特許 6048982 グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6048982

(24)【登録日】2016年12月2日

(45)【発行日】2016年12月21日

(54)【発明の名称】グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C07H 19/067 20060101AFI20161212BHJP

   C07H 19/167 20060101ALI20161212BHJP

   C07H 21/02 20060101ALI20161212BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20161212BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20161212BHJP

【ＦＩ】

   C07H19/067CSP

   C07H19/167

   C07H21/02

   C12N15/00 AZNA

   C12N15/00 G

【請求項の数】6

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2014-536921(P2014-536921)

(86)(22)【出願日】2013年9月19日

(86)【国際出願番号】JP2013075370

(87)【国際公開番号】WO2014046212

(87)【国際公開日】20140327

【審査請求日】2015年3月20日

(31)【優先権主張番号】特願2012-208906(P2012-208906)

(32)【優先日】2012年9月21日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2013-22360(P2013-22360)

(32)【優先日】2013年2月7日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】100163647

【弁理士】

【氏名又は名称】進藤 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100182084

【弁理士】

【氏名又は名称】中道 佳博

(72)【発明者】

【氏名】小比賀 聡

(72)【発明者】

【氏名】壽 悠太朗

(72)【発明者】

【氏名】脇 玲子

【審査官】 三木 寛

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０５２４３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００３／０６８７９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０２６８２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Chemical Communications，２０１０年，Vol.46,No.29，p.5283-5285

【文献】 Chemical Communications，２００７年，No.36，p.3765-3767

【文献】 化学工業，２０１２年 １月 １日，Vol.63, No.1，p.42-48

【文献】 J. Synth. Org. Chem.，１９９９年，Vol.57,No.11，p.969-980

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｈ １９／０６７

Ｃ０７Ｈ １９／１６７

Ｃ０７Ｈ ２１／０２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式ＩまたはＩＩで表される化合物またはその塩：

【化1】

（式ＩまたはＩＩ中、
Ｂ_１は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ^１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

【化2】

を表し；そして
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）。

【請求項2】

前記式ＩまたはＩＩにおいて、前記Ｂ_１が、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項１に記載の化合物またはその塩。

【請求項3】

前記式ＩまたはＩＩにおいて、前記Ｂ_１が、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項１に記載の化合物またはその塩。

【請求項4】

以下の式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：

【化3】

（式Ｉ’またはＩＩ’中、
Ｂ_１は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ^１、Ｒ^１２、およびＲ^１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

【化4】

を表し、そしてＲ^１４は、水素原子を表し；そして
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）。

【請求項5】

前記式Ｉ’またはＩＩ’において、前記Ｂ_１が、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。

【請求項6】

前記式Ｉ’またはＩＩ’において、前記Ｂ_１が、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドに関し、より詳細には、グアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドに関する。

【背景技術】

【0002】

核酸医薬による疾病の治療法として、アンチセンス法、アンチジーン法、アプタマーを用いる方法、ｓｉＲＮＡを用いる方法などがある。このうち、アンチセンス法は、疾病に関わるｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）を外部から導入し、二重鎖を形成させることにより、病原ＲＮＡの翻訳過程を阻害し、疾病の治療や予防を行う手法である。ｓｉＲＮＡを用いる方法もアンチセンス法に類似しており、生体に投与した二重鎖ＲＮＡによりｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する。一方、アンチジーン法は、病原ＲＮＡを転写するＤＮＡ部位に対応する三重鎖形成オリゴヌクレオチドを外部から導入することによりＤＮＡからＲＮＡへの転写を抑制する。また、アプタマーは、短い核酸分子（オリゴヌクレオチド）であるため、疾病の原因となるタンパク質などの生体成分と結合することにより機能を発揮する。

【0003】

こうした核酸医薬の素材として、種々の人工核酸が開発されているが、未だ切札となるべき分子が存在しない。例えば、これまでに開発されてきた核酸医薬の素材として、ホスホロチオエート（Phosphorothioate：Ｓ−ＰＯ_３）型オリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、２’，４’−ブリッジド（架橋）核酸（bridged nucleic acid）（ＢＮＡ）／２’，４’−ロックト核酸（locked nucleic acid）（ＬＮＡ）（特許文献１から４および非特許文献１から４）などがある。Ｓ−オリゴは、サイトメガロウイルスに対するアンチセンス医薬品として、既に米国で上市されている。これは、高いヌクレアーゼ耐性を有するものの、標的核酸鎖との結合親和性が低いという難点を有しており、改善が必要である。これまでに開発されている２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡは、いずれも標的核酸鎖との結合親和性が高く、これからの核酸医薬の素材として最も期待される分子である。しかしながら、ヌクレアーゼに対する耐性が十分ではなく、生体内での安定性という点で改良の余地がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第９８／３９３５２号

【特許文献2】国際公開第２００５／０２１５７０号

【特許文献3】国際公開第２００３／０６８７９５号

【特許文献4】国際公開第２０１１／０５２４３６号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】C. Wahlestedtら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000年，97巻，10号，5633-5638頁

【非特許文献2】Y. Hariら、Bioorg. Med. Chem.，2006年，14巻，1029-1038頁

【非特許文献3】K. Miyashitaら、Chem. Commun.，2007年，3765-3767頁

【非特許文献4】S.M.A. Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.，2008年，130巻，14号，4886-4896頁

【非特許文献5】M. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008年，36巻，13号，4257-4265頁

【非特許文献6】S. Obikaら、Bioorg. Med. Chem.，2001年，9巻，1001-1011頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、標的核酸に対する高い結合親和性および特異性を有し、高いヌクレアーゼ耐性を示すオリゴヌクレオチド用の核酸分子を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡの架橋構造にグアニジンを導入した核酸を含むオリゴヌクレオチドが、特にＤＮＡに対する高い結合親和性および特異性を有し、高いヌクレアーゼ耐性を示すことを見出し、本発明を完成させた。

【0008】

本発明は、以下の式ＩまたはＩＩで表される化合物またはその塩：

【0009】

【化1】

【0010】

（式ＩまたはＩＩ中、
Ｂ_１は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ^１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

【0011】

【化2】

【0012】

を表し；そして
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）を提供する。

【0013】

１つの実施態様では、上記式ＩまたはＩＩにおいて、上記Ｂ_１は、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。

【0014】

１つの実施態様では、上記式ＩまたはＩＩにおいて、上記Ｂ_１は、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。

【0015】

本発明はまた、以下の式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：

【0016】

【化3】

【0017】

（式中、
Ｂ_１は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ^１、Ｒ^１２、およびＲ^１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

【0018】

【化4】

【0019】

を表し、そしてＲ^１４は、水素原子を表し；そして
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）を提供する。

【0020】

１つの実施態様では、上記式Ｉ’またはＩＩ’において、上記Ｂ_１は、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。

【0021】

１つの実施態様では、上記式Ｉ’またはＩＩ’において、上記Ｂ_１は、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。

【発明の効果】

【0022】

本発明によれば、標的核酸に対する高い結合親和性および特異性を有し、高いヌクレアーゼ耐性を示すオリゴヌクレオチド用の核酸分子を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴ）−３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’−エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未反応のオリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。

【図2】５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸ）−３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’−エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未反応のオリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。

【図3】グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチド類縁体およびＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドの、完全相補配列を有するＤＮＡ標的鎖（フルマッチ型）および１塩基ミスマッチを有するＤＮＡ標的鎖（ミスマッチ型）のそれぞれに対するＴｍ曲線を示すグラフである。

【図4】化合物５７（Ａ〜Ｄ）および化合物６１（Ｅ〜Ｈ）のＨｕＨ−７細胞内の動態を示す顕微鏡写真であり、Ａ，Ｅは位相差像; Ｂ，ＦはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ (オリゴヌクレオチド)の蛍光像; Ｃ，ＧはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ (核) の蛍光像; Ｄ，ＨはＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（リソソーム）の蛍光像である。

【図5】化合物５７のＨｕＨ−７細胞内の動態を示す顕微鏡写真であって、図４Ａ〜Ｄについて図４Ｂの矢印で示す領域について拡大した写真（Ａ〜Ｄ）である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。

【0025】

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、またはｎ−ヘキシル基をいう。

【0026】

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基などが挙げられる。

【0027】

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基などが挙げられる。

【0028】

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を１つあるいは炭素数１から６の同一のまたは異なる任意の直鎖アルキル基を２つ有するアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。

【0029】

本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基、同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基、炭素数３から７の任意の環状アルキル基および炭素数４から７のこれらの組み合わせを包含する。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ヘプチル基が挙げられ、同一のまたは異なる分岐鎖を有する炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。

【0030】

本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数２から７の任意の分岐鎖アルケニル基、炭素数３から７の任意の環状アルケニル基および炭素数４から７のこれらの組み合わせを包含する。例えば、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。

【0031】

本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよいアリール基」は、炭化水素のみで構成された炭素数６から１２の任意の芳香族炭化水素化合物、および炭素数６から１２の任意の環構造のうち、当該環構造を構成する１以上の炭素原子が同種または異種のヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）で置換された任意の複素芳香族化合物を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数６から１２の芳香族炭化水素化合物としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして当該複素芳香族化合物としては、ピリジン環、ピロリン環、キノリン環、インドリン環、イミダゾリン環、フリン環、チオフェン環などが挙げられる。ピリジン環としては、例えば、ピリミジン環、ピペリジン環、キノリン環、アクリジン環が挙げられる。

【0032】

本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよいヘテロアリール部分を有するアラルキル基」は、炭化水素のみで構成された炭素数５から１２の任意の芳香族炭化水素化合物、および炭素数５から１２の任意の環構造のうち、当該環構造を構成する１以上の炭素原子が同種または異種のヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）で置換された任意の複素芳香族化合物を包含する。用語「ヘテロ原子を含んでいてもよいヘテロアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などが挙げられる。

【0033】

本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基；スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基；クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲン原子で置換された炭素数１から６のアルキル基で置換されたカルボニル基；メトキシアセチル基のような炭素数１から６のアルコキシアルキルカルボニル基；（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基のようなアリールカルボニル基；２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基；２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基のような炭素数１から６のアルキル基で置換されたアリールカルボニル基；４−アニソイル基のような炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたアリールカルボニル基；２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基；４−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基；２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基のような炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル化アリールカルボニル基；４−フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。

【0034】

本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ炭素数１から６のアルキル基で置換されたシリル基；ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような１から２個のアリール基で置換された炭素数１から６の３つのアルキル基で置換されたシリル基などが挙げられる。

【0035】

本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。

【0036】

本明細書において、「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、および「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」内に記載される用語「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものである。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、炭素数１から６のアルキル基；炭素数１から６のアルケニル基；アシル基；テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基；テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基；シリル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基；ハロゲン原子で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたエチル基；ハロゲン原子で置換されたエチル基；１から３個のアリール基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、ハロゲン原子および／またはシアノ基で置換された１から３個のアリール基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基；ハロゲン原子、炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基；ハロゲン原子および／または炭素数１から６の３個のアルキル基で置換されたシリル基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基；アルケニルオキシカルボニル基；炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基で置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基；が挙げられる。

【0037】

より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−４−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン−２−イル基、テトラヒドロチオフラン−２−イル基が挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基としては、メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基などが挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基としては、２−メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたメチル基としては、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたエチル基としては、１−エトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されたエチル基としては、２，２，２−トリクロロエチル基などが挙げられる。１から３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、９−アンスリルメチル基などが挙げられる。「炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、ハロゲン原子および／またはシアノ基で置換された１から３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、４−シアノベンジル基などが挙げられる。炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４−クロロフェニル基、２−フロロフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル基、２，４−ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子およびまたは３個の炭素数１から６のアルキル基で置換されたシリル基で置換された炭素数１から６のアルコキシ基で置換されたカルボニル基」としては、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基で置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。

【0038】

「核酸合成の水酸基の保護基」としては、脂肪族アシル基；芳香族アシル基；１から３個のアリール基で置換されたメチル基；炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、ハロゲン原子および／またはシアノ基で置換された１から３個のアリール基で置換されたメチル基；またはシリル基；が挙げられる。「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、脂肪族アシル基；芳香族アシル基；１から３個のアリール基で置換されたメチル基；ハロゲン原子、炭素数１から６のアルコキシ基および／またはニトロ基で置換されたアリール基；炭素数１から６のアルキル基；または炭素数１から６のアルケニル基；が挙げられる。「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、アシル基、ベンゾイル基が挙げられる。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、炭素数１から６のアルキル基および／またはシアノ基で置換された炭素数１から６のアルキル基；アラルキル基；ニトロ基および／またはハロゲン原子で置換されたアリール基で置換されたアラルキル基；炭素数１から６のアルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基；２−シアノエチル基；２，２，２−トリクロロエチル基；ベンジル基；２−クロロフェニル基；または４−クロロフェニル基；が挙げられる。「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、脂肪族アシル基または芳香族アシル基、ベンゾイル基が挙げられる。

【0039】

本明細書において、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］で表される基のうち、Ｒ^４がＯＲ^４ａそしてＲ^５がＮＲ^５ａとして表すことができる基は、「ホスホロアミダイト基」という。ホスホロアミダイト基としては、例えば、式−Ｐ（ＯＣ_２Ｈ_４ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）で表される基、または式−Ｐ（ＯＣＨ_３）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）で表される基が挙げられる。ここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。

【0040】

本明細書において、用語「人工ヌクレオシド」および「ヌクレオシド類縁体」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの（すなわち、天然のヌクレオシドではなく、かつ人為的にのみ製造することができるヌクレオシド）、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なもの（例えば、ピリドン、ヒドロキシベンゼン、アミノピリジンなどが挙げられるが、特に限定されない）と糖とが結合したものいう。

【0041】

本明細書において、用語「人工オリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド類縁体」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド類縁体」がリン酸ジエステル結合で２から５０個結合した「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体をいう。そのような類縁体としては、例えば、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。

【0042】

本明細書において、用語「式ＩまたはＩＩで表される化合物の塩」とは、本発明の式ＩまたはＩＩで表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、例えば、式ＩまたはＩＩで表される化合物のナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；式ＩまたはＩＩで表される化合物のアンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；式ＩまたはＩＩで表される化合物のフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；式ＩまたはＩＩで表される化合物のメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような炭素数１から６のアルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、式ＩまたはＩＩで表される化合物のグリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。

【0043】

本明細書において、用語「式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドの薬理学上許容される塩」としては、本発明の式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチド類縁体の塩をいう。そのような塩としては、例えば、式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドのナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドのアンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドのフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドのメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような炭素数１から６のアルカンで置換されたスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドのグリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。

【0044】

以下、本発明について詳述する。

【0045】

本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチドまたはその塩は、以下の式ＩまたはＩＩ：

【0046】

【化5】

【0047】

（式ＩまたはＩＩ中、
Ｂ_１は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ^１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

【0048】

【化6】

【0049】

を表し；そして
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す）で表される構造を有する。

【0050】

上記式ＩまたはＩＩにおいて、Ｂ_１は、プリン塩基（すなわち、プリン−９−イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。

【0051】

上記の塩基（Ｂ_１）の具体例としては、６−アミノプリン−９−イル基（アデニニル基）、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（グアニニル基）、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（シトシニル基）、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（ウラシリル基）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）、および４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が挙げられる。

【0052】

中でも、Ｂ_１は、安全で効果的な核酸医薬への応用という観点から、以下の構造式：

【0053】

【化7】

【0054】

でそれぞれ表される、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（シトシニル基）、６−アミノプリン−９−イル基（アデニニル基）、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（グアニニル基）、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、および２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（ウラシリル基）が好適であり、特に、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基が保護基により保護されていることが好ましい。

【0055】

上記式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ^１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

【0056】

【化8】

【0057】

を表し、好ましくは、水素原子またはメチル基である。「アミノ基の保護基」としては、アセチル基、第三級ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基などが挙げられる。

【0058】

上記式ＩまたはＩＩにおいて、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^４）Ｒ^５［式中、Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、および／または炭素数１から６のアルキル基で置換されたアミノ基を表す］を表す。

【0059】

本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドは、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡの架橋構造にグアニジンが導入されている。グアニジンは正の電荷を有するため、例えば、リン酸ジエステル部のアニオン反発抑制（静電相互作用）および水和効果の増強による標的核酸に対する二重鎖形成能の向上、ならびに酵素耐性能の向上が期待される。

【0060】

本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドから、２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを容易に調製することができる。例えば、２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドの三リン酸化は、非特許文献５に記載の方法に従って容易に行われ得る。

【0061】

本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、以下の式Ｉ’またはＩＩ’で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有する：

【0062】

【化9】

【0063】

（式中、Ｂ_１、Ｒ^２、およびＲ^３は、上記式ＩおよびＩＩについて定義されるものと同様である）。

【0064】

上記式Ｉ’またはＩＩ’において、Ｒ^１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

【0065】

【化10】

【0066】

を表し、好ましくは、水素原子またはメチル基であり、そしてＲ^１４は、水素原子を表す。

【0067】

本発明のオリゴヌクレオチドは、上記ヌクレオシド構造を、任意の位置に少なくとも１つ有する。１つのオリゴヌクレオチドに含有される上記ヌクレオシド構造の数および位置は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。数が多いほど、オリゴヌクレオチドは、標的核酸に対する高い結合親和性および特異性を有し、二重鎖および三重鎖の形成速度が速く、高いヌクレアーゼ耐性を示す。本明細書中では、本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシド、および本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる上記ヌクレオシド構造を総称して、「グアニジン架橋型人工核酸」または「グアニジン架橋型核酸」とも称する。

【0068】

このようなヌクレオシド構造を含むオリゴヌクレオチドおよびその類縁体は、上述のように糖部の架橋により固定された構造を有するため、各種ヌクレアーゼに対して分解されにくく、生体への投与後、長時間生体内に存在することができる。さらに、糖部の架橋上に存在するカチオン性グアニジンに起因する静電作用を介して、例えば、ｍＲＮＡと安定な二重鎖を形成して病因となるタンパク質の生合成を阻害し、あるいはゲノム中の二重鎖ＤＮＡとの間で三重鎖を形成してｍＲＮＡへの転写を阻害する。また、感染したウイルスの増殖を抑えることも可能となる。

【0069】

これらのことから、本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドを用いて合成されたオリゴヌクレオチドおよびその類縁体は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、特定の遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品（アンチセンス分子など）としての有用性が期待される。

【0070】

特に、アンチセンス法では、相補センス鎖ＲＮＡに対する結合親和性および生体内ＤＮＡ分解酵素への耐性の両方が必要とされる。一般的に、核酸は、一本鎖状態では、糖部の構造が絶えずＤＮＡ二重鎖に近い形と、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖やＲＮＡ二重鎖に近い形との間で揺らいでいることが知られている。一本鎖核酸が相補的なＲＮＡ鎖と二重鎖を形成する場合、その糖部構造は固定される。そこで、本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドでは、糖部を予め二重鎖を形成する場合の状態に固定されているため、目的のＲＮＡ鎖と二重鎖を形成しやすく、安定に存在させることができる。また、核酸二重鎖は、水分子のネットワークと呼ばれる鎖のようにつながった水和水により安定化されていることも知られている。本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドでは、グアニジンを有するため、例えば、静電相互作用および水和効果による二重鎖形成能の向上、ならびに酵素耐性能の向上が期待される。さらに、グアニジンを架橋部に導入することによりカチオンの位置が固定され、静電相互作用および水和効果の増強も期待される。本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドでは、分子中にグアニジニウム基由来の正電荷を有するため、天然の核酸やこれまでに知られている人工核酸に比べて、細胞への取り込み効率が向上でき、さらに標的核酸に対するハイブリッド形成速度の向上もまた期待される。これらによりアンチセンス効果の増強および体内残存時間の増大が見込まれ、投与量を減らすことによる副作用の軽減とコストの削減が可能である。

【0071】

本発明のオリゴヌクレオチドおよびその類縁体は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製できる。

【実施例】

【0072】

以下、本発明の２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドおよびその類縁体の合成を、実施例に基づいてさらに詳しく説明する。

【0073】

以下の実施例では、水素核磁気共鳴（^１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルは日本電子株式会社製ＪＮＭ−ＥＣＳ４００型（４００ＭＨｚ）を用い、テトラメチルシラン（０．００ｐｐｍ）、クロロホルム−ｄ（７．２６ｐｐｍ）、メタノール−ｄ_４（３．３０ｐｐｍ）を内部標準として測定した。分裂様式は一重項，二重項，三重項，多重項，ＡＢ四重項，二重四重項をそれぞれｓ，ｄ，ｔ，ｍ，ＡＢ，ｄｄと略した。炭素核磁気共鳴（^１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルはＪＮＭ−ＥＣＳ４００型（１００ＭＨｚ）を用い、クロロホルム−ｄ（７７．０ｐｐｍ）、メタノール−ｄ_４（４９．０ｐｐｍ）を内部標準として測定した。リン核磁気共鳴（^３１Ｐ−ＮＭＲ）は、日本電子株式会社製ＪＮＭ−ＥＣＳ４００型（１６１．８ＭＨｚ）を用い、５％リン酸−重水溶液（０．００ｐｐｍ）を外部標準として測定した。質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）は日本電子株式会社製ＪＭＳ−６００型、同ＪＭＳ−７００型、同ＪＭＳ−Ｄ３００型を用いて測定した。シリカゲルクロマトグラフィーの吸着剤は富士シリシア化学株式会社製ＰＳＱ−１００Ｂ（ａｖｅ．０．１１０ｍｍ）を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーの吸着剤は富士シリシア化学富士株式会社製ＰＳＱ−６０Ｂ（平均０．０６０ｍｍ）を用いた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は株式会社島津製作所製ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＬＣ−１０ＡＴ_ＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＳＰＤ−１０Ａ_ＶＰ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＣＴＯ−１０_ＶＰを用いた。ＨＰＬＣ分析カラムにはＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ^ＴＭ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ（４．６×５０ｍｍ）を、分取カラムにはＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ^ＴＭ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ （１０×５０ｍｍ）を用いた。Ｔｍ測定は株式会社島津製作所製ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＵＶ−１６５０Ｂ、 ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＵＶ−１６５０ＰＣ を用いて行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳはＢｒｕｋｅｒ社製Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（登録商標）Ａｕｔｏｆｌｅｘ II ＴＯＦ／ＴＯＦを用いて測定した。

【0074】

塩化メチレン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、ピリジンはカルシウムヒドリドで乾燥した後に、蒸留し反応溶媒および塩基として使用した。その他の試薬類については、特に記載のない限り、市販のものをそのまま使用した。

【0075】

（実施例１）ヌクレオシド類縁体（化合物８）の合成

【0076】

【化11】

【0077】

（１）化合物５の合成

【0078】

【化12】

【0079】

Nishida, M.ら、Chem. Commun.、2010年、第46巻,p.5283-5285.に記載の方法に従い、Ｄ−グルコースから１５工程で化合物１を合成した。

【0080】

得られた化合物１（２．００ｍｇ，３．８６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液５０ｍＬに窒素気流下、塩化ニッケル（３６ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を加えた後、０℃にて水素化ホウ素ナトリウム（６００ｍｇ，１５．４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間撹拌した。セライトで濾過を行った後に溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール）により精製し、化合物２（１．４７ｇ，８１％）を白色アモルファスとして得た（上記工程ａ）。

【0081】

得られた化合物２の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (CD₃OD) δ : 1.60 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.61, 2.93 (2H, AB, J = 14.0 Hz), 3.54, 3.61 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.70 (1H, t, J = 6.0 Hz, 9.0 Hz), 4.19 (1H, d, J = 6.0 Hz), 4.58, 4.61 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.65, 4.81 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.89 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.30-7.43 (10H, m), 7.53 (1H, d, J = 1.0 Hz)。

【0082】

次いで、得られた化合物２（５７６ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１０ｍＬに、窒素気流下、０℃にて９−フルオレニルメトキシカルボニルイソシアナート（３５０ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４ｍＬ）を加えて０℃にて１５分間撹拌した。次いで、０℃にて水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８０：１）により精製し、化合物３（６３８ｍｇ，６９％）を白色固体として得た（上記工程ｂ）。

【0083】

得られた化合物３の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (CDCl₃) δ : 1.57 (3H, d, J = 1.0 Hz), 3.57, 3.69 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.65 (1H, t, J = 7.5 Hz), 3.91, 4.24 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.16 (1H, d, J = 7.5Hz), 4.22 (1H, t, J = 7.0 Hz), 4.46 (2H, d, J = 7.0 Hz), 4.53 (2H, s), 4.68, 4.77 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.88 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.19-7.44 (15H, m), 7.55 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.78 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.12 (1H, s), 8.29 (1H, s), 9.98 (1H, s)。

【0084】

次いで、得られた化合物３（３３５ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液５ｍＬに、窒素気流下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０３ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて６時間撹拌した。次いで、０℃にて水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８０：１）により精製し、化合物４（２６８ｍｇ，８３％）を黄白色固体として得た（上記工程ｃ）。

【0085】

得られた化合物４の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (CD₃OD) δ : 1.35 (3H, s), 3.11, 3.45 (2H, AB, J = 13.5 Hz), 3.69, 3.83 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.28 (2H, d, J = 6.5 Hz), 4.30 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.32 (1H, t, J = 6.5 Hz), 4.38 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.48, 4.71 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.51, 4.57 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.91 (1H, s), 7.23-7.85 (19H, m)。

【0086】

得られた化合物４（９７１ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液８ｍＬに、窒素気流下、ジエチルアミン（２ｍＬ）を加え室温にて５時間撹拌した。次いで、溶媒留去した後、ヘキサンで洗浄することで化合物５（６０９ｍｇ，９１％）を白色固体として得た（上記工程ｄ）。

【0087】

得られた化合物５の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (CD₃OD) δ : 1.37 (3H, s), 3.12, 3.46 (2H, AB, J = 14.0 Hz), 3.60, 3.86 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.25 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.44 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.50, 4.71 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.51, 4.59 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.89 (1H, s), 7.24-7.80 (10H, m), 7.89 (1H, s)。

【0088】

（２）化合物８の合成

【0089】

【化13】

【0090】

上記で得られた化合物５（５５１ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１２ｍＬに、窒素気流下、室温にてトリエチルアミン（０．６８ｍＬ，４．９３ｍｍｏｌ）を加えた後に、０℃にて無水酢酸（０．２３ｍＬ，２．４７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体（６１６ｍｇ）のイソプロパノール溶液１０ｍＬに炭酸カリウム（４００ｍｇ，２．８９ｍｍｏｌ）を加えて室温にて６日間撹拌した。次いで、０℃にて水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体（５１７ｍｇ）のイソプロパノール溶液１０ｍＬに、水素気流下、水酸化パラジウムカーボン（１．４０ｇ）を加えて室温にて２６時間撹拌した。反応液を濾過して得られたろ液の溶媒を留去することで化合物６（３１９ｍｇ，８０％）を白色固体として得た（上記工程ｅ）。

【0091】

得られた化合物６の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (CD₃OD) δ : 1.87 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.21 (3H, s), 3.45, 3.54 (2H, AB, J = 14.5 Hz), 3.71, 3.86 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.23 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.61 (1H, d, J = 6.5 Hz), 5.85 (1H, s), 8.10 (1H, d, J = 1.0 Hz)。

【0092】

得られた化合物６（２１９ｍｇ，０．６２ｍｍｏｌ）のピリジン溶液７ｍＬに、窒素気流下、０℃にて４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（６３０ｍｇ，１．８６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２０時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４０：１→５：１）により精製し、化合物７（２６７ｍｇ，６６％）を白色アモルファスとして得た（上記工程ｆ）。

【0093】

得られた化合物７の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (CD₃OD) δ : 1.87 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.21 (3H, s), 3.45, 3.54 (2H, AB, J = 14.5 Hz), 3.71, 3.86 (2H, AB, J = 12.0 Hz), 4.23 (1H, d, J = 6.5 Hz), 4.61 (1H, d, J = 6.5 Hz), 5.85 (1H, s), 8.10 (1H, d, J = 1.0 Hz)。

【0094】

得られた化合物７（１３１ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液２ｍＬに、窒素気流下、ジイソプロピルエチルアミン（１４６μＬ，０．８４ｍｍｏｌ）を加えた後、０℃にて２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト（９６μＬ，０．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１４時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をジクロロメタン、ヘキサンにより再沈殿を行うことで精製し、化合物８（１１０ｍｇ，６１％）を白色アモルファスとして得た（上記工程ｇ）。

【0095】

得られた化合物８の物性データは、以下のとおりであった：³¹P-NMR (CDCl₃) δ : 149.94, 151.37。

【0096】

（実施例２）オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
実施例１で得られた化合物８を用いて、オリゴヌクレオチド類縁体（化合物９から１３：以下の表１に示す）を、ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド自動合成機ｎＳ−８（株式会社ジーンデザイン製）により０．２μｍｏｌスケールのＣＰＧ担体を用いて合成した。化合物８のアセトニトリル溶液（０．１Ｍ）のカップリング時間は１６分間で行い、それ以外は天然のＤＮＡ合成と同条件にて行った。活性化剤は５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（０．５Ｍ）を用いた。合成したオリゴヌクレオチドは２８％アンモニア水溶液を用いてＣＰＧ担体から切り出した後に、５５℃にて１２時間かけて塩基部の保護基を除去した。得られた粗成績体を逆相簡易カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ＠Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ， Ｗａｔｅｒｓ社）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣ精製を行った。

【0097】

合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物９から１３）の精製および純度確認は逆相ＨＰＬＣにより以下の条件で行った。
移動相
Ａ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０
Ｂ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液：アセトニトリル＝１：１，ｐＨ７．０
グラジエント：
分析５−９％ＭｅＣＮ（３０分）、分取５−９％ＭｅＣＮ（３０分）：化合物９
分析４−８％ＭｅＣＮ（３０分）、分取４−８％ＭｅＣＮ（３０分）：化合物１０
分析３−７％ＭｅＣＮ（３０分）、分取３−７％ＭｅＣＮ（３０分）：化合物１１
分析４−８％ＭｅＣＮ（３０分）、分取４−８％ＭｅＣＮ（３０分）：化合物１２
分析７−１１％ＭｅＣＮ（３０分）、分取７−１１％ＭｅＣＮ（３０分）：化合物１３
使用カラム：
分析 Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ^ＴＭＯＳＴ Ｃ１８ ２．５ μｍ（４．６×５０ｍｍ）
分取 Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ^ＴＭ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５ μｍ（１０×５０ｍｍ）
流速：
分析 １．０ｍＬ／分
分取 ４．５ｍＬ／分
カラム温度：５０℃
検出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物９から１３）の分子量は、飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により決定した。結果を表１に示す。

【0098】

【表1】

【0099】

表１から明らかなように、飛行時間型質量分析（MALDI-TOF-MS）による分子量測定の結果が理論値とよい一致を示したことから、それぞれ目的とするオリゴヌクレオチドが得られたことを確認した。

【0100】

比較のために、天然型のヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド（化合物１４：以下の表２、配列番号１）、およびウレア架橋型人工核酸２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ（５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンウリジン（非特許文献６に従って合成）を含有するオリゴヌクレオチド類縁体（化合物１５から１８：以下の表３）も、標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って同様に合成し、精製した。

【0101】

（実施例３）融解温度（Ｔｍ）の測定
実施例２で得られた各種オリゴヌクレオチド（化合物８を用いて製造したオリゴヌクレオチド類縁体の化合物９から１２、天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドの化合物１４、およびウレア架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体の化合物１５から１８）と標的鎖（５’−ＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣ−３’：配列番号２）とをアニーリング処理して二重鎖を形成させた後、二重鎖の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。

【0102】

具体的には、ＮａＣｌ １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、オリゴヌクレオチド４μＭ、および標的鎖４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水浴で加熱した後、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＵＶ−１６５０ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに５分間５℃に保った後、測定を開始した。９０℃まで毎分０．５℃の割合で温度を緩やかに上昇させ、０．１℃上昇する毎に２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。結果をＴｍ値および修飾単位あたりのＴｍ値差にて表２に示す。Ｔｍ値が高いほど、二重鎖形成能が高いことを示す。

【0103】

【表2】

【0104】

表２から明らかなように、架橋構造およびカチオンの効果により二重鎖形成能が向上するという予想に反して、二重鎖形成能は天然のＤＮＡとほぼ同程度であった。また、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Ｔｍ値の上昇が見られた。したがって、本発明のヌクレオチド類縁体は、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。

【0105】

架橋部のカチオンによる効果を精査するべく、よりカチオンの効果が表れやすい低塩濃度条件（ＮａＣｌを含まないこと以外は上記サンプル溶液と同じ組成の溶液を使用）でのＴｍ測定を行った。比較対象として、ウレア架橋型人工核酸（化合物１５から１８）のＴｍ値も測定した。結果を表３に示す。

【0106】

【表3】

【0107】

表３から明らかなように、ＲＮＡを標的とする場合のＴｍ値にはあまり差がみられなかった。一方、ＤＮＡを標的とする場合、ウレア架橋型人工核酸の場合は人工核酸の導入数を増やすにつれてＴｍ値が低下するのに対して、グアニジン架橋型人工核酸を導入した場合にはそのようなＴｍ値の低下が見られなかった。このことから、架橋部のカチオンはＤＮＡとの二重鎖の安定化に影響を与えることが示唆された。

【0108】

（実施例４）ヌクレオシド類縁体（化合物２８）の合成

【0109】

【化14】

【0110】

（１）化合物２０の合成

【0111】

【化15】

【0112】

化合物１９をShrestha, A.R.ら、J. Org. Chem.、2011年、第76巻, p.9891-9899に記載の化合物７の調製手順に従って入手した。窒素気流下、化合物１９（２．８６ｇ，４．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４０ｍＬ）に、氷冷下にてピリジン（１．６５ｍＬ，２０．５ｍｍｏｌ）およびトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．３７ｍＬ，８．２０ｍｍｏｌ）を加え、氷冷条件で１時間撹拌した。水を加えて酸を潰した後、ジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体を黄色油状物質として得、フラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１→２：１）により簡易精製し、粗成績体を淡黄色アモルファスとして得た。続いて、窒素気流下、粗成績体（１．９６ｇ，２．３４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（８０ｍＬ）にアジ化ナトリウム（０．２３ｇ，３．６０ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。４８時間後、溶媒留去した後水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成績体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）により精製し、化合物２０（１．７１ｇ，６６％）を白色アモルファスとして得た（上記工程ａ）。

【0113】

得られた化合物２０の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (300MHz, CDCl₃) δ : 0.99 (9H, s), 1.58 (3H, s), 3.63, 3.69 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.69, 3.91 (2H, AB, J = 10.5 Hz), 3.91 (1H, dd, J = 7.2 Hz, 5.4 Hz), 4.23 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.47, 4.53 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 4.57, 4.75 (2H, AB, J = 11.4 Hz), 6.03 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.23-7.60 (20H, m), 8.70 (1H,s)。

【0114】

（２）化合物２４および２５の合成

【0115】

【化16】

【0116】

得られた化合物２０（６２２ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液８ｍＬに、窒素気流下、塩化ニッケル（１１ｍｇ，０．０８５ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下にて水素化ホウ素ナトリウム（６４ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）を加え室温にて１０分撹拌した。反応液をろ過して溶媒留去した後、水を加え酢酸エチルで抽出した。次いで、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒留去し粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：トリエチルアミン＝２００：１）により精製し、化合物２１（４５６ｍｇ，７６％）を白色固体として得た（上記工程ｂ）。

【0117】

得られた化合物２１の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (CDCl₃) δ : 1.04 (9H, s), 1.63 (3H, d, J = 1.5 Hz), 3.59, 3.66 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.67 (1H, dd, J = 5.5 Hz, 9.0 Hz), 3.79, 3.99 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.06 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.55, 4.58 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.67, 4.76 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 5.81 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.19-7.61 (21H, m), 7.95 (1H, s)。

【0118】

得られた化合物２１（５０ｍｇ，０．０７１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１ｍＬに、窒素気流下、Ｎ，Ｎ’−ジ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）チオウレア（３０．４ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（９μＬ，０．０３５ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２１ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を加え室温にて３時間撹拌した。次いで、０℃にて水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒留去し粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）により精製し、化合物２２（５８ｍｇ，８６％）を白色固体として得た（上記工程ｃ）。

【0119】

得られた化合物２２の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (CDCl₃) δ : 1.04
(9H, s), 1.42 (9H, s), 1.46(9H, s), 1.72 (3H, d, J = 1.0 Hz), 3.57, 3.96 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.73, 3.78 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.25 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.57, 4.65 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.59, 4.61 (2H, AB, J = 9.0 Hz), 4.89 (1H, q, J = 8.0 Hz), 5.98 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.20-7.69 (22H, m), 8.93 (1H, d, J = 8.0 Hz), 11.34 (1H,s)。

【0120】

得られた化合物２２（１０６ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液１ｍＬに、窒素気流下、フッ化テトラｎ−ブチルアンモニウム（０．１４ｍＬ，０．１４ｍｍｏｌ）を加え室温にて４．５時間撹拌した。次いで、溶媒留去し得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製し、化合物２３（８０ｍｇ，定量）を白色固体として得た（上記工程ｄ）。

【0121】

得られた化合物２３の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (CDCl₃) δ : 1.42 (9H, s), 1.50 (9H, s), 1.75 (3H, d, J = 1.0 Hz), 2.05 (1H, dd, J = 3.5 Hz, 9.0 Hz), 3.57, 3.62 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.68 (1H, dd, J = 11.0 Hz, 9.0 Hz), 3.84 (1H, dd, J = 11.0 Hz, 3.5 Hz), 4.35 (1H, d, J = 7.5 Hz), 4.51, 4.72 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.58, 4.62 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.87 (1H, q, J = 7.5 Hz), 6.07 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.26-7.52 (11H, m), 7.88 (1H, s), 9.05 (1H, d, J = 7.5 Hz), 11.39 (1H,s)。

【0122】

得られた化合物２３（８５０ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１２ｍＬに、窒素気流下、ピリジン（０．２９ｍＬ，３．５９ｍｍｏｌ）を加え、０℃にてトリフロオロメタンスルホン酸無水物（０．３ｍＬ，１．７８ｍｍｏｌ）を加えて０℃にて３時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。窒素気流下、粗成績体のジクロロメタン溶液８ｍＬにトリエチルアミン２ｍＬを加えて、室温にて２７時間撹拌した。次いで、溶媒留去し得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製し、化合物２４（６４４ｍｇ，７７％）を黄白色アモルファスとして得た（上記工程ｅ）。

【0123】

化合物２４（５７ｍｇ，０．０８２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液１ｍＬに、３５％塩酸（０．３ｍＬ）を加え、室温にて４０分間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重層水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去することで化合物２５（４４ｍｇ，定量）を白色固体として得た（上記工程ｅ’）。

【0124】

得られた化合物２５の物性データは、以下のとおりであった：H-NMR (CD₃OD) δ : 1.54 (3H, d, J = 1.0 Hz), 3.53, 3.70 (2H, AB, J = 10.0 Hz), 3.90, 3.97 (2H, AB, J = 11.0 Hz), 4.16 (1H, s), 4.60, 4.66 (2H, AB, J = 11.5 Hz), 4.62 (2H, s), 4.78 (1H, s), 5.66 (1H, s), 7.27-7.38 (m, 10H), 7.50 (1H, d, J = 1.0 Hz)。

【0125】

（２）化合物２８の合成

【0126】

【化17】

【0127】

上記で得られた化合物２４（６４４ｍｇ，０．９３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液１０ｍＬに、水素気流下、水酸化パラジウムカーボン（９００ｍｇ）を加え、室温にて１４時間撹拌した。次いで、反応液を濾過して得られたろ液の溶媒を留去することで、化合物２６の粗成績体を得た（上記工程ｆ）。

【0128】

化合物２６の粗成績体（３５４ｍｇ）のピリジン溶液７ｍＬに、窒素気流下、０℃にて４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４６９ｍｇ，１．３８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１２時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に飽和重曹水を加えてクエンチした後、反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次いで、溶媒を留去して粗成績体を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製し、化合物２７（４４２ｍｇ，５８％）を白色固体として得た（上記工程ｇ）。

【0129】

得られた化合物２７の物性データは、以下のとおりであった：¹H-NMR (CD₃OD) δ : 1.42 (18H, s), 1.49 (3H, s), 3.39-3.55 (4H, m), 3.73 (6H, s), 4.39 (1H, s), 4.57 (1H, s), 5.51 (1H, s), 6.83 (4H, d, J = 9.0 Hz), 7.17-7.44 (m, 9H), 7.77 (1H, s)。

【0130】

得られた化合物２７（１４１ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液２ｍＬに、窒素気流下、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（３９ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）と２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（７３μＬ，０．２３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３時間撹拌した。次いで、０℃にて反応液に水を加えてクエンチした後酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。溶媒を留去して得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）により精製し、化合物２８（１４８ｍｇ，８６％）を白色アモルファスとして得た（上記工程ｈ）。

【0131】

得られた化合物２８の物性データは、以下のとおりであった：³¹P-NMR (CDCl₃) δ : 148.78, 149.48, 149.78。

【0132】

（実施例５）オリゴヌクレオチド類縁体の合成および精製
実施例４で得られた化合物２８を用いて、１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド類縁体（化合物２９から３２：以下の表４に示す）を、ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド自動合成機ｎＳ−８（株式会社ジーンデザイン製）により０．２μｍｏｌスケールのＣＰＧ担体を用いて合成した。化合物２８のアセトニトリル溶液（０．１Ｍ）のカップリング時間は８分間で行い、それ以外は天然のＤＮＡ合成と同条件にて行った。活性化剤は５−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−テトラゾール（０．２５Ｍ）を用いた。合成したオリゴヌクレオチドは２８％アンモニア水溶液を用いてＣＰＧ担体から切り出した。得られた化合物２９から３１の粗成績体については、逆相簡易カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ＠Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ， Ｗａｔｅｒｓ社）により精製し、続いてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５０％で２４時間処理した後に逆相ＨＰＬＣ精製を行った。得られた化合物３２の粗成績体については、逆相簡易カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ＠Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ， Ｗａｔｅｒｓ社）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣ精製を行った。

【0133】

合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物２９から３２）の精製および純度確認は実施例２と同様に行った。

【0134】

合成したオリゴヌクレオチド類縁体（化合物２９から３２）の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ測定により決定した。結果を表４に示す。

【0135】

【表4】

【0136】

比較のために、天然型のヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３３：以下の表５に示す）も、標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って同様に合成し精製した。

【0137】

（実施例６）融解温度（Ｔｍ）の測定
実施例５で得られた各種オリゴヌクレオチド（化合物２８を用いて製造したオリゴヌクレオチド類縁体の化合物２９から３１、および天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドの化合物３３）と以下の表５および６に記載の標的鎖（１０ｍｅｒのポリＡおよび配列番号３〜５）とをアニーリング処理して複合体を形成させた後、複合体の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。

【0138】

具体的には、ＮａＣｌ １００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、オリゴヌクレオチド４μＭ、および標的鎖４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水浴で加熱した後、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＵＶ−１６５０ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を０℃まで徐々に冷却し、さらに５分間０℃に保った後、測定を開始した。８０℃まで毎分０．５℃の割合で温度を緩やかに上昇させ、０．１℃上昇する毎に２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。表５は、種々の数のグアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチド類縁体のポリＡに対するハイブリッド形成能をＴｍ値および修飾単位あたりのＴｍ値差にて表す。表６は、グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチド類縁体および天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドの種々の標的鎖に対するハイブリッド形成能をＴｍ値にて表す。

【0139】

【表5】

【0140】

【表6】

【0141】

表５から明らかなように、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチドはＲＮＡに対する複合体形成能のみならずＤＮＡに対する複合体形成能も優れていた。また、オリゴヌクレオチドへの人工核酸の導入割合が多いほど、Ｔｍ値の上昇が見られた。したがって、本発明のグアニジン架橋型人工核酸は、アンチセンス法に適するオリゴヌクレオチドの合成に有用であると考えられる。

【0142】

表６から明らかなように、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチドはミスマッチ認識能も有していた。グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチドは、天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドと比べても、望ましい標的鎖（すなわち、ポリＡ）への複合体形成能が優れていた。このため、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチドは、配列非特異的に複合体を形成するおそれがないことがわかった。

【0143】

（実施例７）オリゴヌクレオチド類縁体の二重鎖形成能の評価
実施例４で得られた化合物２８を用いて、種々の塩基からなる９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド類縁体（化合物３４：以下の表７に示す）を、合成したオリゴヌクレオチドを２８％アンモニア水溶液を用いてＣＰＧ担体から切り出した後に、５５℃にて１２時間かけて塩基部の保護基を除去した以外は、実施例５と同様にして合成および精製した。比較のために、天然型のヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３５：以下の表７に示す）も、標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って同様に合成し精製した。

【0144】

化合物３４および３５のオリゴヌクレオチドについて、各オリゴヌクレオチドを標的鎖５’-ＧＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’とアニーリング処理して二重鎖を形成させた後、二重鎖の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。標的鎖へのアニーリングおよびＴｍ値の測定を、実施例６と同様に行った。Ｔｍ値の結果を表７に示す。

【0145】

【表7】

【0146】

表７から明らかなように、種々の塩基からなる配列に設計した場合も、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド（化合物３４）は、ポリＴ配列の場合と同様に、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に関し、二重鎖形成能が優れていた。

【0147】

（実施例８）オリゴヌクレオチド類縁体の三重鎖形成能の評価

【0148】

【化18】

【0149】

実施例４で得られた化合物２８を用いて、１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド類縁体（化合物３６：上記「Ｘ」がグアニジン架橋型人工核酸であり、下線を付与したＣは、２’−デオキシ５−メチルシチジンである。以下の表８にも示す）を、合成したオリゴヌクレオチドを２８％アンモニア水溶液を用いてＣＰＧ担体から切り出した後に、５５℃にて１２時間かけて塩基部の保護基を除去した以外は、実施例５と同様にして合成および精製した。比較のために、天然型のヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３７：上記「Ｘ」が天然型のヌクレオシドであり、下線を付与したＣは、２’−デオキシ５−メチルシチジンである。以下の表８にも示す）も、標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って同様に合成し精製した。

【0150】

標的鎖５’−ＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＹＡＧＡＧＡＧＡＣＧＣ−３’（配列番号６）およびその相補鎖の５’−ＧＣＧＴＣＴＣＴＣＴＺＴＣＴＴＴＴＴＧＣＣ−３’（配列番号７）を含む標的ＤＮＡ二重鎖は以下のように調製した。５’−ＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＹＡＧＡＧＡＧＡＣＧＣ−「Ｃ１８−スペーサー」−ＧＣＧＴＣＴＣＴＣＴＺＴＣＴＴＴＴＴＧＣＣ−３’（配列番号６のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端と配列番号７のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端とをリンカーとして「Ｃ１８スペーサー」にて連結した鎖）を、リンカー部の合成に１８−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコールおよび１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト（Glen Research社製）を用いたこと以外は標準的なホスホロアミダイトプロトコルにて合成し精製し、目的の標的ＤＮＡ二重鎖を得た。ここで、ＹおよびＺは塩基対を形成し得る組合せであり、以下のとおりである：ＹがＡであり、かつＺがＴである；ＹがＴであり、かつＺがＡである；ＹがＧであり、かつＺがＣである；またはＹがＣであり、かつＺがＧである。

【0151】

化合物３６および３７のオリゴヌクレオチドについて、各オリゴヌクレオチドを標的二重鎖とアニーリング処理して三重鎖を形成させた後、三重鎖の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。

【0152】

具体的には、カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）１０ｍＭ、ＫＣｌ １００ｍＭ、およびＭｇＣｌ_２ ５０ｍＭ、オリゴヌクレオチド１．８９μＭ、および標的二重鎖１．８９μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水浴で加熱した後、１０時間かけて室温まで冷却した。分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，ＵＶ−１６５０ＰＣ）のセル室内に結露防止のために窒素気流を通し、サンプル溶液を５℃まで徐々に冷却し、さらに２０分間５℃に保った後、測定を開始した。９０℃まで毎分０．５℃の割合で温度を緩やかに上昇させ、０．１℃上昇する毎に２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定した。なお、温度上昇による濃度変化を防止するため、セルは蓋付きのものを用いた。Ｔｍ値の結果を表８に示す。Ｔｍ値が高いほど、三重鎖形成能が高い。

【0153】

【表8】

【0154】

表８から明らかなように、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド（化合物３６）は、望ましい標的二重鎖（ＹがＡであり、かつＺがＴである）に対する三重鎖形成能が優れていた。

【0155】

（実施例９）オリゴヌクレオチド類縁体のヌクレアーゼ耐性の評価
５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴ）−３’の配列のＸがそれぞれ以下に示す通りである、１０ｍｅｒの各種オリゴヌクレオチドを調製した。すなわち、以下の各種オリゴヌクレオチドを調製した：実施例１のヌクレオシド類縁体（化合物８）を用いて製造した、Ｘがグアニジン架橋型人工核酸であるオリゴヌクレオチド類縁体（すなわち「化合物１３」）；実施例４のヌクレオシド類縁体（化合物２８）を用いて製造した、Ｘがグアニジン架橋型人工核酸であるオリゴヌクレオチド類縁体（すなわち「化合物３２」）；ＸがＬＮＡ−Ｔ（チミンＬＮＡ）であるオリゴヌクレオチド（株式会社ジーンデザイン製：化合物３８）；ＸがＤＮＡ−Ｔ（チミンＤＮＡ）であるオリゴヌクレオチド（１０ｍｅｒのオリゴｄＴ、すなわち「化合物３３」）；およびＸにＳ−オリゴ（酸化剤の代わりに硫化剤としてＤ−１，４−ジチオトレイトール（ＤＤＴＴ、ChemGene社製）を用いたこと以外は標準的なホスホロチオアート合成のプロトコルに従い、合成および精製した）を用いて標準的なホスホロアミダイトプロトコルに従って合成し精製したオリゴヌクレオチド（化合物３９：陽性コントロールとして使用）。

【0156】

ヌクレアーゼ耐性の評価は、以下のように行った。各種オリゴヌクレオチド（７５０ｐｍｏｌ）のいずれかを含む緩衝液１００μＬ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２］に、３’−エキソヌクレアーゼ（Crotalus admanteus venom phosphodiesterase：ＣＡＶＰ、Pharmacia Biotech社製）０．１７５μgを加えて混合し、３７℃でインキュベートし、反応開始後一定の時間ごとに反応液の一部を取り出した。取り出した反応液を９０℃にて２分間加熱して酵素を失活させ、オリゴヌクレオチドの残量をＨＰＬＣにより定量した。ＨＰＬＣ条件は以下のとおりである：グラジエント６−１２％ＭｅＣＮ（１５分）；流速０．８ｍＬ／分；カラム温度５０℃。オリゴヌクレオチドの残量を未反応のオリゴヌクレオチドの割合（％）として算出し、反応時間に対してプロットした。結果を図１に示す。

【0157】

図１は、５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴ）−３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’−エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未反応のオリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。図１の縦軸は、ヌクレアーゼ処理に対して未反応のオリゴヌクレオチドの割合（％）を示し、横軸は、ヌクレアーゼ処理時間（分）を示す。図１の記号は以下を表す：四角、天然型ヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３３）；丸、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３８）；三角、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド（化合物３２）；×、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド（化合物１３）；および逆三角、Ｓ−オリゴを含有するオリゴヌクレオチド（化合物３９）。

【0158】

図１から明らかなように、化合物１３は、ヌクレアーゼ処理の２０分後でも５０％以上が未反応のまま残存しており、分解されにくかった。化合物３２は、化合物１３に比べると未反応のオリゴヌクレオチドの残存割合が低かった。しかし、化合物３２は、ヌクレアーゼ処理の１０分後にはほぼ分解される化合物３８（ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチド）に比べると、分解されにくかった。

【0159】

（実施例１０）オリゴヌクレオチド類縁体のヌクレアーゼ耐性の評価
５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸ）−３’の配列のＸがグアニジン架橋型人工核酸であるオリゴヌクレオチド類縁体である、９ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（化合物４０）を、以下のように調製した。

【0160】

化合物３２（3330pmol）を含む緩衝液４０μＬ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２］に３’−エキソヌクレアーゼ（Crotalus admanteus venom phosphodiesterase：ＣＡＶＰ、Pharmacia Biotech社製）（0.2μg）を加えて混合し、３７℃にて３時間インキュベートした。次いで、９０℃にて２分間加熱して酵素を失活させた後、ＨＰＬＣにて精製を行った。得られたオリゴヌクレオチドについて、飛行時間型質量分析（MALDI-TOF-MS）による分子量測定値（２７４３．０７）が理論値（２７４３．８３）とよい一致を示したことから、目的とするオリゴヌクレオチドが得られたことを確認した。

【0161】

５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸ）−３’の配列のＸがＬＮＡであるオリゴヌクレオチド（株式会社ジーンデザイン製：化合物４１）を比較のために用いた。

【0162】

ヌクレアーゼ耐性の評価は、各種オリゴヌクレオチド（７５０ｐｍｏｌ）のいずれかを含む緩衝液１００μＬに３’−エキソヌクレアーゼ０．０８μgを添加した以外は、実施例９と同様に行った。結果を図２に示す。

【0163】

図２は、５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＸ）−３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’−エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未反応のオリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。図２の縦軸は、ヌクレアーゼ処理に対して未反応のオリゴヌクレオチドの割合（％）を示し、横軸は、ヌクレアーゼ処理時間（分）を示す。図２の記号は以下を表す：丸、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチド（化合物４１）；および三角、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド（化合物４０）。

【0164】

図２から明らかなように、化合物４０（グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチド）は、ヌクレアーゼ処理の２０分後でも８０％が未反応のまま残存していた。これに対し、化合物４１（ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチド）は、ヌクレアーゼ処理の２０分後には未反応のオリゴヌクレオチドはほとんど残っていなかった。このように、実施例４のグアニジン架橋型ヌクレオシド類縁体（化合物２８）のような５員環グアニジン架橋型人工核酸を３’末端に含有するオリゴヌクレオチドは、極めて高いヌクレアーゼ耐性能を示した。

【0165】

（実施例１１）オリゴヌクレオチド類縁体の融解温度（Ｔｍ）の測定
以下の表９に記載する化合物３３（１０ｍｅｒのオリゴｄＴからなる天然型オリゴヌクレオチド）；化合物２９〜３１、４２および４３（化合物２８のグアニジン架橋型核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体）；ならびに化合物４４〜４８（ＬＮＡ−Ｔを含有するオリゴヌクレオチド）について、１０ｍｅｒのポリＡにアニーリング処理して複合体を形成させた後、複合体の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成能を調べた。

【0166】

化合物２９〜３１、４２および４３は、逆相簡易カラムによる精製後のＴＦＡ処理にＴＦＡ５０％に代えてＴＦＡ７５％を用いたこと以外は実施例５に記載のように合成および精製した。化合物４４〜４８は、株式会社ジーンデザイン製である。

【0167】

複合体形成およびＴｍ値の測定については、ＫＣｌ ２００ｍＭ、カコジル酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＭ、オリゴヌクレオチド４μＭ、および標的鎖４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を用いた以外は、実施例６と同様に行った。結果を表９に示す。表９は、天然型オリゴヌクレオチドおよび種々の数のＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドと比較して、種々の数のグアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体のポリＡに対するハイブリッド形成能をＴｍ値および修飾単位あたりのＴｍ値差にて表す。

【0168】

【表9】

【0169】

表９から明らかなように、ＲＮＡを標的とした場合、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体は、天然型オリゴヌクレオチドと比較して十分に高い結合親和性を示した。さらに、人工核酸の導入数が３残基以下の場合は、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体は、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドと同程度のＴｍ値であったが、グアニジン架橋型人工核酸を５残基導入したオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡを５残基導入した場合よりも高い結合親和性を示すことが明らかとなった。１残基当たりのＴｍ値の上昇を比較すると、ＬＮＡを導入した場合は、導入数によらずＴｍ値の上昇は６℃から７℃である一方で、グアニジン架橋型人工核酸を導入した場合は、導入数を増やすにつれて１残基当たりのＴｍ値の上昇が大きくなることが明らかとなった。このことから、架橋構造による結合親和性への影響は相加的であるのに対し、グアニジン由来のカチオンによる結合親和性への影響は相乗的であることが示唆された。また、ＤＮＡを標的とした場合、グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチドは極めて高い結合親和性を示し、天然型オリゴヌクレオチドやＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドよりもはるかに高い結合親和性を有することが明らかとなった。

【0170】

（実施例１２）オリゴヌクレオチド類縁体の標的塩基認識能の評価
表９のグアニジン架橋型人工核酸が５残基導入されているオリゴヌクレオチド類縁体（化合物４３）およびＬＮＡが５残基導入されているオリゴヌクレオチド（化合物４８）について、完全相補配列を有するＤＮＡ標的鎖（フルマッチ型）および１塩基ミスマッチを有するＤＮＡ標的鎖（ミスマッチ型）のそれぞれに対する結合親和性を評価した。標的鎖の配列は、フルマッチ型：５’−（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ）−３’、ミスマッチ型：５’−（ＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡ）−３’である。結合親和性は、実施例１１と同様に、アニーリング処理して複合体を形成させた後、複合体の５０％が解離する温度であるＴｍ値を測定することにより評価した。

【0171】

結果を図３に示す。図３は、グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体およびＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドの、完全相補配列を有するＤＮＡ標的鎖（フルマッチ型）および１塩基ミスマッチを有するＤＮＡ標的鎖（ミスマッチ型）のそれぞれに対するＴｍ曲線を示す。図３の縦軸は、２６０ｎｍの吸光度を表し、横軸は、温度（℃）を表す。グアニジン架橋型人工核酸を含有するオリゴヌクレオチド類縁体（化合物４３）のミスマッチ型（細い一重線）およびフルマッチ型（細い一重破線）ならびにＬＮＡを含むオリゴヌクレオチド（化合物４８）のミスマッチ型（太い一重線）およびフルマッチ型（太い一重破線）に対するそれぞれの結果を示す。

【0172】

図３から明らかなように、グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチド類縁体（化合物４３）は、ミスマッチ型標的鎖に対するＴｍ値はフルマッチ型標的鎖に対するＴｍ値に比較して十分低く、そのＴｍ値の低下は、ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチド（化合物４８）の場合と同程度であった。このことから、グアニジン架橋型人工核酸を含むオリゴヌクレオチドは、標的塩基認識能を損なうことなく、標的鎖との非常に高い結合親和性を有することが明らかとなった。

【0173】

（実施例１３）グアニジン架橋型人工核酸（以下、ＧｕＮＡと称することがある）の細胞内動態に関する評価
（１）蛍光標識ＧｕＮＡ修飾オリゴヌクレオチド（Ｆ−ＧｕＮＡ−ＯＤＮ）の合成と同定
まず、実施例４で得られた化合物２８、天然型ヌクレオシド、および後述の蛍光修飾のためのアミダイト体を用いて、ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド自動合成機ｎＳ−８（株式会社ジーンデザイン製）により、オリゴヌクレオチド類縁体を合成した。合成したオリゴヌクレオチド類縁体は表１０に示す化合物５３から５７の前駆体（化合物４９）になる化合物である。この前駆体（化合物４９）の構造を以下に示す。

【0174】

【化19】

【0175】

オリゴヌクレオチドの自動合成において、チミジンアミダイト体（型番：Ｔ１１１０８１）とチミジンＣＰＧ固相担体（型番：Ｔ３６１０１０）、ＣａｐＡ（型番：Ｌ８４００２０−０６）、ＣａｐＢ（型番：Ｌ８５００２０−０６）、酸化剤（型番：Ｌ８６００２０−０６）は全てＳＡＦＣ（登録商標） Ｐｒｏｌｉｇｏ（登録商標） Ｒｅａｇｅｎｔｓより入手した。アセトニトリル（型番：０１８−１４４５１）とデブロッキング溶液（型番：０４２−２８９２１）は和光純薬工業株式会社より購入した。活性化剤は０．２５Ｍ ５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール／ドライアセトニトリル（製造元コード：３０−３１４０−５２，Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。化合物２８のアセトニトリル溶液（０．１Ｍ）のカップリング時間は２０分間で行い、また、化合物２８を３塩基連続してオリゴヌクレオチドに導入する場合、３塩基目のみダブルカップリングを行った。それ以外は天然のＤＮＡ合成と同条件にて行った。

【0176】

なお、蛍光修飾については、蛍光剤のアミダイト体を用いてオリゴヌクレオチドに導入した場合、後の７５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理時に蛍光剤が加水分解するおそれがある。そこで、まずは、構造式を以下に示すアミダイト体 Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｅｒ Ｃ６ Ｓ−Ｓ （製造元コード：１０−１９３６−９０， Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＤＮＡ自動合成機によりオリゴヌクレオチドの５’末端側に付加して、保護基ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）を脱保護せずに終了することにより、蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３〜５７）の前駆体（化合物４９）を得た。なお、アミダイト体 Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｅｒ Ｃ６ Ｓ−Ｓのジスルフィド結合は７５％ＴＦＡに対し、十分な耐性があることが確認されている。

【0177】

【化20】

【0178】

比較のために、化合物２８に代えてウレア架橋型人工核酸２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ（５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンウリジンを含有するオリゴヌクレオチド類縁体（化合物５８から６１：以下の表１０に示す）（株式会社ジーンデザイン製）を購入して用いた。このオリゴヌクレオチド類縁体の前駆体（化合物５０）の構造を以下に示す。

【0179】

【化21】

【0180】

得られた前駆体（化合物４９）を２８％アンモニア水溶液を用いてＣＰＧ担体から切り出し、ＮＡＰ−１０カラム（コード番号：１７−０８５４−０１， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてアンモニアを除去し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥した。ＲＰ−ＨＰＬＣはＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＴ_ＶＰ， ＳｈｉｍａｄｚｕＳＰＤ−１０Ａ_ＶＰ, ＳｈｉｍａｄｚｕＣＴＯ−１０_ＶＰを用い、以下に示す条件で行った。
移動相
Ａ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０
Ｂ液 ８０％アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液
グラジエント：
Ｂ液濃度: ０−１００％（８０分）
使用カラム:
Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ^ＴＭ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ（１０×５０ｍｍ 製品番号：１８６００３９５４）;
流速:
３．０ｍＬ／分
カラム温度:５０℃
検出：ＵＶ（２５４ｎｍ）

【0181】

次に、７５％トリフルオロ酢酸を添加し、６時間室温にて処理することにより、上記のように精製された前駆体（化合物４９）からＢｏｃ基とＤＭＴｒ基の脱保護を行った後、ＮＡＰ−１０カラムでトリフルオロ酢酸を除去し、凍結乾燥して脱保護された前駆体（化合物５０）を得た。

【0182】

上記の脱保護された前駆体（化合物５０）について、Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｅｒ Ｃ６ Ｓ−Ｓのプロトコルに従い、１００ｍＭ ＤＴＴ／ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．０）を添加して２時間室温にてジスルフィド結合を還元し、ＳＨ基を生成した。得られた還元後の前駆体（化合物５１）をＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｂ液: ５０％アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液; グラジエント: Ｂ液濃度０−５０％／２５分) にて精製し、分取した。得られた還元後の前駆体（化合物５１）の構造を以下に示す。

【0183】

【化22】

【0184】

上記、還元によりＳＨ基が生成され、精製された前駆体（化合物５１）に、構造式を以下に示すＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｃ５ マレイミド（製品コード：Ａ−１０２５４， Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を前駆体（化合物５１）に対して１０等量添加し、室温にて一晩反応させてＳＨ基とマレイミドを結合した（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３６， ２７６４−２７７６， ２００８)。

【0185】

【化23】

【0186】

その後、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｂ液:５０％アセトニトリル／０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液; グラジエント: Ｂ液濃度０−５０％／２５分）にて精製し、蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５２：化合物５３〜６１）を得た。なお、このうち、化合物５４〜５７が蛍光標識ＧｕＮＡ修飾オリゴヌクレオチド（Ｆ−ＧｕＮＡ−ＯＤＮ）である。得られた蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５２）の構造を以下に示す。

【0187】

【化24】

【0188】

合成した蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３〜６１）の精製および純度確認は実施例２と同様に行った。

【0189】

合成した蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３〜６１）の質量分析は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＳｐｉｒａｌＴＯＦ ＪＭＳ−Ｓ３０００， ＪＥＯＬ）により行った。結果を表１０に示す。

【0190】

【表10】

【0191】

（２）蛍光標識ＧｕＮＡ修飾オリゴヌクレオチドＦ−ＧｕＮＡ−ＯＤＮのヒト肝癌細胞（ＨｕＨ−７）への導入とその細胞内動態の観察
まず、前準備として、細胞観察用のガラスボトムディッシュ（品種コード：３９７０−０３５， Ｉｗａｋｉ）のガラス部分に１００μｇ／ｍＬコラーゲン／塩酸（ｐＨ ３．０）（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｃ， 新田ゼラチン株式会社製）を１ｍＬ添加することにより、コラーゲンコーティングを行った。

【0192】

これを室温にて３０分静置後、コラーゲンを除去し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄後、室温にて１時間乾燥した。次に、４．５×１０^５個のＨｕＨ−７細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入した（細胞番号：ＪＣＲＢ０４０３））を播種し、フェノールレッド不含培地１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（製品番号：０８４９０−０５， ナカライテスク株式会社製）下で一晩培養を行い（５％ＣＯ_２）、その後、上記（１）で得られた蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３〜６１）を、それぞれ５００ｎＭの濃度で添加した。

【0193】

蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３〜６１）の添加後、さらに１２時間培養を続け、その後、培養されたＨｕＨ−７細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ， 製品番号：１４０２５−０９２，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で１回洗浄し、プロトコルに従ってＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（製品番号：Ｈ３５７０，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｒｅｄ ＤＮＤ−９９（カタログ番号：Ｌ−７５２８，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて核とリソソームを染色した。その後、ハンクス平衡塩類溶液を２ｍＬ添加し、落射型蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００，株式会社キーエンス製）を用いて蛍光像を取得した。なお、対物レンズは４０×位相差レンズ （Ｓ Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ， 株式会社ニコン製）を用いた。

【0194】

各蛍光剤の検出フィルターセットと露光時間を以下に示す。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８: Ｅｘ ４７０／４０ｎｍ， ＤＭ ４９５ｎｍ， ＢＡ ５３５／５０ｎｍ （ＧＦＰ−Ｂ， 株式会社キーエンス製）， ５秒
Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２： Ｅｘ ３６０／４０ｎｍ， ＤＭ ４００ｎｍ， ＢＡ ４６０／５０ｎｍ （ＤＡＰＩ−Ｂ、株式会社キーエンス製）， ２秒
ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｒｅｄ ＤＮＤ−９９： Ｅｘ ５４０／２５ ｎｍ， ＤＭ ５６５ ｎｍ， ＢＡ ６０５／５５ ｎｍ （ＴＲＩＴＣ， 株式会社キーエンス製）， １．２秒

【0195】

蛍光標識修飾オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５３〜６１）をＨｕＨ−７細胞に導入した結果、化合物２８を６残基導入した化合物５７と２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを６残基導入した化合物６１の２種類のオリゴヌクレオチドを添加した場合に細胞内において特に強い蛍光発光が観察された。その他のオリゴヌクレオチドについては、これらと比較すれば蛍光発光が弱かった。化合物５７（Ａ〜Ｄ）および化合物６１（Ｅ〜Ｈ）のＨｕＨ−７細胞内の動態を示す顕微鏡写真を図４に示す。Ａ，Ｅは位相差像; Ｂ，ＦはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ (オリゴヌクレオチド)の蛍光像; Ｃ，ＧはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ (核) の蛍光像; Ｄ，ＨはＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（リソソーム）の蛍光像である（スケールバー５０μｍ）。化合物２８を６残基導入した化合物５７のオリゴヌクレオチドを用いた場合は強い蛍光発光が確認された(図４Ｂ)。これに対し、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを６残基導入した化合物６１のオリゴヌクレオチドを用いた場合、ある程度の蛍光発光を示したものの、化合物２８を用いた化合物５７より蛍光発光が弱かった(図４Ｆ)。これは、化合物５７では、化合物２８を６残基導入することにより、細胞への導入効率が高められ、さらにオリゴヌクレオチド全体の荷電が変化して細胞表面への吸着効率が高められている結果であると考えられる。これに対し、化合物６１では２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを６残基導入することにより、細胞への導入効率が高められているものの、荷電が変化していないため細胞表面への吸着効率が高められておらず、その分、化合物５７と比較すれば蛍光発光が弱かったと考えられる。

【0196】

次に、化合物５７のＨｕＨ−７細胞内の動態を示す顕微鏡写真であって、図４Ａ〜Ｄについて図４Ｂの矢印で示す領域について拡大した写真（Ａ〜Ｄ）を図５に示す。得られた蛍光発光の細胞内での局在を詳細に観察すると、添加したオリゴヌクレオチドは核内には存在せず、細胞質内の小胞内に多く蓄積しており、リソソーム内にも多数存在していることも明らかとなった。

【0197】

以上のことから、負の電荷を帯びるオリゴヌクレオチドに対し、正の電荷を帯びるグアニジノ基を付与させることによりオリゴヌクレオチド全体の電荷を変化させることは、オリゴヌクレオチド自体の細胞導入効率を向上させる有用な手法であることが証明された。

【0198】

なお、従来はドラッグデリバリーシステムを用いずに、オリゴヌクレオチドを細胞内に導入することは、酵素耐性や細胞透過性の面から困難とされていた。これらを改善するための手法としては、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格にホスホロチオエート修飾を施す手法が汎用されている。しかしながら、ホスホロチオエート修飾においては、リン原子上に生じるキラリティの問題から、生産面、安全面、薬効低下が懸念材料となっていた。今回、ホスホロチオエート修飾を施すことなく細胞内透過性を高められたことから、本発明のグアニジン架橋を有する人工ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドがこれらの欠点を克服し、核酸の医薬品化に貢献できることがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0199】

本発明によれば、標的核酸に対する高い結合親和性および特異性を有し、高いヌクレアーゼ耐性を示すオリゴヌクレオチド用の核酸分子を提供することができる。このような核酸分子は、疾病の新たな治療法や予防法として期待されているアンチセンス法、アンチジーン法、アプタマーを用いる方法、ｓｉＲＮＡを用いる方法などに用いる核酸医薬の素材として大いに貢献することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]