（往復距離）の距離を進むのに要する時間が、ＡＯＭ１８内の回折格子の時間周期Ｔ（＝１／ｆrep）の１／ｍになるように間隔ｄを設定することを意味する。 図１２（ａ）、図１３（ａ）、及び図１４（ａ）は、それぞれガルバノミラー５４からの光がレンズ５８ｃ、レンズ５８ｂ、及びレンズ５８ａに導かれるようにガルバノミラー５４の角度を制御している状態を示す。図１２（ａ）、図１３（ａ）、及び図１４（ａ）においてレンズ群５８及びガルバノミラー５４を介してハーフミラー５２に戻される光の光路長が互いに異なるため、ＡＯＭ１８に入射する光パルスＬＢの位相も変化する。式(5)に従って間隔ｄを設定することで、光パルスＬＢとＡＯＭ１８内の進行波１９（回折格子）との位相関係を、図１２（ａ）、図１３（ａ）、及び図１４（ａ）のそれぞれ時点t1, t2, t3で発生する光パルスＬＢのように順次１／３周期ずつずらすことができる。【0068】
ここで、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepはＡＯＭ１８の音波の周波数ｆAOMに等しいため、これらの各光パルスＬＢにとってＡＯＭ１８は静止しているように見える。このため、複数の光パルスＬＢによって生成される構造化照明の積算が可能となる。図１２（ａ）、図１３（ａ）、及び図１４（ａ）の光パルスＬＢによって標本面に生成する構造化照明を図１２（ｂ）、図１３（ｂ）、及び図１４（ｂ）に示す。このように、本実施形態によれば、ガルバノミラー５４を用いて、光パルスＬＢの位相を変化させることで、構造化照明の位相変化を実現できる。なお、光パルスの繰り返し周波数ｆrep＝ｆAOM／Ｎとしても良い（Ｎは１以上の整数）。整数Ｎを大きくすることにより、種々のカメラに合わせて最速のフレームレートで、構造化照明法(Structured Illumination Microscopy)を用いて得られる像（以下、ＳＩＭ画像という。）の取得を実現できる。【0069】
本実施形態の顕微鏡において、ある位相の構造化照明を標本に投影し、それを撮像する際には、必要な数のパルス光を積算して画像を取得する。構造化照明の位相を変えるときには、ガルバノミラー５４の角度を変えて、レンズ５８ａ〜５８ｃのうち異なるレンズを選ぶことによりパルス光の位相を変化させればよい。これにより、パルス光とＡＯＭ１８内の回折格子とのタイミングを変化させることができ、その状態で再びパルス光を積算して画像を取得することが可能となる。また、現在の一般的なガルバノミラーは１０ｋＨｚ程度での動作が可能であるため、この周波数での位相切り替えが可能となる。
【0070】
なお、ここでは２光束モードを例に挙げて説明したが、３光束モードにおいても本実施形態は適用可能である。その際は、０次光が通過するようにマスクを変更し、構造化照明の縞位相を５位相変化させる必要があるため、レンズ群５８を５つのレンズで構成し、それぞれのレンズに対応するミラーを、式(5)で決まる適切な位置に配置する必要がある。 【0071】
［第４の実施形態］第４の実施形態につき図１５〜図１６（ｄ）を参照して説明する。本実施形態は、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMとパルス光の繰り返し周波数ｆrepを等しくし、電気光学素子又は電気光学変調器(Electro-Optic Modulator: EOM)を用いて、パルス光の位相を変えることで、パルス光とＡＯＭ１８との相対位相を変化させ、パルス光の積算を可能にする。
【0072】
図１５は、本実施形態に係る照明装置１０Ｂ及び制御装置４０Ｂを備えた顕微鏡８Ｂの概略構成を示す。なお、図１５において図１（ａ）に対応する部分には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。図１５において、光ファイバの端部１５Ｂａから射出された光パルスＬＢをコリメートするレンズ１６と、そのコリメートされた光パルスＬＢが入射するＡＯＭ１８との間に、電気光学素子（以下、ＥＯＭという）６２が配置されている。ＥＯＭ６２は、例えばニオブ酸リチウム又はＫＴＰ等の基板に電圧印加用の電極を設けたものである。制御装置４０ＢはＡＯＭ１８及びＥＯＭ６２をそれぞれ駆動信号Ｓ１及びＳ２により制御する。この他の構成は第１の実施形態と同様である。【0073】
本実施形態の位相変調の様子を図１６（ａ）〜（ｃ）に示す。ここでは一例として２光束モードについて説明する。２光束モードでは、ＡＯＭ１８から発生する２つの回折光を用いて標本面１２ａに形成する構造化照明ＩＦとして、３位相分の干渉縞を生成させる必要がある。ＥＯＭ６２は、電気光学効果を利用した光デバイスであり、印加電圧に応じて光路の屈折率が変化するため、結果的に入射光の位相を変調することができる。図１６（ａ）〜（ｃ）に示すように、ＥＯＭ６２に入射する（入力される）周期Ｔの光パルスＬＢの位相をＥＯＭ６２により変化させて出力する（射出させる）ことで、光パルスＬＢとＡＯＭ１８内の回折格子との位相関係を制御し、所望の縞位相を有する構造化照明を実現することができる。
【0074】
光パルスＬＢが時点t1に入射するものとして、図１６（ａ），（ｂ），（ｃ）に示すように、ＥＯＭ６２から光パルスＬＢが時点t1、時点t1からＴ／３遅れた時点t2、及び時点t2からＴ／３遅れた時点t3に射出されるときのＡＯＭ１８内の回折格子に対する光パルスＬＢの位相のモードをそれぞれ位相１、２、３モードと呼ぶ。位相１、２、３モードの光パルスＬＢ光を比較すると、順次Ｔ／３の時間遅れを有している。このような位相遅れは、ＥＯＭ６２に印加する電圧を制御することで付与できる。このために、ＥＯＭ６２には図１６（ｅ）のような電圧を印加する。図１６（ｅ）中の電圧Ｖａ，Ｖｂ，Ｖｃは、図１６（ａ），（ｂ），（ｃ）においてＥＯＭ６２に印加される電圧に対応する。ＥＯＭは印加電圧に応じて屈折率が変化するので、適切な屈折率を付与するように電圧を制御する必要がある。また、一定の電圧を与える時間Ｔexpは、必要なパルス積算数によって決定され、これはカメラ（撮像素子）の積算時間に相当する。【0075】
ＥＯＭ６２によって付与された時間遅れが、光パルスＬＢの位相遅れに相当する。従って、各位相モードの光パルスＬＢにとってＡＯＭ１８内の回折格子の位相は異なっているため、位相１、２、３モードに対応する図１６（ｄ）の構造化照明のパターンＣ２１，Ｃ２２，Ｃ２３で示すように、３つの位相モードで互いに異なった位相の構造化照明で標本面を励起することができる。また、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepはＡＯＭ１８の音波の周波数ｆAOMに等しいため、各光パルスＬＢにとってＡＯＭ１８は静止しているように見える。このため、複数の光パルスの積算が可能となる。このように、光パルスの積算を可能とすることで、一般的なフレームレートの撮像素子３８の利用が可能となり、ＳＮ比の向上が可能となる。なお、光パルスの繰り返し周波数ｆrep＝ｆAOM／Ｎとしても良い（Ｎは１以上の整数）、Ｎを大きくすることにより、種々のカメラに合わせて最速のフレームレートでＳＩＭ画像の取得を実現できる。
【0076】
本実施形態において、ある位相の構造化照明で励起された標本の像（縞画像）をパルス積算により取得した後は、ＥＯＭ６２を用いた光パルスの位相変化により、別の位相の画像を取得する。これを必要な枚数だけ繰り返すことで、構造化照明を用いる顕微鏡に必要な複数の画像を高速に取得することができる。また、ここでは２光束モードを例に挙げて説明したが、３光束モードにおいても本実施形態は適用可能である。その際は、０次光が通過するようにマスク２４を変更するとともに、構造化照明の縞位相を５位相変化させる必要があるため、光パルスの位相がＴ／５ずつ変化するようにＥＯＭ６２を駆動すればよい。
【0077】
［第５の実施形態］第５の実施形態につき図１７（ａ）〜図１８（ｃ）を参照して説明する。本実施形態では、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMと光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepを等しくし、ＡＯＭ１８を駆動する交流信号（周波数ｆAOM）の位相を変えることで、光パルスの位相を変化させる。これにより、光パルスとＡＯＭ１８との相対位相を変化させ、光パルスの積算を可能にする。
【0078】
図１７（ａ）は本実施形態の顕微鏡の照明装置のＡＯＭ１８及び制御装置４０Ｃを示し、図１７（ｂ）は制御装置４０Ｃの構成例を示す。これ以外の構成は第１の実施形態と同様である。ここでは一例として２光束モードについて説明する。２光束モードでは、ＡＯＭ１８から発生する２つの回折光によって標本面上に形成される構造化照明として、３位相分の干渉縞を生成させる必要がある。【0079】
図１７（ａ）において、ＡＯＭ１８には制御装置４０Ｃから周波数ｆAOMの交流信号よりなる駆動信号Ｓ３が印加されている。ＡＯＭ１８は式(1)に従って、その周波数に応じた回折格子として機能する。回折格子のピッチの時間周期をＴとすると、印加する駆動信号の時間周期もＴとなる。この駆動信号の位相を図１７（ａ）の信号Ｓ３（１），Ｓ３（２），Ｓ３（３）に示すように、Ｔ／３ずつ変化させることで、光パルスとＡＯＭ１８との相対位相を変化させることができる。【0080】
そのように駆動信号Ｓ３の位相を変化させるために、図１７（ｂ）に示すように、制御装置４０Ｃに位相調節回路４０Ｃａを設ける。なお、切り替え回路４０Ｃｂは図７に示した方位切り替えスイッチである。この制御装置４０Ｃを用いてＡＯＭ１８に入力される周波数ｆAOMの駆動信号Ｓ３の位相をＴ／３ずつずらすことができる。図１８（ａ），（ｂ），（ｃ）にそれぞれＡＯＭ１８に駆動信号Ｓ３（１），Ｓ３（２），Ｓ３（３）が供給される場合における、光パルスＬＢとＡＯＭ１８内の回折格子とのタイミングを示す。それぞれの光パルスＬＢは同じ時点t1にＡＯＭ１８に入射している。しかし、ＡＯＭ１８に印加する音波の位相を可変にすることで、ＡＯＭ１８内の回折格子の位相が変化するため、図１８（ａ），（ｂ），（ｃ）のパターンＣ３１，Ｃ３２，Ｃ３３で示すように、各光パルスが標本面上に生成する構造化照明の縞の位相を変化させることができる。
【0081】
光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepはＡＯＭ１８の音波の周波数ｆAOMに等しいため、これらの各光パルスにとってＡＯＭ１８内の回折格子は静止しているように見える。このため、複数の光パルスの積算が可能となる。そして、必要な数の光パルスを積算し、画像を取得した後には、図１７（ｂ）の位相調節回路４０Ｃａを用いてＡＯＭ１８に入力される駆動信号の位相をＴ／３変化させ、再び必要数の光パルスを積算して、画像取得を行う。この作業を、必要な画像の枚数分だけ繰り返せばよい。なお、光パルスの繰り返し周波数ｆrep＝ｆAOM／Ｎとしても良い（Ｎは１以上の整数）、Ｎを大きくすることにより、種々のカメラに合わせて最速のフレームレートでＳＩＭ画像の取得を実現できる。なお、ここでは２光束モードを例に挙げて説明したが、３光束モードにおいても本実施形態は適用可能である。その際は、０次光が通過するようにマスクを変更するとともに、構造化照明の縞位相を５位相変化させる必要があるため、ＡＯＭ１８に印加する駆動信号の位相をＴ／５ずつ変化させればよい。
【0082】
［第６の実施形態］第６の実施形態につき図１９（ａ）〜図２０（ｃ）を参照して説明する。本実施形態では、図１（ａ）のパルスレーザー光源よりなる可干渉性光源１５Ａの代わりに、連続発振(Continuous-Wave: CW)型のレーザー光源よりなる可干渉性光源１５ＡＣを用いる。可干渉性光源１５ＡＣからは、光強度が時間的に一定の可干渉性のレーザー光（以下、連続光という。）ＬＢＣが射出される。ＣＷ型のレーザー光源としては、例えばアルゴンイオンレーザー（波長４８８ｎｍ）、ヘリウムネオンレーザー、又はヘリウムカドミウムレーザー等を使用できる。本実施形態は、可干渉性を持つ光として連続光ＬＢＣを使用する以外の構成は第１の実施形態と同様である。ここでは一例として２光束モードについて説明する。２光束モードでは、ＡＯＭ１８から発生する２つの回折光によって標本面上に形成される構造化照明として、３位相分の干渉縞を生成させる必要がある。
【0083】
また、本実施形態では、撮像素子３８のフレームレートをＡＯＭ１８の音波の周波数に同期させたうえで、さらに撮像素子３８の露光時間をＡＯＭ１８内の進行波（位相型の回折格子）が静止しているとみなせるほど極短時間に設定する。ＡＯＭ１８は進行波型であるために、標本面１２ａに投影される構造化照明ＩＦの位相は、ＡＯＭ１８の音波の周波数ｆAOMで絶えず変化している。その音波（回折格子）の時間周期をＴで表すと、Ｔ＝１／ｆAOMとなる。入射光に連続光ＬＢＣを用いることで、標本１２に投影される干渉縞のパターンは常に干渉縞の周期方向に移動している。【0084】
撮像素子３８の露光時間τexpをＡＯＭ１８内の回折格子の時間周期Ｔに比べて十分小さくすることで、動的な干渉縞を静止させることができる。この様子を図１９（ａ）〜（ｃ）に示す。ＡＯＭ１８に入射する連続光ＬＢＣは時間的に一定の光強度を有している（図１９（ａ）参照）。ＡＯＭ１８には、制御装置４０を介して信号発振器４１から交流信号よりなる駆動信号Ｓ１が印加されている。駆動信号Ｓ１の周波数はｆAOMであり、時間周期はＴ（＝１／ｆAOM）である（図１９（ｂ）参照）。標本面１２ａに形成される干渉縞（構造化照明ＩＦ）は時間周期Ｔを１周期として、常に移動している。しかしながら、撮像素子３８の露光時間τexpを図１９（ｃ）に示すように周期Ｔに比べて十分小さくすることで、移動している干渉縞をあたかも静止させることができる。また、２光束モードでは、撮像素子３８のフレームレートｆrを３ｆAOMとし、縞の１周期Ｔの間に露光時間τexpで３枚の画像を取得することで、構造化照明を用いる顕微鏡に要求される、異なる位相の構造化照明で励起された蛍光画像を高速で取得することができる。【0085】
図１９（ａ）〜（ｃ）の１／３周期（Ｔ／３）ずつ離れた時点t1, t2, t3における連続光ＬＢＣとＡＯＭ１８内に生成される位相型回折格子（進行波１９）との関係を図２０（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示す。また、各時点t1, t2, t3に連続光ＬＢＣからＡＯＭ１８によって発生する複数の回折光によって標本面１２ａ上に形成される構造化照明ＩＦのパターンの一例が図２０（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のパターンＣ４１，Ｃ４２，Ｃ４３である。このように、本実施形態においても、所望の構造化照明で、標本１２を励起することができる。【0086】
本実施形態において達成しうる位相切り替えの速度についてその値を概算する。位相切り替えの速度は、ＡＯＭ１８に印加する音波の周波数ｆAOMによって決まる。周波数ｆAOMが１０MHzとすると、２光束モードでは、撮像素子３８のフレームレートｆr は３０MHzとなる。従って、１枚の画像の取得に要する時間ｔｐはｆr の逆数で、ｔｐ＝３３ｎｓとなる。一方向につき３枚の画像が必要であるため、全部の画像を得るために要する時間はおよそ１μｓとなる。【0087】
次に、撮像素子３８に要求される露光時間τexpであるが、ＡＯＭ１８内の回折格子が実質的に静止している時間をＴ／１０００とすると、Ｔ＝／ｆAOM ＝１００ｎｓであるため、露光時間τexpの条件は次のように０．１ｎｓより小さくなる。τexp ＜ Ｔ／１０００＝０．１ｎｓ (6)
このように本実施形態によれば、パルスレーザー光源に比べてより安価な連続発振型のレーザー光源を用いて、標本面における構造化照明の位相切り替えの高速化を実現することができる。
【0088】
なお、ここでは２光束モードを例に挙げて説明したが、３光束モードにおいても本実施形態は適用可能である。その際は、０次光が通過するようにマスクを変更するとともに、構造化照明の縞位相を実質的に５位相変化させるために、撮像素子３８における撮像のタイミングをＴ／５間隔で設定すればよい。なお、本実施形態では、撮像素子３８の露光時間を短くして構造化照明ＩＦを実質的に静止させているが、その代わりに例えば撮像素子３８の前に高速のシャッター（機械式のシャッター又は液晶パネル方式等のシャッター等）を設置し、その高速のシャッターで撮像素子３８に入射する蛍光のタイミングを制御してもよい。この場合、カメラ（撮像素子）の露光時間を長くすることが可能となるので、より一般的なカメラ（撮像素子）を利用することが可能となる。
【0089】
［第７の実施形態］第７の実施形態につき図２１（ａ）〜図２３（ｂ）を参照して説明する。本実施形態でも、図１（ａ）のパルスレーザー光源よりなる可干渉性光源１５Ａの代わりに、連続発振型のレーザー光源よりなる可干渉性光源１５ＡＣを用いる。また、上述の第６の実施形態では、時間的に高速に変化する構造化照明の位相を、撮像素子３８の露光時間を短くすることで実質的に静止させ、撮像タイミングを制御することで、位相変調を行った。しかしながら、場合によっては、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMが高すぎて通常の撮像素子の露光時間とフレームレートが追いつかない恐れもある。また、ＡＯＭ１８内の回折格子の時間周期Ｔよりもはるかに短い極短時間で撮像素子３８を露光する場合、１画像当たりの光量が少ないため、ＳＮ比が低下する恐れもある。そこで、この実施形態は、そのような場合においても、位相変調を用いて構造化照明を静止させることで、構造化照明によって標本面に生成される縞の位相切り替えを一般的な撮像素子のフレームレートに合わせ、十分な高速化を実現するとともに、ＳＮ比を向上する。
【0090】
図２１は、本実施形態の照明装置１０Ｃを備えた顕微鏡８Ｃの概略構成を示す。なお、図２１において、図１（ａ）に対応する部分には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。図２１において、可干渉性の連続光ＬＢＣは、レンズ１６によりコリメートされてＡＯＭ１８に入射し、ＡＯＭ１８から０次光ＬＢ０及び±１次光ＬＢ１，ＬＢ２等が射出される。ここでは一例として２光束モードについて説明する。２光束モードでは、ＡＯＭ１８から発生する２つの回折光（ここでは±１次光ＬＢ１，ＬＢ２とする）によって標本面上に形成される構造化照明として、３位相分の干渉縞を生成させる必要がある。【0091】
本実施形態では、ＡＯＭ１８から発生した回折光のうち、±１次光ＬＢ１，ＬＢ２のみがレンズ２２で集光されてマスク２４の開口を通過する。そして、マスク２４を通過する２つの回折光のうちの一方の回折光（ここでは−１次光ＬＢ２）の位相を変調するために、例えば電気光学素子又は電気光学変調器（ＥＯＭ）よりなる位相変調素子６４がマスク２４に設けられている。また、ＡＯＭ１８及び撮像素子３８の動作を制御する制御装置４０Ｄが位相変調素子６４の動作を制御する。この他の構成は第１の実施形態と同様である。【0092】
本実施形態における位相変調素子６４を用いた位相変調について説明する。まず、位相変調素子６４がないときに、図２１の±１次光ＬＢ１，ＬＢ２とこれらの干渉によって生じる干渉縞（構造化照明ＩＦ）との位相関係を図２２（ａ）に示す。本実施形態では、進行波型のＡＯＭ１８によって生成される位相型回折格子を用いているため、回折光ＬＢ１，ＬＢ２の位相は時間的に常に変化している。＋１次光ＬＢ１の位相をφ+1、−１次光ＬＢ２の位相をφ-1とし、位相を２πで折り返す（ラップする）と、これらは周期Ｔの周期関数となり、それぞれ次のように表すことができる。φ+1＝２πt／Ｔ (7A)
φ-1＝−２πt／Ｔ (7B)
【0093】
ここで、ＴはＡＯＭ１８内の回折格子の時間周期であり、ＡＯＭ１８の音波の周波数をｆAOMとすると、Ｔ＝１／ｆAOMとなる。この±1次光が標本面１２ａに生成する構造化照明ＩＦの位相φstrは、次のようになる。φstr＝φ+1−φ-1＝４πｔ／Ｔ (8)
図２２（ａ）に示すように、±１次光の位相の時間変化が反転しているため、構造化照明の位相も時間的に連続に変化する。従って、位相変調素子６４がない場合には、構造化照明は連続して動き続けることになる。
【0094】
次に、本実施形態の位相変調素子６４を−１次光ＬＢ２（＋１次光ＬＢ１でもよい）の光路に設けた場合につき説明する。この場合、ＥＯＭよりなる位相変調素子６４を用いて、−１次光ＬＢ２の位相φ-1を変調することで構造化照明ＩＦを静止させる。位相変調素子６４を駆動する交流信号よりなる駆動信号Ｓ５の周波数は、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMと等しくなるので、位相変調素子６４はＡＯＭ１８を制御する制御装置４０Ｄによって制御することが望ましい。【0095】
図２２（ｂ）に、位相変調前の−１次光ＬＢ２の位相φ-1、位相変調素子６４で−１次光ＬＢ２に付与する位相φEOM、及び位相変調前後の−１次光ＬＢ２の位相φ’-1をそれぞれ示す。位相変調前の−１次光の位相φ-1は図２２（ａ）（式(7B)）と同様である。このとき、構造化照明の位相を一定にするには、＋１次光ＬＢ１の位相と、−１次光ＬＢ２の位相とを同一にすればよい。それにより、どの時間においても両者の位相差は一定となり、φstr ＝０となる。【0096】
位相変調素子６４がない場合、図２２（ａ）に示したように±１次光の位相は反転している。従って、位相変調素子６４を用いて−１次光の位相を反転させることで、構造化照明ＩＦを静止できる。このために、位相変調素子６４が−１次光に付与する位相量φEOMは、次のようになる。φEOM＝４πｔ／Ｔ＝−２φ-1 (9)
このとき、位相変調後の−１次光の位相φ'-1は、次のようになる。
φ'-1＝φ-1＋φEOM＝−φ-1 (10)
【0097】
このように位相変調素子６４を用いて、−１次光の位相を反転させることで、φ+1＝φ'-1となる。構造化照明の位相φstrは式(8)で示したように、２つの光の位相の差となるため、両者の位相が等しい場合の位相差は０となり、構造化照明は静止する。この様子を図２２（ｃ）に示す。【0098】
ここまで、構造化照明の位相φstr を０とする方法について説明したが、異なる位相で構造化照明を静止させることも要求される。これを実現するためには、位相変調素子６４が付与する位相量を変化させれば良い。式(9)を一般化すると、次のようになる。φEOM＝φ0 −２φ-1＝ φ0 ＋４πｔ／Ｔ (11)
ここで、φ0は初期位相である。２光束モードでは、３位相分の構造化照明が必要であるため、φ0 は、−２π／３、０、＋２π／３のいずれかとなる。φ0 が−２π／３及び２π／３のときの、＋１次光の位相、位相変調後の−１次光の位相、及び構造化照明の位相の関係をそれぞれ図２３（ａ）及び（ｂ）に示す。φ0 が０のときの位相の関係は、図２２（ｃ）と同様である。
【0099】
このように、位相変調素子６４を用いて回折光に位相変調を施すことで、標本面１２ａ上の構造化照明ＩＦの位相を時間的に一定とし、構造化照明ＩＦを静止させることができる。また、位相変調素子６４の位相変調を変化させることで、構造化照明の位相を変化させることができる。従って、撮像素子３８が要求する積算時間分だけ構造化照明を静止させた後は、位相変調素子６４で付与する位相量φ0を変化させることで、構造化照明の位相を変化させればよい。そして、この動作を必要な位相数だけ繰り返せばよい。【0100】
このように本実施形態の照明装置１０Ｃは、標本面１２ａ（被観察面）を照明する照明装置であって、観察用の可干渉性の連続光ＬＢＣを射出する端部１５Ｂａを含む光源系と、端部１５Ｂａから射出された連続光ＬＢＣを回折するＡＯＭ１８と、ＡＯＭ１８から発生する複数の回折光のうち少なくとも１つの回折光（ここでは−１次光ＬＢ２）の位相を変調する位相変調素子６４と、ＡＯＭ１８から発生した回折光（ここでは＋１次光ＬＢ１）及び位相変調素子６４で変調された回折光（−１次光ＬＢ２）を標本面１２ａに集光して位相が可変の干渉縞よりなる構造化照明ＩＦを形成する集光光学系２０（照明光学系）と、を備えている。【0101】
この照明装置１０Ｃによれば、ＡＯＭ１８及び位相変調素子６４を用いて形成される干渉縞を構造化照明として使用できるため、構造化照明を行う場合にその位相を高速にかつ高精度に切り換えることができる。また、本実施形態によれば、安価な連続発振型のレーザー光源及び一般的な撮像素子３８を用いて構造化照明の位相切り替えを高速化できる。これにより、装置構成の単純化、コスト削減といった恩恵を享受することができる。
【0102】
なお、本実施形態においては、位相変調素子６４はマスク２４（集光光学系２０の瞳面）に近接して配置されている。しかしながら、その瞳面をリレー光学系によりリレーした面に位相変調素子６４を配置してもよい。また、連続発振型のレーザー（連続光ＬＢＣ）のコヒーレンス長が短い場合は、±１次光の両方に位相変調素子６４を設置しても良い。また、一方の回折光の光路に位相変調素子６４を置き、他方の回折光の光路に、同様の屈折率と厚みを有するガラス板を置いても良い。
【0103】
また、位相変調素子６４としてＥＯＭを使用するものとしたが、光の位相を高速に変調できれば、素子は限定されない。従って、位相変調素子６４の代わりに、連続的、あるいは周期的な位相を有する位相板を高速で回転させたものを使用してもよい。さらに、空間光変調器を用いて、位相変調を実現しても良い。また、ここでは２光束モードを例に挙げて説明したが、３光束モードにおいても本実施形態は適用可能である。その際は、また、０次光が通過するようにマスク２４を変更するとともに、３光束のうち、２つの光の位相を変調する必要がある。さらに、構造化照明の縞位相を５位相変化させる必要があるため、位相変調素子６４に供給する駆動信号Ｓ５によって、−１次光の位相を２π／５（時間間隔でＴ／５）ずつ変化させればよい。
【0104】
また、本実施形態では、連続光ＬＢＣから回折光を発生させるために進行波型のＡＯＭ１８を使用している。しかしながら、本実施形態では、一方の回折光の位相を位相変調素子６４で変調しているため、ＡＯＭ１８の代わりに定常波型のＡＯＭ、又は通常の回折格子を使用してもよい。この場合、位相変調素子６４で静止している縞を動かすことができるので、標本面１２ａで構造化照明ＩＦの位相を可変にできる。【0105】
［第８の実施形態］第８の実施形態につき図２６〜図２９（ａ）を参照して説明する。
図２６は、本実施形態に係る照明装置１０Ｄ及び制御装置４０Ｅを備えた顕微鏡８Ｄの概略構成を示す。なお、図２６において図１（ａ）に対応する部分には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。図２６において、光ファイバの端部１５Ｂａから射出された光パルスＬＢをコリメートするレンズ１６と、そのコリメートされた光パルスＬＢが入射するＡＯＭ１８との間に、所定の小さい反射率を持つビームスプリッタ５１が配置され、ビームスプリッタ５１で反射された光パルスを検出する例えばフォトダイオードよりなる光電検出器５２が配置されている。
【0106】
光電検出器５２で検出する光は微弱光で十分であり、構造化照明ＩＦの強度をできるだけ大きくすることが望ましいため、ビームスプリッタ５１の反射率はかなり小さい値でよい。このため、ビームスプリッタ５１として単なるガラス板を使用してもよい。さらに、ビームスプリッタ５１の代わりに偏光ビームスプリッタを配置し、この偏光ビームスプリッタの入射側に例えば１／２波長板を配置し、１／２波長板の回転角を調整して、光電検出器５２に入射する光の強度を調整できるようにしてもよい。【0107】
光電検出器５２は、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepを含む周波数域の光を検出できるように広帯域であることが望ましい。光電検出器５２の受光回路（不図示）の遮断周波数をｆcとすると、少なくとも、ｆc ＞ｆrepを満たすように構成されることが望ましい。このために、その受光回路をＴＩＡ(Trans Impedance Amplifier)制御回路などを用いて構成することが望ましい。光電検出器５２に入射した光は光電変換により電気信号に変換され、その不図示の受光回路により検出信号Ｓ６になる。従って、この検出信号Ｓ６は光パルスＬＢと同じ周波数ｆrepを有している。検出信号Ｓ６は、スペクトラムアナライザ５３及び制御装置４０Ｅに供給される。制御装置４０Ｅ内でその検出信号Ｓ６は、波形整形回路５５により、撮像素子３８のトリガに適した信号形態に変換され、可変遅延回路５６に入力される。
【0108】
可変遅延回路５６は、入力される電気信号に任意の時間遅延を付与する電気回路である。可変遅延回路５６は、一例として図２７に示すように、それぞれ１対のインバータ５７よりなる複数個の遅延回路５８を直列に接続し、各遅延回路５８の出力信号を並列にスイッチング素子(Selector)５９に供給するように構成されている。単一のインバータ５７はＮＯＴ回路を構成し、入力される信号（デジタル信号）を反転させる。つまり、ハイレベル“１”（Ｈ）の信号が入力されるとローレベル“０”（Ｌ）の信号を、ローレベル“０”の信号が入力されるとハイレベル“１”の信号を出力する。それを２つ直列に接続することで、２つのインバータ５７（一つの遅延回路５８）の出力信号は入力信号と同じ値を持つが、回路処理に時間を要するので、時間遅延が生じる。ある遅延回路５８で時間遅延が生じた信号をスイッチング素子５９及び次段の遅延回路５８に出力することを繰り返すことで、遅延時間のみ異なる多数の出力信号が並列にスイッチング素子５９に供給される。スイッチング素子５９で任意の一つの出力信号を取り出すことで入力信号に適切な遅延時間Δｔを付与させることができる。
【0109】
あるいは、複数のインバータペア（１対のインバータ５７）の変わりに、バリキャップコンデンサのような静電容量可変のコンデンサを用いて、ＲＣ回路の時定数を変化させることで遅延時間Δｔを与えてもよい。図２６において、可変遅延回路５６の出力（トリガパルスＴＰ）を撮像素子３８のトリガ入力（制御信号Ｓ４の一部）とする。これにより、撮像素子３８のフレームレートを光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepに同期させることができる。スペクトラムアナライザ５３は、検出信号Ｓ６の周波数を検出し、検出した周波数を制御装置４０Ｅ内の制御部５４に供給し、制御部５４は、その周波数及び／又は信号発振器４１の出力に基づいてＡＯＭ１８の進行波（音波）の周波数ｆAOMを制御する。
【0110】
この他の構成及び構造化照明ＩＦによって生成される干渉縞の位相を高速に可変する原理は、図１（ａ）（第１の実施形態）の顕微鏡８と同じである。すなわち、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepは、１以上の整数ｍを用いてＡＯＭ１８の周波数ｆAOMに対して、上述の式(2)（ｆrep＝ｍ・ｆAOM）のように設定される。また、一例として、構造化照明によって生成される干渉縞の位相を１／３周期ずつ変えて、位相の異なる３枚の画像を取得する場合を考える。このとき、ＡＯＭ１８内の音波による回折格子のピッチをｐとすると、その回折格子の変化量はｐ／３（位相量で２π／３）となる。
【0111】
また、マスク２４で０次光をブロックしている状態（２光束モード）では、標本面１２ａ上での構造化照明ＩＦのピッチｐsは、ＡＯＭ１８内の回折格子のピッチｐ、及びＡＯＭ１８から標本面１２ａまでの光学系の投影倍率βを用いて、上述の式(3)で表される。従って、今回のようにＡＯＭ１８において位相を２π／３ずつ変化させた場合、標本面１２ａでの干渉縞の位相変位は４π／３となる。【0112】
このようにして、標本１２は位相の異なる構造化照明ＩＦで励起されるので、それによる蛍光ＬＦを撮像素子３８で撮像することで、構造化照明顕微鏡に必要な画像を、機械的な駆動を必要とせずに、高速に取得することが可能となる。以下、本実施形態の照明方法及び観察方法の一例につき図２９（ａ）のフローチャートを参照して説明する。
【0113】
まず、図２９（ａ）のステップ１２０において、上述の式(1)を用いて、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを決定する。次のステップ１２２において、上述の式(2)を用いて、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepを決定する。ただし、どのように繰り返し周波数ｆrepの光パルス列を得るかは、どのようにして光パルスＬＢを生成しているかによって異なる。例えば直接変調法により光パルスＬＢを生成している場合、繰り返し周波数ｆrepは連続発振(CW)型のレーザー光源を駆動する電気信号の周波数で決定される。従って、その周波数をｆrepに設定すれば良い。この場合、ＡＯＭ１８を駆動するのと同じ信号発振器４１（例えばファンクションジェネレーター）を用いて出力される電気信号をレーザー光源に供給することが望ましい。
【0114】
また、モード同期法により光パルスＬＢを生成している場合、繰り返し周波数ｆrepは、レーザー共振器の共振器長Ｌで決定される。光速をｃとすると、周波数ｆrepと共振器長Ｌは、以下の関係式で表される。ｆrep＝ｃ／（２Ｌ） (41)
従って、周波数ｆrepを変化させるためには、共振器長Ｌを変化させる必要がある。このために、一例としてレーザー共振器の中に電気光学変調器(Electro-Optic Modulator)（以下、ＥＯＭともいう。）を挿入する。ＥＯＭは、例えばニオブ酸リチウム、あるいはＫＴＰ結晶等の基板に電圧印加用の電極を設けた素子であり、電圧により結晶の屈折率を変化させることができる。ＥＯＭ結晶の厚みをｄ、屈折率をｎとすると、ＥＯＭ結晶を透過する光の光路長はｎｄとなる。従って、屈折率を変えることで、光路長を変えることができる。従って、ＥＯＭを用いて、最適な周波数ｆrepになるように共振器長を変化させることで周波数ｆrepを設定することができる。
【0115】
次のステップ１２４において、撮像素子３８のフレームレートｆrを光パルスの繰り返し周波数ｆrepに同期させる。ここでは、撮像素子３８のフレームレートｆrと光パルスの繰り返し周波数ｆrepの制御について述べる。位相の異なる画像を取得するには、図５（ａ）〜（ｃ）を参照して説明したように、撮像素子３８で個々の光パルスを独立に検出する必要がある。従って、撮像素子３８のフレームレートｆrは繰り返し周波数ｆrepに等しくする必要がある。【0116】
次に、光パルスＬＢと撮像素子３８の撮像のタイミングの調整方法について述べる。光パルスＬＢの構造化照明ＩＦにより励起された蛍光ＬＦは、光パルスの繰り返し周波数ｆrepと同じ周波数で撮像素子３８に到達するので、蛍光ＬＦを検出するためには、到達したときに露光している必要がある。このために、撮像素子３８のフレームレートと蛍光信号の位相を適切に設定する必要がある。本実施形態では、これを実現するために可変遅延回路５６を用いる。【0117】
可変遅延回路５６では、光電検出器５２によって得られる光パルスの検出信号に、上述のように適切な遅延時間Δｔを付与させることができる。この場合の遅延時間Δｔは、図２７（ｂ）（横軸は時間ｔ）に示すように、蛍光ＬＦが発生して蛍光ＬＦの強度ＴＬＦが大きくなった時点（すなわち、光電検出器５２で光パルスＬＢが検出された時点）から、制御装置４０Ｅ内の可変遅延回路５６から撮像素子３８に撮像開始を指示するトリガパルスＴＰが出力される（立ち上がる）までの時間である。トリガパルスＴＰが出力された直後から所定時間、撮像素子３８において露光が行われる。図２７（ｂ）において、その露光が行われている時間（露光時間）は仮想的な信号Ｔｅｐがハイレベルとなっている期間で表されている。【0118】
このとき、遅延時間ΔｔのストロークＴ（最大値）と分解能δｔ（可変遅延回路５６で設定可能な最小単位時間）は、以下のようにするのが望ましい。Ｔ＞１／（２ｆrep） (42)
δｔ＜ｔex／２ (43)
ただし、ｔexは撮像素子３８の露光時間であり、この値は光パルスの繰返し周期ｔrep ( = １／ｆrep)より短い。
【0119】
図２７（ｂ）に示すように、遅延時間Δｔを変えることで、露光タイミングと蛍光ＬＦが発生している期間との位相を可変できる。従って、Δｔを可変させて撮像素子３８で画像を取得し、図２７（ｃ）に示すように、その画像の強度Int（任意単位）をΔｔに対してプロットすることで、撮像する蛍光ＬＦの強度が最大となるΔｔを決定することができ、撮像素子３８の露光のタイミングと蛍光ＬＦが発生している期間とを合わせることができる。【0120】
このとき、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMと、光パルスの繰り返し周波数ｆrepは同期していないので、構造化照明ＩＦをそのまま標本１２に投影した場合、発生する蛍光ＬＦの強度が時間に依存する可能性がある。そこで、０次光、＋１次光、−１次光のうち、いずれか１つのみをマスク２４によって透過させる構成とすることが望ましい。回折光の強度分布は周波数ｆAOMに依らず、常に一定となるためである。【0121】
また、細胞の観測位置が変わると屈折率や細胞への浸入長が変わるので、光の光路長が変化し、露光のタイミングも変化する。しかし、仮に光路長が１μｍ変化したとしても、それを時間変化に換算すると、３．３ｆｓであり、これは光パルスの時間間隔に比べて無視できるオーダーであると考えられる。また、蛍光体としては退色しにくいものが望ましい。【0122】
次のステップ１２６において、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを光パルスの繰り返し周波数ｆrepに同期させる。これは、光パルスの繰り返し周波数をマスター周波数として用いることを意味する。このため、図２６において、光電検出器５２を介して検出された検出信号Ｓ６をスペクトラムアナライザ５３で周波数解析することで、光パルスの繰り返し周波数ｆrepを測定し、測定結果を制御装置４０Ｅの制御部５４に供給する。制御部５４は、その測定値された繰り返し周波数の１／ｍ倍の次式で表される周波数を持つ正弦波の電気信号を発振するように信号発振器４１を制御し、その電気信号（駆動信号Ｓ１）でＡＯＭ１８を駆動する。
ｆAOM =ｆrep ／ｍ (44)
【0123】
ここで、ｍは必要な位相送り数（１以上の整数）であり、ＡＯＭ１８はその信号により回折格子として機能する。光パルスＬＢがＡＯＭ１８に入射すると、ＡＯＭ１８より回折光が生じ、標本面１２ａに構造化照明ＩＦが投影される。それにより励起された蛍光分子は蛍光ＬＦを発し、撮像素子３８に構造化照明による像を形成する。この構造化照明による像は撮像素子３８のフレームレートで決まる一定時間間隔で取得される。このとき、蛍光分子の変わりに、ミラーを標本１２として用いても良い。
【0124】
撮像素子３８では、画像をタイムラプスで取得し、各画像の縞位相（干渉縞の位相）を解析する。このとき、光パルスの繰り返し周波数と撮像素子３８のフレームレートは前述の方法で同期された状態にある。従って、取得された画像のうち、ｎ枚目の画像（位相φn）とｎ＋ｊ・ ｍ枚目の画像（位相φn+jm）の位相は一致しているはずである（ｊ＝1,2,3,…）。その各画像の位相差をΔφとすると、Δφは次のようになる。Δφ＝φn+jm−φn (45)
【0125】
Δφ＝０であれば、各画像に位相差はなく、図２８（ａ）のΔφ＝０の場合の画像で示すように、何枚目の画像であっても同様の画像が得られる。これは式(44)が成立していることを示している。従って、この状態では、n, n+1, …, n + m枚目の各画像の位相差は所望の縞位相２π／ｍに設定されており、構造化照明の正確な位相送りを実現できているといえる。また、Δφ≠０であれば、式(44)が成立しておらず、この状態では正確な位相送りが実現できない。
【0126】
例えば、Δφ＞０であれば、ｆAOM ＞ｆrep／ｍであり、このときの各タイムラプス画像（一定周期で撮像されたＮ枚（Ｎは２以上の整数）の画像）は、図２８（ａ）のΔφ＞０の場合の画像で示すように、時間が経つほど、つまり取得枚数が大きくなるほど、縞の進行方向である左側にシフトしている。さらに、Δφ＜０であれば、ｆAOM ＜ｆrep／ｍであり、このときの各タイムラプス画像は、図２８（ａ）のΔφ＜０の場合の画像で示すように、時間が経つほど、つまり取得枚数が大きくなるほど、縞の進行方向と逆の右側にシフトしている。
【0127】
画像をｍ・Ｎ枚取得したときの、位相差Δφと画像の取得枚数Ｎの関係を図２８（ｂ）に示す。図２８（ｂ）より、Δφの大小関係から、周波数の大小関係を知ることができる。従って、Δφ＜０の場合は、信号発振器４１の周波数ｆAOMを大きくし、Δφ＞０の場合は、信号発振器４１の周波数ｆAOMを小さくする。その状態で再び連続画像を取得し、Δφを測定する。Δφが０に収束するまでこれを繰り返すことで、式(44)の関係を成立させ、正確な位相送りを実現することができる。【0128】
また、ここでは、ｍ枚で１セットの画像のうちの一つのみを用いたが、パルスのジッタが問題となる場合は、複数、あるいはすべての画像を用いて、位相の時間依存性を調整しても良い。また、制御装置４０Ｅを用いて、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを可変すれば、ＡＯＭ１８が作る回折格子のピッチを可変することもできる。このとき、光パルスの繰り返し周波数も変える必要がある。
【0129】
ここで、前述したように、どのように光パルスの繰り返し周波数ｆrepを変えるかは、どのようにして光パルスを生成しているかによって異なる。直接変調法により光パルスを生成している場合、適した周波数ｆrepになるようにCW型のレーザー光源を駆動する電気信号の周波数を設定し、まずは撮像素子３８との同期を行い、その後、図２７（ａ）、（ｂ）を参照して説明したように周波数ｆAOMを調整する。 一方、モード同期法により光パルスを生成している場合、レーザー共振器中のＥＯＭに印加する電圧を制御することにより、適した周波数ｆrepになるように共振器長を変化させる。その後、まずは撮像素子３８との同期を行い、さらに図２７（ａ）、（ｂ）を参照して説明したようにＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを調整する。
【0130】
上述のように、本実施形態によれば、光パルスＬＢの周波数ｆrepが、ＡＯＭ１８の音波進行波の周波数ｆAOMのｍ倍（ｍは２以上の整数）になるように調整するために、光パルスＬＢに同期して標本面１２ａ（被観察面）に形成される干渉縞の第１位相（φn）を検出し、その第１位相を検出してからｊ・ｍ（ｊは１以上の整数）パルス目の光パルスＬＢに同期して標本面１２ａに形成される干渉縞の第２位相（φn+jm）を検出し、その第１位相とその第２位相との位相差Δφを低減させるように、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを調整している。従って、光パルスＬＢの周波数ｆrepが、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMのｍ倍になるように効率的に調整できる。【0131】
なお、これまでは、光パルスの繰り返し周波数ｆrepを基準に考えてきたが、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを基準にしてももちろん良い。すなわち、その位相差Δφを低減させるように、光パルスの周波数ｆrepを調整しても良い。この場合は、式(1)より決定したＡＯＭ１８に入力する駆動信号Ｓ１の周波数ｆAOMのｍ倍の周波数を持つ信号を撮像素子３８のトリガとし、その信号の位相を変えることで、撮像素子３８の露光と光パルスのタイミングを合わせる。その後、縞画像を取得し位相解析することで、周波数ｆAOMに合わせて繰り返し周波数ｆrepを調整することが望ましい。各調整方法は前述の通りである。
また、例えば光パルスＬＢの周波数ｆrepが、ＡＯＭ１８の音波進行波の周波数ｆAOMの１／Ｎ倍（Ｎは１以上の整数）になるように調整することも可能である。この場合には、スペクトラムアナライザ５３によって検出される光パルスＬＢの周波数のＮ倍の周波数の駆動信号でＡＯＭ１８を駆動すればよい。
【0132】
［第９の実施形態］第９の実施形態につき図２９（ｂ）〜図３１（ｂ）を参照して説明する。上述の第８の実施形態では、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMが光パルスの繰り返し周波数ｆrepより小さい場合（ｆAOM＜ｆrepの場合）、すなわち、個々の光パルスを独立に検出する必要がある場合の周波数の調整方法を説明した。本実施形態では、ｆrep＝ｆAOM／Ｎの場合の調整方法を述べる。ここでＮは１以上の整数である。以下ではＮ＝１の場合を例に挙げて説明する。
【0133】
図３０は、本実施形態に係る照明装置１０Ｅ及び制御装置４０Ｆを備えた顕微鏡８Ｅの概略構成を示す。なお、図３０において図１（ａ）及び図２６に対応する部分には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。図３０において、光ファイバの端部１５Ｂａから射出された光パルスＬＢをコリメートするレンズ１６と、そのコリメートされた光パルスＬＢが入射するＡＯＭ１８との間に、ビームスプリッタ５１が配置され、ビームスプリッタ５１で反射された光パルスを検出する光電検出器５２が配置されている。光電検出器５２に入射した光は光電変換により電気信号に変換され、不図示の受光回路により光パルスＬＢと同じ周波数ｆrepを有する検出信号Ｓ６になり、検出信号Ｓ６は、スペクトラムアナライザ５３に供給される。
【0134】
この他の構成及び構造化照明ＩＦによって生成される干渉縞の位相を高速に可変する原理は、図１（ａ）（第１の実施形態）の顕微鏡８と同じである。本実施形態においては、撮像素子３８では複数の光パルス（蛍光ＬＦの像）を積算し、１枚の画像を生成する。干渉縞の位相を変える手法は複数あるが、ここでは、ＡＯＭ１８を駆動する駆動信号Ｓ１の位相を変更することで、干渉縞の位相を変える手法を例に挙げて、本実施形態の調整方法の一例につき図２９（ｂ）のフローチャートを参照して説明する。
【0135】
まず、図２９（ｂ）のステップ１３０において、上述の第８の実施形態と同様に、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを上述の式(1)で決める。そして、本実施形態では、ステップ１３２において、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepをＡＯＭ１８の周波数ｆAOMと同じ（ｆrep ＝ｆAOM）にする。本実施例では、撮像素子３８は露光時間の間に多数の光パルス（蛍光ＬＦの像）を積算するので、この効果により撮像素子３８のフレームレートｆrと繰り返し周波数ｆrepの同期は不要となる。ただし、露光時間内における光パルスの数が極端に少なくなった場合には、同期することが望ましい。
【0136】
次のステップ１３４において、繰り返し周波数ｆrepとＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを同期させる。撮像素子３８で撮像される画像は、個々の光パルスが生成する構造化照明ＩＦにより励起された蛍光ＬＦを光パルスの数だけ総和した値で構成される。従って、周波数ｆrepとｆAOMが同期していれば、個々の光パルスが作る構造化照明ＩＦは全く同一のものとなる。【0137】
しかしながら、周波数ｆrepとｆAOMが同期していなければ、光パルスＬＢにとってＡＯＭ１８内の回折格子は静止しておらず、その回折格子は両者のビート周波数ｆbeat（＝ｆrep−ｆAOM）で動いていることになる。従って、光パルス毎に構造化照明の位相が異なることになる。これにより、それらを積算することで得られる画像のコントラストは低下してしまう。【0138】
そこで、繰り返し周波数ｆrepとＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを同期させるために、本実施形態では、図３１（ａ）に示すように、取得画像６０Ａ，６０Ｂを２次元フーリエ変換する。そして、フーリエスペクトル６１Ａ，６１Ｂの０次（DC）成分ＩF0と１次成分ＩF1との次式で表される比ＲＦを計算する。ＲＦ＝ＩF1／ＩF0 (46)
【0139】
そして、信号発振器４１により、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを微調整し、図３１（ｂ）に示すように、比ＲＦが最大となるように調整することで、周波数ｆrepとｆAOMを同期させることができる。構造化照明ＩＦの位相を変えるときには、信号発振器４１により、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMの位相を変化させる。このときの位相の変化量は、２π／ｍ（ｍは２以上の整数）とする。
【0140】
上述のように本実施形態によれば、光パルスの周波数ｆrepが、ＡＯＭ１８の音波進行波の周波数ｆAOMと同じになるように調整する（同期させる）ために、光パルスに同期して標本面１２ａ（被観察面）に形成される干渉縞の像を複数回検出して積算し、この積算された干渉縞のコントラストを高めるように周波数ｆAOMを調整している。従って、光パルスの周波数ｆrepとＡＯＭ１８の周波数ｆAOMとを効率的に、かつ高精度に同期させることができる。【0141】
なお、調整の際にはＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを固定し、光パルスＬＢの繰り返し周波数ｆrepを変化させても良い。このように各種パラメータを調整することで、最適な構造化照明を生成することができる。
また、本実施形態では、構造化照明の位相変調手段としてＡＯＭ１８の駆動信号Ｓ１の位相を変える手法を示したが、本調整方法はこの手法に限定される必要はない。例えばレーザー光源（不図示）とＡＯＭ１８の間の光路にＥＯＭ（電気光学変調器）を挿入し、ＥＯＭによる屈折率変調によりＡＯＭ１８と光パルスのタイミングを変化させて、構造化照明の位相変調を実現する場合においても、本調整手法は適用することができる。
【0142】
［第１０の実施形態］第１０の実施形態につき説明する。本実施形態では、図１（ａ）の顕微鏡８において、パルスレーザー光源よりなる可干渉性光源１５Ａの代わりに、連続発振(CW)型のレーザー光源よりなる可干渉性光源１５ＡＣを用いる。可干渉性光源１５ＡＣから出力される連続光ＬＢＣ（ＣＷレーザー光）を用いて生成される構造化照明ＩＦを用いて標本１２を観察する方法の原理は上記の第６の実施形態で説明した通りである。
【0143】
ここでは一例として２光束モードについて述べる。このため構造化照明ＩＦが作る干渉縞として、３位相分の干渉縞を生成させる必要がある。図１（ａ）において、ＡＯＭ１８には制御装置４０を経由して、信号発振器４１から交流信号（駆動信号Ｓ１）が印加される。この周波数はｆAOMであり、時間周期はＴ（＝１／ｆAOM）である。標本面１２ａに形成される干渉縞は時間周期Ｔを１周期として、常に移動しているが、撮像素子３８の露光時間τexpをＴに比べて十分小さくすることで、移動している干渉縞をあたかも静止させることができる。また、２光束モードでは、撮像素子３８のフレームレートｆr を３ｆAOMとし、縞の１周期Ｔの間に露光時間τexpで３枚の画像を取得することで、構造化照明顕微鏡に要求される、異なる位相の構造化照明で励起された蛍光画像を高速で取得することができる。
【0144】
調整の際には、ＡＯＭ１８の周波数ｆAOMを基本周波数として、そのｍ倍（ｍは２以上の整数）の周波数の電気信号Ｉtrigを制御装置４０の内部のファンクションジェネレーター（不図示）により生成する。それを撮像素子３８のトリガとする。そして、第８の実施形態と同様に、同一位相となる画像を取得してその位相差Δφを調べ、それが最小となるように電気信号Ｉtrigの周波数を微調整することで、正確な位相送りを実現できる。【0145】
本実施形態によれば、可干渉性光源１５ＡＣから射出される光は連続光ＬＢＣ（ＣＷレーザー）であり、上述の第８の実施形態と同様に、音波進行波の周波数ｆAOMのほぼｍ倍（ｍは２以上の整数）の周波数のトリガパルスに同期して標本面１２ａ（被観察面）に形成される干渉縞の第１位相を検出し、その第１位相を検出してからｊ・ｍ（ｊは２以上の整数）パルス目のトリガパルスに同期して標本面１２ａに形成される干渉縞の第２位相を検出し、その第１位相とその第２位相との差を低減させるように、そのトリガパルス（電気信号Ｉtrig）の周波数を調整する。この調整方法によって、ＡＯＭ１８内の回折格子の移動に応じて位相が変化する蛍光ＬＦの像を、撮像素子３８で正確なタイミングで撮像することができ、標本１２を高精度に観察できる。【0146】
なお、上記の第１〜第１０の実施形態において、ＡＯＭ１８，１８Ａ内の位相型の回折格子の方位切り替え機構やその回折格子又は構造化照明の位相の制御機構等は一例であり、それらの構成及び組み合わせは上記の各実施形態に限定されることなく任意の構成及び組み合わせを使用できる。【0147】
また、上記の各実施形態においては、進行波型のＡＯＭ１８，１８Ａ内に生成される位相型の回折格子で生じた回折光のうち、±１次光（又は０次光及び±１次光）を使用する場合について説明したが、±１次光の代わりに例えば±２次回折光又は±３次回折光等を用いても良い。ただし、その場合光強度は１次回折光に比べて低下するので、レーザー光の出力を増加させる等の対策が必要になることもある。【0148】
また、上記の各実施形態は、本発明を構造化照明を用いて蛍光観察を行う顕微鏡に適用したものであるが、本発明は、構造化照明を用いる通常の顕微鏡等にも適用できる。このように、本発明は上述の実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の構成を取り得る。
【符号の説明】
【0149】
８…顕微鏡、１０…照明装置、１２…標本、ＩＦ…構造化照明（干渉縞）、１４…光源系、１５Ａ…可干渉性光源、１８…ＡＯＭ、１９…進行波、２０…集光光学系、３６…結像光学系、３８…撮像素子、４０…制御装置