特許 6056230 液体クロマトグラフィー用カチオン交換体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6056230

(24)【登録日】2016年12月16日

(45)【発行日】2017年1月11日

(54)【発明の名称】液体クロマトグラフィー用カチオン交換体

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20161226BHJP

【ＦＩ】

   G01N30/88 101P

   G01N30/88 201X

   G01N30/88 201G

   G01N30/88 201Y

【請求項の数】4

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2012-157530(P2012-157530)

(22)【出願日】2012年7月13日

(65)【公開番号】特開2014-20829(P2014-20829A)

(43)【公開日】2014年2月3日

【審査請求日】2015年6月26日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】村中 和昭

(72)【発明者】

【氏名】榎本 好宏

【審査官】 大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０８１７２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００２−３０６９７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１６２４４９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３０／００ − ３０／９６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

単官能性ビニルモノマーと多官能性ビニルモノマーの共重合体からなり、その粒径が５μｍ以下である非多孔性粒子の表面に、ポリビニルスルホン酸共重合体が固定されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。

【請求項2】

ポリビニルスルホン酸共重合体の分子量が５０００以上４００００以下であることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。

【請求項3】

ポリビニルスルホン酸共重合体の導入量が、非多孔性粒子の３０重量％以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体。

【請求項4】

請求項１乃至３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を充填して成る液体クロマトグラフィー用カラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、実質的に非多孔性粒子の表面に、ポリビニルスルホン酸共重合体が固定されていることを特徴とするカチオン交換体に関するものである。

【背景技術】

【0002】

液体クロマトグラフィー用のカチオン交換体には、（１）試料中に含まれる塩濃度の影響を受けにくくするために、タンパク質等の対象物質（以下単に「対象」ということがある）に対して高い保持力を有すること、（２）微量成分の分離性能を保つために十分な対象の吸着容量を有すること、（３）分離・分析精度向上のために高い分離能を有すること、（４）分離・分析時間短縮のために速い操作流速で使用できること（速い操作流速に伴う高圧に耐えるための機械強度を有すること）、（５）操作流速の低下を招かないこと（低操作圧であること）、そして（６）交換体と対象との間で、カチオン交換以外の相互作用が小さいこと、が要求される。

【0003】

液体クロマトグラフィー用のカチオン交換体は、交換体を構成する粒子にカチオン交換基（リガンド）を導入したものである。粒子については、上記（３）の改善を目的として、粒子内拡散のない非多孔性の粒子を使用すること（非特許文献１）や粒径が１０μｍ程度の粒子を使用することが提案されている。粒径については更なる微粒子化が進み、粒径５μｍ以下の粒子を使用することが近年では提案されている。そして、このような微粒子の使用に伴う分離・分析時間の長時間化を防止するためにより高い操作圧を負荷する必要が生じ、粒子に求められる上記（４）の機械的強度は１００ＭＰａ程度になっている
一方、カチオン交換基としては、従来からスルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基等が知られている。なかでもスルホン酸基は、ｐＫａが小さく、対象をイオン解離する目的で溶離液のｐＨを低下した場合にそのｐＨの変動が生じたとしても対象を安定的に保持し得ることから、カチオン交換基として多用されており、スルホン酸基の粒子への導入方法として、スチレン共重合体粒子に対して三酸化硫黄、クロロ硫酸又は濃硫酸を作用させる方法、粒子に対してエポキシ基やアリル基を導入し更に亜硫酸を作用させる方法、そして水酸基を有する粒子にプロパンスルトン、ブタンスルトン又は三硫化硫黄を作用させる方法が使用されている。

【0004】

合成ポリマーを骨格とする非多孔性の粒子（合成ポリマー粒子）は、上記（３）とともに（４）をも達成し得るものである。そこで非多孔性のポリマー粒子に従来のようなカチオン交換基の導入方法を適用することが考えられるが、合成ポリマー粒子は、一般的に、後に粒子表面にカチオン交換基を導入するための官能基を有したモノマーと、粒子の機械的強度を高めるための多官能不飽和架橋性モノマーの共重合体を用いて製造するため、粒子の機械的強度を高くするために多官能不飽和架橋性モノマーを多く使用すると粒子表面の官能基量が減少し、粒子表面に十分な量のカチオン交換基を導入できずに粒子表面のカチオン交換基密度が下がる。この結果、対象の保持力が不十分となり（上記（１）が達成できない）、さらに非多孔性であるがゆえの小表面積に起因して対象、特にタンパク質等の生体高分子に対する吸着容量を大きくできず、上記（２）が損なわれ、対象の溶出ピークがブロード化してしまう。
このため、上記（１）や（２）の改善を目的として、カチオン交換能を有するビニルポリマー鎖を粒子表面にグラフトして固定する方法（特許文献１から４）、細孔内に水溶性ポリマーを固定化する方法（特許文献５）が提案されている。しかし、グラフトによってポリマー鎖を粒子表面に固定すると、操作圧が高くなり、上記（５）に反して操作流速の低下を招いてしまう。また細孔内に水溶性ポリマーを固定する方法は非多孔性粒子には適用することができない。

【0005】

上記（２）及び（５）の改善を目的として、スルホン酸基を有するモノマーとカルボン酸基を有するモノマーとの共重合体と、カルボン酸基と反応可能な官能基を有するポリマーを、粒子の表面に部分的架橋によって固定する方法も提案されている（特許文献６）。しかしこの方法では、粒子径が５μｍ程度の微粒子に適用すると上記（５）の要求に反して操作流速の低下を招いてしまう。またこの方法によって（１）及び（６）を改善するためには、部分架橋によって形成されるポリマーはスルホン酸基以外の主鎖及び側鎖の割合が少なく、カチオン交換基密度の高いこと、及び、対象との間で、カチオン交換以外の相互作用（例えば疎水相互作用）を起こしにくいことも要求される。

【0006】

上記方法において（１）及び（６）を改善し得るスルホン酸基を有するモノマーとカルボン酸基を有するモノマーとの共重合体として、ビニルスルホン酸重合体（特許文献６から１０）の使用が考えられるが、ビニルスルホン酸の単独重合体ではこれを粒子表面に固定する方法が限られてしまう。例えば特許文献１１では、ビニルスルホン酸を粒子表面の水酸基と反応させて導入することが記載されているが、粒子表面の水酸基１個に対し、１個のビニルスルホン酸を導入するに過ぎず、上記（２）が損なわれてしまう。またビニルスルホン酸は高分子のものを製造することが困難であり（非特許文献２、特許文献１２）、分子量２万以上のものとしてわずかに特許文献１３がポリビニルスルホン酸重合体（ホモポリマー）を開示しているにすぎず、ホモポリマーであるゆえ、上記したような粒子の表面に部分的架橋によって固定する方法には適用することができない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許５４５３１８６号公報

【特許文献2】米国特許３７２３３０６号公報

【特許文献3】特公昭５７−２３６９４号公報

【特許文献4】特公昭５７−５８３７３号公報

【特許文献5】特開２００８−２３２７６４号公報

【特許文献6】特開２００２−３０６９７４号公報

【特許文献7】特表２００３−５１２１７１号公報

【特許文献8】特許３４７４５６７号公報

【特許文献9】特表２００６−５１９２７３号公報

【特許文献10】特開平１０−６０１４２号公報

【特許文献11】特表２００９−５０６３４０号公報

【特許文献12】特開平７−１７３２２６号公報

【特許文献13】特開２００９−２２７９６５号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ ｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、 Ｊｏｕｒａｎｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ Ｖｏｌｕｍｎ３９８、１９８７、Ｐａｇｅ ３２７−３３４

【非特許文献2】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.,７６、６３９９−６４０１（１９５４）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、（１）から（６）の要請に応え、対象に対して高い保持力を有する、十分な対象の吸着容量を有する、高い分離能を有する、充分な機械強度を有する、低操作圧である、そしてカチオン交換以外の相互作用が小さい、という液体クロマトグラフィー用カチオン交換体を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

前記課題を解決するためになされた本発明の液体クロマトグラフィー用カチオン交換体は、非多孔性粒子の表面に、ポリビニルスルホン酸共重合体が固定されていることを特徴とするものである。以下、本発明を詳細に説明する。

【0011】

本発明のカチオン交換体は、上記（３）の分離能の向上のため、非多孔性粒子を基材とするものである。本発明における「非多孔性」とは、微孔が一切存在しない粒子はもちろんのこと、カチオン交換体を用いて分離等しようとする対象が入り込めないサイズの孔がある粒子であっても含まれる。なお、粒子の孔のサイズを制御する方法は、例えば米国特許第４３８２１２４号等、従来から公知である。

【0012】

非多孔性粒子は、（３）の改善を目的として、粒径を５μｍ以下とすることが好ましく、例えば無機基材（例えば、シリカ、ジルコニア、アルミナ等）や、有機基材（例えば、架橋多糖や、アクリルアミド、アクリルステル、スチレン等のビニルモノマー架橋体）であれば良い。これら粒子は、例えば特公昭５８−５８０２６号や特開昭５３−９０９９１号に開示されたような、単官能ビニルモノマー（グリシジルメタクリレート、ビニルベンジルグリシジルエーテル等）と、多官能ビニルモノマー（エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、グリセンポリメタクリレート、ジビニルベンゼン等）を組み合わせた混合液の懸濁重合により製造する方法、例えば特開２００１−２７１６号に記載されたようなシード重合により製造する方法によって製造することができる。なお、有機基材の非多孔性粒子を使用する場合には、単官能ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーの共重合体、特に単官能性ビニルモノマー由来の構造単位が下記式（１）で示されるものが好ましい（式中、Ｒ1は水素原子又はＣＨ3を表す。Ｒ２は、ポリオキシアルキレン結合を介して、又は直接導入されたポリビニルスルホン酸共重合体を表す）。また（４）の改善の目的では、多官能ビニルモノマーの割合を５重量％以上としたものが好ましく、（１）から（３）の改善の目的では、充分な量のポリビニルスルホン酸共重合体を固定するための官能基を確保するために、多官能性ビニルモノマーの割合は５０重量％以下とすることが好ましい。例えばグリシジルメタクリレート等のエポキシ基を有する単官能性ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーとの共重合体であれば、エポキシ基を直接利用する、エポキシ基を加水分解して開環し水溶性の多価アルコール等で親水化を行うことにより水酸基化する、等が可能であり、また水酸基を有する粒子であれば、例えばエピクロルヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル等の多官能エポキシ化合物などを既知の方法でエポキシ基を導入することが可能である。

【0013】

【化1】

本発明のカチオン交換体は、カチオン交換基としてのスルホン酸基を有するポリビニルスルホン酸共重合体を固定したものであるが、ポリビニルスルホン酸共重合体としては、特に上記（１）〜（３）及び（５）を改善するために、その分子量が５０００から４００００の範囲のものが好ましい。分子量が小さいと（１）から（３）の改善効果が小さく、分子量が大すぎると操作圧が上昇して（５）の改善効果が小さくなるからである。

【0014】

本発明のポリビニルスルホン酸共重合体は、ビニルスルホン酸と、粒子への固定化のため、粒子表面の官能基と結合し得る官能基を有するビニルモノマーとを共重合して得ることができる。例えば粒子表面にエポキシ基又はカルボキシル基が存在する場合には、これらと結合し得る水酸基、アミノ基、チオール基等を有するビニルモノマーをビニルスルホン酸と共重合すれば良い。中でもビニルスルホン酸との共重合が容易な水酸基を有するビニルモノマーが好適であり、具体的に、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリル酸エステル、ポリエチレングリコール(メタ)アクリル酸エステルやグリセロール（メタ）アクリルエステル等のポリオール化合物の(メタ)アクリル酸エステル、Ｎ−ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチル(メタ)アクリルアミド、Ｎ−（トリス（ヒドロキシメチル）メチル）（メタ）アクリルアミド等を例示することができる。

【0015】

ポリビニルスルホン酸共重合体を構成するビニルスルホン酸の構造単位は、（１）〜（３）及び（６）の改善を目的として、９９．５から５０モル％の範囲であることが好ましい。またポリビニルスルホン酸共重合体の粒子表面への固定量については、（５）の改善を目的として、カチオン交換体のカチオン交換容量が５から３０ｍｅｑ／Ｌとなる範囲で調整することが好ましい。このような固定化量の制御により、低操作圧性を備えたカチオン交換体を実現できる。

【0016】

ポリビニルスルホン酸共重合体を粒子表面に固定する方法としては、例えば粒子表面にエポキシ基が存在する場合には、ビニルスルホン酸と水酸基を有するビニルモノマーを共重合してポリビニルスルホン酸共重合体を製造し、該共重合体を溶解した水溶液中に粒子を分散し、溶液を中性からアルカリ性にする、等を例示できる。この場合、ポリビニルスルホン酸共重合体の使用量として５〜５０％濃度を選択し、溶液に０．１〜０．５モル濃度の水酸化ナトリウムを添加して３０から６０度で１から２４時間加熱することを具体的に例示できる。また例えば粒子表面にエポキシ基又はカルボキシル基が存在する場合には、ビニルスルホン酸と水酸基を有するビニルモノマーを共重合してポリビニルスルホン酸共重合体を製造し、該共重合体を揮発性溶媒に溶解した状態でエポキシ基又はカルボキシル基を有する粒子を分散し、溶媒を留去した後、９０から１５０度で１から５時間乾燥加熱する、等を例示することができる。この場合、ポリビニルスルホン酸共重合体の使用量としては、乾燥重量で粒子の５重量％以上とすることを具体的に例示できる。

【0017】

本発明のカチオン交換体は、例えば液体クロマトグラフィー用のカラムに充填して、グリコヘモグロビンを含む種々のタンパク質等の生体試料の分離、精製に使用することが可能である。

【発明の効果】

【0018】

本発明のカチオン交換体は、非多孔性粒子にカチオン交換基を固定したものであるから、（３）を改善することができ、特に５μｍ以下という微粒子を使用した場合には、大きく改善することできる。本発明において、ビニルモノマー共重合体（架橋体）を使用する場合には、１００ＭＰａに耐えうる機械強度を実現でき、（４）を改善することができる。また本発明のカチオン交換体は、スルホン酸基をカチオン交換基として使用し、かつ、充分な量のカチオン交換基を粒子に固定できるから、（１）から（３）及び（６）を改善することができ、しかもその固定量を制御することによって（５）をも改善し得るものである。

【0019】

このように本発明のカチオン交換体は、（１）試料中に含まれる塩濃度の影響を受けにくくするために、対象に対して高い保持力を有し、（２）微量成分の分離性能を保つために十分な対象の吸着容量を有し、（３）分離・分析精度向上のために高い分離能を有し、（４）分離・分析時間短縮のために速い操作流速で使用でき（速い操作流速に伴う高圧に耐えるための機械強度を有し）、（５）操作流速の低下を招かず（低操作圧であり）、そして、（６）交換体と対象との間で、カチオン交換以外の相互作用が小さい（小さなカチオン交換以外の相互作用性）という、従来からの要求に応えることのできるカチオン交換体である。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】実施例１、比較例１及び比較例２の結果を示す図である。

【図2】実施例１におけるタンパク質（グリコヘモグロビン）のクロマトグラムを示す図である。

【実施例】

【0021】

以下、実施例により本発明のカチオン交換体を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［非多孔性基材の作成］
特許公開２００１−２７１６号に記載された方法（シード重合法）により、非多孔性粒子を製造した。ベンジルメタクリレート２０ｇ及びメルカプト酢酸２−エチルヘキシル０．９５ｇを５００ｍＬ三つ口フラスコに入れて混合し、イオン交換水を２００ｇ投入した。マグネティック撹拌子を入れ、８５度に設定したオイルバスに取り付け、窒素導入管を設置し、１５０ｒｐｍで撹拌した。これとは別に５０ｍＬ容器に過硫酸カリウム０．６ｇ及びイオン交換水２０ｇを計り取り溶解した。３０分経過後、三つ口フラスコに設置したゴム栓から、過硫酸カリウム水溶液を注射器で投入した。回転数を３００ｒｐｍとしてソープフリー乳化重合を実施した。２時間重合を継続後、凝集分を取り除いてシード溶液を回収した。シード溶液の固形分含有率は、６．９８％であり、粒子径は電子顕微鏡による測定で０．３９μｍであった。
メタクリル酸２，３エポキシプロピル６４ｇ、二メタクリル酸エチレン１６ｇ、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（商品名Ｖ−６５、和光純薬(株)製）０．２ｇ及びドデシル硫酸ナトリウム０．２ｇを３００ｍＬフラスコに計量し、撹拌子を入れ、マグネティックスタラーで混合した。イオン交換水を１００ｍＬ加え、マグネティックスタラーで撹拌しながら超音波ホモジナイザーで乳化した。前記のように調整したシード溶液１０．９０ｇ（固形分量０．７６０ｇ）及び５０ｍＬの４％濃度のポリビニルアルコール水溶液を加え、１分間よく撹拌し、静置した。室温下で３０分放置後、６０度に設定した水浴に静置し、２時間重合を行った。得られた重合液をガラスフィルターでろ過し、温水、アセトン、温水の順で洗浄して、非多孔性粒子を得た。

【0022】

得られた非多孔性粒子を５００ｍＬセパラブルフラスコに入れ、イオン交換水を３００ｍＬ加え、９０度に設定したオイルバスに設置し、撹拌しながら２４時間加熱することによりエポキシ基の加水分解を行った。エポキシ基を加水分解した後の非多孔性粒子は、電子顕微鏡観察により観察したところ、１．８μｍの粒子径の揃った粒子であった。

【0023】

得られた非多孔性粒子１００ｇ（水サクションドライ）、エピクロロヒドリン１０３ｇ及びイオン交換水１００ｇを５００ｍＬセパラブルフラスコに入れ、４５度に設定した水浴に設置し撹拌した。これとは別に４８％水酸化ナトリウム水溶液８８ｇを計量し、ディスポーザブル注射器に入れ、シリンジポンプに設置し、０．５ｍＬ／分の速度でセパブルフラスコに撹拌しながら投入した。投入後反応を２時間継続し、反応物をガラスフィルターでろ過し、水、アセトンの順で洗浄し、通風乾燥し、エポキシ化非多孔性粒子を得た。
実施例１
ビニルスルホン酸ナトリウム（以下「ＶＳＮａ」と略記する）２５％水溶液（東京化成工業製）１０．０ｇ、２-ヒドロキシエチルメタクリル酸エステル（以下「ＨＥＭＡ」と略記する）０．２１６ｇ（ＶＳＮａとの比率で１０モル％）及び過硫酸カリウム０．０２６ｇを１０ｍＬガラス容器に入れ、６５度に設定した水浴中で５時間重合した。重合液を少量サンプリングし、共重合体の分子量を下記の条件下、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定した結果、重量平均分子量１１７００、ビニルスルホン酸の重合率は９４％であった。

【0024】

ゲルパーミエーションクロマトグラフィーの条件
カラム：ＴＳＫｇｅｌ（登録商標） Ｇ４０００ＰＷ_ＸＬ及び同 Ｇ２５００ＰＷ_ＸＬ
溶離液：０．１ｍｏｌ／Ｌ 硝酸ナトリウム
流速：１．０ｍＬ／分
検出：屈折率計
サンプル：１０倍希釈し、５ｕＬ注入
上記重合液を２００ｍＬのメタノールで再沈精製し、窒素気流下通風乾燥しビニルスルホン酸共重合体の白色粉体を得た。
エポキシ化非多孔性粒子５ｇ（乾燥重量）に対し、ビニルスルホン酸共重合体１．０ｇ（エポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり２０重量％）及び２０ｍＬの純水を１００ｍＬナス型フラスコに入れ、超音波槽にてよく分散した。ナス型フラスコをエバポレータ―に取り付け、減圧下水を留去した。ナス型フラスコを１５０度に設定した温風過熱器に入れ、１時間加熱することにより、ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子の表面に固定した。ナス型フラスコを冷却後、水を入れ、よく分散し、ガラスフィルターを用いて、水、０．１Ｎ塩酸、０．１Ｎ水酸化ナトリウム、水の順で洗浄し、カチオン交換体を得た。得られたカチオン交換体は、１０％のイオン交換水を分散液として、４．６ｍｍ内径ｘ５０ｍｍ長さの液体クロマトグラフィー用カラムにスラリー充填した。得られたカラムを使用して、下記条件下、液体クロマトグラフィーを実施してタンパク質の分離性能を測定した。カチオン交換体の操作圧は、溶離液Ａを流速０．５ｍＬ／分で送液した時の操作圧とした。そしてカチオン交換体のカチオン交換容量は、カラムに２５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸溶液を０．４ｍＬ／分の流速で１０分間通液し、続いてイオン交換水を０．４ｍＬ／分の流速でカラム溶出液の電気伝導度が低下するまで通液し、カラムから抽出したカチオン交換体を２００ｍＬのビーカー中で０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で分散後、０．０１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７を終点として自動滴定することで測定した。

【0025】

液体クロマトグラフィー条件
溶離液Ａ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）
溶離液Ｂ：０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）
グラジエント：５〜１００％溶離液Ｂ直線グラジエント、９．５分
流速：０．４ｍＬ／分
対象：α−キモトリプシノーゲンＡ（１ｇ／Ｌ）
リボヌクレアーゼＡ（１ｇ/Ｌ）
リゾチウム（１ｇ／Ｌ）
注入量：３、５、７、１０、２０、３０及び５０μＬ
対象を１０μＬ注入したときのクロマトグラムは図1に示したとおりであり、３種類の対象が良好に分離されていること、及び、全対象について、本発明のカチオン交換体が十分な保持力を有していることが分かる。カチオン交換体の操作圧については２６．８ＭＰａと低操作圧であり、カチオン交換容量は、カチオン交換体１Ｌあたり１６．６ｍｅｑと十分なものであった。
また下記条件下、グリコヘモグロビンの分析を行った場合のクロマトグラムを図２に示す。グリコヘモグロビンを対象とした場合にも、本発明のカチオン交換体は良好な分離を示すことが分かる。
グリコヘモグロビンの分析条件
溶離液Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）
溶離液Ｂ：０．２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌＯ４を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）
グラジエント：０〜１００％溶離液Ｂ直線グラジエント、１０分
流速：０．５ｍＬ／分
試料：ＨｂＡ１ｃコントロール（１．０ｇ／Ｌ）（東ソー(株)製）
注入量：５μＬ
実施例１で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例２
ビニルスルホン酸共重合体を製造するにあたり、ＨＥＭＡに代えてＶＳＮａとの比率で１モル％量のＮ−ヒドロキシエチルアクリルアミド（以下「ＨＥＡＡ」と略記する）（シグマ製）を使用し、また得られたビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり５重量％とした以外は実施例１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例２で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例３
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり１０重量％とした以外は実施例２と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例３で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例４
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり２０重量％とした以外は実施例２と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例４で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例５
ＨＥＡＡの使用量をＶＳＮａとの比率で５モル％量とし、また得られたビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり５重量％とした以外は実施例１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例５で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例６
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり１０重量％とした以外は実施例５と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例６で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例７
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり２０重量％とした以外は実施例５と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例６で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例８
ＨＥＡＡの使用量をＶＳＮａとの比率で１０モル％量とし、また得られたビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり５重量％とした以外は実施例１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例８で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例９
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり１０重量％とした以外は実施例８と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例９で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例１０
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり２０重量％とした以外は実施例８と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例１０で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例１１
ＨＥＡＡの使用量をＶＳＮａとの比率で２５モル％量とし、また得られたビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり３重量％とした以外は実施例１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例１１で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。

【0026】

実施例１２
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり５重量％とした以外は実施例１１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例１２で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。

【0027】

実施例１３
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり１０重量％とした以外は実施例１１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例１３で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。

【0028】

実施例１４
ビニルスルホン酸共重合体を製造するにあたり、ＶＳＮａとの比率で０．５モル％量のＨＥＭＡを使用し、また得られたビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり５重量％とした以外は実施例１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例１４で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例１５
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり１０重量％とした以外は実施例１４と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例１５で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。

【0029】

実施例１６
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり２０重量％とした以外は実施例１４と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例１６で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。

【0030】

実施例１７
ビニルスルホン酸共重合体を製造するにあたり、ＶＳＮａとの比率で５モル％量のＨＥＭＡを使用し、また得られたビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり５重量％とした以外は実施例１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例１７で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。

【0031】

実施例１８
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり１０重量％とした以外は実施例１７と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例１８で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。

【0032】

実施例１９
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり２０重量％とした以外は実施例１７と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例１９で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。

【0033】

実施例２０
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり２０重量％とし、加熱時間を５時間とした以外は実施例１７と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例２０で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例２１
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり５重量％とした以外は実施例１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例２１で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例２２
ビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり１０重量％とした以外は実施例１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。実施例２２で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
実施例２３
実施例１において、ＶＳＮａ２５％水溶液２０．０ｇ、Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（シグマ製、Ｔｒｉｓ−ＡＡ）０．５ｇ（ＶＳＮａとの比率で７．５モル％）を３０ｍＬガラス容器に入れ、直射日光下に３日間放置した以外は同様の操作を行って得たビニルスルホン酸共重合体を使用し、カチオン交換体を得た。実施例２３で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
比較例１
市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌ（登録商標） ＳＰ−ＮＰＲ）から粒子を取り出し、実施例１で使用したのと同一の４．６ｍｍ内径×５０ｍｍ長さのカラムに充填し、実施例１と同一の条件でタンパク質の分離能を測定した。操作圧は６．２ＭＰａと低操作圧であったが、保持力が弱く、溶出ピークの幅はブロードなものであった。結果を図１に示すとともに、操作圧とα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。
比較例２
市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌ（登録商標） ＳＰ−ＳＴＡＴ）から粒子を取り出し、実施例１で使用したのと同一の４．６ｍｍ内径×５０ｍｍ長さのカラムに充填し、実施例１と同一の条件でタンパク質の分離能を測定した。操作圧は１．６ＭＰａと低操作圧であったが、保持力が弱く、溶出ピークの幅はブロードなものであった。結果を図１に示すとともに、操作圧とα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示す。

【0034】

比較例３
ビニルスルホン酸共重合体を製造するにあたり、ＨＥＭＡに代えてＶＳＮａとの比率で３０モル％量のＨＥＡＡを使用し、また得られたビニルスルホン酸共重合体をエポキシ化非多孔性粒子に固定するにあたり、その使用量をエポキシ化非多孔性粒子の乾燥重量あたり２０重量％とした以外は実施例１と同様の操作を行い、カチオン交換体を得た。比較例３で製造したカチオン交換体に関し、固定したビニルスルホン酸共重合体の分子量とＶＳＮａの重合率、カチオン交換容量、操作圧そしてα−キモトリプシノーゲンＡを１０μＬ注入したときのピーク半値幅を表１に示すが、操作圧が高く、測定は困難であった。

【0035】

比較例４
実施例１で使用したエポキシ化非多孔性粒子４ｇ、デキストラン（分子量６００００）３ｇ、イオン交換水７ｇ及び水酸化ナトリウム６０μＬを容量４０ｍＬの遠心管にいれ、５０度に設定した水浴中で１６時間振盪した。得られた反応物を遠心して上澄を除去し、イオン交換水１０ｍＬを加えて分散後、更に遠心した。上澄の除去、イオン交換水の添加及び遠心からなる操作を合計３回繰り返し、上澄を除去後、遠心管にイオン交換水４．３ｇ、１，３プロパンスルトン１．２ｇ及び４８％水酸化ナトリウム水溶液１．５ｇを加え、撹拌した。反応液をガラスフィルターでろ過し、水、０．１Ｎ塩酸、０．１Ｎ水酸化ナトリウム、水の順で洗浄し、カチオン交換体を得た。

【0036】

得られたカチオン交換体を実施例１で使用したのと同一の４．６ｍｍ内径×５０ｍｍ長さのカラムに充填し、実施例１と同一の条件でタンパク質の分離を試みたが、操作圧が６０ＭＰａ以上となり、分離操作を実施することは困難であった。

【0037】

【表1】

【図1】

【図2】