特許 5960421 細胞の測定方法及び細胞の測定用試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5960421

(24)【登録日】2016年7月1日

(45)【発行日】2016年8月2日

(54)【発明の名称】細胞の測定方法及び細胞の測定用試薬

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20160719BHJP

   C12Q 1/42 20060101ALI20160719BHJP

   G01N 21/76 20060101ALI20160719BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/04

   C12Q1/42

   G01N21/76

【請求項の数】13

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2011-265728(P2011-265728)

(22)【出願日】2011年12月5日

(65)【公開番号】特開2013-116083(P2013-116083A)

(43)【公開日】2013年6月13日

【審査請求日】2014年7月31日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】501387839

【氏名又は名称】株式会社日立ハイテクノロジーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(72)【発明者】

【氏名】岡野定 雅弘

(72)【発明者】

【氏名】野田 英之

(72)【発明者】

【氏名】福薗 真一

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０００−１５７２９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−２３７７９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５０００４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５１１４９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−０５６３９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−１８９１９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Eur. J. Biochem., (1984), 141, [1], p.217-222

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生細胞を含む疑いのあるサンプルに対し、0.1％以上20％以下の濃度でメタノールを添加して生細胞内のATPを増加させる工程と、生細胞外のATPを除去する工程とを含む第一工程、
細胞内のATPを抽出する第二工程、及び
抽出したATPを発光させ発光量を測定する第三工程
を含む、サンプル中の細胞の測定方法。

【請求項2】

第一工程において、さらにグルコース及びアラニンから選択される物質をサンプルに添加する、請求項1に記載の方法。

【請求項3】

前記生細胞外のATPを除去する工程において、ATP分解酵素を添加する、請求項1又は2に記載の方法。

【請求項4】

第一工程において、前記生細胞内のATPを増加させる工程の後に前記メタノールを除去する工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】

第一工程後、フィルターによるろ過で細胞をフィルターへ捕捉し、メタノールを含む溶液を除去した後に、第二工程及び第三工程を実施する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項6】

サンプルをフィルターでろ過した後、第一工程及び第二工程をフィルター上で実施し、その後、フィルターから回収したATP抽出サンプルを発光させる第三工程を実施する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項7】

グルコースの最終濃度が0.8 mM以下である、請求項2〜6のいずれか1項に記載の方法。

【請求項8】

アラニンの最終濃度が0.5 mM以下である、請求項2〜7のいずれか1項に記載の方法。

【請求項9】

メタノールの最終濃度が1％であり、グルコースの最終濃度が0.1 mMであり、アラニンの最終濃度が0.1 mMである、請求項2〜8のいずれか1項に記載の方法。

【請求項10】

測定方法を保証するための陽性コントロールとして、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、エッシェリヒア（Escherichia）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、クロストリジウム（Clostridium）属、カンジダ（Candida）属、及びアスペルギルス（Aspergillus）属からなる群より選択される少なくとも1種の菌体を使用する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。

【請求項11】

測定方法を保証するための陽性コントロールとして、枯草菌（Bacillus subtilis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescence）、メチロバクテリウム・エクストルケンス（Methylobacterium extorquens）、大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、及びクロコウジカビ（Aspergillus niger）からなる群より選択される少なくとも1種の菌体を使用する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。

【請求項12】

ATP分解酵素、ATP抽出液及び発光試薬からなる群より選択される少なくとも1種の試薬と、メタノールを含む試薬とを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の細胞の測定方法を実施するためのキットであって、該メタノールが前記方法の第一工程において0.1％以上20％以下の濃度で使用される、キット。

【請求項13】

前記メタノールを含む試薬がさらにグルコース及びアラニンを含み、該グルコース及びアラニンが前記方法の第一工程において使用される、請求項12に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞内ATPを計測することにより、細胞数又は細胞の存在を高感度に計測する方法及び試薬に関する。特に本発明は、サンプル中の細胞（特に生細胞）を測定する方法及び試薬に関する。

【背景技術】

【0002】

製薬、医療、食品、醸造、水処理など広い分野において細胞数の測定方法は用いられている。特に、各種医薬品製造分野・化粧品製造分野・臨床医学・基礎生化学等の現場では、サンプルの品質管理のため、サンプル中の細胞の有無や、細胞数の計測が実施されている。例えば医薬品製造分野では、厚生労働省により定められた日本薬局方を規格として、医薬品原料や中間体、最終製品、製薬用水に含まれる菌体（細菌・真菌）の管理が必須であり、日々、菌体数の計測が実施されている。

【0003】

日本薬局方に規定されている細菌や真菌数の主な計測は培養法である。培養法では、サンプルを寒天平板培地へ接触させて培養し、培養によって1個の菌が1個のコロニーを形成することを利用して、コロニー数（CFU : Colony Forming Unit）をサンプル中の菌数として定量する。

【0004】

製薬業界における培養法の課題は、培養時間が約1週間必要なことである。このため中間体の製造や最終製品の出荷の段階で計測結果待ちを要し、事業者にとって培養法は時間的・経済的な負荷となっている。また培養法は、菌種によって培地の種類を選択しなければならない。例えば一般的な好気性の細菌では標準寒天培地、貧栄養の環境を好む細菌ではR2A培地、嫌気性の細菌ではチオグリコール培地、真菌ではPDA培地など菌のコロニー形成に適した栄養素を有する培地を選択しなければならない（非特許文献1）。

【0005】

具体的には、好気性細菌は標準寒天培地で温度30〜35℃で48〜72時間、嫌気性細菌はチオグリコール酸培地で温度30〜35℃で5日間以上、貧栄養環境を好む細菌はR2A培地で温度20〜25℃（若しくは30〜35℃）で4〜7日間、真菌はPDA培地で温度20〜25℃で5日間以上培養するなど、各菌種のコロニー形成に適した培地や温度、培養時間など複数のプロトコールを必要とする。このため1つのサンプルを複数に分割したり、又は複数のサンプルを必要としたりする。またコロニーを形成させるため、最大7日間の培養を必要とする課題がある。このため1つのサンプルだけで、すべての菌種の菌数計測は困難であり、複数のサンプルと複数の培地を用いた計測が必須であった。

【0006】

計測時間を短縮させた細胞数の迅速計測方法としてATP（Adenosine TriPhosphate, アデノシン三リン酸）発光計測法が知られている。計測対象となるATPは全ての生物が細胞内に有し、細胞の生命活動に必要とするエネルギー源となる有機化合物である。ATP発光計測法は、ATPと化学反応して光を生じるルシフェラーゼとルシフェリンを使用して、細胞内のATPとルシフェラーゼ、ルシフェリンの反応により生じた発光を計測し、発光量から細胞数を見積もる方法である。

【0007】

一般に、細胞数の計測にATP発光計測法を適用した場合、サンプル中には生きている細胞（生菌）と死細胞（死菌）由来のATPや遊離状態のATPが混在しているため、サンプルをそのまま測定した場合には正確な生細胞数を見積もることができないことが知られている。この問題に対しては、アデノシンリン酸デアミナーゼとアピラーゼなどを組合わせたATP消去法が知られている（特許文献1）。

【0008】

従来法の生細胞内のATP計測方法101では（図1）、生細胞や死細胞由来のATP、遊離状態のATPを含むサンプル102に対して、(1) 生細胞外のATPの除去103、(2) 生細胞内のATPの抽出104、(3) 生細胞由来のATPと発光試薬（ルシフェラーゼ・ルシフェリン等）による発光反応と発光計測105の三段階が実施され、生細胞内のATPと発光試薬との発光から、生細胞数を見積もる。

【0009】

以下では従来法の生細胞内のATP計測法101と、ATP発光法121における生細胞122と死細胞由来のATP・遊離状態のATP 123、ATP分解酵素124の各工程における状態を説明する。

【0010】

生細胞外のATP除去工程103では、主に死細胞由来のATPや遊離状態のATP 123が除去される。除去方法としては、サンプル中へアピラーゼ等のATP分解酵素124が添加される(106)。死細胞はその細胞壁又は細胞膜が壊れているため、死細胞内のATPや遊離のATP 123はATP分解酵素124の活性125により分解される(126)。一方、生細胞122は生存127しているため、生細胞内のATPは、生細胞の細胞壁又は細胞膜によりATP分解酵素124から隔離されている（特許文献2）。特許文献2によれば、生細胞内のATPは、グルコースを添加することで、標準培地で培養後のEscherichia coliやLactobacillus brevis、Staphyllococcus aureus、Bacillus subtilisについてATPを増加できると示している。また特許文献3によれば、芽胞へグルコースとアラニンを添加することで発芽が誘導すると示している。

【0011】

生細胞内のATP抽出工程104では、「生細胞の細胞壁の破壊」と「ATP分解酵素の失活」が実施される。ATPの抽出方法としては、トリクロロ酢酸や塩化ベンザルコニウム、メタノールのATP抽出液107が添加される（特許文献2）。ATP抽出工程104では添加物によって生細胞の細胞壁が破壊されることで生細胞は死滅し、ATPが抽出される(128)。一方、添加物の酵素変性作用によってATP分解酵素はその活性を失う(129)ため、生細胞内からATPが抽出されてもATPは分解されず温存される。

【0012】

ATPと発光試薬による発光反応と計測工程105では、抽出された生細胞由来のATPと発光試薬108を接触させて発光反応130を生じさせる。生じた発光をルミノメーター等の発光計測装置を用いて定量する。発光量は生細胞由来のATP数と比例し、ATP数は生細胞数と比例するため、発光量から生細胞数を見積もることができる。なおこれら3つの工程（生細胞外ATP除去工程103、細胞内ATP抽出工程104、ATP発光反応・計測工程105）は不可逆に進行する。

【0013】

生細胞1個当りのATP内包量は、細菌1 CFU当りの換算で約1.5 x 10^-18 mol/CFU（0.001 fmol/CFU = 1 amol/CFU）である（非特許文献1）。一般的なATP発光計測法のATP計測感度は1 x 10^-15〜1 x 10^-16 mol（1〜0.1 fmol）である。これまでに発明者は、ATP計測感度1.0 x 10^-18 molを達成し、生菌1細胞の計測を試みている。しかしながらこのATP発光計測法を医薬品製造分野において、特に製薬用水の管理において利用する場合、精製水や注射用水といった極めて純度の高い水、言い換えるとほとんど栄養分が存在しない水に含まれる菌体を検出しなければならず、そのような場合、従来技術では生菌1細胞が計測できない課題があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】特許第3547882号

【特許文献2】特開平11-253195号公報

【特許文献3】特開2006-174751号公報

【特許文献4】特許第3811616号

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Analytical Biochemistry 第319巻第287-295頁, 2003年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

従来のATP発光計測法では、サンプル中の細胞数が少ない場合や、細胞中のATP数が少ない場合は、細胞、特に生細胞が計測できない課題があった。一方で、グルコースを添加することでE.coliやL.brevis、S.aureus、B.subtilisのATPは増加することが公知である（特許文献2）。またアラニンを添加することでB.subtilisの芽胞の発芽が誘導されることも公知である（特許文献3）。しかしながら、特許文献2はアミノ酸によるATPの増加についても示しているにも拘らずアラニンは例示されておらず、アラニンのATP増加作用を認めていない。また、特許文献3ではグルコースやアラニンのATP増加作用は全く示されていないことから、これら2つの公知例からアラニンのATP増加作用を予想することは極めて困難だった。

【0017】

このように従来技術やこれらの従来技術の組み合わせでは、細菌や真菌（酵母・カビ）、芽胞や胞子、非芽胞、好気性や嫌気性、グラム陰性やグラム陽性など複数種の様々な細胞を1つのATP発光計測法で同時に計測するには不十分であった。

【0018】

そこで本発明の課題は、ATP発光計測法により複数種の細胞（特に生細胞）を同時かつ高感度に計測可能な方法及び手段を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本発明者は上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ATP発光計測法において、メタノールが生細胞（生菌）内のATPの増加に寄与することを見出し、メタノールをATP抽出工程の前に使用することによって複数種の細胞（特に生細胞）を同時にかつ高感度に測定できるという知見を得、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下の［1］〜［15］である。

【0020】

［1］生細胞を含む疑いのあるサンプルにメタノールを添加して生細胞内のATPを増加させる第一工程、
細胞内のATPを抽出する第二工程、及び
抽出したATPを発光させる第三工程
を含む、サンプル中の細胞の測定方法。
［2］第一工程において、さらに糖及びアラニンから選択される物質をサンプルに添加する、［1］に記載の方法。
［3］第一工程において、ATP分解酵素を同時に添加する、［1］又は［2］に記載の方法。
［4］第一工程後、フィルターによるろ過で細胞をフィルターへ捕捉し、メタノールを含む溶液を除去した後に、第二工程及び第三工程を実施する、［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。
［5］サンプルをフィルターでろ過した後、第一工程及び第二工程をフィルター上で実施し、その後、フィルターから回収したATP抽出サンプルを発光させる第三工程を実施する、［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。
［6］メタノール濃度が50％未満である、［1］〜［5］のいずれかに記載の方法。
［7］糖が、グルコース、フルクトース及びスクロースからなる群より選択される少なくとも1つである、［2］〜［6］のいずれかに記載の方法。
［8］糖の最終濃度が0.8 mM以下である、［2］〜［7］のいずれかに記載の方法。
［9］アラニンの最終濃度が0.5 mM以下である、［2］〜［8］のいずれかに記載の方法。
［10］メタノールの最終濃度が1％であり、糖の最終濃度が0.1 mMであり、アラニンの最終濃度が0.1 mMである、［2］〜［9］のいずれかに記載の方法。
［11］測定方法を保証するための陽性コントロールとして、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、エッシェリヒア（Escherichia）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、クロストリジウム（Clostridium）属、カンジダ（Candida）属、及びアスペルギルス（Aspergillus）属からなる群より選択される少なくとも1種の菌体を使用する、［1］〜［10］のいずれかに記載の方法。
［12］測定方法を保証するための陽性コントロールとして、枯草菌（Bacillus subtilis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescence）、メチロバクテリウム・エクストルケンス（Methylobacterium extorquens）、大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、及びクロコウジカビ（Aspergillus niger）からなる群より選択される少なくとも1種の菌体を使用する、［1］〜［10］のいずれかに記載の方法。
［13］メタノールを含むことを特徴とする、［1］〜［12］のいずれかに記載の細胞の測定方法を実施するための試薬。
［14］さらに糖及びアラニンを含む、請求項［13］に記載の試薬。
［15］ATP分解酵素、ATP抽出液及び発光試薬からなる群より選択される少なくとも1種の試薬と共に供給される、［13］又は［14］に記載の試薬。

【発明の効果】

【0021】

本発明により、ATP発光計測法に基づいてサンプル中の複数種の細胞（特に生細胞）を同時かつ高感度に測定するための方法及び試薬が提供される。本発明の方法及び試薬を用いることにより、細菌や真菌（酵母・カビ）、芽胞や胞子、非芽胞、好気性や嫌気性、グラム陰性やグラム陽性など複数種の細胞について、1つの計測方法で1 amol/CFUを超えるATP内包量の計測が可能である。サンプル中の細胞数が少ない場合や、細胞中のATP量が少ない場合でも、細胞の検出や細胞数の計測が可能である。本発明は、各種医薬品製造分野・化粧品製造分野・臨床医学・基礎生化学等の現場に適応でき、特に製薬用水の管理など貧栄養環境下の細胞及び菌体の検出に有効である。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】細胞内ATP発光計測法における本発明の工程と従来法の工程と比較して、ATP発光計測法における生細胞、死細胞ATP及び遊離ATPとATP分解酵素の状態を示した図である。

【図2】メタノール濃度に対するATP分解酵素の残存活性を示す図である。

【図3】メタノール濃度に対するB.subtilis、S.aureus及びC.albicansの生存度を示す図である。

【図4】M.extorquensのATP内包量に対する各種添加物の効果を示す図である。

【図5】メタノール濃度に対するM.extorquensのATP内包量を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ATP発光計測法に基づくサンプル中の細胞の測定方法に関する。本発明のATP発光計測法141（図１）では、複数種の細胞（例えば菌体）を1つのATP発光計測方法で同時にかつ高感度に計測が可能となる。本発明では、生細胞内ATP増加150、生細胞外のATP除去143のため、細胞内のATPの抽出工程144より前で、複数種の細胞を含むサンプル142へメタノール（及びさらにグルコース、アラニン）、ATP分解酵素145を添加する。本発明の好ましい実施形態では、「生細胞内のATPの増加」工程150と「生細胞外のATPの除去」工程143を同時に実施する。

【0024】

本発明の特徴は、メタノールが生細胞（生菌）内のATPの増加に寄与することを見出したことである。これは、特許文献2や特許文献3には示されていない本発明者らが独自に見出したものである。ATP発光計測法におけるメタノールの利用形態としては、「細胞内のATPの抽出」工程144で利用している従来技術があり、この従来法では、メタノールをATP抽出工程において使用し、細胞の細胞壁を破壊して細胞（菌体）を死滅させ、細胞内からATP抽出させている（特許文献4）。一方、本発明では、メタノールを「細胞内のATPの抽出」工程144より前で使用することで、細胞が生存している条件下で、細胞内のATP量を増加させることを特徴としており、ATP抽出工程で利用しているメタノールとは得られる効果が全く異なる（例えば実施例3）。

【0025】

またメタノールは酵素などタンパク質を変性させる酵素変性作用を有するが、本発明者は、メタノールの濃度を、ATP分解酵素の活性を保持させる濃度、かつ生細胞を生存させる濃度で使用することができる点も確認した（実施例1及び2）。このようにメタノールは酵素変性作用を有するため、必要であれば「細胞内のATPの抽出」工程144より前でメタノールを除いて、発光計測してもよい。

【0026】

本発明では、まず複数種の生細胞や死細胞ATP、遊離ATPを含むサンプル142へ最終濃度が0.01〜30 (v/v)％のメタノールと、グルコース、アラニン、ATP分解酵素145を接触させる。生細胞外ATP除去工程143・生細胞内ATP増加工程150では、生細胞内のATPを増加させ、生細胞外のATPを分解させるため、約5〜360分間、25〜50℃で加熱する。その後、必要であればメタノールやグルコース、アラニン、ATP分解酵素をフィルターでろ過(146)して除いてもよい。続いて、細胞の細胞壁を破壊して細胞内からATPを抽出(144)し、ATP分解酵素を失活させるため、ATP抽出液147を加える。抽出したATPは、発光試薬148と接触させ発光反応149を生じさせ、その発光量を定量することでサンプル中の生細胞数を定量できる。

【0027】

従って、本発明に係るサンプル中の細胞の測定方法では、
生細胞を含む疑いのあるサンプルにメタノールを添加して生細胞内のATPを増加させる第一工程、
細胞内のATPを抽出する第二工程、及び
抽出したATPを発光させる第三工程
を行う。

【0028】

サンプルは、測定対象の生細胞を含む疑いのあるサンプルであれば特に限定されるものではなく、液体、固体若しくは気体サンプル、又はこれらの混合サンプルであってよい。液体サンプルは、そのまま、又は溶媒で希釈若しくは濃縮して使用することができる。固体サンプルは、溶媒に懸濁するか、粉砕機などによりホモジナイズするか、あるいは溶媒と共に攪拌して得られる上清を使用してもよい。例えば綿棒などのスティックを無菌水で湿らせ、測定箇所をふき取った後に、溶媒の中ですすぎ、得られる液体をサンプルとしてもよい。溶媒としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられる。さらには、サンプルをフィルターでろ過し、サンプル成分（細胞）を捕捉したフィルターを用いることも可能である。そのようなフィルターは、細胞を捕捉できるサイズであれば特に限定されない。サンプルは、具体的には、例えば飲食品製造、臨床検査（尿、糞便、血液など）、医薬品製造、化粧品製造、排水処理、細菌検査（海水、河川水、工業用水、土壌など）、抗菌性試験、清浄度試験などにおける任意のサンプルを含む。サンプルの調製は、ATP発光計測法において慣用的に用いられている方法及び手段を用いて、当業者であれば適宜行うことができる。

【0029】

本発明において測定対照となる細胞は、ATPを含む細胞であれば特に限定されるものではない。本発明は、測定対象サンプルに細胞が含まれているかどうかを測定することを目的としているが、含まれている細胞は未知であり、特定することは困難である。そこで本測定法を使用する場合には、本測定法が正常であることを確認してから未知のサンプルを測定することが望ましい。これらの考え方は精度管理と呼ばれる考え方であり、陰性コントロールと陽性コントロールを使用して測定法を保証するのが一般的である。

【0030】

この中で陽性コントロールとして、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、エッシェリヒア（Escherichia）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、クロストリジウム（Clostridium）属、カンジダ（Candida）属、及びアスペルギルス（Aspergillus）属からなる群より選択される少なくとも1種類の菌体を使用することが好ましい。具体的には、例えば以下のような細胞を陽性コントロールとして使用することができ、また本発明に従って測定することができる：

【0031】

・細菌：グラム陽性細菌、例えば好気性芽胞細菌の枯草菌（Bacillus subtilis）、好気性細菌の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、好気性細菌のリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes）、嫌気性芽胞細菌のクロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）；
グラム陰性細菌、例えば好気性細菌の緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescence）、メチロバクテリウム・エクストルケンス（Methylobacterium extorquens）、大腸菌（Escherichia coli）、嫌気性細菌のサルモネラ属菌（Salmonella）、レジオネラ属菌（Legionella）；
・真菌：酵母、例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）；
クロコウジカビ（Aspergillus niger）。

【0032】

好ましくは、日本薬局方により規定されている9種類の生細胞（枯草菌、緑膿菌、蛍光菌、メチロバクテリウム・エクストルケンス、大腸菌、黄色ブドウ球菌、クロストリジウム・スポロゲネス、カンジダ・アルビカンス、及びクロコウジカビ）のうち2種以上、より好ましくは5種以上、最も好ましくは9種全てを含む陽性コントロールを使用する。

【0033】

第一工程では、生細胞を含む疑いのあるサンプルにメタノールを添加する。添加するメタノールの濃度は、最終濃度50％未満、好ましくは0.1〜30％、より好ましくは0.1〜5％、例えば1％である。なお、サンプルとしてフィルターを使用する場合には、フィルターをメタノール溶液に浸漬したり、フィルターにメタノール溶液を滴下又は噴霧することができる。

【0034】

サンプルには、さらに糖及びアラニンから選択される物質を添加することが好ましい。糖としては、グルコース、フルクトース及びスクロースからなる群より選択される少なくとも1つを用いることができる。糖は、最終濃度が0.8 mM以下、好ましくは0.1 mM以下となるように添加する。またアラニンは、最終濃度が0.5 mM以下、好ましくは0.1 mM以下となるように添加する。好ましい実施形態では、メタノールの最終濃度が1％であり、糖の最終濃度が0.1 mMであり、アラニンの最終濃度が0.1 mMである。

【0035】

第一工程と同時に、生細胞外のATPを除去する。具体的には、メタノールと同時にATP分解酵素を添加する。ATP分解酵素は、当技術分野で公知であり、公知のATP分解酵素を単独で又は組み合わせて、適当な反応条件（時間、温度及びpH）で使用することができる。具体的には、特許文献1（特許第3547882号）に記載のATP分解酵素、例えばアデノシンリン酸デアミナーゼ、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、アデノシントリホスファターゼなどが挙げられる。また、ATP発光計測法を実施するためのキットが市販されており、キット添付のATP分解酵素を使用することができる。なお、サンプルとしてフィルターを使用する場合には、フィルターをATP分解酵素溶液に浸漬したり、フィルターにATP分解酵素溶液を滴下又は噴霧することができる。

【0036】

ここで「同時」とは、2つの工程を全く同時に行うことだけではなく、2つの工程を連続的に行うことも意味する。例えば、メタノール（場合によりさらに糖及びアラニン）をサンプルに添加し、その添加と同時に又は後にATP分解酵素をサンプルに添加して反応を行ってもよいし、あるいはATP分解酵素をサンプルに添加し、その添加と同時に又は後にメタノール（場合によりさらに糖及びアラニン）をサンプルに添加して反応を行ってもよい。また、メタノールを添加する第一工程を行い、サンプル中のメタノールを除去した後に、ATP分解酵素を添加してもよいし、あるいはATP分解酵素を添加して生細胞外ATP除去工程を行い、サンプル中のATP分解酵素を除去した後に、メタノールを添加してもよい。操作の簡便性の点から、メタノールとATP分解酵素を順次にサンプルに添加して反応を行うことが好ましい。

【0037】

サンプルと、メタノール及び／又はATP分解酵素との反応は、使用するATP分解酵素の種類、メタノールの濃度、測定対象の細胞の種類などに応じて異なるが、25〜50℃、好ましくは30〜45℃において、1分以上、好ましくは1分〜6時間、より好ましくは5分〜2時間かけて行う。

【0038】

生細胞内ATP増加工程（第一工程）後、メタノールをサンプルから除去することが好ましい。そのため、例えば、上記工程後に、フィルターによるろ過でサンプル中の細胞をフィルターへ捕捉し、メタノールを含む溶液を除去した後に、第二工程及び第三工程を実施することが好ましい。また、生細胞外ATP除去工程後に、ATP分解酵素を除去するか又は失活させることが好ましい。ATP分解酵素の除去は、例えば、フィルターによるろ過、ATP分解酵素の阻害剤の添加などにより行うことができる。後述するATP抽出液として、ATP分解酵素を失活させる活性を有するものを使用してもよい。

【0039】

上述のように、サンプルをフィルターでろ過した後、そのフィルターをサンプルとして、第一工程及び第二工程をフィルター上で実施することも可能である。その場合には、メタノールを含む溶液の除去や、ATP分解酵素の除去は、フィルターを純水や緩衝液で洗浄することにより簡便に行うことができる。

【0040】

第二工程では、細胞内のATPを抽出する。細胞内ATPの抽出方法としては、ATP発光計測法において公知の方法、例えば、サンプルにATP抽出液を添加し、細胞内ATPを細胞外に抽出する方法を用いることができる。ATP抽出液は、細胞内からATPを抽出することができるものであれば限定されるものではなく、さらにATP分解酵素を失活できるものも知られている。そのようなATP抽出液は公知であり、市販されている。例えば、トリクロロ酢酸（TCA）、界面活性剤（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなど）、リゾチームなどが挙げられる。使用するATP抽出液の種類に応じて、サンプルへの添加量、反応条件などを適宜選択する。なお、サンプルとしてフィルターを使用する場合には、フィルターをATP抽出液に浸漬したり、フィルターにATP抽出液を滴下又は噴霧することができる。

【0041】

第三工程では、抽出したATPを発光させる。抽出したATPを発光させ、測定するには、ATP発光計測法において一般的に採用されている方法、例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用することができる。ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応は、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含む発光試薬をサンプルに添加して行う。発光試薬と抽出されたATPとが反応して発光が生じるため、その発光量を測定する。発光試薬としては、天然型ルシフェラーゼ及び変異型ルシフェラーゼのいずれでもよく、市販品を用いることができる。サンプルとしてフィルターを用いる場合には、フィルターからATP抽出サンプルを回収し、そのATP抽出サンプルに発光試薬を添加して発光を行なってもよいし、あるいは、フィルターを発光試薬に浸漬するか又はフィルターに発光試薬を滴下して、フィルター上で発光を行ってもよい。

【0042】

発光の測定は、当技術分野で公知の発光測定方法により、例えばルミノメーター、発光プレートリーダーを用いて、又は光電子増倍管を用いたフォトンカウンティングにより実施することができる。発光量を測定することにより、サンプル中の細胞を測定することができる。なお、本発明において「細胞の測定」とは、サンプル中の細胞の存在を検出すること、及び細胞の数を測定することを意味する。本発明の方法により、サンプル中の細胞を、特に複数種の細胞（生細胞）を1回の方法で、高感度、例えば1 amol/CFUを超えるATP内包量で、測定することが可能である。

【0043】

また上述した本発明の方法は、本発明の試薬を用いて簡便に実施することができる。本発明の試薬は、メタノールを含むことを特徴とする。本発明の試薬は、さらに糖（例えばグルコース、フルクトース及びスクロースからなる群より選択される少なくとも1つ）、及びアラニンを含んでもよい。本発明の試薬は、ATP分解酵素、ATP抽出液及び発光試薬からなる群より選択される少なくとも1つの試薬と共に供給されてもよく、これらの試薬が一緒にパッケージングされていることが好ましい。試薬の形態は、溶液状、粉末状、顆粒状などの任意の形態とすることができる。好ましくは、本発明の方法の実施に適した形態及び濃度で、それぞれの成分を含む。本発明の試薬は、細胞の測定方法を実施するための説明書をさらに含んでもよい。

【実施例】

【0044】

以下、図面を参照して本発明の実施形態の具体例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。

【0045】

［参考例1］Bacillus subtilisに対するグルコース及びアラニンのATP増加効果
芽胞状態の菌懸濁液のB.subtilis を栄研化学社から購入し、注射用水中で3日間、37℃で振盪培養して、ATP発光計測用の菌懸濁液とした。

【0046】

M.extorquensの菌懸濁液は、次の手順に従い作製された。M.extorquensをSCD液体培地（日水製薬社）5 mL中で72時間、25℃で振盪培養した。培養液（培地）をチューブへ分注し、10分間、10000 rpmで遠心して菌をチューブの底へ集めた。上澄み液を除き、代わりに水を加えて菌を懸濁し、再び10分間、10000 rpmで遠心して菌をチューブの底へ集めた。この工程を3回繰り返して、培地成分を除いた菌懸濁液を作製した。続いて注射用水中で3日間、37℃で振盪培養して、ATP発光計測用の菌懸濁液とした。

【0047】

菌のコロニー数を計測するため、必要であれば各菌試料を水で希釈した後、菌懸濁液をR2A寒天培地へ塗布して25℃で培養し、培養開始96時間後から168時間後までコロニー数を計測した。

【0048】

ATP発光計測用の試薬として、ルシフェールHSセット（キッコーマンバイオケミファ社）を用いた。なおルシフェールHSセットには、ATP消去酵素、ATP抽出試薬及び発光試薬が添付されている。

【0049】

B.subtilisとM.extorquensに対するグルコース及びアラニンのATP増減効果は次の手順に従い評価された。B.subtilisとM.extorquensの菌懸濁液50μLへグルコース（和光純薬）10μLとアラニン（和光純薬）10μL、ATP分解酵素10μLを加えた。最終的にリン酸緩衝液（pH 7.4）（インビトロジェン社）を加えて全量を100μLへ調整した。グルコースとアラニン、及びATP分解酵素の最終濃度をそれぞれ100 mMと50 mM、及び10 (v/v)％とし、各混合液を37℃で30分間加熱した。なお比較例1として、試薬セットの説明書記載のプロトコルとしてグルコースとアラニンの添加を除いた。

【0050】

加熱後の混合液100μLに対してATP抽出液100μLを加え、ATP抽出後のサンプル50μLを発光試薬50μLへ添加し、生じた発光を計測した。
結果を以下の表1に示す。

【0051】

【表1】

【0052】

表1に示すように、比較例1の方法の場合、注射用水という貧栄養下で芽胞を形成したB.subtilisのATP内包量は0.004 amol/CFUと低い値であり、この方法では1 CFUの検出は極めて困難であった。

【0053】

そこで、芽胞の発芽を促進することが知られていたグルコース及びアラニンを既報（J Bacteriol Vol.81, p.204, 1961年）に従って、それぞれ100 mM グルコース、50 mM アラニンを添加したところ（比較例2）、B.subtilisのATP内包量は30000％と飛躍的に増加し、1CFUの検出が可能なレベルに達した。一方、製薬用水の管理として日本薬局方に規定されている培地性能試験に使用されるMethylobacterium extorquensを同じプロトコールで測定した場合、M.extorquensのATP内包量は従来法（比較例1）の3割まで低下した。

【0054】

したがって、この条件下では、M.extorquensを高感度に計測することはできず、またB.subtilisとM.extorquensを1つのATP発光計測法で同時かつ高感度に計測することは困難であった。

【0055】

M.extorquensはメタノール資化性菌であることから、後述する実施例では、メタノールのATP増加効果を検討することとした。

【0056】

［参考例2］メタノールのATP発光反応への影響
後述する実施例においてメタノールのATP増加効果を検討するにあたり、まずメタノールのATP発光反応への影響を確認した。

【0057】

ATP溶液 1 mL（2 x 10⁵ amol ATP/mL、キッコーマンバイオケミファ社ルシフェールATP標準試薬セット）と100％メタノール（和光純薬社）10μL〜5 mLを混合し、さらに水（インビトロジェン社）加えて、メタノールの最終濃度が0.1〜50 (v/v)％のATP/メタノール溶液 10 mLを作製した（ATP濃度：2 x 10⁴ amol ATP/mL）。続いて、ATP/メタノール溶液 50μLと発光試薬 50μL（キッコーマンバイオケミファ社ルシフェールHSセット付属）を混合して発光反応を生じさせ、光電子増倍管を用いてフォトンカウンティングにより発光量を計測した。

【0058】

一方、比較のため、メタノールを含まないATP溶液 1 mL（2 x 10⁴ amol ATP/mL）を作製した。続いてATP溶液 50μLと発光試薬 50μLを混合して発光反応を生じさせ、発光量を計測した。

【0059】

メタノール濃度に対するATP・ルシフェラーゼ・ルシフェリン反応の発光量を表2に示す。表2では、0.1〜50 (v/v)％メタノールを含むATP溶液（サンプルNo.2〜5）と、メタノールを含まないATP溶液（サンプルNo.1）と、発光試薬との混合による発光量の比較を示している。

【0060】

【表2】

【0061】

0.1 (v/v)％メタノールを含むATP溶液（サンプルNo.2）と1 (v/v)％メタノールを含むATP溶液（サンプルNo.3）、メタノールを含まないATP溶液（サンプルNo.1）の発光量は、それぞれ12703 CPS（Count per second）と10200 CPS、11534 CPSで発光比は88〜110％を示した。一方、10 (v/v)％メタノールを含むATP溶液（サンプルNo.4）では発光比は29％まで減少し、50 (v/v)％メタノールを含むATP溶液（サンプルNo.5）では発光はほぼ示さなかった。
この結果、ATP発光反応・計測工程に混入するメタノールの濃度は1 (v/v)％以下が望ましいと考えられた。

【0062】

［実施例1］
本実施例では、ATP分解酵素の活性保持が可能なメタノール濃度を検討した。
ATP分解酵素を含むATP消去液（キッコーマンバイオケミファ社ルシフェールHSセット付属ATP消去試薬）10μLと濃度調整済みのメタノール80μLを混合した。そこへATP溶液2 x 10⁶ amol/10μLを加えて37℃で30分間静置した。なおメタノールの最終濃度は0.1〜80 (v/v)％へ調整した。

【0063】

上記混合液を発光試薬へ添加して残存ATP量を計測するため、ATP発光反応へ影響しないメタノール濃度0.1 (v/v)％以下まで水で混合液を希釈した（参考例2、表2)。続いてこの希釈液50μL（1 x 10³ amol ATP/50μL）を発光試薬50μLへ添加して発光量を計測した。なおATP分解酵素を加えていないATP溶液1 x 10³ amol/50μLを作製し、このATP溶液に対する発光量も計測した。ATP分解酵素が加わっていないATP溶液の発光量は、ATP分解酵素の活性が無くなった後にATPを加えた時のATP溶液の発光量とほぼ同じとみなせるため、この発光量を残存ATP分解酵素活性0％と定義した。

【0064】

図2に、ATP分解酵素の残存活性とメタノール濃度を示す。0〜50 (v/v)％メタノールの存在下でのATP分解酵素とATP溶液の混合液からATP発光反応は計測されなかった。これはATP分解酵素が0〜50 (v/v)％メタノールの濃度幅で活性を保持し、加えられたATPを分解したことを示す。一方、メタノール濃度が50 (v/v)％を超えるとATP分解酵素の活性は減少し始め、メタノール濃度が80 (v/v)％で酵素活性が20％まで減少した。

【0065】

この結果、メタノール濃度 50 (v/v)％以下であれば、ATP分解酵素を失活させず、生細胞外のATPの分解が可能であることが明らかとなった。

【0066】

［実施例2］
本実施例では、メタノールが本来殺菌効果を有することから評価菌に対するメタノール濃度の影響を検討した。

【0067】

菌懸濁液10μLと濃度調整済みのメタノール90μLを混合し100μLの菌/メタノール懸濁液を作製した。メタノールの最終濃度は0〜80 (v/v)％とし、菌としてBacillus subtilis（細菌、芽胞、ATCC 6633）、Staphylococcus aureus（細菌、好気性、ATCC 6538）、Candida albicans（真菌、酵母、ATCC 10231）を使用した。菌懸濁液とメタノールを混合して1分間静置した後、細菌の場合はR2A培地（日水製薬）へ塗り広げ25℃で7日間培養した。真菌の場合はPDA培地（日水製薬）へ塗り広げ25℃で5日間培養した。培養後、各メタノール濃度に対するコロニー数を計測した。0％メタノールのコロニー数を生存度100％として、各濃度のメタノールに対する菌の生存度を調べた。

【0068】

図3に、各メタノール濃度に対する菌の生存度を示す。B.subtilisは80 (v/v)％メタノールへ曝されても生存率100％を示した。一方、S.aureusとC.albicansは30 (v/v)％以下のメタノールで生存率90％以上を示した。

【0069】

この結果、30 (v/v)％以下のメタノールでは、B.subtilisとS.aureus、C.albicansの3種類の菌が共に細胞内で生命活動に必要な恒常性が保たれていることを示す。

【0070】

［実施例3］
本実施例では、M.extorquensに対するメタノールのATP増加効果を検討した。
M.extorquensの菌懸濁液は、次の手順に従い作製された。M.extorquensをSCD液体培地（日水製薬社）5 mL中で72時間、25℃で振盪培養した。培養液（培地）をチューブへ分注し、10分間、10000 rpmで遠心して菌をチューブの底へ集めた。上澄み液を除き、代わりに水を加えて菌を懸濁し、再び10分間、10000 rpmで遠心して菌をチューブの底へ集めた。この工程を3回繰り返して、培地成分を除いた菌懸濁液を作製した。続いて注射用水中で3日間、37℃で振盪培養して、ATP発光計測用の菌懸濁液とした。

【0071】

菌のコロニー数を計測するため、必要であれば各菌試料を水で希釈した後、菌懸濁液をR2A寒天培地へ塗布して25℃で培養し、培養開始96時間後から168時間後までコロニー数を計測した。

【0072】

以下、作製した菌懸濁液を用いた第1形態を示す。第1形態は各種試薬の混合のみによる発光計測である。

【0073】

M.extorquensの菌懸濁液50μLへグルコース（和光純薬社）とアラニン（和光純薬社）、ATP分解酵素、10％メタノール、リン酸緩衝液（pH 7.4）（インビトロジェン社）をそれぞれ10μL加えて全量を100μLの混合液を調整し、グルコースやアラニン、メタノールを加えない場合はリン酸緩衝液で全量を100μLへ調整した（表3、サンプルNo.1〜5）。混合液を37℃で30分間加熱した後、生細胞外ATP除去・生細胞内ATP増加工程において、混合液100μLへATP抽出液100μLを添加した（表3、サンプルNo.1〜4）。一方、メタノールのATP抽出効率を比較するため、ATP抽出工程において、混合液100μLへ1％メタノールを含むATP抽出液100μLを混合した（表3、サンプルNo.5）。ATP抽出後のサンプル50μLを発光試薬50μLへ添加し、生じた発光を計測した。

【0074】

以下、作製した菌懸濁液を用いた第2形態を示す。第2形態と第1形態の違いは、第2形態ではろ過を採用している点であり、集菌とメタノール除去の目的でろ過を使用している。

【0075】

M.extorquensの菌懸濁液50μLをウルトラフリーMC（ミリポア社、孔径0.45μm、ポリビニリデンフロライド製メンブレンフィルター）で遠心ろ過（1分間2000 rpm）し、フィルター上へ菌を集めた。フィルター上へグルコースとアラニン、ATP分解酵素、10％メタノールをそれぞれ10μL、リン酸緩衝液（pH 7.4）70μLを加えて、全量100μLの混合液を調製した。グルコースとアラニンの最終濃度を0.1 mMとし、ATP分解酵素とメタノールの最終濃度をそれぞれ10％と1％とした（表3、サンプルNo. 6）。フィルター上の混合液を37℃で30分間加熱した。加熱後、メタノールを含む混合液を除くため、混合液全てをウルトラフリーMCで遠心ろ過（1分間2000 rpm）し、ろ液である混合液を破棄した。続いて水200μLをフィルター上へ加えて、ろ過してフィルターを洗浄した。なお洗浄は5回繰り返した。洗浄後、フィルター上へATP抽出液100μLを加えて、5分間静置後、遠心ろ過（2000 rpm、1分間）してろ液を回収した。各ATP抽出後のサンプル50μLを発光試薬50μLへ添加し、生じた発光を計測した。
表3に、細胞内ATP発光計測法におけるM.extorquensの1 CFU当りのATP内包量（amol/CFU）を示す。

【0076】

【表3】

【0077】

サンプルNo.1とサンプルNo.2は実施例1と同じ結果である。サンプルNo.2の結果から、M.extorquensに対してアラニンとグルコースによる阻害が認められたので、阻害を低減するためアラニンとグルコースの濃度を低下させることにした。0.1 mM アラニンと0.1 mM グルコースにしたサンプルNo.3の場合、M.extorquensのATP量は0.9 amol/CFUへ増加し、阻害を回避するとともに従来法（参考例1の比較例1）よりも約3割ATP量を増加させる濃度を見出した。

【0078】

さらに、メタノールによるATP増加効果を検討するために、最終濃度1 (v/v)％になるようにメタノールを加えたところ、サンプルNo.4に示すとおり、ATP量は1.2 amol/CFUへ増加し、従来法（参考例1の比較例1）よりも約7割ATP量を増加させることができた。

【0079】

このメタノールの添加効果が細胞中のATP量を増加させた効果なのか、それとも特許文献4（特許第3811616号）に示されているATP抽出に対するメタノールの効果なのかを確認するために、サンプルNo.5に示すように「生細胞外ATP除去・生細胞内ATP増加」工程ではなく「ATP抽出」工程に1 (v/v)％メタノールを添加した場合の効果を検証した。その結果、サンプルNo.5のATP量は0.8 amol/CFUとサンプルNo.3と同レベルであり、1 (v/v)％メタノールはATP抽出に対しては効果がないことが確認された。

【0080】

さらに、サンプルNo.6の条件のように、「生細胞外ATP除去・生細胞内ATP増加」工程に1％メタノールを添加し、その後、ろ過洗浄により「ATP抽出」工程へのメタノールやグルコース、アラニンの持込をなくした場合においても、ATP量は1.2 amol/CFUを維持したことから、「生細胞外ATP除去・生細胞内ATP増加」工程での1 (v/v)％メタノール添加は、生細胞内でのATP内包量の増加に効果があることを明らかにした。

【0081】

［実施例4］
本実施例では、M.extorquensのグルコース及びアラニン量に対するATP量の関係を調べた。
M.extorquensの菌懸濁液は、次の手順に従い作製された。M.extorquensをSCD液体培地（日水製薬社）5 mL中で72時間、25℃で振盪培養した。培養液（培地）をチューブへ分注し、10分間、10000 rpmで遠心して菌をチューブの底へ集めた。上澄み液を除き、代わりに水を加えて菌を懸濁し、再び10分間、10000 rpmで遠心して菌をチューブの底へ集めた。この工程を3回繰り返して、培地成分を除いた菌懸濁液を作製した。続いて注射用水中で3日間、37℃で振盪培養して、ATP発光計測用の菌懸濁液とした。

【0082】

菌のコロニー数を計測するため、必要であれば各菌試料を水で希釈した後、菌懸濁液をR2A寒天培地へ塗布して25℃で培養し、培養開始96時間後から168時間後までコロニー数を計測した。

【0083】

M.extorquensの菌懸濁液50μLへ、グルコースとアラニン、ATP分解酵素、また必要に応じて10 (v/v)％メタノールをそれぞれ10μLを加えた。最終的にリン酸緩衝液（pH 7.4）（インビトロジェン社）を加えて全量を100μLへ調整した。グルコースとアラニンの最終濃度を0.1〜100 mMとし、ATP分解酵素とメタノールの最終濃度をそれぞれ10 (v/v)％と1 (v/v)％とし、各混合液を37℃で30分間加熱した。加熱後の混合液100μLへATP抽出液100μLを加え、ATP抽出後のサンプル50μLを発光試薬50μLへ添加し、生じた発光を計測した。

【0084】

図4Aは、1 (v/v)％メタノールと100 mMグルコースの存在下、アラニンの濃度を0.1〜50 mMまで変化させた際の1 CFU当りのM.extorquensのATP内包量（amol/CFU）である。ATP内包量はアラニンの濃度が10 mM以下から増大し、1 mM以下では0.9 amol/CFUを示した。

【0085】

図4Bは、1 (v/v)％メタノールと50 mMアラニンの存在下、グルコースの濃度を0.1〜100 mMまで変化させた際の1 CFU当りのATP内包量（amol/CFU）である。ATP内包量は、グルコース濃度を変化させても約0.5 amol/CFUで推移した。

【0086】

図4Cは、メタノール存在下又は非存在下でグルコースとアラニンの濃度を同時に0.1 mM、5 mM、50 mMへと変化させた際の1 CFU当りのATP内包量を示す。ATP内包量はメタノール非存在下で各濃度が5 mM以下から急に増加し、0.1 mMで0.9 amol/CFUを示した。この結果は、0.1 mMアラニンと100 mMグルコース、1％メタノールの組合せの結果と同じである（図4A）。しかしながら0.1 mM アラニンと0.1 mMグルコースへ、1％メタノールを加えると、ATP内包量は1.2 amol/CFUまで増大した。これはアラニンとグルコースを共に5 mM未満にし、さらにメタノールを加えることでATP量が増大することを示す。

【0087】

特許文献3（特開2006-174751号公報）には、グルコースとアラニンに有芽胞細菌の発芽促進に効果があることが示されているが、ATP増加効果に関しては何ら示されておらず、さらに図4の結果のようにグルコースとアラニンそれぞれ又は組み合わせにより、ATP増加効果に対して至適な濃度領域があることは本発明者が見出したことである。

【0088】

［実験例5］
本実施例では、メタノール濃度に対するATP内包量の増減の効果を調べた。
M.extorquensの菌懸濁液は、次の手順に従い作製された。M.extorquensをSCD液体培地（日水製薬社）5 mL中で72時間、25℃で振盪培養した。培養液（培地）をチューブへ分注し、10分間、10000 rpmで遠心して菌をチューブの底へ集めた。上澄み液を除き、代わりに水を加えて菌を懸濁し、再び10分間、10000 rpmで遠心して菌をチューブの底へ集めた。この工程を3回繰り返して、培地成分を除いた菌懸濁液を作製した。続いて注射用水中で3日間、37℃で振盪培養して、ATP発光計測用の菌懸濁液とした。

【0089】

菌のコロニー数を計測するため、必要であれば各菌試料を水で希釈した後、菌懸濁液をR2A寒天培地へ塗布して25℃で培養し、培養開始96時間後から168時間後までコロニー数を計測した。

【0090】

M.extorquensの菌懸濁液50μLへ、グルコースとアラニン、ATP分解酵素、メタノールをそれぞれ10μL加えた。最終的にリン酸緩衝液（pH 7.4）（インビトロジェン社）を加えて全量を100μLへ調整した。グルコースとアラニンの最終濃度を0.1 mMとし、ATP分解酵素の最終濃度を10 (v/v)％とし、メタノールの最終濃度を0〜80％とした。各混合液を37℃で30分間加熱した。加熱後、メタノールを含む混合液を除くため、混合液全てをウルトラフリーMCで遠心ろ過（1分間2000 rpm）し、ろ液である混合液を破棄した。続いて水200μLをフィルター上へ加えて、ろ過してフィルターを洗浄した。なお洗浄は5回繰り返した。洗浄後、フィルター上へATP抽出液100μLを加えて、5分間静置後、遠心ろ過（2000 rpm、1分間）してろ液を回収した。各ATP抽出後のサンプル50μLを発光試薬50μLへ添加し、生じた発光を計測した。

【0091】

図5Aは、0〜10％メタノール濃度に対するM.extorquensのATP内包量を示す。M.extorquensのATP内包量はメタノール濃度0.5％で最大値（1.5 amol/CFU）を示し、メタノール濃度0％では60％減少（0.7 amol/CFU）した。メタノール濃度0.1〜20％では最大値に対して70％以上のATP内包量（1.1 amol/CFU）を示した（図5A及びB）。一方、メタノール濃度30％以上ではATP内包量は90％減少（0.15 amol/CFU）した（図5B）。

【0092】

［実施例6］
日本薬局方によると「製薬用水の管理」や「無菌検査」に使用する培地が適切であるかを確認するための培地試験に使用する菌体として、以下の延べ9種類の菌種が規定されている：好気性芽胞細菌（グラム陽性）Bacillus subtilis（ATCC 6633）、好気性細菌（グラム陰性）Pseudomonas aeruginosa（NBRC 13275）、好気性細菌（グラム陰性）Pseudomonas fluorescence（NBRC 15842）、好気性細菌（グラム陰性）Methylobacterium extorquens（NBRC 15911）、好気性細菌（グラム陰性）Escherichia coli（ATCC 11775）、好気性細菌（グラム陽性）Staphylococcus aureus（ATCC 6538）、嫌気性芽胞細菌（グラム陽性）Clostridium sporogenes（ATCC 11437）、真菌（酵母）Candida albicans（ATCC 10231）、真菌（カビ・胞子）Aspergillus niger（ATCC 16404）。なお、「ATCC」とは、American Type Culture Collectionのカタログ番号を表し、「NBRC」とはNITE Biological Resource Centerの受託番号を表している。
本実施例では、上記の日本薬局方記載指標菌9種の細胞内ATP計測を行った。

【0093】

非芽胞形成菌（P.aeruginosa、P.fluorescence、M.extorquens、S.aureus、E.coli、C.albicans）の菌懸濁液を次の手順に従い作製した。各菌をSCD液体培地5 mLに加えて48時間振盪培養した。培養温度は日本薬局方を基準としてS.aureus、E.coliでは37℃、P.fluorescence、P.aeruginosa、M.extorquens、C.albicansでは25℃とした。培養後の培養液をチューブへ分注し、10000 rpmで10分間遠心してチューブの底へ菌を集めた。すべての菌について、各成分を含む上澄み液を除き、代わりに水を加えて懸濁して、10000 rpmで10分間遠心してチューブの底へ再び菌を集めた。この工程を3回繰り返して、各成分を除き水と置き換えた。続いて注射用水中で3日間、37℃で振盪培養して、ATP発光計測用の菌懸濁液とした。

【0094】

各菌のコロニー数を計測するため、必要であれば各菌試料を水で希釈した後、M.extorquensの懸濁液をR2A寒天培地へ塗布して25℃で培養し、培養開始96時間後から168時間後までコロニー数を計測した。B.subtilis、P.aeruginosa、P.fluorescence、E.coli、S.aureus、C.sporogenesの細菌懸濁液を標準寒天培地へ塗布して25℃で培養し、培養開始96時間後から168時間後までコロニー数を計測した。C.albicans、A.nigerの真菌懸濁液をPDA培地へ塗布し、各培地上の菌を20℃で培養し、培養開始120時間後のコロニー数を計測した。

【0095】

各菌懸濁液50μLへ、グルコースとアラニン、ATP分解酵素、10％メタノールをそれぞれ必要に応じてそれぞれ10μLずつ加え、リン酸緩衝液（pH 7.4）を加えて全量100μLの混合液を調製した。グルコースとアラニンの最終濃度を0.1 mMとし、ATP分解酵素とメタノールの最終濃度をそれぞれ10％と1％とした。各混合液を37℃で30分間加熱した。加熱後の混合液100μLに対してATP抽出液100μLを加えた。各ATP抽出後のサンプル50μLを発光試薬50μLと混合し、生じた発光を計測した。

【0096】

ATP発光計測法における、上述の公定菌9菌種に対するメタノール、グルコース及びアラニンのATP増加効果を表4に示す。

【0097】

【表4】

【0098】

B.subtilisについて参考例1に示したように、比較例1では1 CFUの検出が困難であったため、ATP増加効果をもたらす100 mMグルコースと50 mMアラニン条件下での各菌種におけるATP内包量を検討した（比較例2）。B.subtilisに対しては劇的な効果が認められ、P.fluorescens、P.aeruginosa、C.sporogenesについても同等から1.5倍程度のATP増加効果が認められたものの、その他の菌体に対しては阻害が認められた。

【0099】

そこで、グルコースとアラニンの濃度をそれぞれ0.1 mMに低減した結果（実施例6-1）、比較的ATP内包量の低いM.extorquens、S.aureus、P.fluorescens、P.aeruginosa、C.sporogenesに対してATP増加効果が認められ、B.subtilisのATP内包量は維持された。また、ATP高含有のA.niger、C.albicansについては、グルコースとアラニンの阻害からの回復は認められなかったものの、1 CFUを検出するには問題ないレベルのATP量であった。

【0100】

さらに、最終濃度1 (v/v)％になるようにメタノールを加えたところ（実施例6-2）、M.extorquensのATP内包量は従来法比1.7倍、S.aureus、P.fluorescens、P.aeruginosaは3倍弱、C.sporogenesは4倍弱、E.coli及びB.subtilisは同レベルであった。一方A.niger、C.albicansはそれぞれ3割強と8割強となったが、ATPの絶対量が多く、1 CFUに検出には問題ないレベルのATP内包量であることが明らかとなった。この様にメタノール資化菌のM.extorquensのみならず、多くの菌種に対してメタノールがATP増加効果を有するという驚くべき効果を見出した。

【0101】

またこれらの結果から、上述の9種類の菌体は、本測定法に従って検出可能であることが証明されたので、これらの菌種は、精度管理のための陽性コントロールとして使用可能であることが確認された。したがってこれら9種類の菌群から選択される少なくとも1種類の菌を陽性コントロールとして使用することが可能である。

【0102】

従来法で細胞数（特に生細胞数）を計測するには、複数の培地と培養温度、培養時間を必要とし、同時計測は困難であるか知られていなかった。本発明は、細菌や真菌（酵母・カビ）、芽胞や胞子、非芽胞、好気性や嫌気性、グラム陰性やグラム陽性など複数種の菌について、極めてATP内包量が少ない細胞についても、同時かつ高感度に検出することを可能とするものである。

【0103】

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明をわかりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加、削除又は置換を行うことが可能である。

【符号の説明】

【0104】

101 従来法のATP発光計測工程のフロー
102 サンプル
103 生細胞外ATP除去工程
104 細胞内ATP抽出工程
105 ATP発光反応・計測工程
106 ATP分解酵素
107 ATP抽出液
108 発光試薬
121 ATP発光法の各工程に対する生細胞、死細胞ATP及び遊離ATPとATP分解酵素の状態変化
122 生細胞
123 死細胞ATP・遊離ATP
124 ATP分解酵素
125 ATP分解酵素の活性有り
126 生細胞外ATPの分解
127 生細胞の生存
128 細胞内ATPの抽出
129 ATP分解酵素の活性無し
130 ATP発光反応
141 本発明のATP発光計測工程のフロー
142 複数種の細胞を含むサンプル
143 生細胞外ATP除去
144 細胞内ATP抽出工程
145 ATP分解酵素・メタノール・グルコース・アラニン
146 ろ過工程
147 ATP抽出液
148 発光試薬
149 ATP発光反応・計測工程
150 生細胞内ATP増加工程

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】