特許 5975480 バイオチップ、バイオアッセイ用キット、及びバイオアッセイ方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5975480

(24)【登録日】2016年7月29日

(45)【発行日】2016年8月23日

(54)【発明の名称】バイオチップ、バイオアッセイ用キット、及びバイオアッセイ方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/64 20060101AFI20160809BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/64 G

   G01N21/64 F

【請求項の数】11

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2012-176041(P2012-176041)

(22)【出願日】2012年8月8日

(65)【公開番号】特開2013-178224(P2013-178224A)

(43)【公開日】2013年9月9日

【審査請求日】2015年3月25日

(31)【優先権主張番号】特願2012-17598(P2012-17598)

(32)【優先日】2012年1月31日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100099933

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 敏

(72)【発明者】

【氏名】田和 圭子

(72)【発明者】

【氏名】吉田 康一

(72)【発明者】

【氏名】田中 喜秀

(72)【発明者】

【氏名】鳴石 奈穂子

(72)【発明者】

【氏名】笹川 知里

【審査官】 横井 亜矢子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−１５８３６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２２６９２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−０５７９８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２１０２５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−０６４９６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０６９４５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２１／００，２１／０１

Ｇ０１Ｎ ２１／１７−２１／７４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

蛍光分子を用いて抗原抗体反応を検出するために使用されるバイオチップであって、
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に、直接又は第１の接着層を間に挟んで形成された金属層と、
前記金属層の上に、第２の接着層を間に挟んで形成された保護層と、
前記保護層の上に形成された消光抑制層とを備え、
前記金属層は、表面プラズモン共鳴光を発生し且つ水溶液中で酸化され得る金属で形成され、
前記保護層は、酸化亜鉛又は酸化チタンで形成され、
前記消光抑制層は、二酸化ケイ素で形成され、
前記金属層に光が入射されることにより、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生し、
発生した前記電場を前記蛍光分子の励起場として増強蛍光を出力することを特徴とするバイオチップ。

【請求項2】

前記保護層の厚さは、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、
前記消光抑制層の厚さは、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。

【請求項3】

前記金属層は、銀で形成され、
前記保護層は、厚さ５ｎｍ以上３０ｎｍ以下の酸化亜鉛であることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオチップ。

【請求項4】

前記第２の接着層は、チタンで形成されることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載のバイオチップ。

【請求項5】

前記第１の接着層は、チタンで形成されることを特徴とする請求項４に記載のバイオチップ。

【請求項6】

前記第２の接着層の厚さは、０．１ｎｍ以上３ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載のバイオチップ。

【請求項7】

前記第１の接着層の厚さは、０．１ｎｍ以上３ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載のバイオチップ。

【請求項8】

表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に、直接又は第１の接着層を間に挟んで形成された金属層と、前記金属層の上に、第２の接着層を間に挟んで酸化亜鉛又は酸化チタンで形成された保護層と、前記保護層の上に二酸化ケイ素で形成された消光抑制層とを有するチップと、
バイオアッセイ用薬剤と、
蛍光分子とを含み、
表面プラズモン励起増強蛍光の検出に使用されることを特徴とするバイオアッセイ用キット。

【請求項9】

前記バイオアッセイ用薬剤は、
特定の抗原に結合する抗体と、
前記チップの表面をアミノ基修飾するためのシランカップリング剤と、
前記抗体を前記チップに対して固定するための架橋剤とを含み、
前記蛍光分子は、前記抗原又は前記抗体に、直接又は媒介分子を介して結合される分子であることを特徴とする請求項８に記載のバイオアッセイ用キット。

【請求項10】

表面に周期構造を有するベース基板と、前記周期構造の上に、直接又は第１の接着層を間に挟んで形成された金属層と、前記金属層の上に、第２の接着層を間に挟んで酸化亜鉛又は酸化チタンで形成された保護層と、前記保護層の上に二酸化ケイ素で形成された消光抑制層とを有するチップを用いて抗原抗体反応を検出する方法であって、
前記チップの前記周期構造を有する側の面に、バイオアッセイ用薬剤及び蛍光分子を注入する第１ステップと、
前記第１ステップが実行された後の前記チップに、光を入射して表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した前記電場を前記蛍光分子の励起場として用いて増強蛍光を検出する第２ステップとを含むことを特徴とするバイオアッセイ方法。

【請求項11】

前記第１ステップは、
前記消光抑制層の表面に前記シランカップリング剤を注入して前記消光抑制層の表面をアミノ基修飾するステップと、
アミノ基修飾された前記消光抑制層の表面に架橋剤を注入した後、特定の抗原に対する抗体を注入して、前記抗体を前記チップに対して固定するステップと、
前記抗体が固定された前記チップの表面に前記抗原を注入した後、前記抗原又は前記抗体に、直接又は媒介分子を介して結合する蛍光分子を注入するステップとを含むことを特徴とする請求項１０に記載のバイオアッセイ方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって発生する表面プラズモン共鳴光により蛍光物質を励起して蛍光を発生させ、表面プラズモン励起増強蛍光（以下、単に「増強蛍光」ともいう）を検出することにより抗原抗体反応を検出できるバイオチップ、抗原抗体反応検出用キット、及び、それらを用いた抗原抗体反応の検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体分子の相互作用を調べる技術であるバイオセンシング、及びそれに使用されるバイオチップの開発が成されている。生体分子の相互作用を調べる方法の一つに、表面プラズモン共鳴を使用した分光分析法が知られている。例えば、下記特許文献１には、表面プラズモン共鳴測定及び蛍光測定によって得られた信号を個別に分析することによって、被検体の固相への結合を判定する装置及びその方法が開示されている。

【0003】

また、下記特許文献２には、抗原抗体反応などの生体分子相互作用を高精度で検出することができる装置及び方法が開示されている。

【0004】

また、下記特許文献３〜６には、クレッチマン型のようにプリズムを使用する必要がない、表面に周期構造を有するマイクロプレート及びバイオチップ、並びに、それらを用いた表面プラズモン励起増強蛍光の検出装置（顕微鏡）及び方法が開示されている。特許文献３〜６に開示されたマイクロプレート及びバイオチップでは、ベース基板の表面に周期構造を形成し、周期構造の上に、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属層（金、銀等）、及び消光抑制層（ＳｉＯ_２、ＺｎＯ等）を形成する。さらに、必要に応じて、ベース基板と金属層との間、及び、金属層と消光抑制層との間に、接着層（Ｃｒ等）を形成する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開平１０−３０７１４１号公報

【特許文献2】特開２００６−２０８０６９号公報

【特許文献3】特開２００８−２８６７７８号公報

【特許文献4】特開２０１０−９６６４５号公報

【特許文献5】特開２０１１−１５８３６９号公報

【特許文献6】特開２０１１−２２６９２５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本願発明者は、生活習慣病マーカの一つの候補として考えられるＩＬ−６（インターロイキン−６）を抗原抗体反応によって検出するイムノアッセイのために、従来の周期構造を有するチップ（ベース基板／Ｃｒ／Ａｇ／Ｃｒ／ＳｉＯ_２）を用いて表面プラズモン励起増強蛍光の測定を試みた。周期構造（ピッチ５００ｎｍ（ナノメートル））を有するベース基板には、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）系高分子を使用し、その上に、膜厚１ｎｍのＣｒ、膜厚４０ｎｍのＡｇ、膜厚１ｎｍのＣｒ、及び膜厚４０ｎｍのＳｉＯ_２を形成した。このチップに対して、公知の検出用キットを用いて、公知のマルチステップアッセイを行なった。即ち、チップ表面の処理（アミノ基修飾）及び洗浄を行ない、抗ＩＬ−６抗体の固定、ブロッキング処理、抗原（ＩＬ−６）の注入、及び蛍光分子（蛍光標識蛋白質）の注入を行なった。

【0007】

マルチステップアッセイにおいて、ブロッキングのためにブロッキング剤（ブロックエース（登録商標））溶液又はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液を投入した段階から、チップ上に形成した多層膜の剥離が発生し始めた。さらに、蛍光分子（蛍光標識蛋白質）を結合させるためにビオチンラベル抗体を注入した段階で、チップ上の溶液の白濁が始まった。剥離及び白濁は、周期構造上に形成した多層膜中の銀が酸化したことによるものである。銀の酸化の原因としては、洗浄に使用したＰＢＳ（燐酸緩衝液）に含まれる界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）、高濃度のブロッキング剤、及び、多段階のアッセイであること等が考えられる。これらの点は、抗原抗体反応の検査等におけるバイオアッセイにおいては、不可欠である。

【0008】

特許文献４〜６には、金属層として銀を使用する場合、水中で非常に不安定な銀を保護するために、銀の酸化を防止するための層（酸化防止層）を形成することが望ましいことが記載されている。また、特許文献４〜６には、金属層と消光抑制層とを接着する接着層を、Ｃｒで膜厚０．１〜３ｎｍに形成すれば、銀の金属層を保護できることが記載されている。

【0009】

しかし、上記したように膜厚１ｎｍのＣｒで接着層を形成したチップを用いても、上記のようなバイオアッセイを実行すると、剥離及び白濁が発生する。即ち、チップの用途によっては、Ｃｒの接着層は、銀で形成された金属層の保護に有効であるとしても、上記のようなマルチステップのバイオアッセイにおいては、銀で形成された金属層を十分に保護できなかった。そして、バイオアッセイにおいて、銀で形成された金属層を十分に保護し、且つ、十分な蛍光強度を得るためのチップの構造及び材質は知られていなかった。

【0010】

したがって、本発明は、バイオアッセイにおいて周期構造上の多層膜が剥離しないバイオチップ、バイオアッセイ用キット、及びバイオアッセイ方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記の目的は、下記によって達成することができる。

【0012】

即ち、本発明に係るバイオチップは、蛍光分子を用いて抗原抗体反応を検出するために使用されるバイオチップであって、表面に周期構造を有するベース基板と、周期構造の上に、直接又は第１の接着層を間に挟んで形成された金属層と、金属層の上に、直接又は第２の接着層を間に挟んで形成された保護層と、保護層の上に形成された消光抑制層とを備え、金属層は、表面プラズモン共鳴光を発生し且つ水溶液中で酸化され得る金属で形成され、保護層は、酸化亜鉛又は酸化チタンで形成され、消光抑制層は、二酸化ケイ素で形成され、金属層に光が入射されることにより、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生し、発生した電場を蛍光分子の励起場として増強蛍光を出力する。

【0013】

好ましくは、保護層の厚さは、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、消光抑制層の厚さは、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下である。

【0014】

より好ましくは、金属層は、銀で形成され、保護層は、厚さ５ｎｍ以上３０ｎｍ以下の酸化亜鉛である。

【0015】

さらに好ましくは、第２の接着層はチタンで形成される。

【0016】

好ましくは、第１の接着層はチタンで形成される。

【0017】

より好ましくは、第２の接着層の厚さは０．１ｎｍ以上３ｎｍ以下である。

【0018】

さらに好ましくは、第１の接着層の厚さは０．１ｎｍ以上３ｎｍ以下である。

【0019】

本発明に係るバイオアッセイ用キットは、表面に周期構造を有するベース基板と、周期構造の上に、直接又は第１の接着層を間に挟んで形成された金属層と、金属層の上に、直接又は第２の接着層を間に挟んで酸化亜鉛又は酸化チタンで形成された保護層と、保護層の上に二酸化ケイ素で形成された消光抑制層とを有するチップと、バイオアッセイ用薬剤と、蛍光分子とを含み、チップの周期構造を有する側の面に、バイオアッセイ用薬剤及び蛍光分子を注入した後、表面プラズモン励起増強蛍光の検出に使用される。

【0020】

好ましくは、バイオアッセイ用薬剤は、特定の抗原に結合する抗体と、チップの表面をアミノ基修飾するためのシランカップリング剤と、抗体をチップに対して固定するための架橋剤とを含み、蛍光分子は、抗原又は抗体に、直接又は媒介分子を介して結合される分子であり、消光抑制層の表面にシランカップリング剤が注入されて消光抑制層の表面がアミノ基修飾され、アミノ基修飾された消光抑制層の表面に架橋剤が注入された後、抗体が注入されて、抗体がチップに対して固定され、抗体が固定されたチップの表面に抗原が注入され、蛍光分子が注入された後、表面プラズモン励起増強蛍光の検出に使用される。

【0021】

本発明に係るバイオアッセイ方法は、表面に周期構造を有するベース基板と、周期構造の上に、直接又は第１の接着層を間に挟んで形成された金属層と、金属層の上に、直接又は第２の接着層を間に挟んで酸化亜鉛又は酸化チタンで形成された保護層と、保護層の上に二酸化ケイ素で形成された消光抑制層とを有するチップを用いて抗原抗体反応を検出する方法であって、チップの周期構造を有する側の面に、バイオアッセイ用薬剤及び蛍光分子を注入する第１ステップと、第１ステップが実行された後のチップに、光を入射して表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した前記電場を前記蛍光分子の励起場として用いて増強蛍光を検出する第２ステップとを含む。

【0022】

好ましくは、第１ステップは、消光抑制層の表面にシランカップリング剤を注入して消光抑制層の表面をアミノ基修飾するステップと、アミノ基修飾された消光抑制層の表面に架橋剤を注入した後、特定の抗原に対する抗体を注入して、抗体をチップに対して固定するステップと、抗体が固定されたチップの表面に抗原を注入した後、抗原又は抗体に、直接又は媒介分子を介して結合する蛍光分子を注入するステップとを含む。

【発明の効果】

【0023】

本発明によれば、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生する金属層として銀を用いたバイオチップに、抗原抗体反応等を検出するためのマルチステップのバイオアッセイが実行されても、剥離及び白濁を生じない。したがって、表面プラズモン励起増強蛍光を安定して検出することができ、ＥＬＩＳＡ法等の従来の検出方法よりも短時間で抗原抗体反等の生物反応を検出することが可能になる。

【0024】

少なくとも、金属層と保護層とを接着するための第２接着層をチタンで形成することにより、マルチステップのバイオアッセイに対するバイオチップの耐性をより向上することができ、界面活性剤を含む洗浄液によって洗浄されても剥離が生じない。バイオアッセイにおいては、蛋白質等の非特異吸着を抑制するために、界面活性剤を含む洗浄液が一般に使用されるので、界面活性剤への耐性が高いバイオチップは特に有効である。

【0025】

また、第１及び第２接着層をチタンで形成することにより、クロムを使用する場合よりも、接着層の厚さを薄くすることができ、表面プラズモン共鳴による増強蛍光強度をより増大させることができる。

【0026】

また、消光抑制層を二酸化ケイ素で形成しているので、市販の抗原抗体反応等のバイオアッセイ用の薬剤をそのまま適用することができる。したがって、安価に実験することができる。

【0027】

また、本発明のバイオチップは、抗原抗体反応の検出に限らず、比較的長期間を要する細胞培養等にも使用可能である。本発明のバイオチップを細胞培養に使用する場合、バイオチップの上で直接、細胞培養が可能であり、長期間にわたって細胞培養を行ないながら、適宜、表面プラズモン共鳴蛍光顕微鏡で観察することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】本発明の実施の形態に係るバイオチップの構造を示す図である。

【図2】バイオチップに対する入射光の方向及び増強蛍光の検出方向を示す図である。

【図3】ベース基板表面の周期構造を示す断面図である。

【図4】スロープを有する周期構造を示す断面図である。

【図5】２次元周期構造が形成されたベース基板を示す平面図である。

【図6】バイオチップ上にシリコンウェルを設けた状態を示す斜視図である。

【図7】マルチステップアッセイを行なった後のチップを示す写真である。

【図8】ＣＣＤによりバイオチップ表面の蛍光画像を撮像するための構成を示す模式図である。

【図9】バイオチップ表面の蛍光画像を示す写真である。

【図10】バイオチップによる増強蛍光を測定するための構成を示す模式図である。

【図11】バイオチップによる反射率の測定結果を示すグラフである。

【図12】バイオチップによる増強蛍光の測定結果を示すグラフである。

【図13】バイオチップによる増強蛍光の測定結果を示すグラフである。

【図14】接着層をＣｒで形成したバイオチップによる反射率の測定結果を示すグラフである。

【図15】接着層をＴｉで形成したバイオチップによる反射率の測定結果を示すグラフである。

【図16】バイオチップによる増強蛍光を測定するための構成を示す模式図である。

【図17】接着層をＴｉで形成したバイオチップによる増強蛍光の測定結果を示すグラフである。

【図18】接着層をＣｒで形成したバイオチップによる増強蛍光の測定結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0029】

以下の実施の形態では、同一の部品には同一の参照番号を付してある。それらの名称及び機能も同一である。したがって、それらについての詳細な説明は繰返さない。

【0030】

図１を参照して、本発明の実施の形態に係るバイオチップ１００は、周期的構造を有するベース基板１０２と、周期的構造の上に形成された第１接着層１０４、金属層１０６、第２接着層１０８、保護層１１０及び消光抑制層１１２からなる多層膜とを備えて構成されている。

【0031】

バイオチップ１００が抗原抗体反応の検出に使用されるとき、消光抑制層１１２の表面に抗体を含む溶液が滴下され、抗体が消光抑制層１１２の表面に結合した後、抗原を含む溶液が滴下され、抗原抗体反応を生じさせる。このとき、抗原又は抗体に蛍光標識蛋白質（蛍光分子）を結合させる。バイオチップ１００は、その状態で図２に示したように、バイオチップ１００の正面（周期構造を有する面）又は背面から所定波長の光Ｌｉｎ１、Ｌｉｎ２が照射される。これによって、表面プラズモン共鳴が発生し、抗原又は抗体に結合された蛍光標識蛋白質からの増強蛍光Ｌｐを検出することができる。

【0032】

ベース基板１０２は、表面に周期的構造である格子が形成されている。ベース基板１０２は、入射光及び放射される蛍光に対して透明な材質、例えばガラス、又はプラスチック（ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等）等で形成されていれば、正面及び背面の何れからの照射においても使用できる。光の照射と検出を同じ側から行なうのであれば、ベース基板１０２は透明である必要はない。

【0033】

周期構造は、例えば一方向に沿ってほぼ等間隔に配置された複数の溝を有する形状である。溝は、例えば鋸歯状溝、正弦波状溝、矩形状溝である。上記した特許文献３〜６に開示されたマイクロプレートと同様に形成することができる。ナノスケールの周期構造を持つ周期構造は、例えば、特許第３３５０７１１号公報、特許第２８３２３３７号公報、特開２００４−１１７８１０号公報などに開示されている方法を使用して形成することができる。プラスチックであれば、スタンパー（型）を用いたプレス成型法又は射出成型法、モールド（型）を用いた熱ナノインプリント法、モールドを用いた光硬化樹脂による光ナノインプリント法等、公知の方法によって形成することもできる。

【0034】

具体的には、ベース基板１０２の表面の周期構造は、断面形状が図３に示した矩形状である。周期構造の周期（ピッチとも記す）、即ち隣接する溝の間隔（Ｍ＋Ｖ）は、蛍光観察に使用する波長以下又は波長程度、例えば１０〜１０００ｎｍであり、好ましくは１００〜６００ｎｍである。周期構造の高さｄ（溝の深さ）は４〜４００ｎｍ、アスペクト比ｄ／Ｖは０．００５〜１０である。凸部の長さをＭ、凹部の長さ（溝の幅）をＶとして、Ｍ／（Ｍ＋Ｖ）でデューティ比を定義する。望ましい溝の深さｄは２０〜４０ｎｍであり、望ましいデューティ比は０．５である。

【0035】

第１接着層１０４は、ベース基板１０２と金属層１０６とを接着するための層である。ベース基板１０２自体が安定して金属層１０６と固着する材質であれば、第１接着層１０４はなくてもよい。第１接着層１０４は、できるだけ薄いことが好ましく、例えば膜厚０．１〜３ｎｍのクロム（Ｃｒ）の薄膜として形成される。

【0036】

金属層１０６は、銀（Ａｇ）であり、例えばスパッタによって形成される。背面から光Ｌｉｎ２が入射される場合、金属層１０６の膜厚は、好ましくは１０〜５０ｎｍであり、より好ましくは２０〜５０ｎｍである。正面から光Ｌｉｎ１が入射される場合、金属層１０６の膜厚は、好ましくは５０ｎｍ以上であり、より好ましくは１００ｎｍ以上である。なお、ベース基板１０２の表面に、スパッタなどによって金属層１０６を形成した場合、図４に示すように、ベース基板１０２の周期構造の段差部分に対応する部分が傾斜（以下、この部分をスロープ部ＳＬという）する。図４において、第１接着層１０４は図示していない。また、後述する金属層１０６の上の保護層１１０及び消光抑制層１１２も同様にスロープＳＬを有する形状に形成される。

【0037】

第２接着層１０８は、金属層１０６と保護層１１０とを接着するための層である。金属層１０６が保護層１１０と安定して固着する材質であれば、第２接着層１０８はなくてもよい。第２接着層１０８は、できるだけ薄いことが好ましく、例えば膜厚０．１〜３ｎｍのクロムの薄膜として形成される。

【0038】

保護層１１０は、バイオアッセイに使用される水溶液（界面活性剤、ブロッキング剤等）から、金属層１０６を保護するための層である。バイオアッセイにおいて、バイオチップ１００の周期構造を有する表面は、界面活性剤、及びブロッキング剤等に繰返し比較的長時間さらされる。金属層１０６に銀を使用する場合、水中で非常に不安定な銀が酸化し、金属層１０６が損傷を受けて剥離してしまう。金属層１０６に金を使用すれば、酸化される問題はない。しかし、銀は金よりも蛍光の増強効果が大きく、イムノアッセイ等のバイオセンシング及びバイオイメージングには有効な金属である。保護層１１０は、銀の酸化を防止し、金属層１０６が損傷を受けて剥離することを防止する。保護層１１０は、入射光及び放射される蛍光に対して吸収が小さく透過率の大きい材質、例えば酸化亜鉛（ＺｎＯ）、又は酸化チタン（ＴｉＯ_２）等で形成されていれば、正面及び背面の何れからの照射においても使用できる。光の照射と検出を同じ側（チップの正面）から行なうのであれば、保護層１１０は透明である必要はない。

【0039】

保護層１１０の厚さは、後述する消光抑制層の厚さも考慮して決定する必要がある。保護層１１０がＺｎＯである場合、約５〜５０ｎｍが好ましく、約５〜３０ｎｍであることがより好ましい。

【0040】

消光抑制層１１２は、抗体を結合させるための層でもあり、市販のバイオアッセイ用のキット（薬剤）が使用できるように二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）で形成されることが好ましい。市販の薬剤には、ＳｉＯ_２への適用を想定しているものが多い。ＳｉＯ_２は、通常観察に使用される入射光及び発生する蛍光の波長領域で吸収を持たない（又は吸収が少ない）ので、透明な薄膜として形成することができる。例えば、スパッタによってＳｉＯ_２を形成する。

【0041】

表面プラズモン励起増強蛍光法の特徴である増強蛍光は、蛍光分子と金属層１０６との距離が近いと、強い励起場で励起された蛍光も金属表面にエネルギー移動して消光されてしまう。したがって、蛍光分子を金属層１０６から所定距離だけ離隔させて消光を抑制することが必要である。また、表面プラズモン共鳴による励起場は近接場であるために、金属表面から離れるにしたがってその電場強度は減衰するため、金属層１０６の表面からおよそ１００ｎｍ以内に存在する蛍光分子のみが効率よく励起される。そのために、保護層１１０及び消光抑制層１１２を合わせた膜厚は、約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲で金属層１０６の種類、消光抑制層１１２の屈折率、入射光の波長などに応じて決定される。例えば、金属層１０６が銀であり、保護層１１０がＺｎＯであり、消光抑制層１１２がＳｉＯ_２であり、６３３ｎｍの波長の励起光を用いる場合、保護層１１０及び消光抑制層１１２の合計の膜厚の最適値は好ましくは約１０〜１００ｎｍであり、より好ましくは約１０〜６０ｎｍである。消光抑制層の厚さは、好ましくは約５〜５０ｎｍであり、より好ましくは約２０〜３０ｎｍである。

【0042】

バイオチップ１００は上記したように、銀で形成された金属層１０６の上に酸化亜鉛又は酸化チタンの保護層１１０を備えているので、抗原抗体反応を検出するためのマルチステップアッセイが実行されても、剥離及び白濁を生じない。即ち、マルチステップアッセイにおいて、高濃度のブロッキング剤等から、金属層１０６を保護し酸化を防止することができる。

【0043】

さらに、第１接着層１０４及び第２接着層１０８に、マルチステップアッセイにおけるチップの耐性を向上させる役割を持たせることもできる。上記では、第１接着層１０４及び第２接着層１０８がクロムで形成されることを説明したが、後述するように、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をチタン（Ｔｉ）で形成することにより、洗浄に使用されるＰＢＳ（燐酸緩衝液）に含まれる界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）に対するチップの耐性を向上させることができることが分かった。第１接着層１０４及び第２接着層１０８の膜厚は、できるだけ薄いことが好ましく、例えば０．１〜３ｎｍに形成されることが好ましい。なお、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をチタンで形成することが最も好ましいが、金属層１０６と保護層１１０とを接着するための第２接着層１０８の方が、ベース基板１０２と金属層１０６とを接着するための第１接着層１０４よりも、界面活性剤と接する可能性が高いので、第２接着層１０８のみをチタンで形成しても、十分な耐性を実現できる。この場合、第１接着層１０４の材質は、接着機能があれば任意であり、クロムであってもよい。

【0044】

したがって、バイオチップ１００は、比較的長期間を要する実験にも使用可能である。例えば、細胞培養に使用することができる。従来の構造のバイオチップ又はマイクロプレートでは、培養液によって銀が酸化されてしまうので、細胞培養を行なった後、培養された細胞をバイオチップ又はマイクロプレートに搭載して、表面プラズモン共鳴蛍光顕微鏡で観察する必要がある。これに対して、バイオチップ１００を使用すれば、その上で細胞培養が可能であり、長期間にわたって細胞培養を行ないながら、適宜、表面プラズモン共鳴蛍光顕微鏡で観察することが可能である。

【0045】

なお、周期構造の形状は、上記した１方向に溝を有する形状に限定されず、ベース基板の表面に交差する２方向に溝を形成し構造、及び円形（フレネル）の周期構造等の２次元周期構造であってもよい。図５を参照して、ベース基板２００には２次元周期構造が形成されている。ベース基板２００の表面には、複数の溝部２１２が直交する２方向に、即ち凸部２１４が直交する２方向に配列している。交差する２方向の溝部２１２は直交している場合に限らず、斜めであってもよい。

【0046】

上記では、金属層１０６が銀で形成されている場合を説明したが、これに限定されない。金属層１０６が水溶液によって酸化され得る金属で形成されていれば、上記のように保護層１１０を形成することによって、金属層１０６を保護することができる。

【実施例1】

【0047】

以下に実験結果を示し、本発明の有効性を示す。

【0048】

図１に示した構造のバイオチップ２種類と、従来の構造のチップ１種類とを作製した。ベース基板には光硬化性樹脂を用い、１方向に溝を有する、ピッチが５００ｎｍの周期構造を形成した。第１接着層１０４及び第２接着層１０８はＣｒで形成し、金属層１０６、保護層１１０、及び消光抑制層１１２はそれぞれＡｇ、ＺｎＯ、ＳｉＯ_２で形成した。各チップの各層の膜厚を表１に示す。第３チップが保護層を形成していない従来の構造のチップである。

【0049】

【表1】

【0050】

図６に示すように、上記の各チップの周期構造及び多層膜を形成した側の面３００上に、周期構造を形成した領域３０２を囲むように、シリコン製の側壁３０４を固定し、水溶液を保持するためのウェル（以下、シリコンウェルという）を設けた。このシリコンウェルによって、約５０〜７０μＬ（マイクロリットル）の水溶液を保持することができる。

【0051】

第１〜第３チップのそれぞれを用いて、生活習慣病マーカ（ＩＬ−６）の抗原抗体反応を検出するために、下記のステップ１〜ステップ７の順でアッセイを行なった。

【0052】

［アッセイの順序］
・ステップ１：チップのＳｉＯ_２表面をシランカップリング剤によりアミノ基修飾する。
（１）２％シランカップリング剤（信越シリコーン社製、化学名：Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、製品番号：ＫＢＭ−６０３）を、チップ上に滴下し、４０℃で２時間インキュベーションを実行する。
（２）１％酢酸水溶液、及びＭＩＬＬＩ−Ｑ（登録商標）水（超純水）を順次用いてチップ上を洗浄し、６０℃で４時間インキュベーションを実行する。
・ステップ２：クロスリンカー（架橋剤）により抗体を固定し、シリコンウェルをチップ上に取付ける。
（１）２ｍＭ（ミリモラー、１Ｍ＝１ｍｏｌ／Ｌ）のＢＳ３（Ｔｈｅｒｍｏ社製、製造番号２１５８６）又はＰＥＧリンカーをチップ上に注入し、２５℃で１０分間インキュベーションを実行する。
（２）ＭＩＬＬＩ−Ｑ水で、チップ上を洗浄する。
・ステップ３：抗ＩＬ−６抗体を固定する。具体的には、１／２００希釈抗体をチップ上に注入し、２５℃で３０分間インキュベーションを実行する。
・ステップ４：ブロッキングを行なう。具体的には、６０μｇ／ｍＬの濃度のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液を、チップ上に注入し、２５℃で５分間インキュベーションした後、ＰＢＳ（燐酸緩衝液）で、チップ上をリンス（洗浄）する。
・ステップ５：抗原ＩＬ−６をチップ上に注入し、５分間インキュベーションを実行した後、ＰＢＳで、チップ上を洗浄する。
・ステップ６：ビオチンラベル抗体をチップ上に注入し、５分間インキュベーションを実行した後、ＰＢＳでチップ上を洗浄する。
・ステップ７：１０ｎＭ（ナノモラー）のＣｙ５−ストレプトアビジン（蛍光標識蛋白質）をチップ上に注入し、５分間インキュベーションを実行した後、ＰＢＳでチップ上を洗浄する。

【0053】

上記のマルチステップアッセイを行なった後の各チップを、チップ正面から撮影した写真を図７に示す。（ａ）は第１チップ、（ｂ）及び（ｃ）は第３チップの写真である。中央の円形部分が水溶液を注入して、マルチステップアッセイを実行したシリコンウェルである。写真（ａ）の第１チップでは、シリコンウェル内の周期構造部分に剥離も白濁も発生していない。写真（ｂ）の第３チップでは、剥離が発生しており、周期構造部分が白くなっている。写真（ｃ）の第３チップでは、周期構造部分が白濁して、周期構造領域３０２が判別できるようになっているが、これもミクロな剥離が始まっていると思われる。

【0054】

図８に示した配置で、表面プラズモン共鳴による増強蛍光をＣＣＤ３１６により撮像して得られた画像を図９に示す。図８では、Ｈｅ−Ｎｅレーザ（波長６３３ｎｍ）光源３１０からの光を、偏光器３１２によって偏光させた後、ミラー３１４で反射させ、レンズ３０６及び３０８を介して各チップ１００の背面から入射した。レーザ光の利用効率を上げるために、レンズ３０６及び３０８の焦点位置がそれぞれミラー３１４の反射点及びチップ１００（ベース基板１０２）の入射点と重なる光学配置をとっている。検出角度θｏｕｔ（ＣＣＤ３１６の配置方向）を３度とし、入射角度θをミラー３１４の傾きを調整して２０〜２６°の範囲で１度ずつ動かし、共鳴角付近の蛍光像を撮影した。なお、チップ１００の透過光が直接ＣＣＤ３１６に入射しないように、ＣＣＤ３１６は、チップ１００の法線に対して、レンズ３０６及び３０８と同じ側に配置されている。

【0055】

図９において、（ａ）は第３チップ（保護層なし）の撮像結果であり、（ｂ）は第１チップの撮像結果である。（ａ）では、増強蛍光による円形の高輝度領域以外に、細かい高輝度部分が多数観察できる。細かい高輝度部分は、通常では観測されないものであり、チップ上の多層膜が剥離し、これにより乱反射されたレーザ光が観測されたものである。これに対して、（ｂ）では、増強蛍光による高輝度領域しか観察されない。このことから、ＺｎＯの保護層を形成した第２チップでは、金属層（Ａｇ）を十分に保護できたことが分かる。

【0056】

図１０に示した配置で、チップ背面からの反射光を測定した結果を図１１に示す。図１０に示すように、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源３１０からの光を、シャッタ３１８、光チョッパ３２０、及び偏光器３１２を介して、チップ１００の背面に入射した。反射光の測定には、フォトダイオード３２４を使用した。図１１の横軸は、光の入射角度θｉｎ（＝反射光の検出角度θｒ）である。図１１において、（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ、第１〜第３チップに関する結果である。（ａ）及び（ｂ）では、グラフに大きな谷が生じており、表面プラズモン共鳴が発生していることが分かる。したがって、第１及び第２チップは、表面プラズモン共鳴による蛍光観測に使用可能である。一方、（ｃ）のグラフでは、反射率が０．１よりも小さく、平坦であって谷が生じていない。このことから、第３チップでは、上記したように白濁が生じていたので、レーザ光が散乱され、表面プラズモン共鳴が発生していないことが分かる。したがって、第３チップは表面プラズモン共鳴による蛍光観測には使用できない。

【0057】

図１０に示した配置で、表面プラズモン共鳴による増強蛍光の強度を測定した結果を図１２に示す。表面プラズモン共鳴による増強蛍光は、チップの正面（周期構造を有する面）から光電子増倍管（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）３２２で測定した。入射角度θｉｎ（度）、検出角度θｏｕｔ（度）はそれぞれ、θｉｎ＝２３〜２４、θｏｕｔ＝０ とした。

【0058】

図１２の縦軸は、蛍光強度（ｃｐｓ：１秒当たりの観測数）であり、横軸は抗原ＩＬ−６の濃度である。第１チップに関する測定値を丸でプロットし、第３チップに関する測定値を三角形でプロットしている。同じ濃度の抗原ＩＬ−６に関して、第１チップを用いて測定した蛍光強度は、第３チップを用いて測定された値よりも明らかに大きい。抗原ＩＬ−６の濃度が１００ｐｇ／ｍＬの場合、表面プラズモン共鳴が確認できた第１チップの蛍光強度は第３チップの蛍光強度の約１０倍であった。

【実施例2】

【0059】

図１３は、保護層を形成したチップ、及び抗原ＩＬ−６を用いて、上記と同様のマルチステップアッセイを行ない測定した結果である。実験Ａ（測定値を丸で示す）及び実験Ｂ（測定値を三角形で示す）は、上記の第２及び第１チップを用いた結果である。実験Ｃ（測定値を四角形で示す）は、上記の第１チップと同じ構造、同じ膜厚で作製したチップであるが、第１チップとは作製日が異なるチップを用いた結果である。

【0060】

図１３において、実験Ａ〜Ｃの測定結果がほぼ曲線に乗っていることから、本バイオチップを用いた測定の再現性が高いことが分かる。通常、抗原ＩＬ−６の濃度が高くなると観測される蛍光強度が高くなる（図１３からもこのことが分かる）。１０ｐｇ／ｍＬ以下の濃度のＩＬ−６を公知のＥＬＩＳＡキットなどを用いて酵素反応による蛍光を計測する場合には、露光時間は数時間単位になることが知られているが、図１３のグラフから、これらのチップであれば、抗原ＩＬ−６の濃度が１０ｐｇ／ｍＬ以下であっても、約１秒で測定できることが分かる。このことから、迅速計測が可能な本バイオチップが非常に有効であることが理解できる。

【実施例3】

【0061】

図１に示した構造のバイオチップ４種類を、それぞれ複数作製した。ベース基板には光硬化性樹脂を用い、１方向に溝を有する、ピッチが５００ｎｍの周期構造を形成した。金属層１０６、保護層１１０、及び消光抑制層１１２はそれぞれＡｇ、ＺｎＯ、及びＳｉＯ_２で形成した。第１接着層１０４及び第２接着層１０８は、Ｃｒ又はＴｉで形成した。各チップの各層の材質及び膜厚を表１に示す。第１チップは、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＣｒで形成したチップである。第２〜第４チップは、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉで形成したチップである。第４チップでは、ＺｎＯの保護層を形成しなかった。

【0062】

【表2】

【0063】

実施例１と同様に、図６に示すようにシリコンウェルを設け、上記のステップ１〜ステップ７と同様のマルチステップのアッセイを行なった。但し、実施例１の場合よりも濃度の高いＢＳＡ溶液を使用した。具体的には、６ｍｇ／ｍＬの濃度のＢＳＡ溶液（市販のＥＬＩＳＡキットに含まれるＡｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔで希釈）を使用した。また、界面活性剤に対するチップの耐性を評価するために、界面活性剤を含むＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む）でチップを洗浄するマルチステップアッセイと、実施例１と同様に、界面活性剤を含まないＰＢＳでチップを洗浄するマルチステップアッセイとを実施した。

【0064】

マルチステップアッセイ後のチップを目視で確認した結果、界面活性剤を含まないＰＢＳでチップを洗浄するマルチステップアッセイにおいて、実施例１の場合よりもはるかに高濃度（約１００倍）のＢＳＡ溶液を使用したにもかかわらず、第１〜第４チップの何れも剥離しなかった。

【0065】

界面活性剤を含むＰＢＳで洗浄するマルチステップアッセイにおいては、第１チップにおいてのみ剥離が生じた。第２〜第４チップには、界面活性剤を含むＰＢＳで洗浄するマルチステップアッセイにおいても、剥離は生じなかった。但し、複数作製した第４チップの中には、明確な剥離は生じてはいないが、白濁が観察されたチップもあった。

【0066】

これらのことから、高濃度のＢＳＡ溶液及び界面活性剤に対してチップを保護するには、接着層をＴｉで形成し、ＺｎＯの保護層を形成することが最も好ましい。なお、接着層がＣｒで形成されていても、高濃度のＢＳＡ溶液に対して、チップを保護することができる。

【0067】

実施例１と同様に、図１０に示した配置で、チップ背面からの反射光を測定した結果を図１４及び図１５に示す。図１４及び図１５の横軸は、光の入射角度θｉｎ（＝反射光の検出角度θｒ）である。図１４は第１チップの条件で成膜した２枚のチップ（グラフＡ及びＢに対応）を用いた測定結果であり、図１５は第２チップの条件で成膜した２枚のチップ（グラフＡ及びＢに対応）を用いた測定結果である。図１４及び図１５のグラフＡ及びＢともに、高濃度ＢＳＡでのブロッキング処理をアッセイ過程に含み、界面活性剤を含むＰＢＳでチップを洗浄するマルチステップアッセイ後の測定結果である。

【0068】

図１４のグラフＡでは、グラフに大きな谷が生じており、反射率は下がっているものの、まだ表面プラズモン共鳴が発生していることが分かる。それに対して、グラフＢでは、反射率がほぼ０であり、表面プラズモン共鳴が発生していないことが分かる。これは、グラフＢを得た第１チップに剥離が生じたためである。グラフＡの反射率が低下しているので、グラフＡを得た第１チップにおいても、部分的にミクロな剥離が生じていると考えられる。

【0069】

図１５のグラフＡ及びグラフＢの何れも、グラフに大きな谷が生じており、表面プラズモン共鳴が発生していることが分かる。また、図１４のグラフＡでは、反射率は、入射角度が大きくなると減少する傾向にある（右下がりの破線の直線参照）が、図１５のグラフＡ及びグラフＢではそのような減少傾向は殆どない。即ち、図１５のグラフＡ及びグラフＢは、図１４のグラフＡと比較して反射率が保持されており、第２チップの方が第１チップよりも、表面プラズモン共鳴による蛍光観察に、より適したチップであると言える。

【実施例4】

【0070】

実施例３と同様に、金属層１０６、保護層１１０、及び消光抑制層１１２をそれぞれＡｇ、ＺｎＯ、及びＳｉＯ_２で形成し、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉ又はＣｒで形成したチップを用いて、表面プラズモン共鳴による増強蛍光強度の評価を行なった。各層の膜厚は、実施例３と同様である。具体的には、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＣｒで形成したチップでは、第１接着層１０４、金属層１０６、第２接着層１０８、保護層１１０、及び消光抑制層１１２の膜厚はそれぞれ、１ｎｍ（Ｃｒ）、３９ｎｍ（Ａｇ）、１ｎｍ（Ｃｒ）、１６ｎｍ（ＺｎＯ）、２０ｎｍ（ＳｉＯ_２）であった。第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉで形成したチップでは、第１接着層１０４、金属層１０６、第２接着層１０８、保護層１１０、及び消光抑制層１１２の膜厚はそれぞれ、０．２ｎｍ（Ｔｉ）、３９ｎｍ（Ａｇ）、０．４ｎｍ（Ｔｉ）、１６ｎｍ（ＺｎＯ）、２０ｎｍ（ＳｉＯ_２）であった。

【0071】

実施したバイオアッセイは、抗原抗体反応を検出するためのアッセイではない。したがって、実施例１とは異なり、上記のステップ３〜６を含まない。また、上記のステップ１におけるアミノ基修飾には、ＡＰＴＥＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）を使用した。実施例１のステップ２では、抗体を固定するためにクロスリンカーを使用したが、ここでは、ＮＨＳ−ＰＥＧ−Ｂｉｏｔｉｎによるビオチン修飾を行った。その後、ステップ７では、１００ｎＭのＣｙ５−ストレプトアビジンを注入した。

【0072】

バイオアッセイ後のチップを用いて、図１６に示した配置で、表面プラズモン共鳴による増強蛍光の強度を測定した結果を図１７及び図１８に示す。図１６における機器の構成及び配置は、図１０と同じである。図１０では、光電子増倍管３２２の位置を固定している（検出角度θｏｕｔ＝０（度））が、ここでは、光電子増倍管３２２を回転移動させ、即ち、チップ１００と光電子増倍管３２２との距離を一定に保ち、検出角度θｏｕｔ（度）を変化させて測定した。

【0073】

図１７及び図１８において、横軸は検出角度θｏｕｔ（度）であり、縦軸は蛍光強度（ｃｐｓ）である。図１７は、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉで形成したチップの測定結果である。図１８は、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＣｒで形成したチップの測定結果である。図１７における２本のグラフは、Ｃｙ５−ストレプトアビジンをインキュベーションした後と、これをＴｗｅｅｎ入りＰＢＳで洗浄した後のチップの測定結果を表している。下側のグラフがＴｗｅｅｎ入りＰＢＳでの洗浄後の結果である。図１８の２本のグラフの意味も同様である。

【0074】

図１７及び図１８のグラフから分かるように、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉで形成したチップの方が、蛍光強度が大きい。それぞれのグラフのピーク位置における、共鳴角度（θｉｎ）は、図１７では８．５度、図１８では９度であった。リバースカップリング角（θｏｕｔ）は、図１７では１２度、図１８では１１度であった。平均蛍光強度は、図１７では６．９×１０^８ｃｐｓ、図１８では３．１８×１０^８ｃｐｓであった。

【0075】

このように、バイオチップにおいて、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＴｉで形成することにより、界面活性剤への耐性を向上させることができることに加えて、蛍光強度を、第１接着層１０４及び第２接着層１０８をＣｒで形成した場合と比較して、２倍以上に増大させることができる。これは、プラズモン生成の抑制原因となり得る第１接着層１０４及び第２接着層１０８を、より薄く形成することができるからである。

【0076】

上記の実施例では、本発明のバイオチップをイムノアッセイ（免疫測定法）において使用した実験例を示したが、これに限定されない。本発明のバイオチップは、広く生物的反応を分析・評価するためのバイオアッセイにおいて有効である。

【0077】

以上、実施の形態を説明することにより本発明を説明したが、上記した実施の形態は例示であって、本発明は上記した実施の形態に限定されるものではなく、種々変更して実施することができる。

【符号の説明】

【0078】

１００ バイオチップ
１０２ ベース基板
１０４ 第１接着層
１０６ 金属層
１０８ 第２接着層
１１０ 保護層
１１２ 消光抑制層

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図7】