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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5995593
(24)【登録日】2016年9月2日
(45)【発行日】2016年9月21日
(54)【発明の名称】抗炎症剤
(51)【国際特許分類】
A61K 35/74 20150101AFI20160908BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20160908BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20160908BHJP
【ＦＩ】
A61K35/74 A
A61P29/00
A61P43/00 105
【請求項の数】2
【全頁数】11
(21)【出願番号】特願2012-172166(P2012-172166)
(22)【出願日】2012年8月2日
(65)【公開番号】特開2014-31325(P2014-31325A)
(43)【公開日】2014年2月20日
【審査請求日】2015年7月30日
【微生物の受託番号】NITE-IPOD FERM P-21411
(73)【特許権者】
【識別番号】591082421
【氏名又は名称】丸善製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】林 多恵子
(72)【発明者】
【氏名】桑原 浩誠
【審査官】
加藤 文彦
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００６−５１９０１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１２／０１４９７１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２０１２−００００９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１１／０９２２６１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２０１０−０４７５０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００９−５１１４７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００９−１２４９４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Inflammation，２０１２年 ４月，Vol.35, No.4，p.1487-1499
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３５／７４
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１４１１を含み、ＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用を有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項2】
ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１４１１の細胞壁画分を含み、ＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用を有することを特徴とする抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【0002】
炎症反応は、免疫担当細胞から分泌される炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインとのバランスが崩れることにより、惹き起こされる。また、このような炎症反応が持続することにより、自己免疫疾患などの疾患が引き起こされることが知られている。
【0003】
前記炎症性サイトカインとしては、例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）などが知られており、前記炎症性サイトカインやそのｍＲＮＡの発現を抑制することで炎症を抑制できると考えられている。そこで、前記ＴＮＦ−αの発現を抑制する成分として、例えば、シソ抽出液（非特許文献１参照）、ヒガンバナ科アルカロイドのリコリン及びリコリシジノール（非特許文献２参照）などが提案されている。また、前記ＩＬ−８の発現を抑制する成分として、例えば、ラマトロバン（特許文献１参照）などが提案されている。
【0004】
前記抗炎症性サイトカインとしては、例えば、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）などが知られており、前記抗炎症性サイトカインやそのｍＲＮＡの発現を促進することで炎症を抑制できると考えられている。そこで、前記ＴＧＦ−β１の発現を促進する成分として、例えば、ツバキの種子の脱脂粕の水性成分（特許文献２参照）などが提案されている。
【0005】
一方、炎症性サイトカインや抗炎症性サイトカインは、上述したように、前記免疫担当細胞により分泌されるが、前記免疫担当細胞は、その半分以上が腸に集中している。そのため、腸内環境のバランスを整えることに有効な乳酸菌を用いて、腸管における炎症反応を抑制し、前記自己免疫疾患などの疾患を予防できる医薬品が求められている。
【0006】
しかしながら、前記炎症反応に関与する、前記ＴＮＦ−α発現抑制作用、前記ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及び前記ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用のいずれの作用をも有し、腸管の炎症を抑制できる乳酸菌由来の抗炎症剤は未だ発見されておらず、そのような乳酸菌の発見が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開平１１−３２２６００号公報
【特許文献2】特開２００９−１５５３１７号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】「炎症」１９９３年，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．４，ｐ．３３７〜３４０
【非特許文献2】「薬学雑誌」２００１年，Ｖｏｌ．１２１，Ｎｏ．２，ｐ．１６７〜１７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れたＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用のいずれの作用をも有し、自己免疫疾患を抑制できる乳酸菌由来の抗炎症剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、乳酸菌であるラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が、優れたＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用のいずれの作用をも有し、自己免疫疾患を抑制できる抗炎症剤となることを知見し、本発明を完成した。
【0011】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、＜１＞ ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を含み、ＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用を有することを特徴とする抗炎症剤である。
＜２＞ ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が、受託番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４１１である前記＜１＞に記載の抗炎症剤である。
【発明の効果】
【0012】
本発明は、従来における問題を解決し、優れたＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用のいずれの作用をも有し、自己免疫疾患を抑制できる乳酸菌由来の抗炎症剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
（抗炎症剤）本発明の抗炎症剤は、優れたＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用のいずれの作用をも有するため、炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインとのバランスが良好に保たれ、腸管炎症等の自己免疫疾患などを治療乃至予防することができる。
【0015】
（１）前記ＴＮＦ−αは、炎症の初発から終息までの過程において重要な役割を担っており、その持続的かつ過剰な産生は、皮膚を含めた組織の障害を引き起こし、炎症性の疾患、例えば、接触性皮膚炎、乾癬、尋常性天疱瘡、肌荒れを伴う各種皮膚疾患の原因となり、炎症の悪化を惹き起こす。そのため、前記ＴＮＦ−αの発現を抑制することにより、上述する炎症症状を緩和できると考えられている。（２）前記ＩＬ−８は、炎症性サイトカインの刺激により、末梢血単球、組織マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞等の種々の細胞から産生される白血球遊走因子である。前記ＩＬ−８の過剰な産生は、好中球の浸潤を伴う炎症疾患、関節リウマチ、痛風、喘息発作、クローン病などの疾患に関与することが知られている。そのため、前記ＩＬ−８のｍＲＮＡ発現を抑制することにより、上述する疾患を緩和できると考えられている。
（３）前記ＴＧＦ−β１は、炎症症状を抑制する働きをもつサイトカインであり、活性化マクロファージなどから産生される。また、前記ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現を促進することにより、細胞外基質蛋白が産生され、分解酵素を抑制して創傷治癒を促進することができると考えられている。
【0016】
本発明の抗炎症剤は、ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
【0017】
＜ラクトバシルス・プランタラム＞前記ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の２２Ａ−１株、２２Ａ−３株、２２Ｂ−２株などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用に優れる点で、ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の２２Ａ−３株が好ましい。
【0018】
前記ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の２２Ａ−１株、２２Ａ−３株、２２Ｂ−２株は、本出願人らにより漬物から単離乃至同定された株であり、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
【0019】
前記ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の２２Ａ−１株の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に２００７年１０月２２日に国内寄託されており、受領番号は、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４０９、受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−２１４０９である。前記ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の２２Ａ−３株の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に２００７年１０月２２日に国内寄託されており、受領番号は、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４１１、受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−２１４１１である。
前記ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の２２Ｂ−２株の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に２００７年１０月２２日に国内寄託されており、受領番号は、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４１０、受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−２１４１０である。
【0020】
前記ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、生菌体のみを使用してもよいし、死菌体のみを使用してもよいし、細胞壁画分のみを使用してもよいし、これらの混合物を使用してもよい。これらの中でも、ＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用に優れる点で、細胞壁画分のみが好ましい。
【0021】
前記ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の前記抗炎症剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０００１質量％〜１００質量％が好ましい。
【0022】
前記ラクトバシルス・プランタラムは、日常的に経口摂取することが可能であり、含有される前記ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の生菌体、死菌体、及び細胞壁画分のいずれも、優れたＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用を効果的に発揮させることができるので、この作用に基づいて、本発明の抗炎症剤の有効成分として利用可能である。
【0023】
＜その他の成分＞前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、生理的食塩水（ＰＢＳ）、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料、美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、アルコール類、色剤、水性成分、水、栄養剤、植物抽出物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0024】
前記その他の成分の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸加水分解物、コラーゲン、コラーゲン加水分解物、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、アスコルビン酸配糖体、コエンザイムＱ１０、プロポリス、ローヤルゼリー、ローヤルゼリー蛋白分解物、フコイダン、アロエ粉末、アロエ抽出物、ブルーベリー粉末、ブルーベリー抽出物、イソフラボン、ノニ粉末、ノニ抽出物、ニンニク粉末、ニンニク抽出物、ウコン粉末、ウコン抽出物、キトサン、グルコサミン、クロレラ粉末、クロレラ抽出物、カルニチン、マカ粉末、マカ抽出物、カシス粉末、カシス抽出物、ハナビラタケ粉末、ハナビラタケ抽出物、その他美容に有効であるとされる植物の粉末及び／又は抽出物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0025】
＜用途＞本発明の抗炎症剤は、優れたＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用を有するため、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病等の自己免疫疾患を主体とした疾患に関する医薬品、並びにこれらの疾患に関する安全な予防薬として好適に用いることができる。
【0026】
本発明の抗炎症剤は、消化管で消化されるようなものでないことが確認されているため、美容用飲食品、健康用飲食品等の飲食品として、幅広く用いることができる。
【0027】
＜使用形態＞本発明の抗炎症剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、坐剤等の非経口投与剤；軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、及び浴用剤、頭髪化粧料等の外用剤などが挙げられる。
【0028】
本発明の抗炎症剤の投与形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口、非経口、外用などが挙げられる。
【0029】
本発明の抗炎症剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【0030】
＜効果＞本発明の抗炎症剤は、優れたＴＮＦ−α発現抑制作用を有するため、ＴＮＦ−α発現抑制剤としても好適に使用することができる。
本発明の抗炎症剤は、優れたＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用を有するため、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制剤としても好適に使用することができる。
本発明の抗炎症剤は、優れたＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用を有するため、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進剤としても好適に使用することができる。
【実施例】
【0031】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0032】
（調製例１）＜ラクトバシルス・プランタラムの死菌体の調製＞
ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２２Ａ−３株；受託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４１１）を３０℃嫌気的条件下で液体培地を用いて一晩培養した。培養後、遠心分離（条件：４℃、１０，０００×ｇ、５分間）して、上清を捨て、ＰＢＳで３回洗浄することにより培地を取除いた。そして、寒天培地を用いて生菌体数を計測した。遠心分離で回収した菌体にＵＶ殺菌灯を照射し菌を殺したものを、ラクトバシルス・プランタラムの死菌体とした。前記死菌体中における生菌体数を、寒天培地を用いて計測した。前記死菌体は使用するまで−８０℃で冷凍保存した。なお、ＵＶ処理菌体の生菌数は、１×１０２ＣＦＵ／ｍＬであり、ＵＶ処理前と比較して１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ以上の菌数減少が確認された。
【0033】
（調製例２）＜ラクトバシルス・プランタラムの生菌体の調製＞
ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２２Ａ−３株；受託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４１１）を３０℃嫌気的条件下で液体培地を用いて一晩培養した。菌株の菌数と濁度との関係を示す検量線から、培養後の菌数を算出し、遠心分離（条件：４℃、１０，０００×ｇ、５分間）して、上清を捨て、ＰＢＳで３回洗浄することにより培地を取除き、ラクトバシルス・プランタラムの生菌体とした。そして、寒天培地を用いて生菌体数を計測した。前記生菌体は使用するまで−８０℃で冷凍保存した。
【0034】
（調製例３）＜ラクトバシルス・プランタラムの細胞壁画分の調製＞
ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２２Ａ−３株；受託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４１１）を３０℃嫌気的条件下で液体培地を用いて３日間培養した。培養後、遠心分離で菌体を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。４５分間超音波粉砕を行い、自己分解酵素を失活させるため、１５分間６０℃で静置させた後、遠心分離（条件：４℃、１，０００×ｇ、１０分間）した。そして、得られた上清を更に遠心分離（条件：４℃、１６，０００×ｇ、３０分間）して、得られた沈殿物を１５分間ＵＶ照射して、ラクトバシルス・プランタラムの細胞壁画分（ＣＷ）とした。前記細胞壁画分は、使用するまで、−８０℃で冷凍保存した。
【0035】
（試験例１）＜ＴＮＦ−α発現抑制作用試験（死菌体使用）＞
実際の腸管状態を模したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを構築し、リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて炎症状態を誘導し、ラクトバシルス・プランタラムによって、炎症状態が抑制（ＴＮＦ−α発現が抑制）されるかを試験した。以下、詳細に説明する。
まず、トランズウェル（１２ｍｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ｗｉｔｈ ０．４μｍ Ｐｏｒｅ Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｓｅｒｔ，Ｓｔｅｒｉｌｅ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃３４０１）、コーニング社）のアピカル側にヒト由来の腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）を配置し、バソラテラル側にマウス由来のマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を配置して、実際の腸管状態を模したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを構築した。次に、トランズウェルのアピカル側にサンプル（調製例１の死菌体）を添加して、３時間培養した。培養後、リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて、マクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を刺激し、３時間培養して炎症状態を誘導した。そして、マクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）からのＴＮＦ−α発現を、マウス由来の繊維芽細胞（Ｌ９２９細胞）を用いたバイオアッセイ（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−α，Ｍｏｕｓｅ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、和光純薬工業株式会社）により調べた。なお、ポジティブコントロールには、ＩＢＤ治療薬のブデソニドを用いた。結果を図１に示す。
【0036】
＜結果＞図１より、ラクトバシルス・プランタラムの死菌体を用いると、ＴＮＦ−αの発現量が有意に抑制されることがわかった。
【0037】
（試験例２−１）＜ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用試験（死菌体使用）＞
実際の腸管状態を模したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを構築し、リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて炎症状態を誘導し、ラクトバシルス・プランタラムによって、炎症状態が抑制（ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現が抑制）されるかを試験した。以下、詳細に説明する。
まず、トランズウェル（１２ｍｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ｗｉｔｈ ０．４μｍ Ｐｏｒｅ Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｓｅｒｔ，Ｓｔｅｒｉｌｅ （Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃３４０１）、コーニング社）のアピカル側にヒト由来の腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）を配置し、バソラテラル側にマウス由来のマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を配置して、実際の腸管状態を模したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを構築した。次に、トランズウェルのアピカル側にサンプル（調製例１の死菌体）を添加して、３時間培養した。培養後、リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて、マクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を刺激し、３時間培養して炎症状態を誘導した。そして、腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）から、キット（セパゾールＲＮＡＩ Ｓｕｐｅｒ、ナカライテスク株式会社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法（ＰＣＲ装置：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ２７２０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ、アプライドバイオシステムズ社；リアルタイムＰＣＲ装置：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社；ＩＬ−８プライマー：ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ，Ｈｓ００１７４１０３＿ｍ１、アプライドバイオシステムズ社）により、ＩＬ−８ｍＲＮＡの発現量を測定した。なお、ポジティブコントロールには、ＩＢＤ治療薬のブデソニドを用いた。結果を図２Ａに示す。
【0038】
＜結果＞図２Ａより、ラクトバシルス・プランタラムの死菌体を用いると、ＩＬ−８ｍＲＮＡの発現量が有意に抑制されることがわかった。
【0039】
（試験例２−２）＜ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用試験（細胞壁画分使用）＞
試験例２−１において用いた〔調製例１の死菌体〕を〔調製例３の細胞壁画分〕に変更したこと以外は、試験例２−２と同様に試験した。結果を図２Ｂに示す。
【0040】
＜結果＞図２Ｂより、ラクトバシルス・プランタラムの細胞壁画分を用いると、ＩＬ−８ｍＲＮＡの発現量が有意に抑制されることがわかった。
【0041】
（試験例３−１）＜ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用試験（細胞壁画分使用）＞
実際の腸管状態を模したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを構築し、リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて炎症状態を誘導し、ラクトバシルス・プランタラムによって、炎症状態が抑制（ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現が促進）されるかを試験した。以下、詳細に説明する。
まず、トランズウェル（１２ｍｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ｗｉｔｈ ０．４μｍ Ｐｏｒｅ Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｓｅｒｔ，Ｓｔｅｒｉｌｅ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃３４０１）、コーニング社）のアピカル側にヒト由来の腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）を配置し、バソラテラル側にマウス由来のマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を配置して、実際の腸管状態を模したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを構築した。次に、トランズウェルのアピカル側にサンプル（調製例３の細胞壁画分）を添加して、３時間培養した。培養後、リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて、マクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を刺激し、３時間培養して炎症状態を誘導した。そして、腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）から、キット（セパゾールＲＮＡＩ Ｓｕｐｅｒ、ナカライテスク株式会社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法（ＰＣＲ装置：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ２７２０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ、アプライドバイオシステムズ社；リアルタイムＰＣＲ装置：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社；ＴＧＦ−β１プライマー：ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ，Ｈｓ００９９８１３３＿ｍ１、アプライドバイオシステムズ社）により、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現量を測定した。なお、コントロールは、調製例３の細胞壁画分を使用しなかったものを用いた。結果を図３Ａに示す。
【0042】
＜結果＞図３Ａより、ラクトバシルス・プランタラムの細胞壁画分を用いると、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現量が有意に促進されることがわかった。
【0043】
（試験例３−２）＜ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用試験（細胞壁画分使用）＞
実際の腸管状態を模したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを構築し、ラクトバシルス・プランタラムによるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現量の経時的変化をリアルタイムＰＣＲ法により試験した。以下、詳細に説明する。
まず、トランズウェル（１２ｍｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ｗｉｔｈ ０．４μｍ Ｐｏｒｅ Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｓｅｒｔ，Ｓｔｅｒｉｌｅ（Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃３４０１）、コーニング社）のアピカル側にヒト由来の腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）を配置し、バソラテラル側にマウス由来のマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を配置して、実際の腸管状態を模したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを構築した。そして、腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法を用いてＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現量を測定した。次に、トランズウェルのアピカル側で分化させた腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）に、サンプル（調製例３の細胞壁画分）を添加して、６時間後、９時間後、２０時間後に、腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）から、キット（セパゾールＲＮＡＩ Ｓｕｐｅｒ、ナカライテスク株式会社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法（ＰＣＲ装置：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ２７２０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ、アプライドバイオシステムズ社；リアルタイムＰＣＲ装置：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社；ＴＧＦ−β１プライマー：ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ， Ｈｓ００９９８１３３＿ｍ１、アプライドバイオシステムズ社）により各時間経過後におけるＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を測定した。なお、コントロールは、調製例３の細胞壁画分を使用しなかったものを用いた。結果を図３Ｂ〜図３Ｄに示す。
【0044】
＜結果＞図３Ｂ〜図３Ｄより、ラクトバシルス・プランタラムの細胞壁画分を添加すると、ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡの発現量が経時的に有意に促進されることがわかった。
【0045】
以上より、ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が、優れたＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用のいずれの作用をも有することがわかった。また、前記ラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を有効成分とすることにより、自己免疫疾患を抑制できる抗炎症剤として利用できることが示唆された。
【受託番号】
【0046】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１４０９
【0047】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１４１１
【0048】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１４１０
【産業上の利用可能性】
【0049】
本発明は、優れたＴＮＦ−α発現抑制作用、ＩＬ−８ｍＲＮＡ発現抑制作用、及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現促進作用のいずれの作用をも有し、自己免疫疾患を抑制できる乳酸菌由来の抗炎症剤であるため、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管ベーチェット病等の自己免疫疾患を主体とした疾患に関する医薬品及びこれらの疾患に関する安全な予防薬として、幅広く用いることができる。