特許 6046869 カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物およびその製造方法。

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6046869

(24)【登録日】2016年11月25日

(45)【発行日】2016年12月21日

(54)【発明の名称】カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物およびその製造方法。

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/08 20060101AFI20161212BHJP

   A61K 31/728 20060101ALI20161212BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20161212BHJP

   A61P 41/00 20060101ALI20161212BHJP

   A61L 27/00 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 8/73 20060101ALI20161212BHJP

   A61Q 1/00 20060101ALI20161212BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20161212BHJP

【ＦＩ】

   C08B37/08 Z

   A61K31/728

   A61P19/02

   A61P41/00

   A61L27/00

   A61L27/00 Z

   A61K47/36

   A61K8/73

   A61Q1/00

   A61Q19/00

【請求項の数】14

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2016-535197(P2016-535197)

(86)(22)【出願日】2016年4月11日

(86)【国際出願番号】JP2016061733

【審査請求日】2016年5月30日

(31)【優先権主張番号】特願2015-82143(P2015-82143)

(32)【優先日】2015年4月14日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000001421

【氏名又は名称】キユーピー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】中前 諒太

(72)【発明者】

【氏名】藤川 俊一

(72)【発明者】

【氏名】吉田 英人

【審査官】 福山 則明

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０８−２５３５０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／０５６６０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０１２２５１２５（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開２００３−２５２９０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０２６４６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 WANG, Gang et al.，Synthesis of Carboxymethyl Polysaccharides and Their Moisture Absorption and Retention Abilities，ASIAN JOURNAL OF CHEMISTRY，２０１４年，Vol. 26, No. 16，pp. 5239-5241，ISSN 0970-7077, TABLE 1

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｂ ３７／０８

Ａ６１Ｋ ３１／７２８

Ａ６１Ｋ ４７／３６

Ａ６１Ｐ １９／０２

Ａ６１Ｐ ４１／００

Ａ６１Ｋ ８／００− ８／９９

Ａ６１Ｑ １／００−９０／００

Ａ６１Ｌ ２７／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

縮合剤を用いて、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が有する水酸基とカルボキシル基との間のエステル結合によって架橋させる、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法。

【請求項2】

請求項１記載の架橋物の製造方法において、
前記縮合剤が、カルボジイミド系縮合剤、またはトリアジン系縮合剤から選ばれる少なく
とも１種である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法。

【請求項3】

請求項１または２記載の架橋物の製造方法において、
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩１，０００質量部に
対して前記縮合剤の割合が５質量部以上４００質量部以下である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法。

【請求項4】

請求項１ないし３のいずれかに記載の架橋物の製造方法において、
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の１質量％以上８０
質量％以下の溶液に縮合剤を添加する、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法。

【請求項5】

請求項１ないし４のいずれかに記載の架橋物の製造方法において、
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量が４，
０００以上４００万以下である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法。

【請求項6】

請求項１ないし５のいずれかに記載の架橋物の製造方法において、
ヒアルロン酸を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率が１０％以上２００％以
下である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法。

【請求項7】

請求項１ないし６のいずれかに記載の架橋物の製造方法において、
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法は、
温度が３０℃以下の含水溶媒中で、溶解した原料ヒアルロン酸および／またはその塩をハ
ロ酢酸および／またはその塩と反応させる工程を含み、
前記含水溶媒は、水、または水溶性有機溶媒と水との混合液であり、
前記混合液における水溶性有機溶媒の割合が６０ｖ／ｖ％以下である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法。

【請求項8】

同一または異なるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩同士を前記修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が有する水酸基とカルボキシル基との間でエステル結合により架橋させた架橋物であって、
前記架橋物は水膨潤性を有し、膨潤度が５倍以上２５０倍以下（質量比）である、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物。

【請求項9】

請求項８記載の架橋物において、
熱安定性試験におけるゲル残存率が１０質量％以上である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物。

【請求項10】

請求項８記載の架橋物において、
耐酵素分解性試験におけるゲル残存率が６０％以上である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物。

【請求項11】

請求項８ないし１０のいずれかに記載のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物を含む、
関節注射剤、癒着防止剤、皮下注射剤、または薬物徐放剤。

【請求項12】

請求項８ないし１０のいずれかに記載のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物を含む、化粧料。

【請求項13】

請求項１ないし７のいずれかに記載の製造方法により得られるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物を含む、
関節注射剤、癒着防止剤、皮下注射剤、または薬物徐放剤の製造方法。

【請求項14】

請求項１ないし７のいずれかに記載の製造方法により得られるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物を含む、化粧料の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物およびその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒアルロン酸は、鶏冠、さい帯、皮膚、軟骨、硝子体、関節液などの生体組織中に広く分布しており、例えば、化粧料、医薬品、食品の成分として広く利用されている。
特に、ヒアルロン酸の高い生体適合性、ゲル膨潤性、および粘弾性を利用して、医療材料や美容材料への応用が盛んに行われている。しかしながら、ヒアルロン酸は生体内でヒアルロニダーゼによって分解されやすく、さらに加熱滅菌処理により粘弾性が低下してしまうことから、より耐酵素分解性および熱安定性が高いヒアルロン酸が求められている。

【0003】

そこで、架橋剤を使用してヒアルロン酸を架橋させた架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法が報告されている（特許文献１：特許第４８７５９８８号公報）
しかしながら、このような方法で架橋された架橋ヒアルロン酸ゲルは生体内でゲルが分解された後、残存する架橋剤成分が生体にとって異物として認識されてしまい、炎症反応を引き起こしてしまう等の悪影響を及ぼすといった、安全性の面で課題があった。

【0004】

このような安全性を鑑みて、特許文献２（特許第４９５８３６８号公報）では、架橋剤を使用せず、ヒアルロン酸水溶液に酸性溶液を加え、凍結保存することで架橋ヒアルロン酸を製造する方法が報告されている。しかしながら、上述の方法では耐酵素分解性や熱安定性において十分満足できるものではなく、さらに、架橋ヒアルロン酸ゲルに必要とされる水膨潤性も低く、医療材料や美容材料として実用化するには課題が多かった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第４８７５９８８号公報

【特許文献2】特許第４９５８３６８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

そこで、本発明の目的は、熱安定性および耐酵素分解性に優れたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物およびその製造方法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者等は、縮合剤を用いて、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を、前記修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が有する水酸基とカルボキシル基との間でエステル結合によって架橋させることで、熱安定性および耐酵素分解性に優れたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物が得られることを見出した。

【0008】

さらに、前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物は、優れた水膨潤性を有している。

【0009】

つまり、本願発明は、
（１）縮合剤を用いて、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を、前記修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が有する水酸基とカルボキシル基との間でエステル結合によって架橋させる、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法、
（２）（１）の架橋物の製造方法において、
前記縮合剤が、カルボジイミド系縮合剤、またはトリアジン系縮合剤から選ばれる少なくとも１種である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法、
（３）（１）または（２）の架橋物の製造方法において、
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩１，０００質量部に対して前記縮合剤の割合が５質量部以上４００質量部以下である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法、
（４）（１）ないし（３）のいずれかの架橋物の製造方法において、
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の１質量％以上８０質量％以下の溶液に縮合剤を添加する、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法
（５）（１）ないし（４）のいずれかの架橋物の製造方法において、
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量が４，０００以上４００万以下である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法、
（６）（１）ないし（５）のいずれかの架橋物の製造方法において、
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が、
ヒアルロン酸を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率が１０％以上２００％以下である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法、
（７）（１）ないし（６）のいずれかの架橋物の製造方法において、
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法は、
温度が３０℃以下の含水溶媒中で、溶解した原料ヒアルロン酸および／またはその塩をハロ酢酸および／またはその塩と反応させる工程を含み、
前記含水溶媒は、水、または水溶性有機溶媒と水との混合液であり、
前記混合液における水溶性有機溶媒の割合が６０ｖ／ｖ％以下である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法、
（８）同一または異なるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩同士をエステル結合により架橋させた架橋物であって、
前記架橋物は水膨潤性を有し、膨潤度が５倍以上２５０倍以下（質量比）である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物、
（９）（８）の架橋物において、
熱安定性試験におけるゲル残存率が１０質量％以上である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物、
（１０）（８）の架橋物において、
耐酵素分解性試験におけるゲル残存率が６０％以上である、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物、
（１１）（１）ないし（７）のいずれかの製造方法により得られるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物、
または（８）ないし（１０）のいずれかのカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物を含む、
関節注射剤、癒着防止剤、皮下注射剤、または薬物徐放剤、
（１２）（１）ないし（７）のいずれかの製造方法により得られるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物、
または（８）ないし（１０）のいずれかのカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物を含む、化粧料、
である。

【発明の効果】

【0010】

上記製造方法によれば、熱安定性および耐酵素分解性に優れたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物を提供できることから、架橋剤を使用しない安全性の高いヒアルロン酸の架橋物として、医療材料、美容材料、および化粧料の成分として使用することができる。

【0011】

さらに、前記架橋物は優れた水膨潤性を有し、やわらかい水膨潤性ゲルを形成することができることから、医療材料・美容材料として好適に用いることができる。

【発明を実施するための形態】

【0012】

次に、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、格別に断らない限り、「部」は「質量部」を意味し、「％」は「質量％」を意味する。

【0013】

＜本発明の特徴−カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法＞
本発明のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物（以下、単に「架橋物」ともいう）の製造方法は、縮合剤を用いて、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を、前記修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が有する水酸基とカルボキシル基との間でエステル結合によって架橋させる、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法に特徴を有する。
本発明の製造方法で得られる架橋物は、優れた熱安定性および耐酵素分解性を有する。さらに、該架橋物は水膨潤性を有することから、やわらかい水膨潤ゲルを形成することができる。

【0014】

＜ヒアルロン酸および／またはその塩＞
本発明において、「ヒアルロン酸」とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの二糖からなる繰り返し構成単位を１以上有する多糖類をいう。また、「ヒアルロン酸の塩」としては、特に限定されないが、食品または薬学上許容しうる塩であることが好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。

【0015】

ヒアルロン酸は、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンとから基本的に構成され、２糖単位が複数個結合したものである。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。

【0016】

＜修飾ヒアルロン酸および／またはその塩＞
本発明において、「修飾ヒアルロン酸および／またはその塩」とは、少なくとも一部に有機基が導入されているヒアルロン酸および／またはその塩のことをいい、ヒアルロン酸および／またはその塩とは異なる構造を有する。また、本発明において「有機基」とは、炭素原子を有する基のことをいう。

【0017】

＜カルボキシメチル基＞
本発明において、「カルボキシメチル基」とは、「−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ」または「−ＣＨ_２−ＣＯ_２⁻」で表される基のことをいう。また、本発明の製造方法で使用する原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、後述する方法にて製造されたものであることができる。
したがって、本発明において、「カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩」とは、少なくとも一部にカルボキシメチル基が導入されているヒアルロン酸および／またはその塩のことをいう。

【0018】

より具体的には、例えば、ヒアルロン酸（下記式（１）参照）を構成する水酸基（下記式（１）において、ヒアルロン酸を構成するＮ−アセチルグルコサミンのＣ−４位、Ｃ−６位、ならびに、ヒアルロン酸を構成するグルクロン酸のＣ−２位、Ｃ−３位）の少なくとも一部の水酸基の水素原子が、−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈおよび／または−ＣＨ_２−ＣＯ_２⁻で表される基)で置換されていることができる。

【0019】

【化1】

・・・（１）
（式中、ｎは１以上７，５００以下の数を示す。）

【0020】

カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸は例えば、下記式（２）で表される化合物であることができる。
また、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の塩としては、特に限定されないが、食品または薬学上許容しうる塩であることが好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。

【0021】

【化2】

・・・（２）
（式中、Ｒ^１〜Ｒ^５は独立して、水素原子、−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ、−ＣＨ_２−ＣＯ_２⁻、または炭素原子を有する基を表し、ｎは１以上７，５００以下の数を示す。ただし、当該カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩全体のＲ^１〜Ｒ^５がいずれも水素原子を表す場合を除く。）

【0022】

＜本発明の製造方法のメカニズム＞
本発明の製造方法では、前記縮合剤と反応させることで、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が有する水酸基とカルボキシル基との間でエステル結合が形成される。
その結果、同一または異なるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩同士がエステル結合によって架橋されることにより、熱安定性および耐酵素分解性が高まると推察される。
さらに、前記水酸基とカルボキシメチル基中のカルボキシル基との間でエステル結合が形成された場合、熱安定性および耐酵素分解性がより高まることが推察される。
なお、前記架橋物において、未修飾ヒアルロン酸に由来するカルボキシル基と水酸基がエステル結合を形成していてもよい。

【0023】

また、ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物は、該架橋物が有する水酸基とカルボキシル基とがエステル結合を介して結合することにより、３次元網目構造が構築され、この３次元網目構造の中に水を取り込むことにより、水膨潤性ゲルを形成することができると推察される。

【0024】

特に、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、カルボキシメチル基を有している分、未修飾ヒアルロン酸および／またはその塩と比較して、ヒアルロン酸骨格の一構成単位中により多くのカルボキシル基を有する。すなわち、該一構成単位中においてエステル結合に関与することができるカルボキシル基が、未修飾ヒアルロン酸および／またはその塩よりも多いため、前記縮合剤と反応させると、より多くのエステル結合を形成することができるため、水膨潤性に優れたやわらかい水膨潤性ゲルを形成することができると推察される。

【0025】

＜縮合剤＞
本発明の製造方法に用いる縮合剤は、エステル結合を形成させるものであり、特に、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が有する水酸基とカルボキシル基との間にエステル結合を形成させるものである。
具体的には、例えば、カルボジイミド系縮合剤、トリアジン系縮合剤、イミダゾール系脱水縮合剤、ホスホニウム系縮合剤、またはウロニウム系縮合剤等が挙げられる。
カルボジイミド系縮合剤としては、例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］―３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、またはＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホ塩酸（ＣＭＥ−カルボジイミド）等が挙げられる。カルボジイミド系縮合剤と併用して使用する縮合反応用添加剤としては、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等を使用することができる。
トリアジン系縮合剤としては、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム−クロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）、またはトリフルオロメタンスルホン酸（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−（２−オクトキシ−２−オキソエチル）ジメチルアンモニウム（界面集積型ＤＭＴ）等が挙げられる。
イミダゾール系脱水縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボジイミダゾール（ＣＤＩ）が挙げられる。
ホスホニウム系脱水縮合剤としては、例えば、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＢＯＰ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩、またはクロロトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＰｙＣｌｏＰ）等が挙げられる。
ウロニウム系縮合剤としては、｛｛［（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデン）アミノ］オキシ｝−４−モルホリノメチレン｝ジメチルアンモニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＣＯＭＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’, −テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’, −テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチ ルウロニウムテトラフルオロほう酸塩（ＴＳＴＵ）、またはＯ−（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン−３−イル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロほう酸塩（ＴＤＢＴＵ）等が挙げられる。
前記縮合剤が水溶性を有することから、カルボジイミド系縮合剤、またはトリアジン系縮合剤を使用するとよい。
特に、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が有する水酸基とカルボキシル基との間のエステル結合を形成させやすいことから、カルボジイミド系縮合剤としてＥＤＣを、トリアジン系縮合剤としてＤＭＴ−ＭＭを使用するとよい。

【0026】

＜カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩に対する縮合剤の割合＞
本発明の製造方法において、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩に対する縮合剤の割合を調整することにより、本発明の架橋物を用いて得られる水膨潤性ゲルの硬さを調整することができる。エステル結合をより確実に形成して熱安定性および耐酵素分解性に優れた架橋物を得られやすい点から、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩１，０００質量部に対する縮合剤の割合は、５質量部以上４００質量部以下であるとよく、さらに３０質量部以上３００質量部以下、６０質量部以上２００質量部以下であるとよい。

【0027】

＜反応温度および反応時間＞
本発明の製造方法において、反応液の温度は、１℃以上１００℃以下であればよく、さらに１℃以上５０℃以下、１℃以上３０℃以下であるとよい。
また、反応時間は、３０分以上１６８時間以下であればよく、さらに１時間以上７２時間以下、１時間以上４８時間以下であればよい。

【0028】

＜溶媒＞
本発明の製造方法において、原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を溶解させる溶媒は、水、または水と混和する水溶性有機溶媒との混和物であることができる。

【0029】

水と混和する水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を挙げることができ、これらを単独でまたは組み合わせて使用することができる。
特に、前記架橋物の精製工程を簡易にすることができる点から、前記溶媒は水、またはエタノールを使用するとよい。

【0030】

［原料カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩（原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩）］
＜反応溶液中の原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の濃度＞
本発明の製造方法では、エステル結合をより確実に形成して、得られる架橋物の熱安定性および耐酵素分解性を高めることができる点で、前記原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の１質量％以上８０質量％以下の溶液に縮合剤を添加するとよく、さらに５質量％以上７０質量％以下、５質量％以上５０質量％以下の溶液に縮合剤を添加するとよい。

【0031】

＜原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量＞
本発明の製造方法において、粘弾性に富む水膨潤ゲルを形成する架橋物が得られやすいことから、前記原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量は４，０００以上４００万以下であるとよい。下限としては、さらに２０万以上であるとよく、３０万以上、８０万以上であるとよい。一方、上限としては、さらに３００万以下であるとよく、２８０万以下、２５０万以下であるとよい。
特に、本発明の架橋物を美容整形用の皮下注射剤用途に用いる場合、膨潤度の高いゲルが得られ易いことから、前記原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量は、５０万以上２００万以下であるとよく、さらに８０万以上１８０万以下であるとよい。
なお、本発明において、原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量は、以下の方法にて測定することができる。

【0032】

ゲル濾過カラムを用いて、分子量が既知である複数の(精製)ヒアルロン酸（基準物質）を液体クロマトグラフィー分析することで、それらの保持時間より検量線を作成する。同様に、測定対象である原料修飾ヒアルロン酸を液体クロマトグラフィー分析し、前記検量線を用いて分子量を求めることで、原料修飾ヒアルロン酸の分子量を求めることができる。
前記液体クロマトグラフィー分析に使用することができる液体クロマトグラフィー分析装置としては、例えば、ＷａｔｅｒｓＡｌｌｉａｎｃｅ ２６９０ ＨＰＬＣ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ ＨＰＬＣ ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＭｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、１２００
Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）が挙げられる。
また、液体クロマトグラフィー分析に使用することができるカラムとしては、例えば、ｓｈｏｄｅｘ社製 配位子交換クロマトグラフィー用カラム（配位子交換モード＋サイズ排除モード)、型名「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０１」、「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０２」、「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０３」、「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０４」、「ＳＵＧＡＲＫＳ−８０５」、「ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０６」、「ＳＵＧＡＲＫＳ−８０７」や、ＴＯＳＯＨ製 サイズ排除クロマトグラフィーカラム、型名「ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷ」が挙げられる。

【0033】

＜原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の動粘度＞
本発明の製造方法において、粘弾性に富む水膨潤ゲルを形成する架橋物が得られやすいことから、前記原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の動粘度は１ｍｍ^２／ｓ以上２００ｍｍ^２／ｓ以下とすることができ、さらに３０ｍｍ^２／ｓ以上１５０ｍｍ^２／ｓ以下とすることができる。本発明において、原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の動粘度は、ウベローデ粘度計（柴田科学器械工業株式会社製）を用いて測定することができる。この際、流下秒数が２００秒以上１，０００秒になるような係数のウベローデ粘度計を選択する。また、測定は３０℃の恒温水槽中で行ない、温度変化のないようにする。ウベローデ粘度計により測定された前記水溶液の流下秒数と、ウベローデ粘度計の係数との積により、動粘度（単位：ｍｍ^２／ｓ）を求めることができる。

【0034】

＜カルボキシメチル化率＞
本発明において、カルボキシル基を有する修飾ヒアルロン酸および／またはその塩のヒアルロン酸を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率（以下、単に「カルボキシメチル化率（ＣＭ化率）」ともいう。）は、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、ヒアルロン酸骨格中のＣ−２位に結合するＮ−アセチル基のメチル基（−ＣＨ_３）のプロトンを示すピーク（２ｐｐｍ付近に発現）の積算値に対する、カルボキシメチル基（−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈまたは−ＣＨ_２−ＣＯ_２⁻）のメチレン基（−ＣＨ_２−）のプロトンを示すピーク（３．８ｐｐｍ以上４．２ｐｐｍ以下の範囲に発現）の積算値の割合（％）で表される。

【0035】

本発明において、「ヒアルロン酸を構成する２糖単位」とは、ヒアルロン酸を構成する、隣り合って結合する２糖（グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミン）で構成される１単位をいい、「ヒアルロン酸を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率」とは、該１単位に対する、該１単位に含まれるカルボキシメチル基の数であり、より具体的には、該１単位を１００％とした場合、該１単位に対する、該１単位に含まれるカルボキシメチル基の数の割合（％）をいう。

【0036】

＜原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩のカルボキシメチル化率＞
本発明の製造方法では、エステル結合をより確実に形成して得られる架橋物の熱安定性および耐酵素分解性を高めることができる点で、前記原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩のカルボキシメチル化率は１０％以上２００％以下であるとよい。下限としては、さらに２０％以上、３０％以上、５０％以上であるとよい。一方、上限としては、さらに１５０％以下、１００％以下、９０％以下であるとよい。

【0037】

［原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法］
本発明の製造方法において、原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、温度が３０℃以下の含水溶媒中で、溶解した原料ヒアルロン酸および／またはその塩をハロ酢酸および／またはその塩と反応させる工程を含み、前記含水溶媒は、水、または水溶性有機溶媒と水の混合液であり、
前記混合液における水溶性有機溶媒の割合が６０ｖ／ｖ％以下であることによって得ることができる。

【0038】

上記反応させる工程において、反応液（含水溶媒）中に原料ヒアルロン酸および／またはその塩の少なくとも一部（ヒアルロン酸および／またはその塩の全部または大部分であるとよい）とハロ酢酸および／またはその塩とが溶解した状態で該ヒアルロン酸および／またはその塩と該ハロ酢酸および／またはその塩とを反応させることができる。

【0039】

＜原料ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量＞
原料ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量は、カルボキシメチル化を円滑に行うことができる点で、４，０００以上４００万以下とすることができる。下限としては、さらに２０万以上であるとよく、３０万以上、８０万以上であるとよい。一方、上限としては、さらに３００万以下であるとよく、２８０万以下、２５０万以下であるとよい。
なお、本発明において、原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量は、極限粘度法により測定することができる。

【0040】

＜含水溶媒における原料ヒアルロン酸および／またはその塩の濃度＞
原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法において、反応液（含水溶媒）における前記ヒアルロン酸の濃度は０．０５ｇ／ｍＬ以上０．５ｇ／ｍＬ以下とすることができる。

【0041】

＜ハロ酢酸および／またはその塩＞
原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法において、ハロ酢酸および／またはその塩は、カルボキシメチル基を原料ヒアルロン酸および／またはその塩に導入するために使用される。

【0042】

ハロ酢酸は例えば、モノハロ酢酸および／またはその塩であるとよく、より具体的には、クロロ酢酸および／またはその塩、または、ブロモ酢酸またはその塩とするとよい。ハロ酢酸の塩は例えば、クロロ酢酸のアルカリ金属塩および／またはブロモ酢酸のアルカリ金属塩であるとよく、クロロ酢酸ナトリウムおよび／またはブロモ酢酸ナトリウムであるとよい。

【0043】

＜ハロ酢酸および／またはその塩の使用量＞
ハロ酢酸および／またはその塩の使用量は、原料ヒアルロン酸および／またはその塩の使用量に対して１０質量％以上５００質量％以下とすることができ、さらに５０質量％以上２００質量％以下とすることができる。

【0044】

＜含水溶媒＞
原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法において、原料ヒアルロン酸および／またはその塩の溶解性が高い点から、前記含水溶媒は、水、または水溶性有機溶媒と水との混合液であるとよい。

【0045】

含水溶媒が水溶性有機溶媒と水との混合液である場合、ヒアルロン酸の溶解性を高めることができる点で、該混合液中における水溶性有機溶媒の割合は６０ｖ／ｖ％以下であるとよく、さらに２０ｖ／ｖ％以上４０ｖ／ｖ％以下であるとよい。

【0046】

水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を挙げることができ、これらを単独でまたは組み合わせて使用することができる。このうち、イソプロパノール、エタノール等の炭素原子数１、２または３の低級モノアルコールを用いるとよい。

【0047】

＜ｐＨ＞
原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法において、水酸基の求核性を高めることができる点で、前記原料ヒアルロン酸および／またはその塩とハロ酢酸および／またはその塩との反応は塩基性条件下で行われるとよく、反応液のｐＨが９以上１４以下とすることができ、さらに１０以上１４以下、１１以上１４以下とすることができる。

【0048】

なお、前記反応の反応液を塩基性に調整するために、塩基性電解質を反応液中で使用することができる。塩基性電解質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム等のアルカリ土類金属の水酸化物が挙げられる。原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を効率良く得ることができる点で、反応液中の塩基性電解質の濃度は、０．２モル／Ｌ以上１０モル／Ｌ以下であるとよく、さらに０．５モル／Ｌ以上８モル／Ｌ以下であるとよい。

【0049】

＜反応温度＞
原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法において、カルボキシル化を円滑に進行でき、かつ、原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の低分子化を抑制できる点から、反応液の温度は３０℃以下であるとよく、さらに０℃超１０℃以下であるとよい。特に、反応液の温度を０℃超１０℃以下にする方が、平均分子量８０万以上の高分子の原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を容易に得ることができる。

【0050】

＜反応時間＞
原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法において、カルボキシル化を円滑に進行でき、かつ、原料修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の低分子化を抑制できる点から、反応時間は３０分以上１００時間以下とするとよく、さらに６０分以上６０時間以下とするとよい。

【0051】

［架橋物］
＜構造＞
本発明の架橋物は、同一または異なるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩同士が有する水酸基とカルボキシル基との間に形成されるエステル結合によって架橋されている。該架橋物は、未修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物よりも後述する熱安定性および耐酵素分解性に優れている。

【0052】

＜熱安定性＞
本発明の架橋物は優れた熱安定性を有する。具体的には、後述の熱安定性試験におけるゲル残存率が１０％以上であり、さらに１５％以上１００％以下、２０％以上８０％以下であるとよい。熱安定性試験におけるゲル残存率が１０％未満であると、加熱滅菌処理のよりゲルが熱分解してしまうため、医療材料や美容材料として使用することができない。

【0053】

本発明において、熱安定性試験は以下の方法で行う。
（ａ）５０ｍＬバイアル瓶に、本発明で得られた架橋物１ｇ（乾燥質量換算）をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）５０ｍＬに分散させ、該架橋物の濃度が２質量％である架橋物水溶液を調製する。
（ｂ）前記架橋物水溶液を、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理する。より具体的には、開始温度２５℃で４０分間かけて１２１℃まで昇温させ、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理し、加圧・加熱終了後１時間静置してから、該架橋物を取り出す工程をいう。
（ｃ）前記オートクレーブ処理後の架橋物を４２０メッシュのナイロンストレーナーに載置し、残存物を蒸留水で洗浄後、吸引ろ過する。
（ｄ）前記ろ過残渣の全量を、秤量済みシャーレ上で５５℃で３時間減圧乾燥する。
（ｅ）前記減圧乾燥後のシャーレを含めた質量を秤量し、シャーレの質量の変化分から残留物の質量を算出する。次いで、架橋物の質量および残留物の質量から、熱安定性試験におけるゲル残存率を以下の式（３）により算出する。

熱安定性試験におけるゲル残存率（質量％）＝オートクレーブ処理後の架橋物の残留物の質量／オートクレーブ処理前の架橋物の質量×１００・・・（３）

【0054】

本発明の架橋物は、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を含むことにより、未修飾ヒアルロン酸および／またはその塩と比較して、エステル結合に関与できるカルボキシル基を多く含むため、熱安定性により優れている。

【0055】

＜耐酵素分解性＞
本発明の架橋物は優れた耐酵素（ヒアルロニダーゼ）分解性を有する。より具体的には、後述の耐酵素分解性試験におけるゲル残存率が６０％以上であり、さらに６０％以上９５％、７０％以上９０％以下であるとよい。耐酵素分解性におけるゲル残存率が６０％未満であると、ヒアルロニダーゼにより分解されやすく、滞留性が低くなってしまう。

【0056】

本発明において、耐酵素分解性試験は以下の方法で行う。
（ａ）本発明の架橋物１００ｍｇ（乾燥質量換算）を５０ｍＭリン酸緩衝液９．５ｍＬに分散させて、該架橋物の濃度が１質量％（固形分）である架橋物水溶液を調製し、２５℃で１０分間静置して、膨潤溶解させる。
（ｂ）前記架橋物水溶液を、ヒアルロニダーゼ（０．２５単位／架橋物１ｍｇあたり）存在下にて４０℃で１５時間保存する。
（ｃ）さらに、ヒアルロニダーゼ（０．２５単位／架橋物１ｍｇあたり）を追加し、４０℃で２４時間保存する。
（ｄ）前記保存後の架橋物を４２０メッシュのナイロンストレーナーに載置し、残存物を蒸留水で洗浄後、吸引ろ過する。
（ｅ）前記ろ過残渣の全量を、秤量済みシャーレ上で５５℃で３時間減圧乾燥する。
（ｆ）前記減圧乾燥後のシャーレを含めた質量を秤量し、シャーレの質量の変化分から残留物の質量を算出する。次いで、架橋物の質量および残留物の質量から、耐酵素分解性試験におけるゲル残存率を以下の式（４）により算出する。

耐酵素分解性試験におけるゲル残存率（％）＝残留物の質量／架橋物の質量（固形分）
×１００ ・・・（４）

【0057】

本発明の架橋物が耐酵素分解性に優れている原因のひとつとして、前記架橋物がカルボキシメチル基を含有することが挙げられる。具体的には、前記架橋物がカルボキシメチル基を含有することより、ヒアルロニダーゼが、前記架橋物に含まれるヒアルロン酸骨格を認識しづらくなるため、耐酵素分解性が向上すると推測される。

【0058】

＜水膨潤性＞
さらに、本発明の架橋物は、優れた水膨潤性を有することから、やわらかい水膨潤性ゲルを形成することができる。ここで、「水膨潤性」とは、水を取り込んで膨潤する性質のことをいい、一般に、水を取り込んでゲル状になる性質のことをいう。本発明の架橋物は、縮合剤との反応によって生じたエステル結合によって形成される３次元網目構造を有し、該３次元網目構造の中に水を取り込むことにより膨潤して、ゲルを構成することができる。

【0059】

＜膨潤度＞
本発明の架橋物は、よりやわらかい水膨潤性ゲルを形成することができる点で、水に対する膨潤度が５倍以上２５０倍以下（質量比）であり、さらに５倍以上２００倍以下であるとよい。ここで、「膨潤度」とは、乾燥ゲルの質量に対する、膨潤ゲルの質量（膨潤ゲル／乾燥ゲル）を意味する。
膨潤度が５倍未満であると、医療材料・美容材料として使用するには硬すぎるゲルになってしまう。一方、膨潤度が２５０倍より大きいと、やわらかすぎてもろいゲルとなってしまう。

【0060】

より具体的には、本発明の架橋物において、熱安定性試験前の膨潤度は、５倍以上５０倍以下（質量比）であるとよく、さらに５倍以上２０倍以下であるとよい。

【0061】

また、熱安定性試験後の膨潤度は、１０倍以上２５０倍以下（質量比）であるとよく、さらに１５倍以上２００倍以下、２０倍以上１５０倍以下であるとよい。

【0062】

＜貯蔵弾性率Ｇ’＞
本発明の架橋物は、粘弾性が優れた水膨潤性ゲルが得られやすいことから、貯蔵弾性率Ｇ’（周波数１Ｈｚ）が１００Ｐａ以上１０万Ｐａ以下であるとよく、さらに１５０Ｐａ以上５万Ｐａ以下であるとよい。なお、本発明において、貯蔵弾性率Ｇ’は後述の実施例に示される方法により測定することができる。

【0063】

［架橋物の用途］
本発明の膝関節注射剤、癒着防止剤、皮下注射剤、または薬物徐放剤は、前記架橋物（または、水膨潤性ゲル）を含むことにより、熱安定性および耐酵素分解性に優れており、さらに固体にて保存が可能であるため、保存安定性に優れている。

【0064】

＜関節注射剤・癒着防止剤＞
本発明の架橋物を関節注射剤・癒着防止剤として使用する場合、前記架橋物は優れた熱安定性および耐酵素分解性を有していることから、生体内である程度の期間分解されずに残存し、その後、生体内で分解されるため、組織同士の癒着を防止することができる上、架橋剤を使用していないため安全性に優れている。
特に、関節注射剤においては、前記架橋物は優れた水膨潤性を有しているため、注射後の痛みを低減することができる。また、癒着防止剤においては、前記架橋物が優れた加工性を有していることから、シート状やフィルム状として幅広い形態で使用することができる。

【0065】

＜皮下注射剤＞
本発明の架橋物を皮下注射剤として使用する場合、医療材料だけでなく、例えば、顔、頭、首、胸部、腹部、臀部、背中、腰、上肢、下肢に注射することにより、美容上の効果（例えば、豊胸、美顔、美脚等、外観をより良くするため）を奏するために使用することができる。前記水膨潤性ゲルは優れた熱安定性および耐酵素分解性、さらに水膨潤性を有するため、美容上の効果を持続させることができる。

【0066】

＜薬物徐放剤＞
本発明の架橋物を薬物徐放剤として使用する場合、前記架橋物は優れた熱安定性および耐酵素分解性を有していることから、生体内である程度の期間分解されずに残存し、その後、生体内で分解されるため、薬物の徐放を補助する作用を有し、かつ、安全性に優れている。

【0067】

＜化粧料＞
本発明の化粧料は前記架橋物を含み、該架橋物は構成するカルボキシル基に起因して、高い保水効果を有する。より具体的には、本発明の架橋物に含まれるカルボキシル基が水と水素結合を構成するため、該カルボキシル基に起因して、優れた保水力を発揮すると推測される。このため、例えば皮膚等の生体組織において高い保水効果を有する。
また、本発明の化粧料が前記水膨潤性ゲルを含む場合、ゲルとして適度な粘弾性を有するため、ゲル特有のみずみずしい触感を実感することができる上、ゲルの中に有効成分を配合することにより、有効成分を徐放させることができる。

【0068】

本発明の化粧料の態様は特に限定されないが、例えば、皮膚用化粧料が挙げられる。具体的には、例えば、洗顔料、洗浄料、化粧水、クリーム、乳液、美容液、パック、クレンジング、ファンデーション、口紅、リップクリーム、リップグロス、リップライナー、頬紅、シェービングローション、アフターサンローション、デオドラントローション、ボディローション、ボディオイル、石鹸、入浴剤が挙げられる。

【0069】

［実施例］
次に、本発明を実施例および比較例に基づき、さらに説明する。なお、本発明はこれに限定するものではない。

【0070】

＜調製例１：カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の調製＞
３０ｍＬのサンプル瓶に水酸化ナトリウム１．０４ｇを秤り取った後、水１２ｍＬを添加して溶解させた。次に、平均分子量が１７５万のヒアルロン酸２．０ｇを添加し溶解させた後、モノブロモ酢酸３．６２ｇを添加して溶解させて、１℃で１６時間静置した。その後、２００ｍＬビーカーにエタノール８０ｍＬを入れ、該反応液を撹拌しながら添加した。その後、４００メッシュのろ布で沈殿を回収した後、１０％塩化ナトリウム水溶液４０ｍＬを添加して沈殿を溶解させた。さらに、８％塩酸水溶液でｐＨを調製した後、エタノール１００ｍＬで３回洗浄した後、減圧濾過し、５５℃で３時間減圧乾燥することにより、調製例１のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸（原料修飾ヒアルロン酸）を含有する組成物を得た。

【0071】

調製例１で得られたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸は分子量が１０７万であり、カルボキシメチル化率が７７％であった。

【0072】

＜カルボキシメチル化率の測定および算出＞
調製例１で得られたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸のカルボキシメチル化率は、以下の方法にて^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積算値より求めた。

【0073】

（試料調製）
試料７ｍｇと内部標準物質４，４−ジメチル−４−シラペンタンスルホン酸ナトリウム（ＤＳＳ）１ｍｇを重水０．７ｍｌに溶かし、ＮＭＲ試料管に移し入れ、キャップをした。

（測定条件）
装置：Ｖａｒｉａｎ ＮＭＲ ｓｙｓｔｅｍ ４００ＮＢ型(バリアンテクノロジーズジャパンリミテッド)
観測周波数：４００ＭＨｚ
温度：３０℃
基準：ＤＳＳ（０ｐｐｍ）
積算回数：６４回

（解析方法）
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの２．０ｐｐｍ付近に現れるヒアルロン酸のＮ−アセチル基（ＣＨ_３）のピークと、３．８ｐｐｍ以上４．２ｐｐｍ以下の範囲に現れるカルボキシメチル基のメチレン基（−ＣＨ_２―）のピークを積分した。積分値から下記の式より、カルボキシメチル化率（ＣＭ化率）を求めた。
ＣＭ化率＝(３．８ｐｐｍ以上４．２ｐｐｍ以下の範囲に現れるピークの積分値／２)／(２．０ＰＰＭのピークの積分値／３)

【0074】

＜実施例１：カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の架橋物の調製＞
１０ｃｍ×７ｃｍのポリエステル製チャック袋に、調製例１で得られた原料修飾ヒアルロン酸１．５ｇを添加し、さらに９０ｍｇ／ｍＬ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール水溶液（以下、「ＨＯＢｔ水溶液」ともいう）２．５４ｍＬおよびイオン交換水１．２１ｍＬを加えた。ここで、反応液における原料修飾ヒアルロン酸の濃度は４０質量％であった。この反応液を手で捏ねて２５℃で２時間保存し、膨潤溶解させた。
次いで、この反応液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」ともいう）を２８８ｍｇ添加した。この反応液を手で捏ねて２５℃で１６時間保存し、膨潤溶解させることで、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の架橋物を含む組成物を得た。

【0075】

＜実施例１：カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の架橋物の精製＞
５００ｍＬビーカーに実施例１で得られた架橋物を含む組成物を移し、イオン交換水２５０ｍＬを加えた。ヒスコトロン（５０００ｒｐｍ×２分）で粉砕処理後、５分間撹拌、５分間静置し、架橋物を沈殿させて上澄みをデカンテーションにより除去した。
次いで、イオン交換水２００ｍＬで２回、６０％エタノール２００ｍＬで１回、９０％エタノール１００ｍＬで１回洗浄した。その後、架橋物を４２０メッシュのナイロンストレイナーで吸引ろ過により回収した後、５５℃で４時間減圧乾燥し、粉末状のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の架橋物１．５４ｇを得た。

【0076】

＜実施例２ないし１０、および比較例１ないし６＞
表１記載の条件に変更した以外は、実施例１と同様の方法で、実施例２ないし１０、および比較例１ないし６の粉末状のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の架橋物を得た。

【0077】

＜比較例７＞
２０ｍＬビーカーに未修飾ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量：２２２万）２．０ｇを添加し、さらに１０％ＨＯＢｔ／７０％エタノール溶液を１０ｍＬ、ＥＤＣを１４４ｍｇ添加した。この反応液を２５℃で終夜撹拌し、ヒアルロン酸の架橋物を含む組成物を得た。
その後、実施例１と同様の精製処理を行い、比較例７の粉末状のヒアルロン酸の架橋物１．９２ｇを得た。

【0078】

＜比較例８ないし１０＞
表１記載の条件に変更した以外は、比較例７と同様の方法で、比較例８ないし１０の粉末状のヒアルロン酸の架橋物を得た。

【0079】

＜試験例１：熱安定性試験＞
５０ｍＬバイアル瓶中に、実施例１ないし７、および比較例１ないし１０で得られたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の架橋物それぞれ１ｇ（乾燥質量換算）を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）５０ｍＬ中に分散させて、架橋物濃度が２質量％（固形分）の混合物を調製した。
次いで、前記バイアルの口にゴム栓をはめて、さらにアルミニウム製の蓋をし、該混合物を１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。
処理後の架橋物を４２０メッシュのナイロンストレイナーに載置し、蒸留水で洗浄後、吸引ろ過により回収し、秤量済みのシャーレ上に広げて５５℃で３時間減圧乾燥した。
その後、シャーレの質量を測定して、シャーレの質量の変化分から残留物の質量を算出した。架橋物の質量および残留物の質量から、熱安定性試験におけるゲル残存率を上述の式（３）により算出した。
なお、前記オートクレーブ処理としては、具体的には、開始温度２５℃で４０分間かけて１２１℃まで昇温させ、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理し、加圧・加熱終了後１時間静置してから、該架橋物を取り出す工程をいう。

【0080】

＜試験例２：耐酵素分解性試験＞
上述の試験例１で得られた架橋物それぞれ１００ｍｇ（乾燥質量換算）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）９．５ｍＬに分散させて濃度１質量％（固形分）の混合物を調製し、２５℃にて１０分間静置して、膨潤溶解させた。
次いで、該混合物にヒアルロニダーゼ（シグマ社、ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｅｓ由来）０．２５単位（０．５ｍＬ）を添加した後、該混合物を４０℃にて１５時間静置した。さらに、ヒアルロニダーゼ０．２５単位（０．５ｍＬ）を追加し、４０℃にて２４時間静置した。
この架橋物を４２０メッシュのナイロンストレイナーで吸引ろ過により回収した後、蒸留水で洗浄し、秤量済みのシャーレ上に広げて５５℃で３時間減圧乾燥した。
その後、シャーレの質量を測定して、シャーレの質量の変化分から残留物の質量を算出した。耐酵素分解性試験におけるゲル残存率を上述の式（４）により算出した。
なお、比較例１ないし７、および比較例１０で得られた架橋物は、試験例１の熱安定性試験においてゲルの残存率が０％であったため、試験例２の耐酵素分解性試験は行っていない。

【0081】

＜膨潤度の測定＞
実施例１ないし１０、および比較例１ないし１０で得られた架橋物について、以下の方法により膨潤度を算出した。
具体的には、架橋物を膨潤させて、水膨潤ゲルを形成させた後、４２０メッシュのナイロンストレイナーで吸引ろ過により回収し、秤量済みのシャーレ上に広げて膨潤ゲルの質量を測定した。次いで、５５℃で３時間減圧乾燥し、乾燥ゲルの質量を測定した。
膨潤ゲルの質量および乾燥ゲルの質量から、水膨潤ゲルにおける膨潤度を以下の式（５）により算出した。
膨潤度（質量比）＝膨潤ゲルの質量／架橋物の質量（固形分）・・・（５）

【0082】

＜貯蔵弾性率Ｇ’の測定＞
実施例１ないし１０、および比較例１ないし１０で得られた架橋物について、以下の測定条件にて貯蔵弾性率Ｇ’を測定した。

【0083】

（測定条件）
測定装置：ＡＲ−Ｇ２（ティー・エー・インスツルメント・ジャパン（株）製）
ギャップ：８００μｍ
測定モード：ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｗｅｅｐ ｓｔｅｐ
測定温度：２５℃
振幅周波数：０．１〜１０Ｈｚ

【0084】

【表1】

【0085】

表１より、縮合剤を用いて、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を、前記修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が有する水酸基とカルボキシル基との間でエステル結合によって架橋させる、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法によって得られた架橋物は、熱安定性および耐酵素分解性に優れていることが理解できる（実施例１ないし１０）。

【0086】

具体的には、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物は、試験例１の熱安定性試験におけるゲル残存率が１０％以上であり、優れた熱安定性を有することが理解できる（実施例１ないし１０）。

【0087】

また、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物は、試験例２の耐酵素分解性試験におけるゲル残存率が６０％以上であり、優れた耐酵素分解性を有することが理解できる（実施例１および２、実施例４ないし７、ならびに実施例９および１０）。

【0088】

さらに、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物は、水膨潤性ゲルを形成する性質を有し、膨潤度が５倍以上２５０倍以下（質量比）であることが理解できる（実施例１ないし１０）。

【0089】

＜配合例１：美容液＞
本配合例では、以下に記す処方にて、実施例４で得られたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の架橋物を配合した美容液を調製した。
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の架橋物 ０．８％
ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量：２００万） ０．２％
加水分解ヒアルロン酸（平均分子量：８０万） ０．１％
カチオン化ヒアルロン酸 ０．１％
加水分解ヒアルロン酸アルキル（C12‐C13）グリセリル ０．１％
１，３−ブチレングリコール ５．０％
カルボキシビニルポリマー ５．０％
エチルヘキシルグリセリン ３．０％
カプリル酸グリセリン ３．０％
ペンチレングリコール ５．０％
グリセリン １．５％
ＰＯＥソルビタンモノステアリン酸エステル １．０％
ソルビタンモノステアリン酸エステル ０．５％
キサンタンガム ０．２％
アルギン酸ナトリウム ０．２％
水酸化カリウム ０．１％
オリーブ油 ０．２％
トコフェロール ０．１％
ＥＤＴＡ−２ナトリウム ０．０２％
アルギニン ０．１５％
グリチルリチン酸ジカリウム ０．０５％
アルブチン ０．２％
パルミチン酸レチノール ０．２％
トラネキサム酸 ０．１％
エラスチン ０．１％
コラーゲン ０．１％
リン酸アスコルビン酸マグネシウム ０．１％
クエン酸ナトリウム １．０％
クエン酸 ０．１％
プロピルパラベン ０．１％
メチルパラベン ０．１５％
香料 適量
精製水 残量

【0090】

＜実施例１１：癒着防止剤＞
実施例３で得られた架橋物を厚さ１ｍｍのフィルム状に圧延して成型し、滅菌処理後、シート状の癒着防止剤を得た。

【0091】

＜実施例１２：皮下注射剤＞
実施例７で得られた架橋物（固形分換算１％）の乾燥物を、０．９％ＮａＣｌを含む注射用水で膨潤させ、１ｍＬの注射器に無菌充填し、滅菌処理後、皮下注射剤を得た。

【0092】

＜実施例１３：薬物徐放剤＞
実施例５で得られた架橋物（固形物換算２％）の乾燥物を、０．９％ＮａＣｌ、０．００１％プロスタグランジンＥ１を含む注射用水で膨潤させ、滅菌処理後、３ｍＬの注射器に無菌充填し、薬物徐放剤を得た。

【0093】

＜実施例１４：膝関節注射剤＞
実施例６で得られた架橋物（固形物換算０．８％）の乾燥物を、０．９％ＮａＣｌを含む注射用水で膨潤させ、滅菌処理後、２ｍＬの注射器に無菌充填し、膝関節注射剤を得た。

【要約】

熱安定性および耐酵素分解性に優れ、さらに水膨潤性にも優れたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物およびその製造方法を提供する。
【解決手段】縮合剤を用いて、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を、前記修飾ヒアルロン酸および／またはその塩が有する水酸基とカルボキシル基との間でエステル結合によって架橋させる、
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物の製造方法。