特許 6012016 単為結果制御遺伝子およびその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6012016

(24)【登録日】2016年9月30日

(45)【発行日】2016年10月25日

(54)【発明の名称】単為結果制御遺伝子およびその利用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20161011BHJP

   A01H 5/00 20060101ALI20161011BHJP

   C07K 14/415 20060101ALI20161011BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20161011BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20161011BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   A01H5/00 A

   C07K14/415

   C12N15/00 A

   C12P19/34 A

【請求項の数】9

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2014-528207(P2014-528207)

(86)(22)【出願日】2013年7月31日

(86)【国際出願番号】JP2013070801

(87)【国際公開番号】WO2014021398

(87)【国際公開日】20140206

【審査請求日】2015年1月29日

【審判番号】不服2016-6159(P2016-6159/J1)

【審判請求日】2016年4月25日

(31)【優先権主張番号】特願2012-170506(P2012-170506)

(32)【優先日】2012年7月31日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 育種学研究 日本育種学会第１２３回講演会要旨集第１５巻別冊第１号（平成２５年３月２７日）日本育種学会発行第４１ページ（２０９）に発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２５年３月２８日東京農業大学世田谷キャンパスにおいて開催された日本育種学会第１２３回講演会に発表

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２４年度、農林水産省、気候変動に適応した野菜品種・系統及び果樹系統の開発委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【早期審理対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】布目 司

(72)【発明者】

【氏名】本多 一郎

(72)【発明者】

【氏名】大山 暁男

(72)【発明者】

【氏名】福岡 浩之

(72)【発明者】

【氏名】山口 博隆

(72)【発明者】

【氏名】宮武 宏治

【合議体】

【審判長】 田村 明照

【審判官】 三原 健治

【審判官】 高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】 我が国における食料農業植物遺伝資源の活用事例，独立行政法人 農業生物資源研究所，平成２２年３月１０日，ｐ．５４（植物遺伝資源の活用事例一覧表 ８．野菜）

【文献】 Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，Ｖｏｌ．１１２，ｐ．７２−８４

【文献】 Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２０００，Ｖｏｌ．１０，ｐ．１２９−１３６

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N 15/00-15/90

C12Q 1/00- 3/00

C07K 1/00-19/00

C12N 1/00- 5/28

A01H 1/00-17/00

ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナス科の植物において、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含む、植物の単為結果性の判定方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜７２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項2】

上記検査工程において、上記単為結果制御遺伝子の塩基配列、または当該単為結果制御遺伝子の発現量を検査する、請求項１に記載の判定方法。

【請求項3】

上記検査工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されている植物、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている植物を、単為結果性を示す植物として選抜する、請求項１または２に記載の判定方法。

【請求項4】

請求項１〜３の何れか一項に記載の判定方法を行い、単為結果性を示す植物を選抜する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。

【請求項5】

ナス科の植物において、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜７２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項6】

上記工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入するか、上記単為結果制御遺伝子を破壊する、請求項５に記載の生産方法。

【請求項7】

上記植物がトマトである請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。

【請求項8】

以下の（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子。
（１）配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項9】

以下の（１）または（２）に記載のポリペプチド。
（１）配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（２）配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、単為結果制御遺伝子およびそれを利用した植物の生産方法等に関する。

【背景技術】

【0002】

単為結果性は、受粉しなくても果実が肥大する形質である。この形質は、例えば、訪花昆虫を用いた受粉誘導、またはホルモン剤処理による着果誘導といった作業を行わなくとも果実が収穫できるという点で有用な形質である。

【0003】

従来、トマトにおいては、単為結果性トマト系統が遺伝資源として配布されており、これを育種素材とした実用品種の育成が進められている。また、トマトにおける単為結果関連遺伝子としてｐａｔ２が存在し、この遺伝子は単因子劣性形質であるとの報告がある。

【0004】

また、特許文献１には、雄親としての少なくとも１つの単為結果関連遺伝子を含むトマト株と、雌親としての少なくとも１つの単為結果関連遺伝子を含む雄性不稔性トマト株を交雑させることにより無核の単為結果トマトを生産する方法が記載されており、該単為結果関連遺伝子の１つとして、ｐａｔ２が記載されている。

【0005】

また、特許文献２には、単為結実性の、または単為結実性かつ雄性不稔性のトマト植物を作出する方法であって、Ｓ.ハブロカイテスの４番、５番および／または１２番染色体由来の遺伝領域を遺伝子移入する方法が記載されている。また、ｐａｔ２の２重劣性の単為結実性への関与について記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】日本国特許公開公報：特開２０１１−０４５３７３（２０１１年３月１０日公開）

【特許文献2】日本国特許公表公報：特表２０１０−５２７５８６（２０１０年８月１９日公表）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

特許文献１および２にも記載の通り、広義のトマトにおいて、単為結果に関与する遺伝子の存在は遺伝学的には認められている。しかし、その詳細な座乗位置および遺伝子の構造は未だ報告がなされていない。

【0008】

単為結果性は栽培条件または品種系統によって形質発現が不安定になることがあるため、植物の外見のみに依拠すると評価が難しい場合がしばしば生じる。また、単為結果性の評価には、開花前の除雄および着果性の評価等の多くの労力と手間が必要である。

【0009】

単為結果性の評価に関してトマトの場合を例示すると、単為結果性は劣性形質であるため、この形質をトマトの外見から評価するためには単為結果性に関与する遺伝子をホモ化する必要がある。また、Ｆ１世代において単為結果性の形質を有する品種を得るためには、その両親に単為結果性の形質を導入する必要があり、育種選抜は効率的に進められていない。

【0010】

本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、単為結果性に関与する新規な遺伝子を同定し、その遺伝子の利用を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、単為結果性に関与する新規な遺伝子を同定して単離することに成功して、本発明を完成させるに至った。

【0012】

すなわち、本発明は、以下の１）〜６）の何れかを包含する。
１） 植物において、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含む、植物の単為結果性の判定方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
２） 上記１）に記載の判定方法を行い、単為結果性を示す植物を選抜する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
３） 植物において、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
４） 上記２）または３）の何れかに記載の生産方法により生産された、単為結果性が制御された植物。
５） 以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子。（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
６） 以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリペプチド。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜８７個の置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、（４）上記（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、単為結果制御活性を有するポリペプチド。

【発明の効果】

【0013】

遺伝子または当該遺伝子がコードするポリペプチドを指標または標的として、植物の単為結果性を判定したり、単為結果性の植物を生産することが出来る。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明の実施例に関し、単為結果原因遺伝子Ａが座乗する領域の連鎖地図を示す図である。

【図2】本発明の実施例で用いた、ＲＮＡｉを誘導するベクターの模式図である。

【図3】本発明の実施例に関し、ＲＮＡｉ組換え体および非形質転換体のそれぞれの完熟果実重について柱頭除去果と受粉果とで比較した図である。

【図4】本発明の実施例に関し、ＲＮＡｉ組換え体および非形質転換体のそれぞれの完熟果実重について、受粉果の果実重を１としたときの柱頭除去果の果実重の比率を示した図である。

【図5】本発明の実施例に関し、単為結果原因遺伝子Ａの時期・組織特異的発現の解析結果を示した図である。

【図6】本発明の実施例に関し、単為結果原因遺伝子Ａの全長を含むクローニングベクターの構造を示した図である。

【図7】本発明の実施例に関し、単為結果原因遺伝子Ａの全長を含むバイナリーベクターの構造を示した図である。

【図8】本発明の実施例に関し、単為結果原因遺伝子Ａ発現組換えトマトにおける柱頭除去果と受粉果との完熟果実重を調査した結果を示す図である。

【図9】本発明の実施例に関し、単為結果原因遺伝子Ａ発現組換えトマトにおける柱頭除去果と受粉果の完熟果実重について、受粉果の果実重を１としたときの柱頭除去果の果実重を比率で示した図である。

【図10】本発明の実施例に関し、ナスの単為結果原因遺伝子ＳｍＡのＲＮＡｉ誘導ベクターの概略構成を示す図である。

【図11】本発明の実施例に関し、ナスの単為結果原因遺伝子ＳｍＡのＲＮＡｉ誘導バイナリーベクターの概略構成を示す図である。

【図12】本発明の実施例に関し、ナスの単為結果原因遺伝子ＳｍＡをＲＮＡｉによって発現抑制した結果を示す図である。

【図13】本発明の実施例に関し、ナスの単為結果原因遺伝子ＳｍＡとトマトの単為結果原因遺伝子Ａとの発現パターンを比較した図である。

【図14】本発明の実施例に関し、トマトにおいて、マーカー配列を用いて単為結果性／非単為結果性の形質を分離した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の実施の形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。

【0016】

〔用語等の定義〕
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体を意図している。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、特に言及のない限り、デオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。

【0017】

本明細書において、「ポリペプチド」は、「タンパク質」とも換言できる。

【0018】

本明細書において、「単為結果（性）」、および「単為結実（性）」は、植物において、受粉をしなくとも果実が肥大する性質を意図している。

【0019】

本明細書において、「ヘテロ（接合）」は、異なる対立遺伝子が相同染色体上の対応する遺伝子座にある状態を意図し、「ホモ（接合）」は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の対応する遺伝子座にある状態を意図する。

【0020】

本明細書において、「トマト」は、広義には、栽培種「Ｓ．リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）」、野生種「Ｓ．ケエスマニ（Ｓ.ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ）、Ｓ．チレンセ（Ｓ.ｃｈｉｌｅｎｓｅ）、Ｓ．クミエレウスキイ（Ｓ.ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）、Ｓ．ガラパゲンセ（Ｓ.ｇａｌａｐａｇｅｎｓｅ）、Ｓ．ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）、Ｓ．リコペルシコイデス（Ｓ.ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ）、Ｓ．ネオリキイ（Ｓ.ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ）、Ｓ．ペネリ（Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）、Ｓ．ペルビアナム（Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、およびＳ．ピンピネリフォリウム（Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）」を含む概念であり、狭義には「Ｓ．リコペルシクム」を意図している。

【0021】

本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」は、ＡおよびＢとＡまたはＢとの双方を含む概念であり、「ＡおよびＢの少なくとも一方」とも換言できる。

【0022】

本明細書において、「ポリヌクレオチド同士が相補的な関係にある」とは、「ポリヌクレオチドが有する塩基配列同士を比較したときに相補的な関係にある」ことと同義である。

【0023】

〔１．単為結果制御遺伝子〕
本発明にかかる単為結果制御遺伝子は、少なくとも単為結果性を制御する活性（単為結果制御活性）を有するポリペプチドをコードするものである。ポリペプチドが「単為結果性を制御する活性を有する」とは、当該ポリペプチドが存在すれば単為結果性（単為結実性）という形質の出現が抑制されること、すなわち単為結果性を負に制御することを指す。また、本発明にかかる単為結果制御遺伝子の発現が抑制されるか、当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの活性が阻害されると、植物は単為結果性という形質を示すか、単為結果性という形質を示さなくとも当該形質の素因を保有するようになる。

【0024】

本発明に係る単為結果制御遺伝子は、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含むものである。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、アミノ酸配列の配列同一性は、７５％以上あるいは８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。例えば、トマトに由来する変異遺伝子、またはトマト以外の植物に由来する相同遺伝子がこの範疇に含まれる。
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸の個数は、１〜７２個あるいは１〜５８個であることがより好ましく、１〜４３個であることがより好ましく、１〜２９個であることがより好ましく、１〜１４個あるいは１〜１０個であることがさらに好ましく、１〜５または６個であることが特に好ましい。
なお、上記「アミノ酸の欠失、置換、および／または付加」は、例えば、Kunkel法（Kunkel et al.(1985):Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.82.p488-）等の部位特異的突然変異誘発法を用いて人為的に変異を導入してもよいし、天然に存在する同様の変異ポリペプチドに由来するものであってもよい。

【0025】

また、アミノ酸の欠失、置換、および／または付加の生じる領域としては、配列番号１のアミノ酸配列のうち、Ｚｎフィンガードメインとして予測される５６番目のバリンから１１２番目のアスパラギンまで、およびホメオドメインとして予測される２１９番目のリジンから２７６番目のアスパラギンを除く領域であることが好ましい。
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、ストリンジェントな条件下とは、例えば、参考文献[Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)]に記載の条件等が挙げられる。ストリンジェントな条件下とは、より具体的には例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハートおよび１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。なお、このポリヌクレオチドは、上記（１）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有することが好ましく、７５％以上あるいは８０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、８５％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有することがさらに好ましく、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上の配列同一性を有することが特に好ましい。

【0026】

本発明にかかる単為結果制御遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。本発明にかかるポリヌクレオチドの一例である、配列番号２に示す塩基配列は、配列番号１に示すポリペプチドをコードするｃＤＮＡの構造遺伝子部分である。本発明にかかる単為結果制御遺伝子は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列等の付加的な配列を含むものであってもよい。

【0027】

本発明に係る単為結果制御遺伝子を取得する（単離する）方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記単為結果制御遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。

【0028】

また、本発明にかかる単為結果制御遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、当該単為結果制御遺伝子のｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明にかかる単為結果制御遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。

【0029】

本発明にかかる単為結果制御遺伝子の由来は植物である限りにおいて特に限定されないが、トマト、ナス、ピーマン、パプリカ、トウガラシ、およびジャガイモ等のナス科の植物であることが好ましく、トマト、ナス、およびジャガイモ等のナス科ナス属の植物であることがより好ましく、トマトまたはナスであることがさらに好ましく、トマトであることが特に好ましい。

【0030】

なお、単離された単為結果制御遺伝子の候補遺伝子が、所望する単為結果制御活性を有するか否かは、由来する植物における当該候補遺伝子の発現を抑制することによって、当該植物の単為結果性が誘導されるかを観察することによって評価ができる。

【0031】

本発明にかかる単為結果制御遺伝子は、植物の単為結果性の機構の解明に利用することができる。

【0032】

本発明に係る単為結果制御遺伝子として、トマト由来のもの（配列番号２、６（ＯＲＦ）、１１（完全長ｃＤＮＡ）、配列番号１６（イントロンを含むゲノムＤＮＡ上の遺伝子））、トマト近縁野生種Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来のもの（配列番号１８）およびトマト近縁野生種Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ由来のもの（配列番号２０）の他、ジャガイモＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｐｈｕｒｅｊａ由来の遺伝子（配列番号２２）、ナスＳ．ｍｅｌｏｎｇｅｎａ由来の遺伝子（配列番号２４）等を挙げることができる。また、本発明に係る単為結果制御遺伝子の範疇には、ここで例示したポリヌクレオチドの塩基配列に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するヌクレオチドからなる遺伝子も含まれる。

【0033】

〔２．単為結果制御タンパク質としてのポリペプチド〕
本発明にかかるポリペプチドは、上記〔１．単為結果制御遺伝子〕欄に記載した単為結果制御遺伝子の翻訳産物であり、少なくとも植物の単為結果性を制御する活性を有する。上述の通り、本発明に係るポリペプチドは、単為結果性という形質の出現を抑制する、すなわち単為結果性を負に制御する。

【0034】

本発明にかかるポリペプチドは、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。より具体的には、当該ポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された翻訳産物をその範疇に含む。

【0035】

本発明にかかるポリペプチドは、より具体的には、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリペプチドである。なお、このポリペプチドは単為結果制御遺伝子の翻訳産物であるから、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」等の意味については上記〔１．単為結果制御遺伝子〕欄の記載をそのまま参照すればよい。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド。なお、配列同一性は、７５％以上あるいは８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド。なお、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸の個数は、１〜７２個あるいは１〜５８個であることが好ましく、１〜４３個であることがより好ましく、１〜２９個であることがより好ましく、１〜１４個であることがさらに好ましく、１〜５または６個であることが特に好ましい。（４）上記（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、単為結果制御活性を有するポリペプチド。

【0036】

上記ポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

【0037】

なお、単為結果制御タンパク質としての本発明に係るポリペプチドとして、トマト由来のもの（配列番号１）、トマト近縁野生種Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来のもの（配列番号１９）およびトマト近縁野生種Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ由来のもの（配列番号２１）の他、ジャガイモＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｐｈｕｒｅｊａ由来のもの（配列番号２３）、ナスＳ．ｍｅｌｏｎｇｅｎａ由来のもの（配列番号２５）等を挙げることができる。

【0038】

〔３．組換え発現ベクター、および形質転換体〕
本発明はまた、本発明にかかる単為結果制御遺伝子が発現可能に組み込まれた組換え発現ベクター、並びに、当該組換え発現ベクターまたは単為結果制御遺伝子が発現可能に導入された形質転換体を提供する。

【0039】

組換え発現ベクターを構成するためのベクターの種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なものを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、適宜プロモーター配列を選択し、当該プロモーター配列と本発明にかかる単為結果制御遺伝子とを、例えば、プラスミド、ファージミド、またはコスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。

【0040】

また、上記形質転換体とは、上記組換え発現ベクターまたは単為結果制御遺伝子が発現可能に導入された細胞、組織および器官のみならず、生物個体を含む意味である。形質転換体の生物種は特に限定されず、例えば、大腸菌等の微生物、植物、動物等が挙げられる。

【0041】

〔４．植物の単為結果性の判定方法〕
本発明に係る単為結果性の判定方法は、植物において、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含んでなる。ここで、「単為結果制御遺伝子」は上記〔１．単為結果制御遺伝子〕欄に記載したものを指し、「単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチド」は上記〔２．単為結果制御タンパク質としてのポリペプチド〕欄に記載したものを指す。なお、「単為結果制御遺伝子の発現を抑制」の範疇には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。

【0042】

また、上記検査工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されている植物、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている植物と判定されたものを、単為結果性が制御された植物の候補として選抜することが好ましい。

【0043】

上記検査工程を行う手法は特に限定されないが、例えば、以下の１）〜３）に示す手法が挙げられる。そして、これら手法の中では、実施の容易さの観点で、１）または２）の手法が好ましい。
１）対象となる植物における単為結果制御遺伝子の発現量を調べ、必要に応じて基準となる発現量と比較して、当該単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか否かを検査する。遺伝子の発現量は、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、定量リアルタイムＰＣＲ法等で転写産物の量を測るか、定量ウエスタンブロット法等で翻訳産物の量を測る方法を採用すればよい。また、基準となる発現量とは、例えば、単為結果性を示さない同種の植物（例えば、単為結果制御遺伝子をホモに持つ個体）における単為結果制御遺伝子の発現量を指す。なお、遺伝子破壊の手法、またはＲＮＡｉ等の手法を用いて、単為結果制御遺伝子の転写または翻訳をほぼ完全に抑制する場合には、基準となる発現量との比較を要しない場合がある。
２）対象となる植物における単為結果制御遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）の塩基配列を解析する。そして、解析の結果、単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能に影響を与える変異が生じている場合には、当該ポリペプチドの機能が阻害されていると判定する。ポリペプチドの機能に影響を与える変異の一例は、単為結果制御遺伝子のコード領域を含む数十〜数千ｂｐのヌクレオチドの欠損であり、好ましくは少なくとも１００ｂｐ〜１１００ｂｐのヌクレオチドの欠損、あるいは少なくとも約２７０ｂｐ〜１１００ｂｐのヌクレオチドの欠損である。なお、このような変異は、相同染色体における一対の単為結果制御遺伝子の少なくとも一方に生じていればよいが、双方に生じている（すなわち劣性ホモである）ことが好ましい。
また、単為結果制御遺伝子上の変異と連鎖するマーカー配列を利用すれば、単為結果制御遺伝子の塩基配列を直接的にか間接的に検査することになって、上記検査工程を行うことが可能である。上記のマーカー配列は、一例において、単為結果制御遺伝子が座乗する位置から約５．５ｃＭ以内（すなわち約５．５ｃＭ〜０ｃＭ）に位置しており、好ましくは約５．３ｃＭ以内に位置しており、より好ましくは約１．２ｃＭ以内に位置しており、さらに好ましくは約１．１ｃＭ以内に位置している。なお、単為結果制御遺伝子上の変異をマーカー配列として利用することももちろん可能である。
３）対象となる植物から、単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドを単離する。そして、ポリペプチドのアミノ酸配列を解析する。そして、解析の結果、このポリペプチドの機能に影響を与える変異（例えば数十以上のアミノ酸の欠失を伴うトランケート体の発生）が生じている場合には、ポリペプチドの機能が阻害されていると判定する。

【0044】

本発明に係る判定方法が適用される植物の種類は特に限定されないが、トマト、ナス、ピーマン、パプリカ、トウガラシ、およびジャガイモ等のナス科の植物であることが好ましく、トマト、ナスおよびジャガイモ等のナス科ナス属の植物であることがより好ましく、トマトまたはナスであることがさらに好ましく、トマトであることが特に好ましい。また、この判定方法が適用される植物は、例えば、育種素材（親植物、すなわち花粉親、または種子親）や、育種により得られた子孫等が挙げられる。なお、育種とは交配による手法のほか、遺伝子工学的な手法も含む概念である。

【0045】

単為結果性は栽培条件または品種系統によって形質発現が不安定になることがあるため、植物の外見のみに依拠すると評価が難しい場合がしばしば生じる。また、単為結果制御遺伝子がヘテロ接合となっている植物も育種材料等として利用価値があるが、特にヘテロ接合の場合は外見だけでは単為結果性を示しうるか否かが明確に判断できない場合もある。本発明に係る単為結果性の判定方法は遺伝子レベルでの判定であるから、遺伝子のホモ化を行って形質評価を行わなくてもよくなり、例えば育種選抜の効率を大幅に向上可能となる。また、単為結果制御遺伝子が明らかとなったため、遺伝子工学的手法を用いる等して、本来この単為結果制御遺伝子と共分離する不良形質との連鎖を切り離すことも可能になる。

【0046】

〔５．単為結果性が制御された植物の生産方法、および作出した植物〕
本発明に係る、単為結果性が制御された植物の生産方法の一形態（形態１とする）は、上記〔４．植物の単為結果性の判定方法〕欄で記載した判定方法を行って、単為結果性が制御された植物を選抜する工程を含む方法である。

【0047】

また、本発明に係る、単為結果性が制御された植物の生産方法の他形態（形態２とする）は、植物において、単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む方法である。ここで、「単為結果制御遺伝子」は上記〔１．単為結果制御遺伝子〕欄に記載したものを指し、「単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチド」は上記〔２．単為結果制御タンパク質としてのポリペプチド〕欄に記載したものを指す。

【0048】

なお、上記形態２では、上記単為結果制御遺伝子を破壊するか、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入することによって、単為結果制御遺伝子の発現を抑制することが好ましい。なお、「単為結果制御遺伝子の発現を抑制」の範疇には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。

【0049】

単為結果制御遺伝子を破壊する手法は特に限定されず、例えば、相同組換えを用いた特異的な遺伝子破壊を行う、部位特異的突然変異誘発法を用いて単為結果制御遺伝子の途中に終止コドンを導入する、重イオンビーム等の照射によって物理的に遺伝子の一部を破壊する等の方法で行うことができる。

【0050】

また、単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入する手法は特に限定されず、例えば、ＲＮＡ干渉、またはアンチセンスＲＮＡ等の手法によって行うことができる。このポリヌクレオチドを含む発現カセット（例えばベクター等）を植物へ導入する方法は特に限定されず、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法等を適宜用いればよい。なお、このポリヌクレオチドを含む発現カセットは、植物細胞、カルス、植物組織、または植物個体に対して導入すればよい。

【0051】

なお、単為結果制御遺伝子の発現の抑制は、単為結果制御遺伝子の遺伝子発現を制御している発現調節配列（例えば、プロモーター配列、またはエンハンサ配列）に、遺伝子発現を抑制するような変異を導入することによっても行うことができる。

【0052】

本発明はまた、上記の生産方法により生産された、単為結果性が制御された植物も提供する。単為結果性が制御された植物とは、単為結果性という形質が出現した植物の他、単為結果性という形質が出現していないもののその素因を保有する植物を含む概念である。

【0053】

本発明に係る方法により生産される植物の種類は特に限定されないが、トマト、ナス、ピーマン、パプリカ、トウガラシ、およびジャガイモ等のナス科の植物であることが好ましく、トマト、ナスおよびジャガイモ等のナス科ナス属の植物であることがより好ましく、トマトまたはナスであることがさらに好ましく、トマトであることが特に好ましい。

【0054】

〔６．本発明に係る具体的な態様の例示〕
すなわち、本発明は、以下の１）〜１１）の何れかを包含する。
１） 植物において、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含む、植物の単為結果性の判定方法。検査工程の一形態では、例えば、少なくとも植物のつぼみにおいて、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
２） 上記検査工程において、上記単為結果制御遺伝子の塩基配列、または当該単為結果制御遺伝子の発現量を検査する、１）に記載の判定方法。
３） 上記検査工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されている植物、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている植物を、単為結果性を示す植物として選抜する、１）または２）に記載の判定方法。
４） １）〜３）の何れかに記載の判定方法を行い、単為結果性を示す植物を選抜する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
５） 植物において、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。当該工程の一形態では、例えば、少なくとも植物のつぼみにおいて、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
６） 上記工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入するか、上記単為結果制御遺伝子を破壊する、５）に記載の生産方法。
７） 上記植物がナス科の植物である１）〜６）の何れかに記載の方法。
８） 上記植物がトマトである７）に記載の方法。
９） ４）〜６）の何れかに記載の生産方法により生産された、単為結果性が制御された植物。
１０） 以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子。当該単為結果制御遺伝子の一形態では、例えば、少なくとも植物のつぼみにおいて、単為結果制御遺伝子の発現を抑制することによって、植物が単為結果性を示す。（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
１１） 以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリペプチド。当該ポリペプチドの一形態では、例えば、少なくとも植物のつぼみにおいて、このポリペプチドの機能を阻害することによって、植物が単為結果性を示す。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜８７個の置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、（４）上記（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、単為結果制御活性を有するポリペプチド。

【0055】

また、本発明の他の態様においては、以下の１２）〜１７）の何れかであってもよい。
１２） 植物において、以下の（Ｓ１）〜（Ｓ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含む、植物の単為結果性の判定方法。検査工程の一形態では、例えば、少なくとも植物のつぼみにおいて、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する。
（Ｓ１）配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｓ２）配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｓ３）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｓ４）上記（Ｓ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
１３） 上記１２）に記載の判定方法を行い、単為結果性を示す植物を選抜する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
１４） 植物において、以下の（Ｓ１）〜（Ｓ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。当該工程の一形態では、例えば、少なくとも植物のつぼみにおいて、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する。
（Ｓ１）配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｓ２）配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｓ３）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｓ４）上記（Ｓ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
１５） 上記１３）または１４）の何れかに記載の生産方法により生産された、単為結果性が制御された植物。
１６） 以下の（Ｓ１）〜（Ｓ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子。当該単為結果制御遺伝子の一形態では、例えば、少なくとも植物のつぼみにおいて、単為結果制御遺伝子の発現を抑制することによって、植物が単為結果性を示す。（Ｓ１）配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｓ２）配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｓ３）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１〜８７個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（Ｓ４）上記（Ｓ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
１７） 以下の（Ｓ１）〜（Ｓ４）の何れかに記載のポリペプチド。当該ポリペプチドの一形態では、例えば、少なくとも植物のつぼみにおいて、このポリペプチドの機能を阻害することによって、植物が単為結果性を示す。
（Ｓ１）配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（Ｓ２）配列番号２５に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、（Ｓ３）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１〜８７個の置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、（Ｓ４）上記（Ｓ１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、単為結果制御活性を有するポリペプチド。
なお、上記の１２）〜１７）において、アミノ酸配列の配列同一性は、７５％以上あるいは８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。

【0056】

本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変
更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

【実施例】

【0057】

〔１．トマト由来の単為結果原因遺伝子Ａの同定〕
〔遺伝解析集団の育成〕
単為結果性のトマト系統ＬＳ９３５（野菜茶業研究所より入手）と、非単為結果性のトマト系統Ｓａｌａｄｅｔｔｅ（ＬＡ２６６２）（Tomato Genetics Resource Center、米国より入手）とを交配することによってＦ_２個体の集団を得た。このＦ_２集団を用いて、以下に記載する、トマト由来の単為結果原因遺伝子Ａを含む連鎖地図の作成および単為結果性の遺伝解析を行った。さらに、Ｆ_２集団から選抜した系統の自殖後代Ｆ_３集団を、後述する単為結果性の詳細な遺伝解析に用いた。

【0058】

なお、トマト系統ＬＳ９３５は、単為結果性を示すことが報告されている品種Ｓｅｖｅｒｉａｎｉｎに、大玉トマト品種Ｍｏｎｅｙ Ｍａｋｅｒを戻し交配した系統として導入された遺伝資源である。Ｓａｌａｄｅｔｔｅは、大玉トマト系統として導入された遺伝資源であって非単為結果性を示す（すなわち単為結果性を示さない）。

【0059】

〔単為結果性の評価方法〕
開花前に柱頭を除去し、柱頭除去果の完熟果重量と種子の有無を調査した。植物体あたり３花房以上の柱頭除去果と１花房以上の放任受粉果の完熟果の重量を調査した。柱頭除去果と放任受粉果との重量を比較し、同等の果実重の完熟果が着果した系統を単為結果性と判断した。なお、ＲＮＡｉ組換えトマト以外に関して、放任受粉果が小さく柱頭除去果との差が小さいために単為結果性の判断の難しい系統は、挿し芽による増殖を行い、再度検定をした。

【0060】

〔連鎖地図の作成〕
既報のＳＳＲ（simple sequence repeat）マーカー(参考文献：Ohyama A. et al. (2009) Mol. Breed. 23: 685-691, Shirasawa L. et al. (2010) Theor. Appl. Genet. 121:731-739.)および既報のＳＮＰマーカー近傍にあるＳＳＲをマーカー化したもの（出願人が開発中の独自マーカー）を用いて、Ｆ_２集団１００個体の単為結果性／非単為結果性に関する形質分離を調査して、図１に示す連鎖地図を作成した。連鎖地図の作成にはMapmaker exp 3.0を用いた。なお、図１中の左側はトマト第４染色体の連鎖地図であり、ＴＥＳで始まる名称は既報のＳＳＲマーカー、ｔｂｍで始まる名称は出願人が開発した独自マーカーを示す。

【0061】

〔単為結果性の詳細な遺伝解析〕
Ｆ_２集団を用いた遺伝解析により単為結果原因遺伝子Ａはトマト第４染色体に座乗し、２つのＳＳＲマーカー間約５ｃＭの領域に位置することが明らかとなった（図１参照）。ＳＳＲマーカーの配列情報とトマト全ゲノム配列情報（sol genomics network http://solgenomics.net/）との比較解析を行ったところ、この２つのＳＳＲマーカー間の物理距離は約１１００ｋｂに相当した。

【0062】

次に、トマト全ゲノム配列情報を利用して、単為結果原因遺伝子Ａの座乗する領域のＳＳＲを新たに抽出して多型を検索した。また、当該領域に座乗する候補遺伝子近傍のＳＮＰ多型を新たに検索した。Ｆ_２集団から当該領域の遺伝子型がヘテロ接合であるＦ_２個体を選定し、その後代Ｆ_３個体の遺伝子型を決定して遺伝的組換え個体を選定し、この個体の単為結果性を評価した。これにより単為結果原因遺伝子Ａを、２つのＳＮＰマーカー間約３００ｋｂに絞り込んだ。なお、約３００ｋｂに絞り込んだ領域の近傍に位置する遺伝マーカーは図１中の右側に示す。ＲＨＦ２ＡｓおよびＰＨＤｓは新規に開発したＳＮＰマーカーであり、ｔｓｍ０４１２０８は新規に開発したＳＳＲマーカーであり、ａｔｈｂ３１は新規に開発した挿入欠失変異マーカーである。

【0063】

そして、非単為結果性の系統「Ｓａｌａｄｅｔｔｅ」と単為結果性の系統「ＬＳ９３５」とに関して、約３００ｋｂに絞り込んだゲノム上の上記領域の塩基配列を決定し、配列の変異を検索した。その結果、「Ｓａｌａｄｅｔｔｅ」のゲノム配列（配列番号３）と比較して、「ＬＳ９３５」のゲノム配列（配列番号４）に１０３４ｂｐの欠失変異（配列番号５）を見出した。

【0064】

この欠失変異は配列番号６に示すような読み枠をもつ推定遺伝子の上に存在し、第１エクソンの一部と第１イントロンの一部が「ＬＳ９３５」のゲノムから失われていることが推定された。そこで、この配列番号６に示される読み枠をもった推定遺伝子の欠失変異が単為結果性の原因であると予想し、以下の実験を進めた。なお、「Ｓａｌａｄｅｔｔｅ」が有する上記推定遺伝子のゲノム上の塩基配列（イントロンを含む）は配列番号１６に、「ＬＳ９３５」が有するゲノム上の対応する塩基配列は配列番号１７に示した。

【0065】

〔単為結果原因遺伝子Ａの完全長ｃＤＮＡ配列の取得〕
非単為結果性のトマト品種「秋玉」の葉、茎および花を含む地上部組織から全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ法で抽出し、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、配列番号７で示すポリヌクレオチドを遺伝子特異的プライマーとして用いた５’−ＲＡＣＥ法によって、ｍＲＮＡの転写開始点および翻訳開始点を含むｃＤＮＡの増幅を試みた。増幅産物は大腸菌ベクターにクローニングし、その配列をＳａｎｇｅｒ法によって決定した。ＰＣＲ法による増幅の際には低頻度ながら塩基配列の変異が生じることが知られているため、独立に複数のクローンの塩基配列を決定した。その結果、第一エクソン（５’−ＵＴＲ（非翻訳領域）２９８ｂｐおよびＯＲＦの５’−側５４１ｂｐ）および第２エクソン３ｂｐを含む完全長ｃＤＮＡの５’側末端８４２ｂｐの配列が得られた。

【0066】

同様に、配列番号８で示すポリヌクレオチドを遺伝子特異的プライマーとして用いた３’−ＲＡＣＥ法によって、翻訳終止点およびポリアデニレーション部位を含むｃＤＮＡの増幅と大腸菌ベクターへのクローニングおよび配列決定を試みた。その結果、３０５ｂｐの第２エクソン（ＯＲＦの３’−側末端（翻訳終止点を含む））および２３４ｂｐの３’−ＵＴＲを含む完全長ｃＤＮＡの３’側末端５３９ｂｐの配列が得られた。

【0067】

さらに、配列番号９および配列番号１０に示す１対のプライマーセットを用い、上記と同じｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応によって増幅されたｃＤＮＡの配列をダイレクトシーケンシング法によって決定した。そして、以上のようにして得られた、完全長ｃＤＮＡの５’側末端、３’側末端、並びにその他の領域を配列の重複に基づき統合して配列番号１１に示す１４０５ｂｐの塩基配列を得て、これを単為結果原因遺伝子Ａの完全長ｃＤＮＡ配列とした。

【0068】

〔単為結果原因遺伝子Ａのアミノ配列の解析およびホモログ遺伝子の探索〕
単為結果原因遺伝子Ａは、ブラスト検索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）の結果、コードするアミノ酸配列における５６番目のバリンから１１２番目のアスパラギンまでがＺｎフィンガードメインとして予測され、さらに２１９番目のリジンから２７６番目のアスパラギンまでがホメオドメインとして予測される、Ｚｎフィンガー・ホメオドメイン型のホメオボックス遺伝子に属することが示された。Ｚｎフィンガー・ホメオドメイン型のホメオボックス遺伝子は、転写因子として形態形成を制御することが予想される。また、トマト近縁野生種Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来、トマト近縁野生種Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ由来、ジャガイモＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｐｈｕｒｅｊａ由来、ナスＳ．ｍｅｌｏｎｇｅｎａ由来の単為結果性遺伝子Ａのホモログをデータベース上で見出した。単為結果性遺伝子Ａがコードするアミノ酸配列に対するこれらのホモログのアミノ酸配列の相同性は、トマト近縁野生種Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来のもの（配列番号１９）は９５％、トマト近縁野生種Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ由来のもの（配列番号２１）は９４％、ジャガイモＳ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｐｈｕｒｅｊａ由来のもの（配列番号２３）は８４％、ナスＳ．ｍｅｌｏｎｇｅｎａ由来のもの（配列番号２５）は７５％であった。なお、ナスのホモログ遺伝子の探索に用いたデータベースは、発明者らが独自に構築した未公開のものである。

【0069】

〔単為結果原因遺伝子Ａのプロモーターの単離〕
配列番号１１に示す単為結果原因遺伝子Ａの完全長ｃＤＮＡ配列は配列番号３に示すゲノム配列の塩基番号９４２１から１１６０３までに対応する。したがって、その上流のゲノム配列は単為結果原因遺伝子Ａの発現制御に関わるプロモーター領域であると推定される。そこで、その領域を増幅するＰＣＲプライマーを合成し、これを用いてトマト品種「桃太郎８」のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで消化し、クローニングベクターｐＨＳＧ３９８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ部位に挿入してクローニングした。

【0070】

そして、得られたクローンの配列をＳａｎｇｅｒ法によって確認し、配列番号３の配列と比較することによってＰＣＲ増幅時の変異を含まないクローンを選択した。得られた２５７２ｂｐのクローンは、５’末端にゲノム由来のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位、３’末端にＰＣＲプライマー由来のＳｍａＩ認識部位を有し、単為結果原因遺伝子Ａの転写開始点の上流２２３９ｂｐ、転写開始点から５’−ＵＴＲおよび翻訳開始点を経てタンパクコード領域の一部に至る合計３２７ｂｐ、並びにＰＣＲプライマー由来のＳｍａＩ認識部位６ｂｐからなる。このＤＮＡ断片（配列番号１２）を単為結果原因遺伝子Ａのプロモーターとして以下の実験に用いた。

【0071】

〔ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導ベクターの構築〕
配列番号１３および配列番号１４に示すプライマーを用い、トマト品種「秋玉」のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、配列番号１５に示す５００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片は５’末端にＳｍａＩ認識部位およびＨｉｎｄＩＩＩ認識部位、３’末端にＥｃｏＲＩ認識部位およびＸｈｏＩ認識部位をもつ。この断片をクローニングベクターｐＴＹ２６２（ＡＢ７３６１５２（ＤＤＢＪ））に挿入し、単為結果原因遺伝子Ａに対するＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子を構築した。このｐＴＹ２６２ベクターはＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＮｏｓターミネータからなる発現カセットを有し、トマトチューブリン遺伝子の第１イントロンを挟むように外来配列のクローニングサイトを配置したベクターである（図２（ａ））。

【0072】

まず、上述した５００ｂｐ断片（配列番号１５）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したものをＮｏｓターミネータ（ｔＮｏｓ）の直前に挿入した。次いで上述の５００ｂｐ断片をＳｍａＩおよびＸｈｏＩによって消化し、得られたベクターにおけるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの直後に挿入した。得られたＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子は、配列番号１５の５００ｂｐ断片のほぼ全域をトマトチューブリン遺伝子第１イントロンを挟んで逆位反復配列に配置した構造を有し、一般に植物において構成的発現を誘導するＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって発現誘導される（図２（ｂ））。さらに、このＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを配列番号１２に示した単為結果原因遺伝子Ａのプロモーターと入れ換えたＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子を構築した。次いで、構築したＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子をもつクローンをＡｓｃＩで消化し、得られたＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子を含む断片をバイナリベクターｐＺＫ３Ｂ(参考文献 Kuroda et al., Biosci Biotech Biochem, (2010) 74: 2348-2351)にＣａＭＶ３５Ｓプロモータ::ＧＦＰ::Ｎｏｓターミネータからなるレポーター遺伝子を挿入した改変バイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰのＡｓｃＩ認識部位に挿入してｐＺＫ３ＢＧＦＰ＿ｇｅｎｅＡ-ＲＮＡｉ（図２（ｃ））を構築した。

【0073】

〔ＲＮＡｉ組換えトマトの作出〕
トマトを図２（ｃ）に示すＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子(ベクター)で形質転換した。具体的には、アグロバクテリウム法（Sun et al. 2006 Plant Cell Physiol 47: 426-431）を用いて、トマト品種「秋玉」の子葉にバイナリベクターを有するアグロバクテリウムを感染させ、カナマイシン含有培地上で培養および選抜し、再分化植物を得た。再分化植物の遺伝子導入をＰＣＲにより確認し、ＲＮＡｉ組換えトマトを得た。なお、ＲＮＡｉ組換えトマトでは、単為結果原因遺伝子Ａの発現が大きく抑制されていることを確認した。

【0074】

〔ＲＮＡｉ組換えトマトの単為結果性の検討〕
ＲＮＡｉ組換えトマトを栽培し、開花前に柱頭を除去した柱頭除去果と開花当日に受粉を行った受粉果の完熟果重量を調査した。また、非形質転換体も同時に栽培し、同様の処理を行い、完熟果重量を調査し、コントロールとした。結果を図３および図４に示す。

【0075】

図３に示すように非遺伝子組換えトマト品種「秋玉」の柱頭除去果は着果肥大しなかったが、ＲＮＡｉ組換えトマトは柱頭除去果が受粉果と同等に着果肥大した。また、図４に示すように、受粉果の果実重を１としたときの柱頭除去果の果実重の比率は、コントロールの非形質転換体では柱頭除去果の果実重がほぼ０であったのに対し、ＲＮＡｉ組換えトマトでは、果実重の比率について有意差は見られなかった。

【0076】

以上の結果から、単為結果原因遺伝子Ａの機能抑制（欠失変異）が単為結果性の原因であると結論づけた。

【0077】

〔単為結果原因遺伝子Ａの発現解析〕
単為結果原因遺伝子Ａの時期・組織特異的発現を、蛍光リアルタイムＰＣＲ装置（LC480型、ロシュ社）およびロシュ社のライトサイクラー480 SYBR Greenマスターキットを用いて、リアルタイム定量ＰＣＲ法により詳細に調査した。調査に用いたトマト品種はマネーメーカーであり、調査した組織は図５に示す通りである。なお、図５において「開花」とは花における遺伝子の発現量を、「緑熟期」および「完熟期」とは果実における遺伝子の発現量を表す。単為結果原因遺伝子Ａの増幅には配列番号２６および配列番号２７に塩基配列を示すプライマーを用いた。リアルタイム定量ＰＣＲの内在標準遺伝子として、発明者らが独自に開発した、トマト組織で構成的に発現するハウスキーピング遺伝子Solyc04g049180.2.1 (ITAG2.30、配列番号２８)を用い、ハウスキーピング遺伝子のＰＣＲ増幅には配列番号２９および配列番号３０に塩基配列を示すプライマーを用いた。

【0078】

その結果、単為結果原因遺伝子Ａの発現には、少なくとも以下の６つの特徴を示すことが明らかとなった（図５も参照）。
１．調査した全ての組織および発育ステージのうち、全長２ｍｍの未熟な蕾で最も発現量が高い。
２．蕾の生長に伴って発現量は低下し、開花時には１／２０以下に低下する。
３．開花後２日目から６日目にかけて若干の発現上昇が認められるが全長２ｍｍの未熟な蕾の１／５程度もしくはそれ以下である。
４．緑熟期および完熟期には発現はほぼ０となる。
５．葉や茎においても一定の発現が認められるが未熟蕾の１／２程度もしくはそれ以下である。
６．根では発現がほとんど認められない。

【0079】

〔単為結果原因遺伝子Ａ発現ベクターの構築〕
配列番号３１および配列番号３２に塩基配列を示すプライマーを用い、トマト品種「秋玉」のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅を行い、配列番号３３に塩基配列を示す遺伝子断片を得た。得られた遺伝子断片は、配列番号３に塩基配列を示すゲノム配列における塩基番号７１５０から１２０９８までに対応する。この遺伝子断片は、５’末端および３’末端にプライマー由来のＡｓｃＩ認識部位を有し、単為結果原因遺伝子Ａの転写開始点の上流２２７１ｂｐ、転写開始点から５’−ＵＴＲおよび翻訳開始点を経てイントロン部位に至る第一エクソン７８０ｂｐ、イントロン７７８ｂｐ、当該イントロンの直後から翻訳終止コドンを経てｐｏｌｙＡ付加位置に至る第二エクソン５６６ｂｐ、並びに、当該第二エクソンの下流のゲノム配列４９５ｂｐからなる。

【0080】

この増幅された遺伝子断片をAscIで消化し、クローニングベクターｐＵＣ１９８ＡＡ (参考文献：Kuroda et al., Biosci Biotech Biochem, (2010) 74: 2348-2351) のＡｓｃＩ認識部位に挿入してクローニングした（図６に示す pUC198AA_whole_gene_A）。得られたクローンの塩基配列をＳａｎｇｅｒ法によって決定し、配列番号３に示す塩基配列と比較することによって、ＰＣＲ増幅時の変異を含まないクローンを選択した。この選択したクローンをＡｓｃＩで消化し、消化によって得た断片を、バイナリベクターｐＺＫ３Ｂ(Kuroda et al., Biosci Biotech Biochem, (2010) 74: 2348-2351)にＣａＭＶ３５Ｓプロモータ::ＧＦＰ::Ｎｏｓターミネータからなるレポーター遺伝子を挿入した改変バイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰのＡｓｃＩ認識部位に挿入して、バイナリーベクターpZK3BGFP_whole_Gene_Aを構築した（図７）。

【0081】

〔単為結果原因遺伝子Ａ発現組換えトマトの作出〕
〔ＲＮＡｉ組換えトマトの作出〕の場合と同様にして、アグロバクテリウム法を用いて、単為結果性トマト系統ＬＳ９３５の子葉にバイナリベクターpZK3BGFP_whole_gene_Aを有するアグロバクテリウムを感染させ、カナマイシン含有培地上で培養および選抜し、再分化植物を得た。再分化植物に目的の遺伝子が導入されていることをＰＣＲ法により確認し、単為結果原因遺伝子A発現組換えトマトを得た。

【0082】

〔単為結果原因遺伝子Ａ発現組換えトマトの単為結果性の検討〕
単為結果原因遺伝子Ａ発現組換えトマトを栽培し、開花前に柱頭を除去した柱頭除去果と開花当日に受粉を行った受粉果との完熟果実重を調査した。また、非形質転換体（ＬＳ９３５）も同時に栽培し、単為結果原因遺伝子Ａ発現組換えトマトと同様の処理を行い、完熟果実重を調査しコントロールとした。結果を図８および図９に示す。なお、図８および図９において、Ｅ１６およびＥ１８は単為結果原因遺伝子Ａ発現組換えトマトである。

【0083】

図８に示すように単為結果性系統である非組換えトマトＬＳ９３５の柱頭除去果は受粉果と同等に着果肥大したが、単為結果原因遺伝子Ａ発現組換えトマトの柱頭除去果は着果肥大しなかった。また、図９に示すように、受粉果の果実重を１としたときの柱頭除去果の果実重の比率は、非組換えトマトＬＳ９３５では有意な差は見られなかったが、単為結果原因遺伝子Ａ発現組換えトマトではほぼ０であった。

【0084】

〔２．マーカー配列を用いたトマトの形質の分離〕
単為結果性のトマト系統ＬＳ９３５（野菜茶業研究所より入手）と、非単為結果性のトマト系統Ｓａｌａｄｅｔｔｅ（ＬＡ２６６２）（Tomato Genetics Resource Center、米国より入手）とを交配することによってＦ_２個体の集団を得た。このＦ_２集団から選抜した系統の自殖後代Ｆ_３集団と、このＦ₃集団から選抜した系統の自殖後代Ｆ₄集団とを、マーカー配列を用いたトマトのジェノタイプおよび表現形質の分離の解析に用いた。結果を図１４に示す。

【0085】

同図において、Ｌで示されるジェノタイプはＬＳ９３５のホモ型形質（単為結果原因遺伝子に欠失あり：単為結果性（ｐ））、Ｓで示されるジェノタイプはＳａｌａｄｅｔｔｅのホモ型形質（単為結果原因遺伝子Ａに欠失なし：非単為結果性（ｎｐ））、Ｈで示されるジェノタイプはヘテロ型の形質（非単為結果性（ｎｐ））を指す。

【0086】

同図に示すマーカー配列は何れも発明者らが独自に開発したものであり、以下の特性を持つ。これらの中では、ＲＨＦ２Ａｓ、ａｔｈｂ３１、ＰＨＤｓの判定精度が高く、特にａｔｈｂ３１は判定精度が１００％の完全連鎖型マーカーである。
・ｔｂｍ２１６７：単為結果原因遺伝子Ａからの距離約１．１ｃＭ。配列番号４７上に位置する配列番号４８および配列番号４９のプライマーセットを用いてゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応により増幅される断片のＳＳＲ多型。断片長が２４１塩基であれば単為結果性系統ＬＳ９３５型、断片長が２４３塩基であれば非単為結果性系統Ｓａｌａｄｅｔｔｅ型である。
・ＲＨＦ２Ａｓ：単為結果原因遺伝子Ａからの距離約１３５．１ｋｂ。配列番号５０に示す塩基配列における１２３番目の塩基がＡであるか、ＴであるかというＳＮＰ。当該塩基がＡであればジェノタイプが単為結果性系統ＬＳ９３５型であり、当該塩基がＴであればジェノタイプが非単為結果性系統Ｓａｌａｄｅｔｔｅ型である。
・ａｔｈｂ３１：単為結果原因遺伝子Ａ内の挿入欠失変異。配列番号３に示す塩基配列における９９７７番目〜１１０１１番目の塩基が欠失している変異。この欠失があればジェノタイプが単為結果性系統ＬＳ９３５型であり、この欠失がなければジェノタイプが非単為結果性系統Ｓａｌａｄｅｔｔｅ型である。
・ＰＨＤｓ：単為結果原因遺伝子Ａからの距離約１６１．６ｋｂ。配列番号５１に示す塩基配列における１１９番目の塩基がＡであるか、ＧであるかというＳＮＰ。当該塩基がＡであればジェノタイプが単為結果性系統ＬＳ９３５型であり、当該塩基がＧであればジェノタイプが非単為結果性系統Ｓａｌａｄｅｔｔｅ型である。
・ｔｓｍ０４１２０８：単為結果原因遺伝子Ａからの距離約２４７．７ｋｂ。配列番号５２に位置する配列番号５３および配列番号５４のプライマーセットを用いてゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応により増幅される断片の多型。断片長が３９３塩基であれば単為結果性系統ＬＳ９３５型、断片長が３５９塩基であれば非単為結果性系統Ｓａｌａｄｅｔｔｅ型である。
・ｔｂｍ２１７７：単為結果原因遺伝子Ａからの距離約５．３ｃＭ。配列番号５５に位置する配列番号５６および配列番号５７のプライマーセットを用いてゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応により増幅される断片のＳＳＲ多型。断片長が２４３塩基であれば単為結果性系統ＬＳ９３５型、断片長が２４１塩基であれば非単為結果性系統Ｓａｌａｄｅｔｔｅ型である。

【0087】

〔３．ナス由来の単為結果原因遺伝子ＳｍＡの同定〕
ナス「中生真黒」のゲノムＤＮＡからシーケンシングライブラリを作成し、イルミナ社HiSeq2000型シーケンサを用いて、インサートサイズ２００−３００ｐｂの断片のペアエンドおよび２ｋｂのメイトペアシーケンスを行った。得られた合計１４．４億リード、ナスゲノム(約１．１Ｇｂ)の約１４０ｘに相当する配列データを、アセンブラプログラムSOAPdenovoによりアセンブルし、１，３２１，１５７配列、全長１，１４５Ｍｂの断片ゲノム配列を得た。その配列に対してＢＬＡＳＴＮ解析を行い、トマト単為結果原因遺伝子Ａと部分的に高い相同性を示すゲノム配列(６７，９０２塩基対)を得た。得られたゲノム配列を用いて、遺伝子予測プログラムAugustusを用いて遺伝子予測を行い、ナスのホモログ遺伝子（以下、単為結果原因遺伝子ＳｍＡ）候補を含むゲノムＤＮＡ配列（配列番号３４）およびそのタンパクコード配列（配列番号３５）を得た。配列番号３４および配列番号３５に示す塩基配列から、単為結果原因遺伝子ＳｍＡは２つのエクソンと１つのイントロンとからなる遺伝子であることが明らかである。この予測遺伝子配列に基づいて設計したＰＣＲプライマーを用い、ナスの蕾由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、単為結果原因遺伝子ＳｍＡのＯＲＦ全体を含むｃＤＮＡクローンを得た。得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列をサンガー法によって決定し、プログラムより予測された配列番号３５に示す塩基配列と同一であること、ナスの蕾において発現している遺伝子であることを確認した。単為結果原因遺伝子ＳｍＡがコードするタンパク質は、配列番号２５にアミノ酸配列を示したものである。

【0088】

配列番号３６および配列番号３７に塩基配列を示すプライマーを調製し、配列番号３５に塩基配列を示すクローンを鋳型としてＰＣＲを行い、配列番号３８に塩基配列を示す４７３塩基対のＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物は５’末端にＢａｍＨＩ認識部位およびＨｉｎｄＩＩＩ認識部位、３’末端にＳａｃＩ認識部位およびＫｐｎＩ認識部位をもつ。このＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＴＹ２６２（AB736152(DDBJ)）に逆位反復構造をとるように挿入し、ナスの単為結果原因遺伝子ＳｍＡに対するＲＮＡｉ誘導ベクターを構築した。さらに、このベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモータを配列番号３９に塩基配列を示した２５６１塩基対からなるＳｍＡ遺伝子プロモータ配列と入れ換えた（図１０）。このプロモータ配列はその３’末端に、配列番号４０に塩基配列を示すＳｍＡのＯＲＦの５’末端部分２９塩基対および未同定のｍＲＮＡをコードする５’非翻訳領域を含むと推定されるが、ＲＮＡｉ誘導には機能のあるタンパク質をコードするＲＮＡの転写は不要であり、ＲＮＡｉ誘導ベクターとしての機能に影響はない。

【0089】

得られたRNAi誘導ベクターをAscIで消化し、バイナリベクターｐＺＫ３Ｂ(Kuroda et al., Biosci Biotech Biochem, (2010) 74: 2348-2351)にＣａＭＶ３５Ｓプロモータ::ＧＦＰ::Ｎｏｓターミネータからなるレポーター遺伝子を挿入した改変バイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰのＡｓｃＩ認識部位に挿入し、ＲＮＡｉ誘導バイナリーベクターpZK3BGFP_ SmA-RNAiを構築した（図１１）。

【0090】

単為結果性を示さないナス品種「千両二号」を、図１１に示すＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子（バイナリーベクター）で形質転換した。具体的には、アグロバクテリウム法（Billings et al. 1997 J. Amer. Hort. Sci. 122: 158-162）を用いて、ナス品種「千両二号」の子葉への感染、カナマイシン含有培地上における培養と選抜を行い、再分化植物に目的遺伝子が導入されているかをＰＣＲにより確認し、ＲＮＡｉ組換えナスを得た。

【0091】

ＲＮＡｉ組換えナスを栽培し、開花前に柱頭を除去した花において、明らかな子房の肥大が認められた（図１２）。非組換え体では柱頭を除去した場合、子房の肥大はほとんど認められず、花は開花後１週間程度の後に枯死する。以上の結果から、単為結果原因遺伝子ＳｍＡの発現抑制により、トマトにおいて観察されたのと同様、ナスにおいても、落下防止と果実肥大が誘導されると結論した。

【0092】

ナスの単為結果原因遺伝子ＳｍＡはトマトの単為結果原因遺伝子Ａに対して、構造上最も類似した配列をもつが、その発現様式の時期・組織的特異性についても、図１３に示す通り、極めて類似していることがリアルタイム定量ＰＣＲ分析の結果から明らかである。なお、リアルタイム定量ＰＣＲの内在標準遺伝子として、独自に開発した構成的に発現するハウスキーピング遺伝子SmFL20F10（配列番号４１）を用いた。また、トマトでは、このSmFL20F10のオルソログであることがBLAST検索の結果から強く推定されるSolyc04g049180.2.1 (ITAG2.30、配列番号４２)を用いた。
内部標準遺伝子の増幅用プライマー配列は以下の通り。
＜ナスSmFL20F10用（配列番号４１）＞
フォワードプライマー： 配列番号４３
リバースプライマー： 配列番号４４
＜トマトSolyc04g049180.2.1用（配列番号４２）＞
フォワードプライマー： 配列番号４５
リバースプライマー： 配列番号４６

【産業上の利用可能性】

【0093】

本発明によれば、単為結果性を有する新品種の植物を得ることができる。また、本発明は、農業または園芸等の分野に利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図13】

【図14】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]