特許 6045912 グルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼを用いたグルコシル−α−１，２−グリセロールの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6045912

(24)【登録日】2016年11月25日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】グルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼを用いたグルコシル−α−１，２−グリセロールの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/12 20060101AFI20161206BHJP

   C12P 19/00 20060101ALI20161206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20161206BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/12ZNA

   C12P19/00

   !C12N15/00 A

【請求項の数】4

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2012-286731(P2012-286731)

(22)【出願日】2012年12月28日

(65)【公開番号】特開2014-128206(P2014-128206A)

(43)【公開日】2014年7月10日

【審査請求日】2015年11月19日

(73)【特許権者】

【識別番号】304027279

【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学

(73)【特許権者】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100080089

【弁理士】

【氏名又は名称】牛木 護

(74)【代理人】

【識別番号】100161665

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 知之

(72)【発明者】

【氏名】中井 博之

(72)【発明者】

【氏名】仁平 高則

(72)【発明者】

【氏名】斉藤 由華

(72)【発明者】

【氏名】大坪 研一

(72)【発明者】

【氏名】北岡 本光

【審査官】 星 浩臣

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−２１０９２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Bacillus selenitireducens MLS10 chromosome, complete genome, NC_014219 REGION: 3048904..3051189. [online]. 2012-12-22. NCBI. [retrieved on 2014-01-27]. Retrieved from the Internet: <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/297582338?sat=17&satkey=24217801>，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/297582338?sat=17&satkey=24217801

【文献】 仁平高則, 外6名, Bacillus selenitireducens 由来2-O-α-D-グルコシルグリセロールホスホリラーゼの発見, 日本農芸化学会2013 年度大会講演要旨集, 2013.03.05, 2C16p01

【文献】 T. Yamamoto et al., Acceptor recognition of kojibiose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii: syntheses of glycosyl glycerol and myo-inositol,Journal of Bioscience and Bioengineering,2006.05.30, 101(5), pp. 427-433

【文献】 C. Goedl et al., A High-Yielding Biocatalytic Process for the Production of 2-O-(alpha-d-glucopyranosyl)-sn-glycerol, a Natural Osmolyte and Useful Moisturizing Ingredient,Angewandte Chemie International Edition,2008.11.21, 47(52), pp. 10086-10089

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／１２

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｐ １９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

β−グルコース１−リン酸と、グリセロールと、以下の酵素学的性質と配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うステップと、グルコシル−α−１，２−グリセロールを回収するステップとを含むグルコシル−α−１，２−グリセロールの製造方法：
ａ）作用
β−グルコース１−リン酸とグリセロールとに作用してグルコシル−α−１，２−グリセロールを生成する；
ｂ）基質特異性
β−グルコース１−リン酸とグリセロールとに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ７．５；
ｄ）温度安定性
ｐＨ７．５の条件下で、４０℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．５−９．５で安定。

【請求項2】

β−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖と、グリセロールと、リン酸と、以下の酵素学的性質と配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うステップと、グルコシル−α−１，２−グリセロールを回収するステップとを含むグルコシル−α−１，２−グリセロールの製造方法：
ａ）作用
β−グルコース１−リン酸とグリセロールとに作用してグルコシル−α−１，２−グリセロールを生成する；
ｂ）基質特異性
β−グルコース１−リン酸とグリセロールとに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ７．５；
ｄ）温度安定性
ｐＨ７．５の条件下で、４０℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．５−９．５で安定。。

【請求項3】

β−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖の組み合わせが、マルトースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．８）及びマルトースとの組み合わせ、トレハロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．６４）及びトレハロースとの組み合わせ、コウジビオースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２３０）及びコウジビオースとの組み合わせ、ニゲロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２７９）及びニゲロースとの組み合わせ、よりなる群から選択される１つ以上の組み合わせである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記溶液がｐＨ４．５〜９．５である請求項１又は２に記載のグルコシル−α−１，２−グリセロールの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼ及びそれを用いたグルコシル−α−１，２−グリセロールの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

日本の伝統食品である清酒や味噌、味醂に微量に含まれるグルコシル−α−１，２−グリセロールは、がん細胞増殖抑制作用、抗アレルギー作用、血管内皮細胞増殖促進因子産生促進作用、血糖値上昇抑制作用、抗菌作用、細胞賦活作用、真皮マトリックス産生促進作用、中性脂肪蓄積抑制作用、メラニン産生抑制作用、皮膚刺激低減作用が報告されており、食品・化粧品・医薬品素材としての利用が期待されている（特許文献１及び２）。このように近年栄養面からだけでなく、オリゴ糖の機能性が注目されているが、その高純度調製の困難さ・高コストが当該研究の産業応用を妨げている。そのため、機能性オリゴ糖をはじめとする種々の有用糖質の選択的な低コスト大量調製法の確立が現在強く望まれている。

【0003】

しかし、従来のグルコシル−α−１，２−グリセロールの製造方法には、以下の問題点があり、安価に製造することができなかった。化学的酸化法は、過ヨウ素酸を用いた酸化反応により、マルチトールから合成可能であるが、反応位置選択性は充分ではなく、収率が低かった（１８％：重量比率）。また、酵素合成法は、α−グルコシダーゼ及びスクロースホスホリラーゼの糖転移反応により合成可能であるが、反応自体がこれら酵素の本来の反応ではないため、過剰なグリセロール存在下で行わざるを得ず、さらにα−グルコシダーゼを用いた際は反応位置選択性が低く副産物を生じるため、収率も低かった（５．９％：グリセロールを基準としたモル比率）。また、合成産物の分解も問題点として挙げられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平９−１２４４５７号公報

【特許文献2】特表２０１２−５０６８８２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

そこで、本発明は上記問題点に鑑み、安価な材料から、グルコシル−α−１，２−グリセロールを簡便且つ選択的に大量製造することを可能にする、新規のグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼ及びそれを用いたグルコシル−α−１，２−グリセロールの製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記課題を達成するため鋭意検討した結果、新規にグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼを発見した。そして、β−グルコース１−リン酸と、グリセロールを出発原料としたグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応（加リン酸分解反応の逆反応）、またはβ−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素の加リン酸分解反応と新規に発見したグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応を組み合わせることで、グルコシル−α−１，２−グリセロールを簡便かつ選択的に大量製造できることを見出し、本発明を完成させた。

【0007】

すなわち、本発明で用いられるグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼは、以下の酵素学的性質と配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する：
ａ）作用
β−グルコース１−リン酸とグリセロールとに作用してグルコシル−α−１，２−グリセロールを生成する；
ｂ）基質特異性
β−グルコース１−リン酸とグリセロールとに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ７．５；
ｄ）温度安定性
ｐＨ７．５の条件下で、４０℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ５．５−９．５で安定。

【0008】

そして、本発明のグルコシル−α−１，２−グリセロールの製造方法は、β−グルコース１−リン酸と、グリセロールと、前記グルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うステップと、グルコシル−α−１，２−グリセロールを回収するステップとを含む。

【0009】

また、本発明のグルコシル−α−１，２−グリセロールの製造方法は、β−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖と、グリセロールと、リン酸と、前記グルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うステップと、グルコシル−α−１，２−グリセロールを回収するステップとを含む。

【0010】

また、β−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖の組み合わせが、マルトースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．８）及びマルトースとの組み合わせ、トレハロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．６４）及びトレハロースとの組み合わせ、コウジビオースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２３０）及びコウジビオースとの組み合わせ、ニゲロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２７９）及びニゲロースとの組み合わせ、よりなる群から選択される１つ以上の組み合わせである。

【0011】

また、前記溶液がｐＨ４．５〜９．５である。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、安価な材料からグルコシル−α−１，２−グリセロールを簡便且つ選択的に大量製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】実施例１で調製したグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼの至適ｐＨを示した図である。

【図2】実施例１で調製したグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼのｐＨ安定性を示した図である。

【図3】実施例１で調製したグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼの温度安定性を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明によれば、（１）β−グルコース１−リン酸と、グリセロールと、前記グルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うことで、グルコシル−α−１，２−グリセロールを簡便かつ選択的に大量製造することができる。（２）β−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖と、グリセロールと、リン酸と、前記グルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼを含む溶液中で酵素反応を行うことで、グルコシル−α−１，２−グリセロールを簡便かつ選択的に大量製造することができる。

【0015】

β−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びその基質となる糖の組み合わせは、マルトースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．８）及びマルトースとの組み合わせ、トレハロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．６４）及びトレハロースとの組み合わせ、コウジビオースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２３０）及びコウジビオースとの組み合わせ、ニゲロースホスホリラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２７９）及びニゲロースとの組み合わせ、よりなる群から選択される１つ以上の組み合わせであり、最も好ましい組み合わせはマルトースホスホリラーゼ及びマルトースとの組み合わせである。

【0016】

β−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼは特に限定されるものではなく、いかなる起源の酵素を用いることも可能である。反応液中でのβ−グルコース１−リン酸を生成する糖質加リン酸分解酵素及びグルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼの濃度は特に限定されないが、それぞれ、０．０１〜１０００μＭ、好ましくは、０．１〜１００μＭで使用することができる。これらの酵素の使用形態は特に限定されるものではなく、菌体抽出液、精製酵素、固定化酵素など種々のものを利用することができる。本発明の好適な実施形態によれば、上記反応に関わる全ての酵素を固定化したバイオリアクターカラムを用いて、固定化酵素リアクターとして反応を行うことも可能である。

【0017】

出発原料として用いる糖質の使用濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは約１〜約１０００ｇ／Ｌであり、より好ましくは約１０〜約１０００ｇ／Ｌである。

【0018】

酵素反応に関わるリン酸はいかなる起源のものであっても良い。反応系に加えるリン酸濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約１００ｍＭ程度である。

【0019】

【化1】

【0020】

反応形態は特に限定されるものではないが、水溶液又は緩衝液中で行われるのが好適である。反応液のｐＨは好ましくは４．５〜９．５である。反応温度は特に限定されるものではないが、好ましくは５℃〜５０℃、特に３０℃が好ましい。また反応時間は特に限定されるものではないが、０．１〜１００時間であることが好ましい。

【0021】

本発明により得られるグルコシル−α−１，２−グリセロールは任意の方法で精製することができる。例えば、本発明により得られるグルコシル−α−１，２−グリセロールは、カラムクロマトグラフィーや結晶化により単離することが可能である。カラムクロマトグラフィーとして、これに限定されるものではないが、サイズ排除クロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過膜分離、逆浸透膜分離が含まれる。結晶化方法としては、これに限定されるものではないが、濃縮、温度低下、溶媒添加（エタノール、メタノール、アセトンなど）が含まれる。

【0022】

なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の思想を逸脱しない範囲で種々の変形実施が可能である。

【0023】

次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

【実施例1】

【0024】

バチルス・セレニティレデュセンスのゲノム情報を基に、Ｂｓｅｌ２８１６遺伝子に対するフォーワードプライマー（配列番号３）及びリバースプライマー（配列番号４）を設計し、合成した。Ｂｓｅｌ２８１６遺伝子の塩基配列を配列番号２に、またこの塩基配列にコードされているアミノ酸配列を配列番号１に示す。

【0025】

バチルス・セレニティレデュセンスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマー及びＫＯＤ ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、９５℃に２分間保持したのち、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で２分３０秒間のサイクルを４５回繰り返してＰＣＲ反応を行った。その結果、２３００ｂｐの増幅断片が得られた。このＰＣＲで増幅されるＤＮＡ断片は、５’末端にＮｃｏＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトをそれぞれ有するＢｓｅｌ２８１６をコードするＤＮＡである。

【0026】

得られた増幅断片を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ−２８ａ（ノバジェン社製）に高効率ライゲーション試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。さらに、ライゲーション反応液を用いて大腸菌コンピテントセルＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、Ｃ末端に６残基のヒスチジンからなるＨｉｓタグが付加されたＢｓｅｌ２８１６をコードするＤＮＡを含む発現ベクターｐＥＴ−２８ａを回収した。

【0027】

この発現ベクターｐＥＴ−２８ａを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＨａｎａｈａｎらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８３年、第１６６巻、第５５７−５８０頁）に従って形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地２００ｍＬに植菌し、ＩＰＴＧ濃度を０．１ｍＭとして誘導培養を１８℃で２４時間行った。培養液から遠心分離で回収した菌体を１０ｍＬの５００ｍＭ塩化ナトリウム及び１０％グリセロールを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁し、超音波処理により破砕した後、遠心分離後によって粗酵素液を得た。組換えタンパク質の精製は、Ｈｉｓタグタンパク質精製用カラムＨｉｓＴｒａｐＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより行った。得られた精製酵素溶液を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．０に対して透析を行い、遠心式フィルターユニットアミコンウルトラ−３０（ミリポア社製）を用いた限外濾過によって３ｍＬに濃縮することで、Ｂｓｅｌ２８１６精製酵素標品を調製した。

【実施例2】

【0028】

得られたＢｓｅｌ２８１６精製酵素標品を用い、以下に示す方法によってＢｓｅｌ２８１６を新規酵素グルコシル−α−１，２−グリセロールホスホリラーゼと同定し、グルコシル−α−１，２−グリセロールを生成した。

【0029】

５００ｍＭのβ−グルコース１−リン酸（糖供与体）、５００ｍＭのグリセロール（糖受容体）、１．３μＭのＢｓｅｌ２８１６を含む反応液１ｍＬ（ｐＨ７．５）中で酵素反応を３０℃、２４時間行い、１３０μＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止した。反応液をイオン交換樹脂アンバーライトＭＢ３及びＩＲＡ４０２ＢＬ−ＣＬ（オルガノ社製）で脱塩及び還元糖を除去した後、トヨパールＨＷ−４０Ｓ（東ソー社製）による水を溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィー（径２．６ｃｍ、長さ１００ｃｍ）により二糖画分を単離した。精製後の収量は６３ｍｇであった。生成物をＮＭＲにより分析したところ、グルコシル−α−１，２−グリセロールであることを確認した。

【0030】

４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）中、１０ｍＭのβ−グルコース１−リン酸及びグリセロールを用いて、Ｂｓｅｌ２８１６が合成反応時に生成するリン酸をモリブデンブルー法により定量した結果、グリセロールを糖受容体とした際のＢｓｅｌ２８１６の活性は６２．５ユニット／ｍｇであった。

【0031】

Ｂｓｅｌ２８１６の３０℃における至適ｐＨは７．５付近であり（図１）、安定ｐＨ範囲は４℃及び２４時間の条件下でｐＨ５．５−９．５であった（図２）。本酵素のｐＨ７．５における安定性は４０℃までであった（図３）。

【0032】

５００ｍＭのマルトース、５００ｍＭのグリセロール、１０ｍＭのリン酸、１．１μＭのマルトースホスホリラーゼ、１．３μＭのＢｓｅｌ２８１６を含む反応液１ｍＬ（ｐＨ７．５）中で酵素反応を３０℃、２４時間行った後、１０μＬの６Ｎ塩酸を添加することで反応を停止した。反応液をイオン交換樹脂アンバーライトＭＢ３及びＩＲＡ４０２ＢＬ−ＣＬ（オルガノ社製）で脱塩及び還元糖を除去した後、トヨパールＨＷ−４０Ｓ（東ソー社製）による水を溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィー（径２．６ｃｍ、長さ１００ｃｍ）によりグルコシル−α−１，２−グリセロール画分を単離した。精製後の収量は５７ｍｇであった。

【産業上の利用可能性】

【0033】

以上のように本発明は、食品・化粧品・医薬品産業で利用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]