特許 6033632 セロビオン酸ホスホリラーゼを用いた酸性βグルコシル二糖の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6033632

(24)【登録日】2016年11月4日

(45)【発行日】2016年11月30日

(54)【発明の名称】セロビオン酸ホスホリラーゼを用いた酸性βグルコシル二糖の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/12 20060101AFI20161121BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20161121BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20161121BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/12ZNA

   !C12N9/12

   !C12N15/00 A

【請求項の数】6

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2012-228364(P2012-228364)

(22)【出願日】2012年10月15日

(65)【公開番号】特開2014-79185(P2014-79185A)

(43)【公開日】2014年5月8日

【審査請求日】2015年9月10日

(73)【特許権者】

【識別番号】304027279

【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学

(73)【特許権者】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100080089

【弁理士】

【氏名又は名称】牛木 護

(74)【代理人】

【識別番号】100161665

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 知之

(72)【発明者】

【氏名】中井 博之

(72)【発明者】

【氏名】仁平 高則

(72)【発明者】

【氏名】斉藤 由華

(72)【発明者】

【氏名】大坪 研一

(72)【発明者】

【氏名】北岡 本光

(72)【発明者】

【氏名】西本 完

【審査官】 伊藤 良子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／１１８００７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１２８６０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／００７４８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Database GenBank [online], Accession No.ABD80168.1，２０１１年１１月２１日，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/89950153?sat=18&satkey=1747322

【文献】 Database GenBank [online], Accession No.AAM43298.1，２００９年 ２月２６日，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/21115350?sat=18&satkey=1856173

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １９／１２

Ｃ１２Ｎ ９／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

α−グルコース１−リン酸と、グルコン酸又はグルクロン酸と、以下の酵素学的性質と配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するセロビオン酸ホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うステップと、セロビオン酸又はグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を回収するステップとを含む酸性βグルコシル二糖の製造方法：
ａ）作用
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用してセロビオン酸を生成し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用してグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を生成する；
ｂ）基質特異性
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ６．５；
ｄ）温度安定性
ｐＨ６．５の条件下で、３５℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．５−１０．５で安定。

【請求項2】

α−グルコース１−リン酸と、グルコン酸又はグルクロン酸と、以下の酵素学的性質と配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するセロビオン酸ホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うステップと、セロビオン酸又はグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を回収するステップとを含む酸性βグルコシル二糖の製造方法：
ａ）作用
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用してセロビオン酸を生成し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用してグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を生成する；
ｂ）基質特異性
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ６．０；
ｄ）温度安定性
ｐＨ６．０の条件下で、３５℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．０−１０．５で安定。

【請求項3】

α−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖と、グルコン酸又はグルクロン酸と、リン酸と、以下の酵素学的性質と配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するセロビオン酸ホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うステップと、セロビオン酸又はグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を回収するステップとを含む酸性βグルコシル二糖の製造方法：
ａ）作用
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用してセロビオン酸を生成し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用してグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を生成する；
ｂ）基質特異性
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ６．５；
ｄ）温度安定性
ｐＨ６．５の条件下で、３５℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．５−１０．５で安定。

【請求項4】

α−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖と、グルコン酸又はグルクロン酸と、リン酸と、以下の酵素学的性質と配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するセロビオン酸ホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うステップと、セロビオン酸又はグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を回収するステップとを含む酸性βグルコシル二糖の製造方法：
ａ）作用
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用してセロビオン酸を生成し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用してグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を生成する；
ｂ）基質特異性
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ６．０；
ｄ）温度安定性
ｐＨ６．０の条件下で、３５℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．０−１０．５で安定。

【請求項5】

α−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖の組み合わせが、スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．７）及びスクロースとの組み合わせ、ホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１）及びデンプンまたはデキストリンとの組み合わせ、セロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２０）及びセロビオースとの組み合わせ、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．４９）及びセロデキストリンとの組み合わせ、ラミナリビオースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．３１）またはβ−１，３オリゴグルカンホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．３０）及びラミナリオリゴ糖との組み合わせ、β−１，３グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．９７）及びβ−１，３グルカンとの組み合わせ、トレハロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２３１）及びトレハロースとの組み合わせ、よりなる群から選択される１つ以上の組み合わせである、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

前記溶液がｐＨ５．５〜８．５である請求項１〜４のいずれかに記載の酸性βグルコシル二糖の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、セロビオン酸ホスホリラーゼ及びそれを用いた酸性βグルコシル二糖の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

食品に添加されるオリゴ糖の機能として、近年栄養面からだけでなく、品質改良を目的とした嗜好面の向上能が注目されているが、その高純度調製の困難さ・高コストが当該研究の産業応用を妨げている。そのため、オリゴ糖をはじめとする種々の糖質の選択的な低コスト大量調製法の確立が望まれている。

【0003】

ところで、酸性βグルコシル二糖の一つであるセロビオン酸は、種々の食品用添加剤として有用とされている。例えば、ベーカリー製品の原料にセロビオン酸を添加することにより、食感に優れ、ソフトなボリュームがあり、焼成後の保存安定に優れたベーカリー製品を作製可能であることから、ベーカリー製品用品質改良剤として有用とされている（特許文献１）。また、煮崩れ防止能を有しつつも、食感に優れ、食味に影響を及ぼさないことから、食品の煮崩れ防止剤として有用とされている（特許文献２）。さらに、カルシウムや鉄等との塩形態である場合に水溶性を示すことから、ミネラル補強剤としても有用とされている。

【0004】

しかし、従来のセロビオン酸の製造方法には、以下の問題があり、安価に製造することはできなかった。化学的酸化法は、酸化反応の位置選択性は充分ではなく、副反応生成物を生じるため収率が低かった。また、酸化酵素法は、高価なセロビオースを出発材料とするため、高コストとなっていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１０−３５５１３号公報

【特許文献2】特開２０１０−１１９３４３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

そこで、本発明は上記問題点に鑑み、安価な材料から酵素合成法により効率的にセロビオン酸を製造することを可能にする、新規のセロビオン酸ホスホリラーゼ及びそれを用いた酸性βグルコシル二糖の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を達成するため鋭意検討した結果、新規に２種のセロビオン酸ホスホリラーゼを発見した。そして、α−グルコース１−リン酸とグルコン酸又はグルクロン酸を出発原料としたセロビオン酸ホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応（加リン酸分解反応の逆反応）、またはα−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素の加リン酸分解反応と新規に発見したセロビオン酸ホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応を組み合わせることで、酸性βグルコシル二糖を簡便かつ選択的に大量製造することができることを見出し、本発明を完成させた。

【0008】

本発明で用いられるセロビオン酸ホスホリラーゼは、以下の酵素学的性質と配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する：
ａ）作用
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用してセロビオン酸を生成し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用してグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を生成する；
ｂ）基質特異性
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ６．５；
ｄ）温度安定性
ｐＨ６．５の条件下で、３５℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．５−１０．５で安定。

【0009】

或いは、本発明で用いられるセロビオン酸ホスホリラーゼは、以下の酵素学的性質と配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する：
ａ）作用
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用してセロビオン酸を生成し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用してグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を生成する；
ｂ）基質特異性
α−グルコース１−リン酸とグルコン酸とに作用し、α−グルコース１−リン酸とグルクロン酸とに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ６．０；
ｄ）温度安定性
ｐＨ６．０の条件下で、３５℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．０−１０．５で安定。

【0010】

本発明の酸性βグルコシル二糖の製造方法は、α−グルコース１−リン酸と、グルコン酸又はグルクロン酸と、前記セロビオン酸ホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うステップと、セロビオン酸又はグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を回収するステップとを含む。

【0011】

或いは、本発明の酸性βグルコシル二糖の製造方法は、α−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖と、グルコン酸又はグルクロン酸と、リン酸と、前記セロビオン酸ホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うステップと、セロビオン酸又はグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を回収するステップとを含む。

【0012】

また、α−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖の組み合わせが、スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．７）及びスクロースとの組み合わせ、ホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１）及びデンプンまたはデキストリンとの組み合わせ、セロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２０）及びセロビオースとの組み合わせ、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．４９）及びセロデキストリンとの組み合わせ、ラミナリビオースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．３１）またはβ−１，３オリゴグルカンホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．３０）及びラミナリオリゴ糖との組み合わせ、β−１，３グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．９７）及びβ−１，３グルカンとの組み合わせ、トレハロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２３１）及びトレハロースとの組み合わせ、よりなる群から選択される１つ以上の組み合わせである。

【0013】

また、前記溶液がｐＨ５．５〜８．５である。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、安価な材料から酵素合成法により効率的にセロビオン酸又はグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】実施例１で調製したセロビオン酸ホスホリラーゼの至適ｐＨを示した図である。

【図1B】実施例１で調製したセロビオン酸ホスホリラーゼのｐＨ安定性を示した図である。

【図1C】実施例１で調製したセロビオン酸ホスホリラーゼの温度安定性を示した図である。

【図2A】実施例２で調製したセロビオン酸ホスホリラーゼの至適ｐＨを示した図である。

【図2B】実施例２で調製したセロビオン酸ホスホリラーゼのｐＨ安定性を示した図である。

【図2C】実施例２で調製したセロビオン酸ホスホリラーゼの温度安定性を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明によれば、α−グルコース１−リン酸と、グルコン酸又はグルクロン酸と、前記セロビオン酸ホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うことで、酸性βグルコシル二糖を簡便かつ選択的に大量製造することができる。或いは、α−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖と、グルコン酸又はグルクロン酸と、リン酸と、前記セロビオン酸ホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うことで、酸性βグルコシル二糖を簡便かつ選択的に大量製造することができる。

【0017】

α−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖の組み合わせは、スクロースホスホリラーゼ及びスクロースとの組み合わせ、ホスホリラーゼ及びデンプンまたはデキストリンとの組み合わせ、セロビオースホスホリラーゼ及びセロビオースとの組み合わせ、セロデキストリンホスホリラーゼ及びセロデキストリンとの組み合わせ、ラミナリビオースホスホリラーゼまたはβ−１，３オリゴグルカンホスホリラーゼ及びラミナリオリゴ糖との組み合わせ、β−１，３グルカンホスホリラーゼ及びβ−１，３グルカンとの組み合わせ、トレハロースホスホリラーゼ及びトレハロースとの組み合わせ、よりなる群から選択される１つ以上の組み合わせであり、最も好ましい組み合わせはスクロースホスホリラーゼ及びスクロースとの組み合わせである。

【0018】

α−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びセロビオン酸ホスホリラーゼは特に限定されるものではなく、いかなる起源の酵素を用いることも可能である。反応液中でのα−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びセロビオン酸ホスホリラーゼの濃度は特に限定されないが、それぞれ、０．０１〜１０００μＭ、好ましくは、１０〜３０μＭで使用することができる。これらの酵素の使用形態は特に限定されるものではなく、菌体抽出液、精製酵素、固定化酵素など種々のものを利用することができる。本発明の好適な実施形態によれば、上記反応に関わる全ての酵素を固定化したバイオリアクターカラムを用いて、固定化酵素リアクターとして反応を行うことも可能である。

【0019】

出発原料として用いる糖質の使用濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは約１〜約１０００ｇ／Ｌであり、より好ましくは約１０〜約１０００ｇ／Ｌである。

【0020】

酵素反応に関わるリン酸はいかなる起源のものであっても良い。反応系に加えるリン酸濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約１００ｍＭ程度である。

【0021】

【化1】

【0022】

【化2】

【0023】

反応形態は特に限定されるものではないが、水溶液又は緩衝液中で行われるのが好適である。反応液のｐＨは好ましくは５〜９である。反応温度は特に限定されるものではないが、好ましくは５℃〜８０℃、特に３０℃が好ましい。また反応時間は特に限定されるものではないが、０．１〜１００時間であることが好ましい。

【0024】

本発明により得られる酸性βグルコシル二糖は任意の方法で精製することができる。例えば、本発明により得られる酸性βグルコシル二糖は、カラムクロマトグラフィーや結晶化により単離することが可能である。カラムクロマトグラフィーとして、これに限定されるものではないが、サイズ排除クロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過膜分離、逆浸透膜分離が含まれる。結晶化方法としては、これに限定されるものではないが、濃縮、温度低下、溶媒添加（エタノール、メタノール、アセトンなど）が含まれる。

【0025】

なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の思想を逸脱しない範囲で種々の変形実施が可能である。

【0026】

次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

【実施例1】

【0027】

サッカロファガス・デグラダンスのゲノム情報を基に、Ｓｄｅ０９０６遺伝子に対するフォーワードプライマー（配列番号３）及びリバースプライマー（配列番号４）を設計し、合成した。Ｓｄｅ０９０６遺伝子の塩基配列を配列番号２に、またこの塩基配列にコードされているアミノ酸配列を配列番号１に示す。

【0028】

サッカロファガス・デグラダンスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマー及びＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、９４℃に２分間保持したのち、９５℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、６８℃で３分３０秒間のサイクルを４０回繰り返してＰＣＲ反応を行った。その結果、２３８１ｂｐの増幅断片が得られた。このＰＣＲで増幅されるＤＮＡ断片は、５’末端にＮｃｏＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトをそれぞれ有するＳｄｅ０９０６をコードするＤＮＡである。

【0029】

得られた増幅断片を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ−２８ａ（ノバジェン社製）に高効率ライゲーション試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。さらに、ライゲーション反応液を用いて大腸菌コンピテントセルＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、Ｃ末端に６残基のヒスチジンからなるＨｉｓタグが付加されたＳｄｅ０９０６をコードするＤＮＡを含む発現ベクターｐＥＴ−２８ａを回収した。

【0030】

この発現ベクターｐＥＴ−２８ａを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＨａｎａｈａｎらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８３年、第１６６巻、第５５７−５８０頁）に従って形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地２００ｍＬに植菌し、ＩＰＴＧ濃度を０．１ｍＭとして誘導培養を１８℃で２４時間行った。培養液から遠心分離で回収した菌体を１０ｍＬの５００ｍＭ塩化ナトリウム及び１０％グリセロールを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁し、超音波処理により破砕した後、遠心分離後によって粗酵素液を得た。組換えタンパク質の精製は、Ｈｉｓタグタンパク質精製用カラムＨｉｓＴｒａｐＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより行った。得られた精製酵素溶液を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．０に対して透析を行い、遠心式フィルターユニットアミコンウルトラ-３０（ミリポア社製）を用いた限外濾過によって３．５ｍＬに濃縮することで、Ｓｄｅ０９０６精製酵素標品を調製した。

【実施例2】

【0031】

キントモナス・カンペストリスのゲノム情報を基に、ＸＣＣ４０７７遺伝子に対するフォーワードプライマー（配列番号７）及びリバースプライマー（配列番号８）を設計し、合成した。ＸＣＣ４０７７遺伝子の塩基配列を配列番号６に、またこの塩基配列にコードされているアミノ酸配列を配列番号５に示す。

【0032】

キントモナス・カンペストリスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマー及びＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、９５℃に２分間保持したのち、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で２分３０秒間のサイクルを４５回繰り返してＰＣＲ反応を行い、最後に６８℃に５分間保持した。その結果、２４１５ｂｐの増幅断片が得られた。このＰＣＲで増幅されるＤＮＡ断片は、５’末端にＮｄｅＩサイトを、３’末端にＮｏｔＩサイトをそれぞれ有するＸＣＣ４０７７をコードするＤＮＡである。

【0033】

得られた増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ−２４ａ（ノバジェン社製）に高効率ライゲーション試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いて連結した。さらに、ライゲーション反応液を用いて大腸菌コンピテントセルＤＨ５αを形質転換し、Ｃ末端に６残基のヒスチジンからなるＨｉｓタグが付加されたＸＣＣ４０７７をコードするＤＮＡを含む発現ベクターｐＥＴ−２４ａを回収した。

【0034】

この発現ベクターｐＥＴ−２８ａを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地２００ｍＬに植菌し、ＩＰＴＧ濃度を０．１ｍＭとして誘導培養を１８℃で２４時間行った。培養液から遠心分離で回収した菌体を１０ｍＬの５００ｍＭ塩化ナトリウム及び１０％グリセロールを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁し、超音波処理により破砕した後、遠心分離後によって粗酵素液を得た。組換えタンパク質の精製は、Ｈｉｓタグタンパク質精製用カラムＨｉｓＴｒａｐＨＰを用いたカラムクロマトグラフィーにより行った。得られた精製酵素溶液を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．０に対して透析を行い、遠心式フィルターユニットアミコンウルトラ-３０を用いた限外濾過によって３．５ｍＬに濃縮することで、ＸＣＣ４０７７精製酵素標品を調製した。

【実施例3】

【0035】

得られたＳｄｅ０９０６精製酵素標品を用い、以下に示す方法によってＳｄｅ０９０６を新規酵素セロビオン酸ホスホリラーゼと同定し、セロビオン酸を生成した。

【0036】

５００ｍＭのα−グルコース１−リン酸（糖供与体）、５００ｍＭのグルコン酸（糖受容体）、９．５μＭのＳｄｅ０９０６を含む反応液１ｍＬ（ｐＨ６．５）中で酵素反応を３０℃、２４時間行い、６５℃、３０分熱処理することで反応を停止した。反応液にフォスファターゼ（８３μｇ）を添加して３０℃、２４時間静置した後、トヨパールＨＷ−４０Ｓカラム（径２．６ｃｍ、長さ７０ｃｍ）による水を溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィーにより二糖画分を単離した。精製後の収量は４３ｍｇであった。生成物をＮＭＲにより分析したところ、セロビオン酸であることを確認した。

【0037】

５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）中、２ｍＭのα−グルコース１−リン酸及びグルコン酸を用いて、Ｓｄｅ０９０６が合成反応時に生成するリン酸をモリブデンブルー法により定量した結果、グルコン酸を糖受容体とした際のＳｄｅ０９０６の活性は１．８ユニット／ｍｇであった。

【0038】

Ｓｄｅ０９０６の３０℃における至適ｐＨは６．５付近であり（図１Ａ）、安定ｐＨ範囲は４℃及び２４時間の条件下でｐＨ５．５−１０．５であった（図１Ｂ）。本酵素のｐＨ６．５における安定性は３５℃までであった（図１Ｃ）。

【0039】

５００ｍＭのスクロース、５００ｍＭのグルコン酸、１０ｍＭ リン酸、０．１８μＭのスクロースホスホリラーゼ、１２μＭのＳｄｅ０９０６を含む反応液１０ｍＬ（ｐＨ６．５）中で酵素反応を３０℃、２４時間行った後、６５℃、３０分熱処理することで反応を停止した。反応液にインベルターゼ（０．３３ｍｇ）及びフォスファターゼ（０．８３ｍｇ）を添加して３０℃、２４時間静置した後、トヨパールＨＷ−４０Ｆカラム（径２．６ｃｍ、長さ７０ｃｍ）による水を溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィーによりセロビオン酸画分を単離した。精製後の収量は１．３ｇであった。

【実施例4】

【0040】

得られたＸＣＣ４０７７精製酵素標品を用い、以下に示す方法によってＸＣＣ４０７７を新規酵素セロビオン酸ホスホリラーゼと同定し、セロビオン酸を生成した。

【0041】

５００ｍＭのα−グルコース１−リン酸（糖供与体）、５００ｍＭのグルコン酸（糖受容体）、２０μＭのＸＣＣ４０７７を含む反応液１ｍＬ（ｐＨ６．０）中で酵素反応を３０℃、２４時間行い、６５℃、３０分熱処理することで反応を停止した。反応液にフォスファターゼ（８３μｇ）を添加して３０℃、２４時間静置した後、トヨパールＨＷ−４０Ｓカラム（径２．６ｃｍ、長さ７０ｃｍ）による水を溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィーにより二糖画分を単離した。精製後の収量は５８ｍｇであった。生成物をＮＭＲにより分析したところ、セロビオン酸であることを確認した。

【0042】

５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）中、２ｍＭのα−グルコース１−リン酸及びグルコン酸を用いて、ＸＣＣ４０７７が合成反応時に生成するリン酸をモリブデンブルー法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４６、１６２、４２１-４２８）により定量した。上記条件下に毎分１μモルのリン酸を生成する活性を１ユニットと定義した。その結果、グルコン酸を糖受容体とした際のＸＣＣ４０７７の活性は２．３ユニット／ｍｇであった。

【0043】

ＸＣＣ４０７７の３０℃における至適ｐＨは６．０付近であり（図２Ａ）、安定ｐＨ範囲は４℃及び２４時間の条件下でｐＨ５．０−１０．５であった（図２Ｂ）。本酵素のｐＨ６．０における安定性は３５℃までであった（図２Ｃ）。

【0044】

５００ｍＭのスクロース、５００ｍＭのグルコン酸、１０ｍＭ リン酸、０．１８μＭのスクロースホスホリラーゼ、２６μＭのＸＣＣ４０７７を含む反応液（ｐＨ６．０）中で酵素反応を３０℃、２４時間行った後、６５℃、３０分熱処理することで反応を停止した。反応液にインベルターゼ（０．３３ｍｇ）及びフォスファターゼ（０．８３ｍｇ）を添加して３０℃、２４時間静置した後、トヨパールＨＷ−４０Ｆカラム（径２．６ｃｍ、長さ７０ｃｍ）による水を溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィーによりセロビオン酸画分を単離した。精製後の収量は１．４ｇであった。

【実施例5】

【0045】

得られたＳｄｅ０９０６及びＸＣＣ４０７７精製酵素標品を用い、以下に示す方法によってグルコシル−β−１，３−グルクロン酸を生成した。

【0046】

５００ｍＭのα−グルコース１−リン酸（糖供与体）、５００ｍＭのグルクロン酸（糖受容体）、９．５μＭのＳｄｅ０９０６を含む反応液１ｍＬ（ｐＨ６．５）中で酵素反応を３０℃、２４時間行い、６５℃、３０分熱処理することで反応を停止した。反応液にフォスファターゼ（８３μｇ）を添加して３０℃、２４時間静置した後、トヨパールＨＷ−４０Ｓカラム（径２．６ｃｍ、長さ７０ｃｍ）による水を溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィーにより二糖画分を単離した。精製後の収量は４２ｍｇであった。生成物をＮＭＲにより分析したところ、グルコシル−β−１，３−グルクロン酸であることを確認した。

【0047】

５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）中、２ｍＭのα−グルコース１−リン酸及びグルクロン酸を用いて、Ｓｄｅ０９０６が合成反応時に生成するリン酸をモリブデンブルー法により定量した結果、グルクロン酸を糖受容体とした際のＳｄｅ０９０６の活性は０．３ユニット／ｍｇであった。

【0048】

５００ｍＭのα−グルコース１−リン酸（糖供与体）、５００ｍＭのグルクロン酸（糖受容体）、２０μＭのＸＣＣ４０７７を含む反応液１ｍＬ（ｐＨ６．０）中で酵素反応を３０℃、２４時間行い、６５℃、３０分熱処理することで反応を停止した。反応液にフォスファターゼ（８３μｇ）を添加して３０℃、２４時間静置した後、トヨパールＨＷ−４０Ｓカラム（径２．６ｃｍ、長さ７０ｃｍ）による水を溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィーにより二糖画分を単離した。精製後の収量は３９ｍｇであった。生成物をＮＭＲにより分析したところ、グルコシル−β−１，３−グルクロン酸であることを確認した。

【0049】

５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）中、２ｍＭのα−グルコース１−リン酸及びグルクロン酸を用いて、ＸＣＣ４０７７が合成反応時に生成するリン酸をモリブデンブルー法により定量した結果、グルクロン酸を糖受容体とした際のＸＣＣ４０７７の活性は０．８ユニット／ｍｇであった。

【0050】

５００ｍＭのスクロース、５００ｍＭのグルクロン酸、１０ｍＭ リン酸、０．１８μＭのスクロースホスホリラーゼ、２６μＭのＸＣＣ４０７７を含む反応液１０ｍＬ（ｐＨ６．０）中で酵素反応を３０℃、２４時間行った後、６５℃、３０分熱処理することで反応を停止した。反応液にインベルターゼ（０．３３ｍｇ）及びフォスファターゼ（０．８３ｍｇ）を添加して３０℃、２４時間静置した後、トヨパールＨＷ−４０Ｆカラム（径２．６ｃｍ、長さ７０ｃｍ）による水を溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィーによりグルコシル−β−１，３−グルクロン酸画分を単離した。精製後の収量は０．６８ｇであった。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]