特許 6061373 ２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物、これを含有するコラーゲン細胞外分泌阻害剤及び医薬品組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6061373

(24)【登録日】2016年12月22日

(45)【発行日】2017年1月18日

(54)【発明の名称】２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物、これを含有するコラーゲン細胞外分泌阻害剤及び医薬品組成物

(51)【国際特許分類】

   C07C 205/44 20060101AFI20170106BHJP

   A61K 31/11 20060101ALI20170106BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170106BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20170106BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20170106BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20170106BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20170106BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20170106BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20170106BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20170106BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20170106BHJP

   C07C 47/565 20060101ALI20170106BHJP

【ＦＩ】

   C07C205/44

   A61K31/11

   A61P43/00 111

   A61P1/16

   A61P1/18

   A61P9/00

   A61P9/10 101

   A61P13/12

   A61P11/00

   A61P7/00

   A61P17/00

   C07C47/565

【請求項の数】7

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2012-163835(P2012-163835)

(22)【出願日】2012年7月24日

(65)【公開番号】特開2014-24759(P2014-24759A)

(43)【公開日】2014年2月6日

【審査請求日】2015年7月21日

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】504322611

【氏名又は名称】学校法人 京都産業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100112874

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 薫

(74)【代理人】

【識別番号】100147865

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 美和子

(72)【発明者】

【氏名】夏目 徹

(72)【発明者】

【氏名】永田 和宏

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 進也

(72)【発明者】

【氏名】土井 隆行

(72)【発明者】

【氏名】吉田 将人

【審査官】 吉森 晃

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５０９６６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５２２０９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０４４７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１０−５０４８３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１３４４７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０７３６１６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０５６１５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５３４７７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５３０５０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 スイス国特許発明第００６４２０４３（ＣＨ，Ａ５）

【文献】 Shinde, Avinash T.; Zangade, Sainath B.; Chavan, Shivaji B.;，A practical iodination of aromatic compounds by using iodine and iodic acid，Synthetic Communications，２０１０年，40(23)，3506-3513

【文献】 El-Kabbani, Ossama; Scammells, Peter J.; Day, Tom; Dhagat, Urmi;，Structure-based optimization and biological evaluation of human 20α-hydroxysteroid dehydrogenase (AKR1C1) salicylic acid-based inhibitors，European Journal of Medicinal Chemistry ，２０１０年，45(11)，5309-5317

【文献】 Brooks, C. J. W.; Morman, J. F.，Infrared spectra of substituted salicylaldehydes，Journal of the Chemical Society，１９６１年，3372-81

【文献】 Buu-Hoi, Ng. Ph.; Loc, T. Ba; Xuong, Ng. Dat，Nuclear benzylation of salicylaldehyde and o-vanillin，Compt. rend.，１９５６年，242，1331-4

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記一般式（Ｉ）で示される２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物

（式（Ｉ）中、Ｒ_１は、水素原子、ハロゲン原子又はニトロ基を示す。
Ｒ_２は、ハロゲン原子、フェニル基又はベンジル基を示す。当該フェニル基又は当該ベンジル基の芳香環は、ハロゲン原子により置換されていてもよい。）
を有効成分とするコラーゲン細胞外分泌抑制剤。

【請求項2】

前記式（Ｉ）中、Ｒ_２が、フェニル基又はベンジル基である請求項１記載のコラーゲン細胞外分泌抑制剤。

【請求項3】

前記式（Ｉ）中、Ｒ_２が、ベンジル基であって塩素原子で置換されたものである、請求項１記載のコラーゲン細胞外分泌抑制剤。

【請求項4】

前記式（Ｉ）中、Ｒ_１がニトロ基又は臭素原子であり、Ｒ_２が無置換のベンジル基である請求項１記載のコラーゲン細胞外分泌抑制剤。

【請求項5】

Ｈｓｐ４７及び／又はＰ４Ｈとコラーゲン分子との相互作用を阻害する活性を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載のコラーゲン細胞外分泌抑制剤。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれかに記載のコラーゲン細胞外分泌抑制剤を含む、線維症用の医薬品組成物。

【請求項7】

肺線維症、肝線維症、膵嚢胞線維症、心臓繊維症、骨髄繊維症、腎線維症、動脈硬化症、強皮症、ケロイドからなる群より選択される一以上の線維症の治療及び／又は予防に用いられる請求項６記載の医薬品組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物、これを含有するコラーゲン細胞外分泌阻害剤及び医薬品組成物に関する。より詳しくは、コラーゲンの細胞外への分泌を抑制する作用を有する２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物等に関する。

【背景技術】

【0002】

線維症は、コラーゲンを主とする細胞外マトリクスが組織に過度に集積することによって組織が線維化して硬化し、組織あるいは臓器の機能低下を生じる疾患である。代表的な線維症としては、肺線維症及び肝線維症などがある。

【0003】

肺線維症では、炎症によって肺胞が破壊される。また、肝線維症では、ウイルス性肝炎、アルコール性肝障害等の種々の肝障害によって肝細胞が壊死する。これらの修復過程において線維芽細胞の増殖と細胞外マトリックスの過度な集積が生じることで、肺線維症あるいは肝線維症が引き起こされる。

【0004】

線維症を予防又は治療するためには、細胞外マトリクスの主成分であるコラーゲンの過剰な蓄積を抑制することが必要である。特許文献１及び特許文献２には、ある種のピリジン誘導体がコラーゲンの産生を抑制する効果を有し、線維症の疾患に有用であることが開示されている。また、特許文献３には、ある種のベンゼン誘導体が同様の効果を有することが記載されている。

【0005】

本発明に関連して、「ヒートショックプロテイン４７（Ｈｓｐ４７）」と「プロリン水酸化酵素（Ｐ４Ｈ）」について説明する。Ｈｓｐ４７は、小胞体に局在するコラーゲン特異的分子シャペロンであり、コラーゲンの分泌に必須である（非特許文献１参照）。正常なコラーゲンが細胞外に分泌されるためには、新規に合成されたコラーゲンが小胞体内で３重らせん構造を形成する必要がある。Ｈｓｐ４７は３重らせん構造に結合することで、その安定化に関与している。Ｈｓｐ４７の機能の阻害はコラーゲンの分泌阻害を引き起こす。このため、Ｈｓｐ４７は線維症治療薬の有望な創薬ターゲットと考えられている（非特許文献２参照）。

【0006】

Ｐ４Ｈ（Prolyl-4-hydroxylase）は、Ｈｓｐ４７とともにコラーゲンの細胞外分泌に必須のタンパク質である。Ｐ４Ｈは新規に合成されたコラーゲンのプロリン残基を水酸化する酵素である。プロリンの水酸化はコラーゲンの３重らせん構造形成に必須である。このため、Ｐ４Ｈも、線維症治療薬の有望な創薬ターゲットとされている（非特許文献３参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特表２００２−５０７６０１号公報

【特許文献2】特開２００１−８９４５０号公報

【特許文献3】特開２００１−８９４１２号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】"Embryonic Lethality of Molecular Chaperone Hsp47 Knockout Mice Is Associated with Defects in Collagen Biosynthesis." The Journal of Cell Biology, 2000, Vol.150, No.6, pp.1499-1505.

【非特許文献2】"Resolution of liver cirrhosis using vitamin A-coupled liposomes to deliver siRNA against a collagen-specific chaperone." Nature biotechnology, 2008, Vol.26, No.4, pp.431-442.

【非特許文献3】"Selective inhibition of hepatic collagen accumulation in experimental liver fibrosis in rats by a new prolyl 4-hydroxylase inhibitor." Hepatology, 1998, Vol.28, No.2, pp.404-411.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、コラーゲンの細胞外分泌を抑制可能な新規化合物を提供することを主な目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記課題解決のため、本発明は、下記一般式（Ｉ）で示される２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物を提供する。この２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物は、コラーゲンとＨｓｐ４７及びＰ４Ｈとの相互作用を阻害する活性を有し、Ｈｓｐ４７及びＰ４Ｈによるコラーゲンの細胞外分泌機能を阻害して、コラーゲンの細胞外分泌を抑制する作用を示す。従って、この２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物はコラーゲン細胞外分泌抑制剤の有効成分となり得る。

【0011】

【化1】

（式（Ｉ）中、Ｒ_１は、水素原子、ハロゲン原子又はニトロ基を示す。
Ｒ_２は、ハロゲン原子、フェニル基又はベンジル基を示す。当該フェニル基又は当該ベンジル基の芳香環は、ハロゲン原子により置換されていてもよい。）

【0012】

上記２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物において、Ｒ_２は、フェニル基又はベンジル基であることが活性上好ましく、ベンジル基又は塩素原子で置換されたベンジル基であることがさらに好ましい。
さらに、Ｒ_１がニトロ基又は臭素原子であり、Ｒ_２が無置換のベンジル基である２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物が活性上特に好ましい。

【0013】

また、本発明は、上記２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物を有効成分として含有するコラーゲン細胞外分泌抑制剤と、該コラーゲン細胞外分泌抑制剤を含む線維症用の医薬品組成物を提供する。

【0014】

本発明において、「線維症」には、コラーゲンを主とする細胞外マトリクスの組織中への集積とこれに伴う組織機能の低下を呈する疾患が広く包含されるものとし、具体的には肺線維症、肝線維症、膵嚢胞線維症、心臓繊維症、骨髄繊維症、腎線維症、動脈硬化症、強皮症、ケロイドなどが含まれるものとする。

【発明の効果】

【0015】

本発明により、コラーゲンの細胞外分泌を抑制可能な新規化合物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】被検化合物についてＨｓｐ４７とコラーゲンとの結合阻害活性を測定した結果を示す図面代用グラフである（試験例１）。

【図2】被検化合物の存在下で培養した繊維芽細胞における細胞外コラーゲン蓄積量を測定した結果を示す図面代用グラフである（試験例１）。

【図3】被検化合物の存在下で培養した繊維芽細胞における細胞内コラーゲン貯留量を測定した結果を示す図面代用グラフである（試験例１）。

【図4】化合物Ｄ及び化合物（Ｉ−１）についてＨｓｐ４７とコラーゲンとの結合阻害活性を測定した結果を示す図面代用グラフである（試験例２）。

【図5】化合物（Ｉ−１）についてＰ４Ｈとゼラチンとの結合阻害活性を測定した結果を示す図面代用グラフである（試験例２）。

【図6】化合物（Ｉ−１）のＨｓｐ４７及びＰ４Ｈに対する結合能を評価した結果を示す図面代用グラフである（試験例３）。

【図7】基質ペプチドの水酸化を指標として化合物（Ｉ−１）によるＰ４Ｈの酵素活性阻害作用を評価した結果を示す図面代用チャートである（試験例４）。

【図8】細胞内コラーゲンの水酸化を指標として化合物（Ｉ−１）によるＰ４Ｈの酵素活性阻害作用を評価した結果を示す図面代用写真である（試験例４）。

【図9】化合物（Ｉ−１）の存在下で培養した繊維芽細胞における細胞内（Ａ）及び細胞外（Ｂ）のコラーゲン量を測定した結果を示す図面代用グラフである（試験例５）。

【図10】化合物（Ｉ−１）の存在下で培養した繊維芽細胞のコラーゲンとラミニンの免疫染色像を示す図面代用写真である（試験例５）。

【図11】Ｈｓｐ４７とコラーゲンとの結合阻害活性を示す化合物（Ｉ−１）の類縁化合物の構造を説明する図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

【0018】

１．２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物
本発明者らは、化合物ライブラリーを用いてＨｓｐ４７とコラーゲンとの相互作用を阻害する活性を有する物質の探索を行った。その結果、下記一般式（Ｉ）で示される２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物（以下「化合物（Ｉ）」と称する）が、結合阻害活性を有することを見出した。化合物（Ｉ）は、Ｐ４Ｈとコラーゲンとの結合阻害活性も有し、Ｈｓｐ４７及びＰ４Ｈによるコラーゲンの細胞外分泌機能を阻害して、コラーゲンの細胞外分泌を抑制する作用を示した。

【0019】

【化2】

【0020】

化合物（Ｉ）において、Ｒ_１は、水素原子、ハロゲン原子又はニトロ基を示す。ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子であってよく、このうちフッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。Ｒ_１は、特に好適には臭素原子又はニトロ基である。

【0021】

また、Ｒ_２は、ハロゲン原子、フェニル基又はベンジル基を示す。ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子であってよく、このうち臭素原子が好ましい。

【0022】

フェニル基又はベンジル基の芳香環は、ハロゲン原子により置換されていてもよい。芳香環の置換基となるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子であってよいが、特には塩素原子とされる。

【0023】

Ｒ_２は、フェニル基又はベンジル基であることが好ましく、無置換のベンジル基又は塩素原子で置換されたベンジル基であることがより好ましく、無置換のベンジル基が特に好ましい。

【0024】

化合物（Ｉ）の具体例として「表１」に示す化合物が挙げられる。このうち、Ｒ_１がニトロ基であり、Ｒ_２が無置換のベンジル基である化合物（Ｉ−１）及びＲ_１が臭素原子であり、Ｒ_２が無置換のベンジル基である化合物（Ｉ−２）は、Ｈｓｐ４７とコラーゲンとの結合阻害活性の高さから特に好ましい。

【0025】

【表1】

【0026】

２．コラーゲン細胞外分泌抑制剤及び医薬品組成物
本発明に係るコラーゲン細胞外分泌抑制剤は、上記２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物を有効成分とし、Ｈｓｐ４７及び／又はＰ４Ｈとコラーゲン分子との相互作用を阻害する活性を有し、コラーゲンの細胞外分泌を抑制する作用を示す。コラーゲンの細胞外分泌を抑制できれば、細胞外マトリクスの組織中への過度な集積とこれに伴う組織機能の低下を防止又は軽減することが可能と考えられる。従って、このコラーゲン細胞外分泌抑制剤は、種々の線維症を治療又は予防するための医薬品組成物として利用され得る。

【0027】

医薬品組成物は、コラーゲン細胞外分泌抑制剤と薬理学的に許容される各種添加剤とにより製剤化される。添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射用溶剤等の添加剤を使用することが可能である。

【0028】

賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等のケイ酸塩誘導体；リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体が挙げられる。

【0029】

結合剤としては、例えば、上記賦形剤のほか、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイロウ等のワックス類；ホウ酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水ケイ酸、ケイ酸水和物等のケイ酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。注射用溶剤としては、例えば、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。

【0030】

医薬品組成物の投与経路としては、例えば、経口投与、経腸投与等の非経口投与が挙げられる。医薬品組成物の投与剤形としては、例えば、注射剤、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。また、医薬品組成物は飲食品又は飼料等に配合して投与することもできる。投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、年齢、性別、体重等により適宜設定され得る。

【実施例】

【0031】

＜実験例１＞
１．Ｈｓｐ４７とコラーゲンとの結合阻害活性を有する物質のスクリーニング
天然由来化合物と合成化合物とを含む化合物ライブラリーを用いて、Hsp47とコラーゲンとの結合阻害活性を有する物質の探索を行った。化合物ライブラリーは、放線菌（Actinomycetes）由来化合物を33,440種、真菌（Fungi）由来化合物を8,240種、その他の天然物由来化合物を640種、合成化合物を10,240種含む。

【0032】

（１）組換えＨｓｐ４７タンパクの発現・精製
大腸菌発現系を用いてリコンビナントHsp47（rHsp47）の発現と精製を行った。ベクター（pET21a, Invitrogen）にchick Hsp47をクローニングし、発現ベクター（pET21a-chick Hsp47）を作成した。発現ベクターを用いて大腸菌（BL21(DE3)株）を形質転換し、培養を行った。培養液にIPTGを添加し、Hsp47をヒスチジンタグ組換えタンパクとして発現させた。菌体を細胞溶解バッファー（20mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 50mM imidazole, 15% glycerol, 1%NP40）に懸濁し、リゾチームを加え、氷上で50分間撹拌した。懸濁液を超音波処理した後、遠心分離を行った。ヒスチジンタグ組換えタンパク用精製カラム、ゲル濾過カラム及び限外濾過ユニットを用い、定法に従って上清中からrHsp47を回収した。

【0033】

（２）表面プラズモン共鳴測定によるスクリーニング
ライブラリー化合物の存在下におけるrHsp47とコラーゲンとの相互作用をSPRバイオセンサー（BIAcore3000, BIACORE）を用いて測定した。コラーゲンをアミノカップリング法によりCM5センサーチップに固定した。rHsp47をランニングバッファー（0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% (v/v) SurfactantP20）を用いて6.6 microg/mlに調製した。また、ランニングバッファーを用いてライブラリー化合物（被検化合物）を40, 13, 4.4 microMに調製した。測定は、流速10 microl/min、相互作用時間150秒、乖離時間15秒、温度25℃の条件で行った。

【0034】

化合物の非存在下でのrHsp47とコラーゲンの結合量に対して、化合物の存在下で減少した結合量の比率を算出し、阻害率を得た。結果を図１に示す。化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃの存在下においてrHsp47とコラーゲンとの結合量の減少がみられ、これらの化合物がrHsp47とコラーゲンとの結合を阻害する活性を有していることが明らかとなった。化合物Ｃの構造のみを下記に示す。

【0035】

化合物Ｃ：

【化3】

【0036】

（３）細胞外コラーゲンの蓄積量の評価
シリウスレッドを用いて細胞外のコラーゲン量の評価を行った。Hsp47遺伝子がヘテロなマウス繊維芽細胞（+/−）をプレートに播種した。DMSOに50microMで溶解した化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃを培地に添加し、72時間培養した。培地を除いた後、PBSで２回洗浄し、ブアン液（75%ピクリン酸、10%ホルマリン、5%酢酸）で固定した。蒸留水で２回洗浄し、シリウスレッド溶液（0.1% シリウスレッド、ピクリン酸溶液）を加え、室温で１時間染色した。0.01N HClを用いて非特異的に吸着した色素を除いた後、0.1N NaOHを加えて色素を溶解させ、吸光度（570nm）を測定した。

【0037】

化合物の存在下と非存在下での吸光度比（存在下／非存在下）を、コラーゲン蓄積量として算出した。結果を図２に示す。全ての化合物について、その存在下でのコラーゲン蓄積量の減少がみられ、これらの化合物が細胞外コラーゲンの蓄積を抑制する活性を有していることが明らかとなった。

【0038】

さらに、パルスチェイス法により、細胞内へのコラーゲン貯留量の評価を行った。マウス繊維芽細胞を化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ（100 microM）存在下で1時間培養した。メチオニン及びシステインを含まない培地にて30分間培養を行った後、培地を³⁵S標識のメチオニン及びシステイン（Express³⁵S protein labeling mix, PerkinElmer Life Sciences）を終濃度4.1Mbq/mlで含む培地に交換し、20分間標識を行った。その後、非標識のメチオニン及びシステインを含む培地に交換し、一定時間培養を行った。

【0039】

培養後、培地回収後の細胞をPBSで洗浄後、タンパク質抽出バッファー（50mM Tris-HCl pH8.0, 0.15M NaCl, 5mM EDTA, 1% NP40）を加え、氷上で20分間静置した。その後、遠心分離を行って得た上清にサンプルバッファーと0.1M DTTを加えて5分間煮沸し、細胞成分サンプルとした。

【0040】

細胞成分サンプルについてSDS-PAGEを行い、FLA-7000（FujiFILM）を用いて³⁵S標識プロコラーゲンの放射活性を検出し、チェイス開始時に対する１時間後の放射活性比（１時間後／０時間）を算出した。プロコラーゲンのバンド位置の同定には免疫沈降法を用いた。結果を図３に示す。全ての化合物で、コントロールに比して細胞内に貯留する³⁵S標識プロコラーゲン量が増加し、特に化合物Ｃでは顕著な増加が認められた。このことから、化合物Ｃがコラーゲンの細胞外分泌を抑制する作用を有することが明らかとなった。

【0041】

以上、本試験例の結果から、化合物ＣがHsp47とコラーゲンとの結合を阻害し、Hsp47によるコラーゲンの細胞外分泌機能を阻害することによってコラーゲンの細胞外蓄積を抑制する可能性が示唆された。

【0042】

＜実験例２＞
２．化合物Ｃの分解産物の活性評価
化合物Ｃの分解産物である化合物Ｄ及び化合物（Ｉ−１）について、rHsp47とコラーゲンとの結合阻害活性を評価した。評価は、SPRバイオセンサーを用いて実験例１と同様にして行った。化合物Ｄ及び化合物（Ｉ−１）の構造を下記に示す。

【0043】

化合物Ｄ：

【化4】

【0044】

化合物（Ｉ−１）：

【化5】

【0045】

化合物Ｄ及び化合物（Ｉ−１）の阻害率を図４に示す。化合物（Ｉ−１）においてrHsp47とコラーゲンとの結合阻害活性が顕著に認められた。

【0046】

さらに、大部分がコラーゲンの単量体で占められるゼラチンを用い、P4Hとゼラチン（コラーゲン単量体）との結合阻害活性を評価した。P4Hには、ニワトリ胚から精製したタンパクを用いた。ニワトリ胚を氷冷したExtraction buffer（0.1 M NaCl, 0.1 M glycine, 10 microM DTT, 0.01 M Tris- HCl buffer pH 7.8, 0.1% TritonX100）に入れホモジェナイズを行った後、遠心分離を行って上清を回収した。硫安沈殿によりタンパクを濃縮した後、透析により塩を除去した。ポリLプロリンカラムに吸着させ、Enzyme buffer（0.1 M NaCl, 0.1 M glycine, 10 uM DTT, 0.01 M Tris- HCl buffer pH 7.8）で洗浄した後、poly(proline) （平均分子量7 kDa，Sigma）で溶出させた。イオン交換カラムとゲル濾過カラムを用いて溶出液中のP4Hを精製した。

【0047】

結果を図５に示す。化合物（Ｉ−１）は、2, 6, 17 microMの各濃度においてP4Hとゼラチンとの結合も阻害し得ることが明らかとなった。

【0048】

＜実験例３＞
３．化合物（Ｉ−１）のＨｓｐ４７及びＰ４Ｈに対する結合能の評価
化合物（Ｉ−１）のHsp47、P4H及びコラーゲンに対する結合能をSPRバイオセンサー（BIAcoreA100, BIACORE）を用いて評価した。rHsp47、P4H又はコラーゲンをCM5センサーチップに固定した。化合物（Ｉ−１）をランニングバッファー（0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% (v/v) Tween20）を用いて8.5、55.6、166.7 microMに調製した。測定は、流速10 microl/min、相互作用時間180秒、乖離時間30秒、温度25℃の条件で行った。

【0049】

結果を図６に示す。化合物（Ｉ−１）のHsp47及びP4Hへの結合量は濃度依存的に増加した。一方、化合物（Ｉ−１）はコラーゲンには結合しなかった。このことから、化合物（Ｉ−１）は、Hsp47及びP4Hに結合してこれらとコラーゲンとの結合を阻害することが示唆された。

【0050】

＜実験例４＞
４．化合物（Ｉ−１）のＰ４Ｈ酵素活性阻害作用の評価
（１）基質ペプチドの水酸化を指標とした評価
基質ペプチドの水酸化を指標として、化合物（Ｉ−１）のP4H酵素活性阻害作用を評価した。タンパク低吸着チューブに、酵素反応溶液（50mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 50microM FeSO4, 0.5mM a-ketoglutarate, 2mM ascorbic acid, 0.1mM DTT, BSA 2mg/mL, catalase 0.1mg/mL）を入れ、37℃でプレインキュベートした。酵素反応溶液に、50microMの基質ペプチド（(GPP)₁₀、ペプチド研究所）と精製P4H（100nM）及び被検化合物を200microM入れ、酵素反応を開始させた。

【0051】

0.5% trifluoroacetic acid（TFA）を反応容量に対し10%入れ、酵素反応を停止させた。遠心分離後の上清をHPLC（Shimadzu LC-10 system）で分析した。カラムには、Cosmosil5C₁₈-AR-IIカラム（4.6ID × 250mm,Nacalai）を用い、カラム温度は42℃，フロー速度は1 ml/minとし、溶出は溶液A（水,0.05%TFA）と溶液B（アセトニトリル, 0.05%TFA）のグラディエントにより行った。溶出したペプチドを分光光度計（検出波長220nm）で検出した。

【0052】

結果を図７に示す。化合物（Ｉ−１）の非存在下（陰性コントロール）では、溶出時間16.5〜21分の間に１〜６個の水酸基が付加された基質ペプチドに対応するピークが検出され、P4Hによる基質ペプチドの水酸化が進行していることが確認される。一方、化合物（Ｉ−１）の存在下では、α,α-dipyridylの存在下（陽性コントロール）と同様に、基質ペプチドに付加される水酸基数の減少が確認された。このことは、化合物（Ｉ−１）がP4Hの水酸化酵素活性を阻害することを示している。

【0053】

陽性コントロールに用いたα,α-dipyridylは鉄キレータである。P4Hによる水酸化反応には、補酵素として鉄が必須であり、α,α-dipyridylは、鉄をキレートしてP4Hの水酸化酵素活性を阻害する。なお、化合物（Ｉ−１）は、その化学構造から、鉄キレータとしては作用しないと推定される。

【0054】

（２）細胞内タンパクの水酸化を指標した評価
細胞内タンパクの水酸化を指標として、化合物（Ｉ−１）のP4H酵素活性阻害作用を評価した。実験例１と同様にパルスチェイス法を行って、細胞内タンパクの水酸化レベルを評価した。一定時間培養後の培地に、サンプルバッファー（0.125 M Tris-HCl pH 6.8, 4%SDS, 20% glycerol, 0.002% Bromophenol blue)と0.1M DTTを加えて5分間煮沸し、培地成分サンプルとした。培地回収後の細胞をPBSで洗浄後、タンパク質抽出バッファー（50mM Tris-HCl pH8.0, 0.15M NaCl, 5mM EDTA, 1% NP40）を加え、氷上で20分間静置した。その後、遠心分離を行って得た上清にサンプルバッファーと0.1M DTTを加えて5分間煮沸し、細胞成分サンプルとした。

【0055】

細胞成分サンプルについてSDS-PAGEを行い、FLA-7000（FujiFILM）を用いて³⁵S標識タンパクの放射活性の検出を行った。結果を図８に示す。化合物（Ｉ−１）の存在下で培養を行った細胞では、細胞内プロコラーゲンの分子量が濃度依存的に減少した。分子量の減少は、P4Hの酵素活性に必須のアスコルビン酸を除いた培地で培養を行った場合、及び、α,α-dipyridylの存在下で培養を行った場合と同程度であり、水酸化レベルの減少によるものと推察された。このことから、化合物（Ｉ−１）が細胞内のP4Hの酵素活性も阻害することが明らかとなった。なお、図中矢頭は、プロコラーゲンα１に相応する分子量のバンドを示す。

【0056】

＜試験例５＞
５．化合物（Ｉ−１）のコラーゲン細胞外分泌抑制作用の評価
（１）パルスチェイス法による評価
チェイス時間20、60分における細胞成分サンプル及び培地成分サンプルについてSDS-PAGEを行い、FLA-7000（FujiFILM）を用いてプロコラーゲンα１に相応する分子量のバンドから³⁵S標識タンパクの放射活性を検出し、解析を行った。結果を図９に示す。Ａは細胞成分サンプル、Ｂは培地成分サンプルの結果を示す。

【0057】

化合物による処置を行っていないサンプル（陰性コントロール１）及び実験例１におけるスクリーングでHsp47とコラーゲンとの結合阻害活性を示さなかった化合物を処置したサンプル（陰性コントロール２）では、時間経過に従って細胞内のプロコラーゲンα１が減少し、細胞外のプロコラーゲンα１が上昇しており、コラーゲンの細胞外分泌が生じていることが推定される。これに対して、化合物（Ｉ−１）を処置したサンプルでは、α,α-dipyridylを処置したサンプル（陽性コントロール）と同様に、細胞外のプロコラーゲンα１の経時増加が抑制され、細胞内に多量のプロコラーゲンα１が存在している。このことは、化合物（Ｉ−１）がコラーゲンの細胞外分泌を抑制する作用を有することを示すものである。

【0058】

（２）免疫染色による評価
マウス繊維芽細胞をカバーガラス上で培養した。培地を回収した後、4% PFA溶液にて細胞を固定し、標本とした。１次抗体としてウサギポリクローナル抗Ｉ型コラーゲン抗体及びポリクローナル抗Laminin抗体、２次抗体としてAlexaFluor488結合型抗体ウサギIgG抗体を用い、定法に従って免疫染色を行った。核染色にはHoechst 33342を用いた。

【0059】

共焦点顕微鏡で撮像した画像を図１０に示す。化合物（Ｉ−１）を処置した細胞では、細胞外基質としてラミニンの染色陽性像を認めるものの、細胞外コラーゲンの陽性像は、化合物による処置を行っていない細胞（陰性コントロール）に比して顕著に減少している。このことは、化合物（Ｉ−１）によってコラーゲンの細胞外分泌が特異的に抑制されることを示している。

【0060】

＜試験例６＞
６．類縁化合物の活性評価
化合物（Ｉ−１）と類似の構造を有する化合物について、rHsp47とコラーゲンとの結合阻害活性を、実験例１と同様にSPRバイオセンサーを用いて評価した。

【0061】

活性が認められた類縁化合物の構造を図１１に示す。これらのうち、化合物（Ｉ−９）は高い活性を示し、化合物（Ｉ−１）と同程度の活性を示した。

【産業上の利用可能性】

【0062】

本発明に係る２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物は、コラーゲンとＨｓｐ４７及びＰ４Ｈとの相互作用を阻害する活性を有し、コラーゲンの細胞外分泌を抑制する作用を示す。従って、この２−ヒドロキシベンズアルデヒド化合物は、種々の線維症を治療又は予防するための医薬品組成物として利用され得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図5】

【図7】

【図9】

【図11】

【図4】

【図6】

【図8】

【図10】