特許 6029998 グリセロール廃液からのエタノール生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6029998

(24)【登録日】2016年10月28日

(45)【発行日】2016年11月24日

(54)【発明の名称】グリセロール廃液からのエタノール生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/08 20060101AFI20161114BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20161114BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20161114BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20161114BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/08

   C12N1/20 FZNA

   C12N1/00 S

   C12M1/00 D

【請求項の数】3

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2013-30449(P2013-30449)

(22)【出願日】2013年2月19日

(65)【公開番号】特開2014-158438(P2014-158438A)

(43)【公開日】2014年9月4日

【審査請求日】2015年11月30日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 第６４回日本生物工学会大会講演要旨集（平成２４年９月２５日）公益社団法人日本生物工学会発行第７１ページ（２Ｈａ１２）に発表

【微生物の受託番号】IPOD  FERM P-22124

(73)【特許権者】

【識別番号】000173809

【氏名又は名称】一般財団法人電力中央研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100087468

【弁理士】

【氏名又は名称】村瀬 一美

(72)【発明者】

【氏名】松本 伯夫

(72)【発明者】

【氏名】平野 伸一

【審査官】 森井 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１３−００００１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１３９２１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１８０７８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１８３１６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１１−００８０４５６（ＫＲ，Ａ）

【文献】 電力中央研究所環境科学研究所研究報告 (2012) No.V11029, p.1-9

【文献】 APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，２００９年，Vol.75, No.18，p.5871-5883

【文献】 Chin. J. Appl. Environ. Biol. (2008) vol.14, no.5, p.678-683

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ ７／０８

Ｃ１２Ｎ １／２０

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を、中和処理することなく、嫌気環境下でパエニバチルス マセランス（Paenibacillus macerans）ＮＳ−１株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２４）に接触させる工程を含むことを特徴とするグリセロール廃液からのエタノール生産方法。

【請求項2】

パエニバチルス マセランス（Paenibacillus macerans）ＮＳ−１株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２４）を含み、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液から、前記グリセロール廃液を中和処理することなく、嫌気環境下でエタノールの生産するための微生物含有組成物。

【請求項3】

パエニバチルス マセランス（Paenibacillus macerans）ＮＳ−１株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２４）が生息する嫌気状態の微生物処理槽を含み、前記微生物処理槽に油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を中和処理することなく投入してエタノールを生産するためのバイオリアクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グリセロール廃液からのエタノール生産方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液からのエタノールの生産に好適な方法に関する。また、本発明は、上記グリセロール廃液からのエタノールの生産に好適な微生物含有組成物及びバイオリアクターに関する。

【背景技術】

【0002】

バイオディーゼル燃料は、植物油等の油脂とメタノール等の第一級アルコールを原料として製造されるが、この際に主生成物である脂肪酸メチルエステル等の脂肪酸アルキルエステルと共に、副産物として原料油脂の約１０％に相当するグリセロール廃液が生じることが知られている（非特許文献１）。

【0003】

グリセロールは様々な化成品の基になる物質であるため、有効利用が望まれている。かかる状況の下、微生物の作用による有用物質への変換技術に関する研究が各種進められている。例えば、非特許文献２では、微生物を利用してグリセロールをエタノールに変換する技術について報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】山本博巳、「基礎からわかるバイオマス資源」、株式会社エネルギーフォーラム（２０１２）

【非特許文献2】S. S. Yazdani, R. Gonzalez, “Engineering Escherichia coli for the efficient conversion of glycerol to ethanol and co-products”, Metabolic Engineering, 10, 340-351(2008).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ところで、バイオディーゼル燃料を製造する際には、油脂と第一級アルコールを反応させる際に水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ性触媒を用いるアルカリ触媒法が広く採用されているが、アルカリ触媒法を採用した場合、バイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液は、アルカリ性触媒の影響によりアルカリ性を呈する。そのため、非特許文献２においては、アルカリ性のグリセロールをいったん中和処理してから、微生物を利用したエタノールの生産を実施するようにしている。

【0006】

しかしながら、グリセロール廃液の中和処理には、酸が必要になると共に、中和処理を行うための作業工程が別途必要になり、コストアップや工程数増加の要因となる。したがって、微生物を利用したグリセロール廃液からのエタノール生産の実用化を図る上では、コストアップや工程数増加の要因となるグリセロール廃液の中和処理を必要としない技術の確立が望ましいと言える。

【0007】

本発明は、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液から微生物を利用してエタノールを生産する方法について、グリセロール廃液を中和処理することなく供することのできる方法を提供することを目的とする。

【0008】

また、本発明は、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液から微生物を利用してエタノールを生産するための微生物含有組成物について、グリセロール廃液を中和処理することなく供することのできる微生物含有組成物を提供することを目的とする。

【0009】

さらに、本発明は、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液から微生物を利用してエタノールを生産するバイオリアクターについて、グリセロール廃液を中和処理することなく供することのできる方バイオリアクターを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

かかる課題を解決するため、本願発明者が鋭意検討した結果、本願発明者が単離したパエニバチルス マセランス（Paenibacillus macerans） ＮＳ−１株（以下、単に「ＮＳ−１株」と呼ぶこともある）が、中性の環境下だけでなく、アルカリ性の環境下においても、グリセロールをエタノールに変換する能力を発揮することを知見した。

【0011】

かかる知見に基づいて本願発明者がさらに鋭意検討した結果、ＮＳ−１株を使用することで、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるアルカリ性のグリセロール廃液を、中和処理することなく、エタノール生産が可能であることを知見するに至り、さらに種々検討を重ねて本発明を完成するに至った。

【0012】

即ち、本発明のグリセロール廃液からのエタノール生産方法は、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を、中和処理することなく、嫌気環境下でＮＳ−１株に接触させる工程を含むようにしている。

【0013】

また、本発明の微生物含有組成物は、ＮＳ−１株を含み、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液から、このグリセロール廃液を中和処理することなく、嫌気環境下でエタノールの生産するためのものである。

【0014】

さらに、本発明のバイオリアクターは、ＮＳ−１株が生息する嫌気状態の微生物処理槽を含み、この微生物処理槽に油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を中和処理することなく投入することで、グリセロール廃液中のグリセロールがエタノールに変換されるものである。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を、中和処理することなく、ＮＳ−１株を利用した微生物処理に供してエタノールを生産することが可能となる。したがって、中和処理に必要となる酸の使用や、中和処理を行うための作業工程を省略して、グリセロール廃液からのエタノール生産を低コストに且つ効率よく実施することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ＮＳ−１株の原子間力顕微鏡像である。

【図2】中性環境におけるＮＳ−１株のエタノール生産活性（グリセロール純品使用）を示す図である。

【図3】比増殖速度に与えるエタノール濃度の影響を検討した結果を示す図である。

【図4】中性環境におけるＮＳ−１株のエタノール生産活性（グリセロール廃液使用）を示す図である。

【図5】ｐＨ未調整のグリセロール廃液を使用した場合の、ＮＳ−１株のエタノール生産活性を示す図である。

【図6】グリセロール廃液を使用したエタノール変換試験を元にした培養シミュレーション結果を示す図である。

【図7】培養液を種々の回収割合とした場合のエタノール変換培養シミュレーション結果を示す図である。

【図8】培養液の回収率とエタノール生産速度の関係を示す図である。

【図9】グリセロール廃液からのエタノール生産連続培養シミュレーション結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。

【0018】

＜ＮＳ−１株＞
本発明において使用される微生物は、パエニバチルス（Paenibacillus）属に属し、中性の環境下だけでなく、アルカリ性の環境下においてもグリセロールをエタノールに変換する機能を発揮する微生物である。このような機能を発揮する微生物はこれまでに報告例がない。この微生物は、パエニバチルス マセランス（Paenibacillus macerans）ＮＳ−１株として、独立行政法人 産業技術研究所 特許生物寄託センターに２０１１年５月１９日付けで寄託されている（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２４）。

【0019】

ＮＳ−１株について、コロニー形状を表１に、炭素源資化性を表２ａ及び表２ｂに、酵素活性を表３に示す。また、ＮＳ−１株の原子間力顕微鏡像を図１に示す。

【0020】

【表1】

【0021】

【表2a】

【0022】

【表2b】

【0023】

【表3】

【0024】

また、ＮＳ−１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。

【0025】

以下、ＮＳ−１株を利用した本発明のエタノール生産方法、微生物含有組成物、及びバイオリアクターについて説明する。

【0026】

＜エタノール生産方法＞
本発明のエタノール生産方法は、中性の環境下だけでなく、アルカリ性の環境下においてもグリセロールをエタノールに変換するＮＳ−１株の特異な機能を利用して、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液から、エタノールを生産するようにしている。

【0027】

油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液は、油脂と第一級アルコールを反応させる際に添加する水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ性触媒の影響によりアルカリ性を示す。ここで、アルカリ性の環境下でグリセロールをエタノールに変換する機能を発揮する微生物は報告されていなかったことから、微生物を利用してアルカリ性のグリセロール廃液からエタノールを生産する場合には、グリセロール廃液を中和処理して中性にしてから微生物処理に供することが必須であると考えられていた。これに対し、ＮＳ−１株は、中性環境下だけでなく、アルカリ性の環境下においてもグリセロールをエタノールに変換する、これまでの微生物にはない特異な機能を有している。ＮＳ−１株のこの特異な機能を利用することで、アルカリ性のグリセロール廃液を中和処理することなく、エタノール生産を行うことが可能となる。

【0028】

ＮＳ−１株は、例えばパエニバチルス属の微生物の培養に適した公知の培地成分（例えば、P. Pason et al., “Purification and characterization of a multienzyme complex produced by Paenibacillus curdlanolyticus B-6”, Appl. Microbiol. Biotech., 85, 573-580 (2010).を参照）やこのような公知の培地成分に適宜変更を加えた培地成分を有する培養液中で培養される。尚、ＮＳ−１株は嫌気性微生物であり、培養は嫌気環境下にて実施される。

【0029】

ＮＳ−１株とグリセロール廃液の接触は、嫌気環境下にて、例えば培養液に予めグリセロール廃液を添加してＮＳ−１株を当該培養液中で培養することや、ＮＳ−１株を培養している培養液中にグリセロール廃液を添加すること等により行われる。あるいは、ＮＳ−１株を予め培養液中で培養し且つ高濃度に濃縮しておき、これにグリセロール廃液を添加して、嫌気環境下でグリセロール廃液中のグリセロールをエタノールに変換するようにしてもよい。この場合、グリセロール廃液中のグリセロールを極めて効率よくエタノールに変換することができる。

【0030】

ＮＳ−１株を培養する際、及びＮＳ−１株をグリセロール廃液と接触させる際の培養液の培養温度は、２０℃〜４０℃とすることが好適であり、３０℃とすることがより好適である。

【0031】

尚、培養液中のグリセロール廃液の濃度については、ＮＳ−１株のグリセロールのエタノールへの変換活性が大きく阻害されない限り、特に限定されるものではないが、グリセロール濃度換算で６０ｍＭ以下とすることが好適であり、３０ｍＭ以下とすることがより好適である。この場合には、ＮＳ−１株のグリセロールのエタノールへの変換活性が最大限に発揮される。

【0032】

＜微生物含有組成物＞
本発明の微生物含有組成物は、ＮＳ−１株を含むものであり、その形態は特に限定されない。例えば、生育に必要な栄養源や微量元素、ビタミン類等を含む培養液等にＮＳ−１株が添加された液剤や凍結保存品、フリーズドライ品等、種々の形態とすることができる。

【0033】

油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を中和処理することなく、本発明の微生物含有組成物と接触させることで、グリセロール廃液中のグリセロールをエタノールに変換することができる。したがって、グリセロール廃液からのエタノール生産を、グリセロール廃液の中和処理を行うことなく実現することができる。

【0034】

＜バイオリアクター＞
本発明のバイオリアクターは、ＮＳ−１株が生息する嫌気状態の微生物処理槽を含むものである。微生物処理槽に油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を中和処理することなく投入することで、グリセロール廃液からエタノールを生産することができる。

【0035】

バイオリアクターの運転は、例えば、微生物処理槽中のグリセロールがＮＳ−１株に消費されてグリセロール濃度が実質的にゼロに達した時点で培養液の一部を回収し、グリセロールを含む新鮮な培養液を投入する半回分法とすることが好適である。この場合、グリセロール廃液からのエタノールの生産を連続的に効率よく実施することができる。尚、半回分法におけるグリセロール廃液の投入量と培養液の回収率については、ＮＳ−１株に消費されてグリセロールが消失する前にＮＳ−１株の菌体密度が定常に達するように適宜調整される。

【0036】

また、微生物処理槽には、常時定常期よりも高い菌体密度、例えば５〜１０倍量の菌体密度のＮＳ−１株を生息させるようにしてもよい。この場合には、廃グリセロールからのエタノール生産効率をさらに向上させることができる。

【0037】

上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。即ち、ＮＳ−１株を利用して、油脂と第一級アルコールを原料としてアルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液から、このグリセロール廃液を中和処理することなく、エタノールを生産するものであれば、全て本発明の範囲に包含される。

【実施例】

【0038】

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。

【0039】

１．実験方法
（１）微生物
本実施例では、グリセロールからエタノールを生産する活性を有する、パエニバチルス マセランス（Paenibacillus macerans）ＮＳ−１株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２４）を使用した。また、比較のために、パエニバチルス マセランス（Paenibacillus macerans）の基準株（ＮＢＲＣ１５３０７）を菌株保存機関であるＮＢＲＣから購入して使用した。

【0040】

（２）培養液
本実施例において使用した培養液は、Paenibacillus属の培養に関する報告を基に表４ａに示す組成とした（P. Pason et al., “Purification and characterization of a multienzyme complex produced by Paenibacillus curdlanolyticus B-6”, Appl. Microbiol. Biotech., 85, 573-580 (2010).）。培養液は無機塩を主体としており、主要炭素源としてグリセロール（またはグリセロール廃液）を含む。微生物の生育を助ける目的で窒素源としてトリプトンを添加するとともに表４ｂに示すビタミン類および微量金属を微量添加した。

【0041】

【表4a】

【0042】

【表4b】

【0043】

培養液のｐＨ及びグリセロール濃度は、実験条件に応じ変化させた。

【0044】

ｐＨについては、本実験で検討した範囲においてグリセロール廃液を培養液に混入した際の最大値がｐＨ＝９であったことから、実験条件としてはｐＨ７，８，９に設定することとした。

【0045】

グリセロール純品を使用した試験では、ビタミン、微量金属を除く成分についてオートクレーブ滅菌し、滅菌後の溶液にフィルター除菌したビタミン、微量金属の濃縮液を添加した。

【0046】

本実施例において使用したグリセロール廃液は、食品系の企業から排出された食用油からアルカリ触媒法によってバイオディーゼル燃料を生成した際に副産物として生じたもので、アルカリ性を呈している（ｐＨ＝９．９）。グリセロール廃液の組成を表５に示す。

【0047】

【表5】

【0048】

グリセロール廃液を使用した実験では、ビタミン、微量金属、グリセロール廃液を除く成分についてオートクレーブ滅菌し、所定濃度のグリセロール廃液、フィルター除菌したビタミン、微量金属の濃縮液を添加した。なお、グリセロール廃液は、粘度が高い上、熱による成分の変性が生じる可能性があるため、フィルター除菌やオートクレーブ滅菌の適用が困難であった。ただし、成分組成から微生物の混入の可能性が極めて低いことから、未滅菌で実験に使用した。

【0049】

なお、本実施例において使用した微生物は、表４ａ及び表４ｂに示す培養液（但し、ｐＨ＝７、グリセロール（純品）濃度＝５ｇ／Ｌ）で、窒素ガスを充填した１００ｍＬ容積のバイアル瓶を使用し、３０℃、嫌気的環境下で約２週間おきに継代培養してから実験に供した。

【0050】

（３）培養試験方法
オートクレーブ滅菌した１００ｍＬ容積のガラスバイアル瓶に、上記１の（２）で調整した培養液を５０ｍＬ充填し、ブチルゴム栓で密閉したうえで、容器内を窒素ガスにより嫌気状態とした。そこへ、継代培養した微生物（上記１の（２）を参照）の懸濁液を、シリンジを用いて所定の菌体密度となるように植菌し、３０℃に加温した恒温器中で静置培養した。培養試験は基本的に３連（ｎ＝３）で実施した。

【0051】

（４）菌体密度計測
培養液に生息する微生物の計測は、微生物の懸濁密度と相関のある６６０ｎｍの吸光度を吸光度計により測定することにより行った。

【0052】

（５）成分分析
培養液中のグリセロール、および微生物変換によって生じたエタノール、酢酸は、液体クロマトグラフィー（Ｌａｃｈｒｏｍｅ Ｅｌｉｔｅ、日立製）で定量分析した。クロマトグラフィーのカラムはＧｅｌｐａｋ（登録商標）（ＧＬ−Ｃ６１０Ｈ−Ｓ、７．８φ×３００ｍｍ）を使用し、０．１％リン酸をバッファーとして用い、ＲＩ検出器により信号を得た。なお、計測時のオーブン温度は４０℃、カラム内の流速は０．５ｍＬ／分とした。測定には、フィルター濾過により微生物等の固形分を除去した培養液１０μＬを使用した。

【0053】

２．実験結果（グリセロール純品）
（１）中性環境における微生物のエタノール生産活性
まず、ＮＳ−１株のエタノール生産活性を、グリセロール純品を使用した中性条件で調査した。グリセロールを６０ｍＭ含有させた培養液に、ＮＳ−１株を１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で植菌した際の、グリセロール濃度、菌体密度、並びに生成物の濃度変化を図２に示す。

【0054】

培養開始直後からグリセロール濃度が減少するとともに、エタノールの生成が生じることが確認された。また、菌体密度は培養開始１日目で急激な増加があったが、２日目以降では定常状態で推移する傾向が見られた。尚、培養初期において、微量の酢酸の生成が確認されたが、エタノールと比較するとその生産量は小さかった。

【0055】

（２）アルカリ性環境における微生物のエタノール生産活性
ＮＳ−１株について、初期培養液のｐＨを７，８，９に設定した際の、培養６日目のグリセロール純品の消費量、エタノール生産量、並びにエタノール変換効率を表６に示す。

【0056】

【表6】

【0057】

表６に示されるように、ＮＳ−１株のエタノール変換効率は、ｐＨによる影響を受けずに、ｐＨ９においても、９２．７％という極めて高い値が得られた。一方、パエニバチルス マセランス（Paenibacillus macerans）の基準株（ＮＢＲＣ１５３０７、表６中の「Ｔｙｐｅ Ｓｔｒａｉｎ」）で同様の試験を実施したところ、アルカリ環境（ｐＨ＝８，９）ではグリセロールのエタノールへの変換がみられなかった。以上の結果から、ＮＳ−１株は、アルカリ環境に順応し、エタノール生産活性を維持する特異な微生物であると判断された。

【0058】

（３）初期グリセロール濃度の微生物変換への影響
初期培養液（ｐＨ＝７）に含まれるグリセロール濃度を変化させたときの培養６日目のエタノール変換効率、ならびにグリセロール消費率の変化を調査した結果を表７に示す。

【0059】

【表7】

【0060】

エタノール変換効率については、初期グリセロール濃度１０ｍＭで１００％となり、初期グリセロール濃度を高めることで若干低下したものの、初期グリセロール濃度を１００ｍＭ、１５０ｍＭとした場合においても、７０〜８０％に維持されることが明らかとなった。

【0061】

また、グリセロール消費率については、初期グリセロール濃度１０ｍＭで１００％となったが、初期グリセロール濃度６０ｍＭで６０％まで低下し、初期グリセロール濃度を１００ｍＭ、１５０ｍＭとした場合には２０〜３０％まで低下した。尚、本実験の結果から、初期グリセロール濃度を高くしても、グリセロール消費量は３０ｍＭ程度で頭打ちとはなるものの、ＮＳ−１株によりグリセロールは消費され、エタノール変換に供されることが明らかとなった。

【0062】

以上の結果から、初期グリセロール濃度を高めてもエタノール変換効率が大きく低下することはないことが明らかとなった。換言すると、ＮＳ−１株においては、初期グリセロール濃度に起因する基質阻害が顕著には生じないことが明らかとなった。但し、グリセロールからエタノールへの変換効率を最大限に高める上では、グリセロール濃度は６０ｍＭ以下に維持することが好適であり、３０ｍＭ以下に維持することが好適であると考えられた。

【0063】

（４）エタノール含有濃度の微生物変換への影響
上記２の（３）の結果において、ＮＳ−１株のグリセロールからのエタノール生産が生成物であるエタノールによってどの程度影響を受けるかを調査するため、グリセロール６０ｍＭを含む培養液（ｐＨ＝７）にあらかじめエタノールを種々の濃度で含有させた際の微生物の比増殖速度を計測した。その結果を図３に示す。

【0064】

初期エタノール濃度０の場合、微生物の比増殖速度は０．４（／ｈ）であった。初期エタノール濃度を増加させるに伴い、微生物の比増殖速度は減少し、エタノール濃度約４３０ｍＭで比増殖速度が半減する結果を得た。

【0065】

一般的に微生物反応による生成物（ここではエタノール）の高濃度蓄積が微生物の反応に影響を及ぼす恐れがあるが、本実験の結果を上記２の（３）での実験結果と合わせて考察すると、初期グリセロール濃度６０ｍＭ以上で蓄積したエタノール濃度は３０ｍＭ程度であり、生成物であるエタノールの蓄積による影響は殆どないと考えられた。

【0066】

３．実験結果（グリセロール実廃液）
（１）中和グリセロール廃液の変換活性
ＮＳ−１株を用いたグリセロール廃液からのエタノール生成試験として、中性条件下でのグリセロール廃液からのエタノール生成を確認した。培養液に５ｇ／Ｌ（正味グリセロール濃度約３０ｍＭ）のグリセロール廃液を含有させたのちにｐＨ＝７とし、ＮＳ−１株による変換試験を実施した。その際のグリセロール、エタノール、酢酸濃度の経時変化を図４に示す。

【0067】

図４に示される結果から、培養開始直後よりグリセロール濃度の減少が観察され、培養開始３日目でほぼすべてのグリセロールが消失することが明らかとなった。６日目におけるエタノール変換効率は６９．０％（エタノール生成量ｍＭ／グリセロール消費量ｍＭ：１８．９／２７．４）であり、グリセロール純品を用いた際と遜色ない値を示した。

【0068】

（２）ｐＨ未調整グリセロール廃液の変換活性
培養液にグリセロール廃液を５ｇ／Ｌ含有させたところ、ｐＨは約９を示した。この培養液にＮＳ−１株を１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの初期密度で植菌し変換試験を実施したところ、７日の培養期間でほぼグリセロールが消失し、エタノールの生成が確認された（図５）。また、培養初期に酢酸の生成が認められた。培養７日目におけるグリセロール消費量に対するエタノール生成の割合（エタノール変換効率）は７２．５％であった。

【0069】

これまでに、ｐＨ未調整のグリセロール廃液からの微生物変換によるエタノール生産の報告例は無い。これはアルカリ性の環境下において活性を維持できる微生物が限られているためと考えられる。

【0070】

以上、本実験の結果から、ＮＳ−１株が、アルカリ性であるｐＨ未調整のグリセロール廃液からエタノールを生産することのできる機能を持つ特異な性質を有する微生物であることが明らかとなった。

【0071】

４．微生物反応の数式化による連続培養のシミュレーション
ＮＳ−１株を用いて、グリセロール廃液からエタノールを生産するリアクターを構築した際の好適な運転条件について、シミュレーションにより検討した。

【0072】

（１）ＮＳ−１株によるグリセロール廃液からのエタノール生産反応の数式化
上記３の（２）において、ＮＳ−１株によるグリセロール廃液からのエタノール生産を実施した際の物質変化を元に、微生物によるエタノール生産の数値モデルを構築した。この際に、以下の点に着目した。
・微生物の対数増殖は培養初期で止まり、その後は一定の菌数を維持する。
・培養初期にのみ酢酸の生成が生じる。
・エタノール生成は培養期間を通して生じる。
・高濃度のグリセロール、エタノールによって基質阻害、生成物阻害が生じる。

【0073】

微生物の対数増殖が、基質の完全消費を待たずに終了し、同時期に酢酸生成が停止する現象は、アセトン・ブタノール発酵で知られるClostridium acetobutylicumが、培養初期に酢酸、酪酸を生成しながら対数増殖し、ある時点で対数増殖が停止し異なる生成物を生産するようになる現象に酷似している。この現象は、培養途中において何らかの代謝転換因子が蓄積し、一定量に達するとスイッチが切り替わることによって生じると考えられている（T. Kousaka et al., “Characterization of the sol operon in butanol-hyper-producing Clostridium saccharoperbutylacetonicum strain N1-4 and its degeneration mechanism”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 58-68 (2007)）。本実施例においては、酢酸生成ならびに微生物の生育が停止するタイミングをもって生成物の切り替わりが起こっていると仮定し、シミュレーションを行うこととした。

【0074】

以下に、菌体の増殖、グリセロール濃度変化、エタノール濃度変化、酢酸濃度変化に対する数式を示す（田口久治 他編、「微生物培養工学」、共立出版株式会社（１９９２））。

【0075】

菌体の増殖モデル

【0076】

【数1】

【0077】

グリセロール濃度変化モデル

【0078】

【数2】

【0079】

エタノール濃度変化モデル

【0080】

【数3】

【0081】

酢酸濃度変化モデル

【0082】

【数4】

【0083】

ｒ_ｘ ：菌体の増殖速度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／ｈ）
μ_ｍａｘ：最大比増殖速度（１／ｈ）
ｃ_ｓ ：基質（グリセロール）濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
Ｋ_Ｓ ：基質（グリセロール）の飽和定数（ｍｏｌ／Ｌ）
Ｋ_Ｐ ：生成物（エタノール）の阻害定数（ｍｏｌ／Ｌ）
ｃ_ｐ ：生成物（エタノール）の濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
Ｘ ：菌体密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
ｒ_ｓ ：基質（グリセロール）の濃度変化（ｍｏｌ／Ｌ／ｈ）
Ｙ ：基質あたりの菌体増殖量（ｃｅｌｌｓ／ｍｏｌ）
ｒ_ｐ ：生成物（エタノール）の濃度変化（ｍｏｌ／Ｌ／ｈ）
Ｙ_Ｐ／Ｓ：エタノール変換効率（ｍｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔ／ｍｏｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）
ｃ_Ｂ ：副生成物（酢酸）の濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
ｒ_Ｂ ：副生成物（酢酸）の濃度変化（ｍｏｌ／Ｌ／ｈ）
Ｙ_Ｂ／Ｓ：酢酸変換効率（ｍｏｌ ｂｙｐｒｏｄｕｃｔ／ｍｏｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）

【0084】

図６に、ＮＳ−１株によるグリセロール廃液からのエタノール生成のシミュレーション（線）ならびに実測値（点）を示す。シミュレーションによってグリセロールの消費、エタノール、酢酸の生成を矛盾なく再現することができた。また、グリセロール廃液中では実測が困難であった菌体密度の推移についても予測することができた。なお、培養後期のグリセロール濃度について、実測では１．６ｍＭ程度のグリセロールが残存していたが、グリセロールの初期濃度（２５ｍＭ）では基質阻害の効果が殆どないこと、測定上の誤差の可能性があることから、シミュレーションではゼロに達しているとみなした。

【0085】

（２）ＮＳ−１株によるエタノール生産連続培養系のシミュレーション１
上記４の（１）で採用した初期条件を用いて、ＮＳ−１株を用いてグリセロール廃液からのエタノール生産連続培養を想定したシミュレーションを実施した。連続培養においては、グリセロール濃度がゼロに達した時点で培養液の一部を回収し、グリセロール（濃度：２５ｍＭ）を含む新鮮な培養液を投入する半回分法とした。この培養液の交換において回収する培養液の割合を変化させた際の培養液交換頻度や、その際の菌体密度の推移、エタノール生産効率について調査した。

【0086】

半回分培養の際に回収する培養液の割合を２０体積％、５０体積％、８０体積％に設定し、１０日間連続培養した際のシミュレーション結果を図７に示す。培養開始から最初にグリセロール濃度がゼロになるまでの時間はすべての条件において約３日で等しく、その後の回収する培養液の割合の違いによって異なる濃度変化を示した。１０日間での培養液の交換頻度はそれぞれ２０体積％で１１回、５０体積％で６回、８０体積％で４回であった。回収する培養液の割合２０体積％の運転条件では、次第に菌体密度が低下していく結果となった。これは菌体密度が定常期に達する前にグリセロールが消失することが原因であり、徐々に菌体密度が低下する影響でグリセロール消費速度が次第に遅くなり、培養液交換までのタイミングが長くなる結果となった。一方で、回収する培養液の割合が５０体積％、８０体積％の場合にはグリセロールが消失する前に菌体密度が定常に達するため、２回目以降の培地交換のタイミングは各条件においてほぼ一定となった。

【0087】

次に、連続培養においてエタノール生産速度が最大となる回収割合を探るため、回収する培養液の割合を１０体積％から９０体積％まで変化させた際の、それぞれ３回目の培養液交換からグリセロール消失までに要した時間と回収されるエタノールから、エタノール生産速度（ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ）を算出した（図８）。その結果、回収する培養液の割合を５０体積％とした場合に最も高いエタノール生産速度に達し、その値は６．５６ｍｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙと見積もられた。

【0088】

（３）ＮＳ−１株によるエタノール生産連続培養系のシミュレーション２
実用性を考える場合、生産されるエタノールの濃度はより高いほうが望ましい。そこで、半回分培養において、グリセロール濃度がゼロに達した時点で、培養液の５体積％のみを回収し新たにグリセロール濃度を初期値に戻す操作を想定し、シミュレーションを行った（図９）。グリセロールの初期濃度を５０ｍＭ（ＮＳ−１株において完全に消費可能な濃度）とした場合、培養器中のエタノール濃度は徐々に増加し、約６００ｍＭ（２７．６ｇ／Ｌ）で定常状態になると予測された（図８−Ａ）。この値は現時点でグリセロールからエタノール生産をする微生物変換に関する文献値の最高値である２８．１ｇ／Ｌ（X. Liu et al., “Bioconversion of crude glycerol feedstocks into ethanol by Pachysolen tannophilus”, Bioresource Technology, 104, 579-586 (2012)）にほぼ匹敵するものであり、実用的価値が認められた。ただし、この培養条件においてエタノール濃度が定常に達するまでには５００日を要すると見込まれた。

【0089】

ここで、ＮＳ−１株は菌体密度が一定以上高くならないため、微生物の自然の増殖に頼った連続培養では到達濃度に限界があると考えられた。ところで、微生物を用いた物質生産システムの中には、微生物を反応触媒と見立て、あらかじめ培養し高濃度に濃縮した微生物を維持しながら物質生産を行う手法が知られている（M. Inui et al., “Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions”, J. Microbiol. Biotechnol.,7(4), 182-196 (2004)）。ＮＳ−１株によるエタノール生産においても同様の手法をとることが可能であると考えられるため、培養液中に常時定常期の５倍、１０倍の菌体密度のＮＳ−１株を保持した状態で、グリセロール濃度がゼロに達した時点で、培養液の５体積％を回収し新たにグリセロール濃度を初期値に戻す操作を想定し、この際に生成されるエタノール濃度を推定した。その結果、菌体密度を５倍とした場合には、定常状態に達するまでの日数が９０日、１０倍の場合には４５日と大幅に短縮されると予測され、更なる実用性が期待できることが明らかとなった（図９−Ｂ、Ｃ）。

【図3】

【図8】

【図1】

【図2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]