特許 6064183 還元酵素遺伝子増幅用プライマーセット、および還元酵素遺伝子取得方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6064183

(24)【登録日】2017年1月6日

(45)【発行日】2017年1月25日

(54)【発明の名称】還元酵素遺伝子増幅用プライマーセット、および還元酵素遺伝子取得方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170116BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20170116BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170116BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/02

   C12N1/21

【請求項の数】17

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2013-40378(P2013-40378)

(22)【出願日】2013年3月1日

(65)【公開番号】特開2014-168387(P2014-168387A)

(43)【公開日】2014年9月18日

【審査請求日】2016年1月18日

(73)【特許権者】

【識別番号】000002093

【氏名又は名称】住友化学株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100124062

【弁理士】

【氏名又は名称】三上 敬史

(74)【代理人】

【識別番号】100113000

【弁理士】

【氏名又は名称】中山 亨

(74)【代理人】

【識別番号】100151909

【弁理士】

【氏名又は名称】坂元 徹

(73)【特許権者】

【識別番号】515157758

【氏名又は名称】公立大学法人 富山県立大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100124062

【弁理士】

【氏名又は名称】三上 敬史

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 伸哉

(72)【発明者】

【氏名】黒川 純司

(72)【発明者】

【氏名】朝子 弘之

【審査官】 飯室 里美

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−１７７７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−２６１０４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PNAS, 2012, Vol.109, p.19220-19225

【文献】 Nucleic Acids Research, 2007, Vol.35, e45

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｎ ９／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

還元酵素をコードする核酸を取得する方法であって、
（１）配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＤＮＡ試料を鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程；
（２）前記増幅産物と、環状化すると宿主細胞において発現ベクターとして機能可能な二本鎖線状ベクターＤＮＡとを、内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下で融合させて、前記増幅産物を含有する環状組換え発現ベクターを得る工程、
ここで、前記二本鎖線状ベクターＤＮＡを構成する２本の鎖の一方は、その５’末端に配列番号６で示される塩基配列を有し、その３’末端に配列番号７で示される塩基配列を有し、配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列を宿主細胞において発現可能とする塩基配列と、宿主細胞において機能可能な複製起点またはその相補配列とを、配列番号７で示される塩基配列の５’上流に有する一本鎖ＤＮＡである；
（３）前記環状組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を得る工程；
（４）前記形質転換体又はその処理物が、基質を還元する活性を測定し、当該活性を有する形質転換体を選抜する工程；及び
（５）工程（４）で選抜された形質転換体から、前記活性を有する還元酵素をコードする核酸を得る工程；
を含む方法。

【請求項2】

前記一本鎖ＤＮＡが、その３’末端において、配列番号８で示される塩基配列の３’下流に連続して配列番号７で示される塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡである請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記一本鎖ＤＮＡが、配列番号３で示される塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡである請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＤＮＡ試料が、環境サンプル由来の環境ＤＮＡである請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

基質を還元する活性が、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する活性である請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

宿主細胞が大腸菌である請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット。

【請求項8】

環状化すると宿主細胞において発現ベクターとして機能可能な二本鎖線状ベクターＤＮＡであって、当該ＤＮＡを構成する２本の鎖の一方が、その５’末端に配列番号６で示される塩基配列を有し、その３’末端に配列番号７で示される塩基配列を有し、配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列を宿主細胞において発現可能とする塩基配列と、宿主細胞において機能可能な複製起点またはその相補配列とを、配列番号７で示される塩基配列の５’上流に有する一本鎖ＤＮＡである二本鎖線状ベクターＤＮＡ。

【請求項9】

以下の群から選ばれるタンパク質：
（ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する活性を有するタンパク質；及び
（ｃ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する活性を有するタンパク質。

【請求項10】

請求項９に記載のタンパク質をコードする核酸。

【請求項11】

配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７のいずれかで示される塩基配列を有する請求項１０に記載の核酸。

【請求項12】

請求項１０又は請求項１１に記載の核酸を含有する組換えベクター。

【請求項13】

請求項１０又は請求項１１に記載の核酸の上流に、宿主細胞において機能可能なプロモーターが機能可能な形で結合されてなる請求項１２に記載の組換えベクター。

【請求項14】

宿主細胞内で複製可能なベクターに、請求項１０又は請求項１１に記載の核酸を組込むことを特徴とするベクターの製造方法。

【請求項15】

請求項１０もしくは請求項１１に記載の核酸又は請求項１２もしくは請求項１３に記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。

【請求項16】

宿主細胞が大腸菌である請求項１５記載の形質転換体。

【請求項17】

請求項１０もしくは請求項１１に記載の核酸又は請求項１２もしくは請求項１３に記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、還元酵素をコードする核酸を取得する方法、及び、当該方法により得られる還元酵素をコードする核酸等に関する。

【背景技術】

【0002】

還元酵素は、基質を還元する能力を有し、近年、例えば、医農薬の有効成分となる化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用されている。例えば、特許文献１には、ライフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｓｐ．）属の微生物から還元酵素をコードする核酸をクローニングし、当該還元酵素を発現する形質転換体を用いて光学活性アルコールを製造する方法が開示されている。
このような工業的に利用される還元酵素としては、温度、pＨ、溶媒、圧力等に対する安定性が高いことが望ましい。例えば、有機溶媒に対する安定性が高いと、反応時間の短縮や反応効率の向上が期待できる。また、温度に対する安定性（即ち、熱安定性）が高いと、反応温度を高くすることが可能となり、反応速度を高めるだけでなく、反応中の還元酵素の失活を軽減することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００４−２６１０４２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

従来のスクリーニング方法によって微生物から目的の還元酵素を見出すには、純粋培養が可能な微生物を培養し、標的とする特定の基質を分解又は変換する微生物をスクリーニングする必要があった。純粋培養可能な微生物は土壌等の環境中に存在する全微生物の１％足らずであると言われていることから、従来のスクリーニング法であると還元酵素のスクリーニング源は環境中の微生物の約１％しかないことになる。また、上記の従来のスクリーニング法では、種類の異なる多数の微生物を各々に適した条件で培養する必要があり、かなりの労力と時間を要する場合がある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本願発明は、還元酵素をコードする核酸を効率的に取得する方法、当該方法により取得され得る還元酵素をコードする核酸等を提供する。
すなわち、本発明は、
１．還元酵素をコードする核酸を取得する方法であって、
（１）配列番号１で示される塩基配列(５’−ｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔｖａｃｍｇｇｍｇｓｍｇ−３’)を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で示される塩基配列（５’−ｃｇｇｔｃａｃｔｇｇｇｃｇｇｔｒｔａｂｃｃｒｃｃｒｔｃｂ−３’）を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＤＮＡ試料を鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程；
（２）前記増幅産物と、環状化すると宿主細胞において発現ベクターとして機能可能な二本鎖線状ベクターＤＮＡとを、内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下で融合させて、前記増幅産物を含有する環状組換え発現ベクターを得る工程、ここで、前記二本鎖線状ベクターＤＮＡを構成する２本の鎖の一方は、その５’末端に配列番号６で示される塩基配列（５’−ａｃｃｇｃｃｃａｇｔｇａ−３’)を有し、その３’末端に配列番号７で示される塩基配列（５’−ａｔｇｇｃｔｃａｇｔａｃｇａｃｇｔｃｇｃｃｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔ−３’）を有し、配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列を宿主細胞において発現可能とする塩基配列と、宿主細胞において機能可能な複製起点またはその相補配列とを、配列番号７で示される塩基配列の５’上流に有する一本鎖ＤＮＡである；
（３）前記環状組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を得る工程；
（４）前記形質転換体又はその処理物が、基質を還元する活性を測定し、当該活性を有する形質転換体を選抜する工程；及び
（５）工程（４）で選抜された形質転換体から、前記活性を有する還元酵素をコードする核酸を得る工程；
を含む方法（以下、本発明核酸取得方法と記すこともある。）；
２．前記一本鎖ＤＮＡが、その３’末端において、配列番号８で示される塩基配列（５’−ａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔ−３’）の３’下流に連続して配列番号７で示される塩基配列（５’−ａｔｇｇｃｔｃａｇｔａｃｇａｃｇｔｃｇｃｃｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔ−３’)を有する一本鎖ＤＮＡである前項１に記載の方法；
３．前記一本鎖ＤＮＡが、配列番号３で示される塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡである前項１または２に記載の方法；
４．前記ＤＮＡ試料が、環境サンプル由来の環境ＤＮＡである前項１から３のいずれか一項に記載の方法；
５．基質を還元する活性が、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する活性である前項１から４のいずれか一項に記載の方法；
６．宿主細胞が大腸菌である前項１から５のいずれか一項に記載の方法；
７．配列番号１で示される塩基配列（５’‐ｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔｖａｃｍｇｇｍｇｓｍｇ−３’）を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で示される塩基配列（５’−ｃｇｇｔｃａｃｔｇｇｇｃｇｇｔｒｔａｂｃｃｒｃｃｒｔｃｂ−３’）を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット（以下、本発明プライマーセットと記すことがある。）；
８．環状化すると宿主細胞において発現ベクターとして機能可能な二本鎖線状ベクターＤＮＡであって、当該ＤＮＡを構成する２本の鎖の一方が、その５’末端に配列番号６で示される塩基配列（５’−ａｃｃｇｃｃｃａｇｔｇａ−３’）を有し、その３’末端に配列番号７で示される塩基配列（５’−ａｔｇｇｃｔｃａｇｔａｃｇａｃｇｔｃｇｃｃｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔ−３’)を有し、配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列を宿主細胞において発現可能とする塩基配列と、宿主細胞において機能可能な複製起点またはその相補配列とを、配列番号７で示される塩基配列の５’上流に有する一本鎖ＤＮＡである二本鎖線状ベクターＤＮＡ；
９．以下の群から選ばれるタンパク質：
（ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する活性を有するタンパク質；及び
（ｃ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する活性を有するタンパク質；
１０．前項９に記載のタンパク質をコードする核酸；
１１．配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７のいずれかで示される塩基配列を有する前項１０に記載の核酸；
１２．前項１０又は前項１１に記載の核酸を含有する組換えベクター；
１３．前項１０又は前項１１に記載の核酸の上流に、宿主細胞において機能可能なプロモーターが機能可能な形で結合されてなる前項１２に記載の組換えベクター；
１４．宿主細胞内で複製可能なベクターに、前項１０又は前項１１に記載の核酸を組込むことを特徴とするベクターの製造方法；
１５．前項１０もしくは前項１１に記載の核酸又は前項１２もしくは前項１３に記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
１６．宿主細胞が大腸菌である前項１５記載の形質転換体；及び
１７．前項１０もしくは前項１１に記載の核酸又は前項１２もしくは前項１３に記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法；
等を提供する。

【発明の効果】

【0006】

本願発明により、還元酵素をコードする核酸の効率的な取得方法が提供可能となり、例えば、環境中に存在する微生物由来の環境ＤＮＡから取得される、有機溶媒に対する安定性や熱安定性に優れた還元酵素をコードする核酸等が提供可能となる。

【発明を実施するための形態】

【0007】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0008】

本発明プライマーセットについて説明する。
本発明プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド１及び配列番号２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２からなる。
配列番号１：５’−ＧＡＣＣＧＧＴＣＣＧＣＧＡＴＣＧＴＶＡＣＭＧＧＭＧＳＭＧ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＧＴＣＡＣＴＧＧＧＣＧＧＴＲＴＡＢＣＣＲＣＣＲＴＣＢ−３’
ここで、Ｒはアデニン又はグアニン、Ｍはアデニン又はシトシン、Ｓはシトシン又はグアニン、Vはアデニン又はシトシン又はグアニン、Bはシトシン又はグアニン又はチミンを示す。

【0009】

上記オリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２はそれぞれ、配列番号１又は２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの全ての組み合わせからなる混合物（ミックスオリゴヌクレオチド、縮重オリゴヌクレオチド）であることが好ましい。

【0010】

上記オリゴヌクレオチド１としては配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられ、上記オリゴヌクレオチド２としては配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。また、上記オリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２は、上記配列番号１又は２で示される塩基配列の５’末端側に、制限酵素サイトを含む塩基配列等が付加されたオリゴヌクレオチドであってもよい。制限酵素サイト（制限酵素認識配列）は、当業者にとって公知の配列を適宜、選択することができる。また、制限酵素サイトの５’末端側にさらに数個の塩基を含んでもよい。制限酵素サイトのさらに５’末端側に付加する塩基の数としては、一般的には、３塩基以上あれば、制限酵素で効率よく切断することができ、適宜、所望の制限酵素が制限酵素サイトを効率的に切断できる塩基数を選択することができる。制限酵素による切断配列を含むように付加される塩基配列としては、還元酵素遺伝子に特異的であり、他の酵素遺伝子と相同性の少ない配列を選択することが望ましい。また、プライマーセットの各プライマーが互いにハイブリダイゼーションを起こさないように、還元酵素遺伝子に対するハイブリダイゼーション能を保持する範囲内で、末端配列が付加されることが好ましい。上記オリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２は、その配列の長さが１５〜５０塩基である一本鎖のオリゴヌクレオチドである。上記オリゴヌクレオチド１及びオリゴヌクレオチド２は、ミックスプライマー、縮重プライマーとして用いることができる。

【0011】

具体的には、本発明プライマーセットとしては、
配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。

【0012】

本発明プライマーセットとしては、
配列番号１で示される塩基配列の５’末端側に、制限酵素サイトを含む塩基配列が付加されたオリゴヌクレオチド、及び、配列番号２に記載の塩基配列の５’末端側に、制限酵素サイトを含む塩基配列が付加されたオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを挙げることもできる。

【0013】

本発明のオリゴヌクレオチド及びプライマーセットによれば、還元酵素のアミノ酸配列をコードする核酸を効率的に取得できる。例えば、環境中に存在し単離培養の困難な微生物に由来する還元酵素のアミノ酸配列をコードする核酸も効率的に取得できる。本発明プライマーセットの各オリゴヌクレオチドの５’末端側に制限酵素サイトを含む塩基配列が付加されていると、取得した核酸のクローニングや、還元酵素をコードする核酸を含む組み換えベクターの構築等に便利である。

【0014】

本発明核酸取得方法について説明する。
本発明核酸取得方法は、還元酵素をコードする核酸を取得する方法であって、
（１）配列番号１で示される塩基配列（５’−ｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔｖａｃｍｇｇｍｇｓｍｇ−３’）を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で示される塩基配列（５’−ｃｇｇｔｃａｃｔｇｇｇｃｇｇｔｒｔａｂｃｃｒｃｃｒｔｃｂ−３’）を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＤＮＡ試料を鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程；
（２）前記増幅産物と、環状化すると宿主細胞において発現ベクターとして機能可能な二本鎖線状ベクターＤＮＡとを、内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下で融合させて、前記増幅産物を含有する環状組換え発現ベクターを得る工程、
ここで、前記二本鎖線状ベクターＤＮＡを構成する２本の鎖の一方は、その５’末端に配列番号６で示される塩基配列（５’−ａｃｃｇｃｃｃａｇｔｇａ−３’）を有し、その３’末端に配列番号７で示される塩基配列（５’−ａｔｇｇｃｔｃａｇｔａｃｇａｃｇｔｃｇｃｃｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔ−３’）を有し、配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列を宿主細胞において発現可能とする塩基配列と、宿主細胞において機能可能な複製起点またはその相補配列とを、配列番号７で示される塩基配列の５’上流に有する一本鎖ＤＮＡである；
（３）前記環状組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を得る工程；
（４）前記形質転換体又はその処理物が、基質を還元する活性を測定し、当該活性を有する形質転換体を選抜する工程；及び
（５）工程（４）で選抜された形質転換体から、前記活性を有する還元酵素をコードする核酸を得る工程；
を含む方法である。

【0015】

上記（１）の工程は、本発明プライマーセットを用い、ＤＮＡ試料を鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程である。上記ＤＮＡ試料としては、環境サンプル由来の環境ＤＮＡが挙げられる。

【0016】

本発明において「環境」とは、土壌、堆肥、汚泥、下水、河川、湖沼、海水、海底、昆虫、動物、及び植物の固体の組織内部及び表面、並びに、排泄物等、微生物の生育環境を意味する。「環境サンプル」とは、環境から採取されたサンプルであり、具体的には、土壌、堆肥等から採取されたサンプルが挙げられる。「環境ＤＮＡ」とは環境サンプルから得られるＤＮＡを意味する。環境ＤＮＡの抽出方法としては、例えば、５ｇの土壌サンプルを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ８）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、及び１％ ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）を含む抽出溶液１３．５ｍｌと１００μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液に懸濁し、３７℃で３０分間振とうした後、２０％ＳＤＳ水溶液を１．５ｍｌ添加し、６５℃、２時間抽出した後、クロロホルム／イソアミルアルコール処理を行って得られる上清液からＤＮＡを取得する方法（Appl. Environ. Microbiol., 62(2):316,1996）や、土壌ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ、ニッポンジーン社製）を用いてそのマニュアルにしたがって調製する方法が挙げられ、環境サンプル中に存在する微生物中のＤＮＡを抽出することができればいかなる手段を用いてもよい。

【0017】

核酸増幅反応としては、当業者にとって公知の方法を用いることができ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。例えば、環境ＤＮＡを鋳型として、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行い増幅産物を得る。ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２００μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々８０ｐｍｏｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．５Ｕ及び鋳型となるＤＮＡ試料を混合した反応液を９４℃で２分間保温した後、９４℃で０．５分間次いで６９℃で１分間次いで７２℃で１分間の保温サイクルを４０回行い、さらに７２℃で１０分間保温する条件が挙げられる。増幅産物が得られたことを確認する方法としては、アガロースゲル電気泳動法等が挙げられる。

【0018】

上記（１）の工程で得られる増幅産物には、所望の還元酵素のアミノ酸配列をコードする核酸が含まれることが期待できる。そのような還元酵素のアミノ酸配列をコードする核酸の単離及び同定は、以下のようにして行うことができる。まず、上記増幅産物を、環状化すると宿主細胞において発現ベクターとして機能可能な二本鎖線状ベクターＤＮＡと融合させて、組換え発現ベクターを構築する（工程（２））。次いで、得られた組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する（工程（３））。得られた形質転換体又はその処理物を用いて基質を還元する活性を測定し、当該活性を有する形質転換体を選抜する（工程（４））。選抜された形質転換体から、前記活性を有する還元酵素をコードする核酸を得る（工程（５））。

【0019】

以下に、工程（２）〜（５）について説明する。
（２）の工程は、上記増幅産物と、環状化すると宿主細胞において発現ベクターとして機能可能な二本鎖線状ベクターＤＮＡとを、内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下で融合させて、前記増幅産物を含有する環状組換え発現ベクターを得る工程である。

【0020】

本発明核酸取得方法で用いられる上記「環状化すると宿主細胞において発現ベクターとして機能可能な二本鎖線状ベクターＤＮＡ」は、環状化すると宿主細胞において発現ベクターとして機能可能な二本鎖線状ベクターＤＮＡであって、当該ＤＮＡを構成する２本の鎖の一方が、その５’末端に配列番号６で示される塩基配列(５’−ａｃｃｇｃｃｃａｇｔｇａ−３’)を有し、その３’末端に配列番号７で示される塩基配列（５’−ａｔｇｇｃｔｃａｇｔａｃｇａｃｇｔｃｇｃｃｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔ−３’）を有し、配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列を宿主細胞において発現可能とする塩基配列と、宿主細胞において機能可能な複製起点またはその相補配列とを、配列番号７で示される塩基配列の５’上流に有する一本鎖ＤＮＡである二本鎖線状ベクターＤＮＡ（以下、本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡと記すこともある。）である。
配列番号６で示される塩基配列（５’−ａｃｃｇｃｃｃａｇｔｇａ−３’)及び配列番号７で示される塩基配列（５’−ａｔｇｇｃｔｃａｇｔａｃｇａｃｇｔｃｇｃｃｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔ−３’)はそれぞれ、工程（１）で用いられる本発明プライマーセットのオリゴヌクレオチドの塩基配列とオーバーラップする配列を含む。従って、工程（１）で得られた増幅産物と本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡとは、それぞれの末端に同じ塩基配列を有する。このような増幅産物と本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡとを、内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下で当該ＤＮＡポリメラーゼが活性を示し得る条件下にインキュベートすると、前記ＤＮＡポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性によって、前記増幅産物と本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡの３’末端からヌクレオチドが除去されていく。これにより、前記増幅産物と本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡ上に互いに相補的な一本鎖領域が生じ、これら相補的な一本鎖領域間の塩基対合によって前記増幅産物と本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡとがアニールする。その結果、前記増幅産物を含有する環状組換え発現ベクターが得られる。
このような、ベクターＤＮＡと挿入ＤＮＡの末端に存在する相同な塩基配列間を融合させる反応に使用される、内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、ポックスウイルスＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、市販のキット（例えば、In Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製））等を利用することもできる。

【0021】

本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡにおいて、「配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列を宿主細胞において発現可能とする塩基配列」としては、配列番号７で示される塩基配列を宿主細胞において転写可能とするプロモーター配列、及び、配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列を宿主細胞において翻訳可能とするリボソーム結合配列が挙げられる。
大腸菌において機能可能なプロモーターとしては、例えば、ｌａｃプロモーターやｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーターを挙げることができる。
大腸菌等の原核生物で機能可能なリボソーム結合配列としてはＳＤ配列が挙げられる。発現量を向上させるために、ＳＤ配列と開始コドンの距離や、プロモーターと開始コドンの距離を工夫することもできる。例えば、ＳＤ配列と開始コドンの距離を５ヌクレオチド以上１３ヌクレオチド以下にするとよい。ＳＤ配列から開始コドンまでの塩基配列としては、例えば、配列番号８で示される塩基配列（５’−ａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔ−３’）が挙げられる。
宿主細胞において機能可能な複製起点としては、宿主細胞において利用可能な通常のベクターの複製起点を挙げることができる。例えば、大腸菌で機能可能な複製起点としては、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＩＩ（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア社製）、ｐＫＫ２２３−３（ＧＥヘルスケア社製）等の市販のベクターに含まれる複製起点を挙げることができる。
本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡを構成する２本の鎖のうち、その３’末端に配列番号７で示される塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡにおいて、上記の「配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列を宿主細胞において発現可能とする塩基配列」及び「宿主細胞において機能可能な複製起点またはその相補配」は、配列番号７で示される塩基配列の５’上流の、それぞれが機能可能な位置に存在する。
本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡとしては、具体的には、当該二本鎖線状ベクターＤＮＡを構成する２本の鎖の一方が、その３’末端において、配列番号８で示される塩基配列（５’−ａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔ−３’）の３’下流に連続して配列番号７で示される塩基配列（５’−ａｔｇｇｃｔｃａｇｔａｃｇａｃｇｔｃｇｃｃｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔ−３’）を有する一本鎖ＤＮＡである二本鎖線状ベクターＤＮＡを挙げることができる。すなわち、前記一本鎖ＤＮＡは、その３’末端に、配列番号２９で示される塩基配列（５’−ａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇｇｃｔｃａｇｔａｃｇａｃｇｔｃｇｃｃｇａｃｃｇｇｔｃｃｇｃｇａｔｃｇｔ−３’）を有する。
本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡとして、より具体的には、当該二本鎖線状ベクターＤＮＡを構成する２本の鎖の一方が配列番号３で示される塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡである二本鎖線状ベクターＤＮＡを挙げることができる。
本発明二本鎖線状ベクターＤＮＡは、後述の実施例に記載の方法等により作製することができる。

【0022】

工程（２）で得られる環状組換え発現ベクターは、例えば、配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列と、工程（１）で得られた増幅産物がコードする所望の還元酵素のアミノ酸配列とが融合してなる還元酵素を宿主細胞において発現させることができる。

【0023】

（３）の工程は、工程（２）で得られた環状組換え発現ベクター（以下、本発明環状組換え発現ベクターと記すことがある。）を宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程である。
宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物等が挙げられる。上記宿主細胞としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。大腸菌としては、Ｋ−１２由来株が好ましく、具体的にはＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１株、ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＤＨ１株、ＭＶ１１８４株、ＪＭ１０５株、ＭＣ１０６１株、Ｃ６００株等が例示される。

【0024】

本発明環状組換え発現ベクターを宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−X等に記載される塩化カルシウム法や、「ＭＥＴＨＯＤＳ ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｕｌｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ」 Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法等を挙げることができる。

【0025】

本発明環状組換え発現ベクター等が導入された形質転換体は、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜することができる。

【0026】

（４）の工程は、工程（３）で得られた形質転換体又はその処理物が、基質を還元する活性を測定し、当該活性を有する形質転換体を選抜する工程である。
形質転換体が還元酵素をコードする核酸を保有していることは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション等を行うことによっても、確認することができる。

【0027】

形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。

【0028】

炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、スクロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。

【0029】

窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のナトリウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。

【0030】

有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。

【0031】

さらに、アロラクトースで誘導されるタイプのｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター等と還元酵素をコードする核酸とが機能可能な形で接続された本発明環状組換え発現ベクターが導入された形質転換体の場合には、還元酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。

【0032】

本発明環状組換え発現ベクターを保有する形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養、及び、固体培養が挙げられる。

【0033】

培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５〜約４０℃である。培地のｐＨは約６〜約８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日間〜約５日間が好ましい。

【0034】

活性を検出するために用いる形質転換体又はその処理物としては、例えば、形質転換体の培養物、生形質転換体、破砕物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質、及び、これらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に還元酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に還元酵素等を閉じ込める方法）が挙げられる。

【0035】

基質を還元する活性は、以下の方法により検出することができる。例えば、上記の形質転換体又はその処理物を、基質及びＮＡＤＨと混合して３０℃で保温し、消費されるＮＡＤＨ量を反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより還元活性を測定する。基質としては、アセトフェノン、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、ｎ−バレルアルデヒド、４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル、４’−クロロアセトフェノン、３−メチル−２−オキソ酪酸エチルエステル、２−ヘプタノン、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ｎ−ヘプチルアルデヒド、ベンゾイルギ酸エチル、プロピオンアルデヒド、１−フェニル−２−ブタノン、ｎ−ブチルアルデヒド、３−オキソ酪酸エチル等が挙げられる。例えば、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する能力を指標にして、還元活性を有する形質転換体を選抜する。

【0036】

（５）の工程は、工程（４）で選抜された形質転換体から、前記活性を有する還元酵素をコードする核酸を得る工程である。
還元酵素をコードする核酸の塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ ｅｒ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７） ７４：５４６３−５４６７頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、ライフテクノロジーズ社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ等の市販の試薬を用いてもよい。

【0037】

本発明核酸取得方法を用いることにより、還元酵素をコードする核酸を効率的に取得することができる。また、本発明は、本発明核酸取得方法で得られる還元酵素をコードする核酸、還元酵素、還元酵素をコードする核酸を含む組換えベクター、及び、それを含む形質転換体等が提供可能となる。

【0038】

本発明の還元酵素、還元酵素をコードする核酸、還元酵素をコードする核酸を含む組換えベクター、及び、それを含む形質転換体について説明する。

【0039】

本発明の還元酵素は、以下の群から選ばれるタンパク質：
（ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する活性を有するタンパク質；及び
（ｃ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６または２８のいずれかで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する活性を有するタンパク質；
である。

【0040】

上記の（ｂ）及び（ｃ）に示されるタンパク質のアミノ酸配列において、（ａ）に示されるタンパク質のアミノ酸配列との間に認められることのある相違は、一部のアミノ酸の欠失、挿入、置換、付加等である。これらには、例えば、上記（ａ）で示される蛋白質が細胞内で受けるプロセシングによる欠失が含まれる。また、該蛋白質が由来する生物の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異や、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、突然変異処理等によって人為的に導入される遺伝子変異等により生じるアミノ酸の欠失、置換、付加等が含まれる。
かかる欠失、挿入、置換、付加等を受けるアミノ酸の数は、当該タンパク質が2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する活性を発揮することのできる範囲内の数であれば良い。上記（ｂ）における「数個のアミノ酸」としては、例えば、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、もしくは２５個のアミノ酸が挙げられる。
アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への保存的置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。
かかるアミノ酸の欠失、挿入、付加若しくは置換（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う手法としては、例えば、上記（ａ）に示されるタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対して部位特異的変異導入を施し、その後このポリヌクレオチドを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
アミノ酸の改変を人為的に行う手法としては、例えば、上記（ａ）に示されるタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してランダムに変異導入を施し、その後このポリヌクレオチドを常法により発現させる手法も挙げられる。ここでランダムに変異を導入する手法としては、例えば、上記のアミノ酸配列のいずれかをコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、それぞれのポリヌクレオチドの全長を増幅できるようなプライマー対を用い、基質に用いるdATP、dTTP、dGTP、dCTPの各々の添加濃度を通常とは変化させた反応条件や、或いはポリメラーゼの反応を促進させるMg^２＋の濃度を通常よりも増加させた反応条件でＰＣＲを行う方法等が挙げられる。このようなＰＣＲの手法としては、例えば、Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112 に記載される方法があげられる。また、WO0009682号公報に記載される方法をあげることもできる。

【0041】

「配列同一性」とは、２つの塩基配列又は２つのアミノ酸配列間の同一性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、FASTA［Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，4, 2444-2448(1988)］、BLAST［Altschulら、Journal of Molecular Biology, 215, 403-410(1990)］、CLUSTAL W［Thompson,Higgins＆Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680(1994a)］等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、DNA Data Bank of Japan［国立遺伝学研究所 生命情報・ＤＤＢＪ研究センター (Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan ；CIB/DDBJ)内で運営される国際ＤＮＡデータバンク］のホームページ等において、一般的に利用可能である。また、配列同一性は市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。具体的には例えば、GENETYX-WIN Ver.5（ソフトウェア開発株式会社製）」を用い、Lipman-Pearson法［Lipman, D. J. and Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441,(1985)］により相同性解析を行ってアラインメントを作成することにより算出することができる。
上記（ｃ）に記載の「９０％以上の配列同一性」としては、例えば９０、９５、９８、または９９％以上の配列同一性が挙げられる。

【0042】

本発明の還元酵素をコードする核酸は、上記の（ａ）から（ｃ）に示されるタンパク質をコードする核酸（以下、本発明核酸と記すこともある。）である。
本発明の還元酵素をコードする核酸としては、具体的には、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７のいずれかで示される塩基配列を有する核酸を挙げることができる。

【0043】

本発明の還元酵素をコードする核酸は、例えば、環境サンプル由来の環境ＤＮＡから、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 等に記載される遺伝子工学的方法に準じて取得することができる。
例えば、環境サンプル由来の環境ＤＮＡをλgt10等のベクターとリガーゼを用いて連結することにより環境ＤＮＡライブラリーを得る。
得られた環境ＤＮＡライブラリーから、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列又は当該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ反応や、上記環境ＤＮＡライブラリーから、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７のいずれかで示される塩基配列に対し相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド又は当該塩基配列の部分塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、本発明の還元酵素をコードする核酸を取得することができる。
ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、例えば、約15塩基から約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７のいずれかで示される塩基配列の５’側の翻訳開始点から始まる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７のいずれかで示される塩基配列の３’側の翻訳終了点から始まる塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。ＰＣＲは、例えば、KOD -Plus- Neo（東洋紡製）を用いて、９５℃で３０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで６８℃で2分間の保温を１サイクルとしてこれを４０サイクル行う。このようなＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、必要に応じて低融点アガロース電気泳動等に供して精製した後、エタノール沈殿により回収することにより、精製し回収することができる。
ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブとしては、例えば、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７のいずれかで示される塩基配列に対し相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は、当該ポリヌクレオチドの部分塩基配列を有するポリヌクレオチド等が挙げられる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC（0.9M塩化ナトリウム、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1％(w/v)フィコール400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1％(w/v)BSA）、0.5％(w/v)SDS及び100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ存在下に、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5％(w/v)SDS存在下に、室温で15分間の保温を２回行い、さらに0.1×SSC（0.015M 塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5％(w/v)SDS存在下に、68℃で30分間保温する条件等を挙げることができる。また、例えば、5×SSC、50mMHEPES pH7.0、10×デンハルト溶液及び20μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ存在下に65℃にて保温し、次いで2×SSC中で室温にて３０分間の保温を行い、さらに0.1×SSC中で６５℃にて４０分間の保温を２回行う条件を挙げることもできる。

【0044】

本発明の還元酵素をコードする核酸は、例えば、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７で示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等の通常の方法に準じて、目的とする塩基配列を有する核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。

【0045】

本発明の還元酵素をコードする核酸は、細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ７「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、９５頁〜１００頁、島本巧・佐々木卓治監修秀潤社、１９９７年７月１日刊行に記載の方法などを参考に合成することもできる。この方法では、長い合成オリゴヌクレオチドプライマーのみを使用してＤＮＡを合成する。プライマーの対は、プライマーの各々の３'末端に約１０ｂｐ〜約１２ｂｐの相補鎖またはオーバーラップをもつように合成され、お互いのプライマーを鋳型としてＤＮＡ合成を行う。プライマーの全長は、約６０ｍｅｒ〜約１００ｍｅｒ、好ましくは約８０ｍｅｒ〜約１００ｍｅｒである。
具体的には、まず、設計された塩基配列をもとに例えば約９０塩基ごとにプライマーとするＤＮＡオリゴマーを設計し、合成する。ＤＮＡオリゴマーの合成は、β−シアノエチルホスホアミダイド法によりＤＮＡ合成機を用いて行うことができる。
設計した塩基配列の中央部付近から５'側約９０残基上流までの配列を用いて第１のＤＮＡオリゴマーを設計し、合成する。次にこの第１のＤＮＡオリゴマーの３'側１２残基の配列を含み、この部分よりポリヌクレオチドの３'下流側に９０残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第２のＤＮＡオリゴマーとする。また、第１のＤＮＡオリゴマーの５'側１２残基を含み、この部分よりポリヌクレオチドの５'上流側に９０残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第３のＤＮＡオリゴマーとする。更に、第２のＤＮＡオリゴマーの５'側（遺伝子側からみると３'側）の１２残基の配列を含み、この部分よりポリヌクレオチドの３'下流側に第２のＤＮＡオリゴマーの相補鎖を合成し、これを第４のＤＮＡオリゴマーとする。以下同様に第５、第６とＤＮＡオリゴマーを合成し、全部の領域をカバーできるまで更にオリゴマーを合成する。
次に、これらオリゴマーを順番にＰＣＲ反応により結合する。まず第１のＤＮＡオリゴマーと第２のＤＮＡオリゴマーとの両者をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。次にこのＰＣＲ産物を鋳型として、第３のＤＮＡオリゴマーと第４のＤＮＡオリゴマーとの両者をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、例えば、変性温度９４℃１分間、アニール温度５１℃１分間、伸長温度７２℃２分間を１セットとして５サイクル反応させた後、変性温度９４℃１分間、アニール温度６０℃１分間、伸長温度７２℃２分間を１セットして２０サイクル反応を行う。反応に使用するＤＮＡポリメラーゼは塩基の取り込みエラー率の低い酵素を使用することが好ましい。以下この操作を繰り返し、塩基配列を伸長し、目的の塩基配列を得る。目的の塩基配列の両端には、必要に応じて制限酵素部位を設け、常法に従いクローニングベクターに導入し、サブクローニングしたり、セルフライゲーションによってプラスミドを構築する。得られたポリヌクレオチドの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで確認し、目的の塩基配列が得られたことを確認する。

【0046】

本発明の還元酵素をコードする核酸の塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著, Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、ライフテクノロジーズ社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。

【0047】

上述のようにして得られる核酸が、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールに還元する活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
まず上述のようにして得られる核酸を後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで当該形質転換体の培養物を2,2,2−トリフルオロアセトフェノン及びＮＡＤＨと混合して３０℃で保温し、消費されるＮＡＤＨ量を反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより還元活性を測定する。このようにして、得られた核酸がかかる活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。

【0048】

本発明の組換えベクターは、本発明核酸又は宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明核酸とが機能可能な形で結合されてなる核酸等を含有する。

【0049】

本発明の組換えベクターの調製は、本発明核酸又は宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明核酸とが機能可能な形で結合されてなる核酸等を、本発明核酸が導入される宿主細胞において利用可能なベクター、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーを持つベクター（以下、基本ベクターと記すこともある。）に通常の遺伝子工学的手法に準じて、組み込むことにより構築すればよい。

【0050】

ここで「基本ベクター」としては、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等を挙げることができる。また、出芽酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のベクター、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ（ＧＥヘルスケア社製）、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルス等を挙げることができる。また、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを挙げることができる。

【0051】

本発明の組換えベクターを、自律複製起点を含むベクター（具体的には例えば、酵母用ベクターｐＡＣＴ２、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４等）を用いて構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。

【0052】

本発明核酸を宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明核酸とが機能可能な形で接続されてなる核酸を宿主細胞に導入すればよい。

【0053】

ここで、「機能可能な形で」とは、本発明核酸が導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に本発明核酸が発現されるように、当該プロモーターと本発明核酸とを接続させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すＤＮＡを挙げることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（ｌａｃＰ）、トリプトファンオペロンのプロモーター（ｔｒｐＰ）、アルギニンオペロンのプロモーター（ａｒｇＰ）、ガラクトースオペロンのプロモーター（ｇａｌＰ）、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター（λ−ｐＬ、λ−ｐＲ）等を挙げることができる。また、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター等を挙げることができる。また、宿主細胞が出芽酵母である場合には、例えば、ＡＤＨ１プロモーター等を挙げることができる。

【0054】

また、宿主細胞において機能するプロモーターを予め保有する基本ベクターを使用する場合には、前記プロモーターと本発明核酸とが機能可能な形で接続するように、上記のプロモーターの下流に本発明核酸を挿入すればよい。例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ等である場合には、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられている。当該クローニング部位に本発明核酸を挿入することにより得られるベクターを動物細胞へ導入することにより、当該動物細胞において本発明核酸を発現させることができる。これらのベクターには予めＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉを欠失したＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えば、ＣＯＳ細胞等に当該ベクターを導入すると、細胞内でベクターのコピー数が非常に増大し、結果として当該ベクターに組み込まれた本発明核酸を大量発現させることもできる。また上記の酵母用ベクターｐＡＣＴ２はＡＤＨ１プロモーターを有しており、当該ベクター又はその誘導体のＡＤＨ１プロモーターの下流に本発明核酸を挿入すれば、本発明核酸を、例えば、ＣＧ１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能なベクターが構築できる。

【0055】

本発明核酸又は本発明の組換えベクター等を、宿主細胞に導入することにより、本発明形質転換体を作製する。次いで作製された本発明形質転換体を通常の細胞培養方法に従い培養することにより、本発明の還元酵素を大量に製造し、取得することができる。

【0056】

宿主細胞としては、微生物の場合には、例えば、真核生物、原核生物等を挙げることができる。好ましくは、例えば、大腸菌等を挙げることができる。当該宿主細胞に、通常の遺伝子工学的方法により、上記のようなベクターを導入することにより、宿主細胞を形質転換することができる。

【0057】

本発明の組換えベクターを宿主細胞へ導入する方法は、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用すればよい。大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ， Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；「モレキュラー・クローニング 第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等の通常の方法を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等の通常の遺伝子導入法を挙げることができる。また、酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等で用いられるリチウム法の通常の方法を挙げることができる。尚、ウイルスをベクターとして用いる場合には、上記のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、本発明遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、当該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。

【0058】

自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用ベクターｐＡＣＴ２や、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４等を用いて本発明ベクターを構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。
基本ベクターとして選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。

【0059】

宿主細胞において本発明核酸又は本発明の組換えベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属及びAspergillus属に属する微生物等を挙げることができる。

【0060】

宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明核酸又は本発明の組換えベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd edition」(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,「Current Protocols in Molecular Biology」(1987)、John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等を挙げることができる。

【0061】

宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明核酸又は本発明の組換えベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。

【0062】

本発明核酸、還元酵素、本発明核酸を含む組換えベクター、及び、その形質転換体を用いることにより、例えば、カルボニル化合物から有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得ることができる。かかる光学活性なアルコールの製造方法では、基質であるカルボニル化合物に、還元酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させる。

【0063】

形質転換体の培養方法、形質転換体の処理物の調製方法等は、上述の本発明核酸取得方法の工程（４）において説明した方法を用いることができる。また、形質転換体の培養物から還元酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。

【0064】

まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、還元酵素を精製することができる。

【0065】

クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）等が挙げられる。

【0066】

還元酵素を含む画分を選抜するには、例えば、2,2,2−トリフルオロアセトフェノンを還元して2,2,2−トリフルオロ-1-フェニルエタノールを生産する能力を指標にして選抜すればよい。

【0067】

基質であるケトン化合物又はアルデヒド化合物としては、例えば、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｎ−ヘキシルアルデヒド、ｎ−ペプチルアルデヒド、ｎ−デシルアルデヒド、２−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、２−ニトロベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、３−ペンタノン、３−クロロ−２−ブタノン、ｔｅｒｔ−ブチルアセトアセテート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、ピルビン酸エチル、メチル ３−オキソブタノエート、エチル ３−オキサブタノネート、エチル ４−クロロアセトアセテート、メチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、エチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン、イソプロピル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、エチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ３−オキソペンタノエート、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、アセトフェノン、２’−ブロモアセトフェノン、３’−ブロモアセトフェノン、４’−ブロモアセトフェノン、２−クロロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、４’−クロロアセトフェノン、ベンジルアセトン、１−フェニル−２−ブタノン、ｍ−メトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、４−アセチル安息香酸、Ｄ−（＋）-グルコース、４−クロロ-３-オキソ酪酸エチル、３−メチル-２-オキソ酪酸エチル、４−ヒドロキシ-２-ブタノン、ベンゾイルギ酸エチル、１−フェニル-２-ブタノン、３−オキソ酪酸エチル等が挙げられる。

【0068】

上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行うとよい。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。

【0069】

上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類；トルエン、ヘキサン、シクロへキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類；メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類；ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物；アセトン等のケトン類；アセトニトリル等のニトリル類、及び、これらの混合物が挙げられる。

【0070】

上記方法における反応は、例えば、水、ＮＡＤＨ、及びケトン化合物又はアルデヒド化合物を、還元酵素又はそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。

【0071】

上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。また、窒素や空気等を吹き込みながら、反応を行なってもよい。通気量は通常０．１〜５Ｌ／分の範囲である。

【0072】

反応の終点は、例えば、反応液中のカルボニル化合物の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。

【0073】

反応液からのアルコールの回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。

【0074】

形質転換体又はその処理物としては、上述のものを用いることができるが、本発明の形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生きている形質転換体を用いるよりも形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が、製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ還元酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染等の影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。

【0075】

本発明の還元酵素を用いたアルコールの製造方法はＮＡＤＨの存在下に行われ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物の還元反応の進行に伴い、ＮＡＤＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記す）に変換される。還元酵素が、変換により生じたＮＡＤ＋を、例えば、２−プロパノールの酸化反応に伴って、還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有している場合には、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換を可能にする基質として、２−プロパノール等を共存させることもできる。

【実施例】

【0076】

以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。

【0077】

実施例１（環境ＤＮＡの取得）
４℃で保存された以下の環境サンプル（Ａ）〜（Ｅ）及び土壌DNA抽出キット（ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ、ニッポンジーン社製）を用い、同キットのマニュアルにしたがってＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡをそれぞれ環境ＤＮＡ（Ａ）〜（Ｅ）とした。抽出されたＤＮＡは１．５％アガロースゲル電気泳動にて確認した。
（Ａ）富山県射水市片口の堆肥（草および枝 ７９℃）
（Ｂ）富山県射水市片口の堆肥（木の皮 ６０℃）
（Ｃ）富山県射水市片口の堆肥（草及び枝 表面）
（Ｄ）富山県射水市片口の堆肥（木の皮 ５９℃）
（Ｅ）富山県射水市片口の堆肥（草及び枝 ７９℃以下）

【0078】

実施例２（オリゴヌクレオチドプライマーの作製）
以下の4種類のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
プライマー１：５’−ＧＡＣＣＧＧＴＣＣＧＣＧＡＴＣＧＴＶＡＣＭＧＧＭＧＳＭＧ−３’ (配列番号１)
プライマー２：５’−ＣＧＧＴＣＡＣＴＧＧＧＣＧＧＴＲＴＡＢＣＣＲＣＣＲＴＣＢ−３’ （配列番号２）
プライマー３：５’−ＡＣＧＡＴＣＧＣＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＴ−３’ （配列番号４）
プライマー４：５’−ＡＣＣＧＣＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴ−３’ （配列番号５）
Ｒはアデニン又はグアニン、Ｖはアデニン又はシトシン又はグアニン、Ｍはアデニン又はシトシン、Ｓはシトシン又はグアニン、Ｂはシトシン又はグアニン又はチミン、をそれぞれ示す。

【0079】

実施例３（二本鎖線状ベクターＤＮＡの作製）
特開２００８−０１７７７３に記載されたプラスミドｐＫＥＬＡは、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するタンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターである。
プラスミドｐＫＥＬＡを制限酵素ＸｈｏＩで消化した。消化されたＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから５．３ｋｂのＤＮＡを回収し、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。得られた精製液からＤＮＡをエタノール沈殿し、得られた沈殿を乾燥させた後、滅菌水５μｌに溶解させた。得られた酵素消化ＤＮＡ水溶液に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を１０μｌ添加し、１６℃にて一晩放置した後、ＤＮＡをエタノール沈殿し、得られた沈殿を乾燥させ、５μｌの滅菌水に溶解させた。得られたＤＮＡ溶液を用いてトランスフォーメーション法でＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（東洋紡社製）を形質転換した。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）培地に接種し培養した。培養菌体からＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドを以下ｐＫＥＬＡｓと記す。

【0080】

配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー３及び配列番号５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー４を用いて、プラスミドｐＫＥＬＡｓを鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。

【0081】

［プライマー］
プライマー３：５’−ＡＣＧＡＴＣＧＣＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＧＣＧＡＣＧＴ−３’ （配列番号４）
プライマー４：５’−ＡＣＣＧＣＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴ−３’ （配列番号５）
［反応液組成］
ｐＫＥＬＡｓ溶液（１００μｇ／ｍｌ） １μｌ
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭの混合液） ４μｌ
プライマー（１０μＭ） 各０．８μｌ
２×Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ １０μｌ
ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡社製） ０．４μｌ
滅菌水 ３μｌ
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＢｉｏ−ＲＡＤ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅにセットし、９４℃にて２分間保温した後、９８℃で１０秒間次いで６０℃で３０秒間次いで６８℃で３分間の保温サイクルを３０回行い、さらに６８℃で５分間保温した。増幅産物をＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製し、これを二本鎖線状ベクターＤＮＡとした。

【0082】

実施例４（ＤＮＡ試料からの核酸増幅、環状組換え発現ベクターの作製及び形質転換体の取得）
（４−１）環境ＤＮＡからの核酸増幅
配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー１及び配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー２を用いて、環境サンプル（Ａ）〜（Ｅ）から取得された環境ＤＮＡを鋳型にして、下記反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。

【0083】

プライマー１：５’−ＧＡＣＣＧＧＴＣＣＧＣＧＡＴＣＧＴＶＡＣＭＧＧＭＧＳＭＧ−３’ （配列番号１）
プライマー２：５’−ＣＧＧＴＣＡＣＴＧＧＧＣＧＧＴＲＴＡＢＣＣＲＣＣＲＴＣＢ−３’ (配列番号２)
Ｒはアデニン又はグアニン、Vはアデニン又はシトシン又はグアニン、Ｍはアデニン又はシトシン、Ｓはシトシン又はグアニン、Bはシトシン又はグアニン又はチミン、をそれぞれ示す。
［反応液組成］
環境ＤＮＡ液 （10〜50 nｇ） １μl
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭの混合液） ４μｌ
プライマー１（１０μＭ） ０．８μｌ
プライマー２（１０μＭ） ０．８μｌ
５×Phusion GC Buffer ４μｌ
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase（New England BioLabs社製） ０．４μｌ
DMSO １μｌ
滅菌水 ８μｌ
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＢｉｏ−ＲＡＤ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅにセットし、９４℃にて２分間保温した後、９８℃で１０秒間次いで７４℃で１分間の保温サイクルを５回行い、次に、９８℃で１０秒間次いで７２℃で１分間の保温サイクルを５回行い、次に、９８℃で１０秒間次いで７０℃で１分間の保温サイクルを５回行い、次に、９８℃で１０秒間次いで６８℃で１分間の保温サイクルを２０回行い、さらに６８℃で７分間保温した。増幅産物をＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。

【0084】

（４−２）環状組換え発現ベクターの作製と形質転換体の取得
（４−１）で得られた増幅産物の精製後の溶液２μlに、実施例３で得られた二本鎖線状ベクターＤＮＡ精製液６μlを添加し、5×In-Fusion HD Enzyme Premix（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を2μl添加した後、50℃にて15分間保温し、次いで、氷上に静置した。これを用いてトランスフォーメーション法によりE．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した。

【0085】

環境ＤＮＡ（Ａ）から増幅されたＤＮＡがクローニングされた大腸菌組換え体は３３４コロニー得られた。環境ＤＮＡ（Ｂ）から増幅されたＤＮＡがクローニングされた大腸菌組換え体は４０コロニー得られた。環境ＤＮＡ（Ｃ）から増幅されたＤＮＡがクローニングされた大腸菌組換え体は２８６コロニー得られた。環境ＤＮＡ（Ｄ）から増幅されたＤＮＡがクローニングされた大腸菌組換え体は３９コロニー得られた。環境ＤＮＡ（Ｅ）から増幅されたＤＮＡがクローニングされた大腸菌組換え体は４２２コロニー得られた。

【0086】

実施例５（形質転換体のアセトフェノン還元活性測定と還元酵素をコードする核酸の取得）
（５−１）粗酵素液の調製
実施例４にて得られた形質転換体、プラスミドｐKELAｓにてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した形質転換体、又は、特開２００８−０１７７７３に記載のプラスミドｐＫＥＬＡにてＥ．ｃｏｌｉ JM109株を形質転換した形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０．４ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ培地４ｍｌ中で３７℃にて２２時間振盪培養した。得られた培養液１ｍｌを２ｍｌ容の遠心チューブに入れ、４℃にて１５０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離することにより、湿菌体を沈殿させた。遠心上清液を除いた湿菌体に、５００ｍｇのビーズ（Φ０．１ｍｍ）と、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）０．５ｍｌを加え、Ｍｕｌｔｉ−Ｂｅａｄｓ Ｓｈｏｃｋｅｒ（安井器械社製）を用いて２５００ｒｐｍ、１５０秒間：ＯＮ（３０秒×３）、ＯＦＦ（３０秒×２）の条件で破砕処理を行った。破砕液を短時間遠心分離した後、破砕液の入ったチューブの底に穴をあけ、チューブを１．５ｍｌ容の新しい遠心チューブに押し込んだ。４℃にて３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、２ｍｌ容の遠心チューブを抜き、１．５ｍｌ容の遠心チューブのサンプルをさらに４℃にて１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、得られた遠心上清液を粗酵素液とした。

【0087】

（５−２）還元活性測定と還元酵素をコードする核酸の取得（その１）
１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．３ｍＭ ＮＡＤＨ、及び１０ｍＭ ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを含む反応液９９０μｌを２５℃で１．５分間保温し、（５−１）で得られた粗酵素液を１０μｌ添加した後、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸収の減少を測定した。また、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．３ｍＭ ＮＡＤＨ、１５％ １−プロパノール、及び１０ｍＭ ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを含む反応液９９０μｌを２５℃で１．５分間保温し、（５−１）で得られた粗酵素液を１０μｌ添加した後、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸収の減少を測定した。プラスミドpKELAｓにてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した形質転換体から得られた粗酵素液では３４０ｎｍにおける吸収の減少が検出されず、これをブランクとした。NADHのモル吸光係数（ε）を６．２２×１０００M^−１cm^−１とし、２５℃で１分間に１μmolのNADHを変換する酵素量を１Ｕとし、培養液１ｍｌあたりの酵素活性値を算出した。１５％１−プロパノール非存在下での２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性値を１００として、１５％１−プロパノール存在下での、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性値の相対値を算出した（表１）。

【0088】

【表1】

【0089】

プラスミドｐＫＥＬＡを含有する形質転換体の粗酵素液における、１５％１−プロパノール非存在下での２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性値に対する、１５％１−プロパノール存在下での２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性値の低下率と比べると、環境ＤＮＡから増幅されたＤＮＡを含む環状組換え発現ベクター＃0012、＃0013、＃0014、＃0015、＃0016、＃0017、＃0018、＃0021、＃0022をそれぞれ含有する形質転換体の粗酵素液では、１５％１−プロパノールの存在による２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性値の低下率が少なく、これらの形質転換体は、プラスミドｐＫＥＬＡを含有する形質転換体が産生する還元酵素よりも有機溶媒耐性に優れた還元酵素を産生していることが判った（表１）。

【0090】

粗酵素液の還元活性が確認された上記９種類の形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、環境ＤＮＡから増幅されたＤＮＡを含む組換え発現ベクター（以下、プラスミド＃0012、＃0013、＃0014、＃0015、＃0016、＃0017、＃0018、＃0021、＃0022と記すこともある。）を取得した。

【0091】

（５−３）還元活性測定と還元酵素をコードする核酸の取得（その２）
（５−１）で得られた粗酵素液を表２に示す各温度で３０分間保温した。１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．３ｍＭ ＮＡＤＨ、及び１０ｍＭ ２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを含む反応液９９０μｌを２５℃で１．５分間保温した後、前記温度で保温した粗酵素液を１０μｌ添加し、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸収の減少を測定した。表２に示す各温度に替えて4℃で保温した粗酵素液での活性値を１００として、各温度処理後の粗酵素液の活性値の相対値を算出した（表２）。
プラスミドｐＫＥＬＡを含有する形質転換体の粗酵素液における、温度処理による２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性値の低下率と比べると、環境ＤＮＡから増幅されたＤＮＡを含む環状組換え発現ベクター＃0024を含有する形質転換体の粗酵素液では、温度処理による２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性値の低下率が少なく、当該形質転換体は、プラスミドｐＫＥＬＡを含有する形質転換体が産生する還元酵素よりも熱安定性に優れた還元酵素を産生していることが判った（表２）。

【0092】

【表2】

【0093】

粗酵素液の還元活性が確認された上記の形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、環境ＤＮＡから増幅されたＤＮＡを含む組換え発現ベクター（以下、プラスミド＃0024と記すこともある。）を取得した。

【0094】

実施例６（還元酵素をコードする核酸の塩基配列決定）
実施例５で粗酵素液の２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元活性が確認された形質転換体から取得されたプラスミド＃0012、＃0013、＃0014、＃0015、＃0016、＃0017、＃0018、＃0021、＃0022、＃0024にクローニングされたＤＮＡの塩基配列を決定した。Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエルマー製）を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（パーキンエルマー製）で解析した。プラスミド＃0012、＃0013、＃0014、＃0015、＃0016、＃0017、＃0018、＃0021、＃0022及び＃0024からそれぞれ得られた塩基配列を配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７及び９に示し、これら塩基配列にそれぞれコードされるアミノ酸配列を配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８及び１０に示す。配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８及び１０で示される各アミノ酸配列と、プラスミドｐＫＥＬＡにコードされる２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列との配列同一性は約５０−７５％である。

【産業上の利用可能性】

【0095】

本願発明により、医農薬の有効成分となる化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用される還元酵素をコードする核酸の効率的な取得方法が提供可能となり、例えば、環境中に存在する微生物由来の環境ＤＮＡから取得される、有機溶媒に対する安定性や熱安定性に優れた還元酵素をコードする核酸等が提供可能となる。
［配列表フリ−テキスト］
配列番号１
オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
ベクター
配列番号４
オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ベクターの塩基配列
配列番号７
ベクターの塩基配列
配列番号８
ベクターの塩基配列
配列番号９
#0024の塩基配列
配列番号１０
#0024のアミノ酸配列
配列番号１１
#0012の塩基配列
配列番号１２
#0012のアミノ酸配列
配列番号１３
#0013の塩基配列
配列番号１４
#0013のアミノ酸配列
配列番号１５
#0014の塩基配列
配列番号１６
#0014のアミノ酸配列
配列番号１７
#0015の塩基配列
配列番号１８
#0015のアミノ酸配列
配列番号１９
#0016の塩基配列
配列番号２０
#0016のアミノ酸配列
配列番号２１
#0017の塩基配列
配列番号２２
#0017のアミノ酸配列
配列番号２３
#0018の塩基配列
配列番号２４
#0018のアミノ酸配列
配列番号２５
#0021の塩基配列
配列番号２６
#0021のアミノ酸配列
配列番号２７
#0022の塩基配列
配列番号２８
#0022のアミノ酸配列
配列番号２９
ベクターの塩基配列

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]