特許 6070180 酵素のスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6070180

(24)【登録日】2017年1月13日

(45)【発行日】2017年2月1日

(54)【発明の名称】酵素のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/48 20060101AFI20170123BHJP

   C12Q 1/34 20060101ALI20170123BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20170123BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170123BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/48 ZZNA

   C12Q1/34

   C12Q1/68 A

   C12N15/00 A

【請求項の数】3

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2012-285329(P2012-285329)

(22)【出願日】2012年12月27日

(65)【公開番号】特開2014-124166(P2014-124166A)

(43)【公開日】2014年7月7日

【審査請求日】2015年11月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100166165

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 英直

(72)【発明者】

【氏名】野口 惇

(72)【発明者】

【氏名】中西 睦

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 寛

(72)【発明者】

【氏名】牧野 友理子

(72)【発明者】

【氏名】井出 輝彦

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５０２４６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１０８６７２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特開２０１１−０７８３８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０６５５６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０４５３１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０２０７５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００３−３３４０９５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ａ）（１）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（２）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、及び（３）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性のうち全ての活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドに変異を導入する工程と、
（Ｂ）変異を導入した前記ポリヌクレオチドをベクターに挿入する工程と、
（Ｃ）前記ポリヌクレオチドを挿入したベクターで宿主を形質転換する工程と、
（Ｄ）得られた形質転換体を培養し、前記酵素を発現させる工程と、
（Ｅ）前記形質転換体の培養液から前記酵素を抽出する工程と、
（Ｆ）前記酵素の性能を評価する工程と、
を含む、前記酵素のスクリーニング方法において、前記（Ｆ）の工程における酵素の性能評価を、前記（１）から（３）のうち全ての活性を必要とする核酸合成を行なうことで評価する、前記スクリーニング方法。

【請求項2】

酵素がトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素である、請求項１に記載のスクリーニング方法。

【請求項3】

前記（Ｆ）の工程における酵素の性能評価を、特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加している）を用いて、下記（Ｉ）から（Ｖ）の工程により前記特定塩基配列又はその配列に相補的な配列を含むＲＮＡを合成することで評価する、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
（Ｉ）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列又はその配列に相補的な配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（ＩＩ）ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（ＩＩＩ）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列又はその配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（ＩＶ）ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記プロモーター配列から前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（Ｖ）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（Ｉ）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は酵素のスクリーニング方法に関する。特に本発明は、遺伝子工学的手法により得られた、（１）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（２）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（３）リボヌクレアーゼＨ活性のうち、１以上の活性を有する酵素を発現可能な形質転換体から、所望の性能を有した酵素を効率的にスクリーニングする方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

レトロウイルスの増殖に必須の因子として発見された逆転写酵素は、一本鎖ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成（逆転写）する、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有しており、ｃＤＮＡ合成等に必須な遺伝子工学試薬あるいは遺伝子診断用酵素として利用されている。

【0003】

逆転写酵素の一つである、トリ骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、分子量約６３ｋＤａのα鎖および分子量約９５ｋＤａのβ鎖からなるヘテロ複合体であり、ＡＳＬＶファミリーとして知られている。このうちα鎖は、タンパク質分解性プロセシングによりβ鎖から形成されている（非特許文献１）。ＡＭＶ逆転写酵素のα鎖とβ鎖のヘテロ複合体は、α鎖またはβ鎖のみの場合と比較して安定であり、有用であることが知られている（特許文献１）。

【0004】

逆転写酵素はＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性だけでなく、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性やリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を併せ持つ酵素が知られており、前述のトリ骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素が一例としてあげられる。このような複数の活性を持つ酵素は、１つの酵素で複数の反応を行なうことが出来るため、例えばＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法などの遺伝子増幅法で用いる酵素として利用されている（特許文献２および３）。逆転写酵素を用いた反応ではその増幅の効率と正確性の向上のため、より高い温度で逆転写反応が可能な酵素が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００３−３３４０９５号公報

【特許文献2】特開２００６−１４６３２号公報

【特許文献3】特表平４−５０７１９７号公報

【特許文献4】特開２０１２−１２０５０６号公報

【特許文献5】特開２０１２−０７５４１８号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ Ｓ．Ｆ．Ｊ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１６３（１９９３）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、（１）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（２）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（３）リボヌクレアーゼＨ活性のうち、１以上の活性を有する、性能が向上した酵素を得るためのスクリーニング方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、（１）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（２）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（３）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性のうち、１以上の活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドに変異を導入し、当該変異を導入したポリヌクレオチドを含むベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体から得られた酵素のスクリーニングにおいて、当該酵素を用いた核酸合成を行ない評価することで、所望の性能を有した当該酵素を得ることを見出し、本願発明を完成するに至った。

【0009】

すなわち本発明の第一の態様は、
（Ａ）（１）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（２）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（３）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性のうち、１以上、好ましくは２以上の活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドに変異を導入する工程と、
（Ｂ）変異を導入した前記ポリヌクレオチドをベクターに挿入する工程と、
（Ｃ）前記ポリヌクレオチドを挿入したベクターで宿主を形質転換する工程と、
（Ｄ）得られた形質転換体を培養し、前記酵素を発現させる工程と、
（Ｅ）前記形質転換体の培養液から前記酵素を抽出する工程と、
（Ｆ）前記酵素の性能を評価する工程と、
を含む、前記酵素のスクリーニング方法において、前記（Ｆ）の工程における酵素の性能評価を、前記（１）から（３）のうち１以上、好ましくは２以上の活性を必要とする核酸合成を行なうことで評価する、前記スクリーニング方法である。

【0010】

また本発明の第二の態様は、酵素が前記（１）から（３）の活性を全て有する酵素である、前記第一の態様に記載のスクリーニング方法である。

【0011】

また本発明の第三の態様は、酵素がトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素である、前記第二の態様に記載のスクリーニング方法である。

【0012】

また本発明の第四の態様は、前記（Ｆ）の工程における酵素の性能評価を、特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加している）を用いて、下記（Ｉ）から（Ｖ）の工程により前記特定塩基配列又はその配列に相補的な配列を含むＲＮＡを合成することで評価する、前記第一から第三の態様のいずれかに記載のスクリーニング方法である。
（Ｉ）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列又はその配列に相補的な配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（ＩＩ）ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（ＩＩＩ）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列又はその配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（ＩＶ）ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記プロモーター配列から前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（Ｖ）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（Ｉ）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。
さらに本発明の第五の態様は、前記第一から第四の態様のいずれかに記載のスクリーニング方法で得られた酵素である。

【発明の効果】

【0013】

本発明は、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、リボヌクレアーゼＨ活性のうち、１以上の活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドに変異を導入する工程と、変異を導入した前記ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入する工程と、前記ポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターで宿主を形質転換する工程と、得られた形質転換体を培養し前記酵素を発現させる工程と、
前記形質転換体の培養液から前記酵素を抽出する工程と、前記酵素の性能を評価する工程とを含む前記酵素のスクリーニング方法において、前記酵素の性能評価を、前記三つの活性のうち１以上の活性を必要とする核酸合成を行なうことで評価することを特徴としている。本発明により、前記核酸合成に必要な所望の性能を有した酵素の取得を可能とする。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】野生型のＡＭＶ逆転写酵素β鎖のアミノ酸配列（配列番号１、上段）と、本発明で例示される変異部位を示す図である。

【図2】プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢの構造を示す図である。

【図3】蛍光強度の増加時間から逆転写酵素のユニット数を見積もる検量線を示す図である。

【図4】野生型と本発明の改変または変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の耐熱性評価の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性とは、１本鎖のＲＮＡ鎖を鋳型として、それに相補的な塩基配列持つＤＮＡ鎖を合成する活性であり、酵素番号Ｅ．Ｃ．２．７．７．７に分類される酵素が持つ酵素活性である。本発明において、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性とは、１本鎖のＤＮＡ鎖を鋳型として、それに相補的な塩基配列持つＤＮＡ鎖を合成する活性であり、酵素番号Ｅ．Ｃ．２．７．７．４９に分類される酵素が持つ酵素活性である。本発明において、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性とは、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド二本鎖を形成しているＲＮＡ鎖を切断し、一本鎖ＤＮＡを生じるリボヌクレアーゼであり、酵素番号Ｅ．Ｃ．３．１．２６．４に分類される酵素が持つ酵素活性である。

【0016】

本発明における、（１）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（２）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、（３）ＲＮａｓｅＨ活性の１以上の酵素活性を有する酵素は、（１）から（３）の任意の活性を有する酵素又は（１）から（３）の任意の活性の組合せを有する酵素であり、連鎖的に核酸合成する酵素をスクリーニングする観点から、（１）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性と（２）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性の組合せが好ましく、またＲＴ−ＰＣＲ法に有用な酵素を取得する観点では、（１）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性と（３）ＲＮａｓｅＨ活性の組合せを有する酵素が好ましく、さらにはＴＲＣ法やＮＡＳＢＡ法に用いる酵素として有用な酵素をスクリーニングする観点から、（１）から（３）の活性を全て有する酵素、例えばマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素やトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素が好ましく、特にＡＭＶ逆転写酵素が好ましい。

【0017】

ＡＭＶが本来有する、ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの全長は２５７４塩基であり、そのヌクレオチド配列を配列番号３に示す。なお配列番号３に記載の塩基配列からなるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドは、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子逆転写酵素β鎖をコードする遺伝子であるが、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子逆転写酵素にはβ鎖よりも低分子のα鎖も存在し、そのヌクレオチド配列は、配列番号３に記載の塩基配列のうち５’末端側１７１６塩基からなる（配列番号４）。宿主が大腸菌の場合における、より好ましいＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの一例として、特許文献４に記載された方法を用いて大腸菌コドンを用いて変換したβ鎖の遺伝子（配列番号５）の配列およびα鎖の遺伝子（配列番号６）が例示できる。

【0018】

本発明のスクリーニング方法では、前記（１）から（３）のうち１以上の活性を有する酵素をスクリーニングする方法は、以下の工程（Ａ）〜（Ｆ）：
（Ａ）前記（１）から（３）の活性のうち、１以上の活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドに変異を導入する工程と、
（Ｂ）変異を導入した前記ポリヌクレオチドをベクターに挿入する工程と、
（Ｃ）前記ポリヌクレオチドを挿入したベクターで宿主を形質転換する工程と、
（Ｄ）得られた形質転換体を培養し、前記酵素を発現させる工程と、
（Ｅ）前記形質転換体の培養液から前記酵素を抽出する工程と、
（Ｆ）前記酵素の性能を評価する工程と
を含んでおり、工程（Ｆ）における条件を適宜選択することにより、所望の性能、例えば向上した（１）から（３）のいずれか１以上の活性、向上した耐熱性、界面活性剤や有機溶剤の影響を受けない性能など、を有する酵素をスクリーニングすることができる。

【0019】

工程（Ａ）は、野生型の酵素等をコードするポリヌクレオチドの任意の位置に変異を導入する工程である。野生型の酵素をコードするポリヌクレオチドの入手は、当業者のなし得る方法であればいかなる方法でもよく、例えば前記酵素のゲノム情報より作製した適切なプライマーを用いたＰＣＲにより取得することができる。野生型の酵素等をコードするポリヌクレオチドとしては、野生型酵素をコードするポリヌクレオチドの他に、前記（１）から（３）のうち少なくともいずれか１つの活性を有する酵素をコードしていれば任意の欠失、置換、及び／又は付加を有するポリヌクレオチドを使用することができ、例えば特許文献４に記載される様に大腸菌コドン型を有するように改変されたポリヌクレオチドも用いることができる。変異を導入した前記ポリヌクレオチドは、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤、放射線への露出といった公知の技術を適宜使用することにより得られるが、ハイスループットで変異を導入したポリヌクレオチドを取得する観点から、エラープローンＰＣＲが好ましい。エラープローンＰＣＲは、公知の方法により行うことができるが、一般に、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を持たないポリメラーゼを、所望の程度の突然変異が生じるようにＭｎ²⁺濃度、ｄＮＴＰ濃度、温度を選択して野生型の酵素等をコードするポリヌクレオチドに対してＰＣＲを行なうことにより、変異を導入することができる。

【0020】

工程（Ｂ）は、変異を導入した前記ポリヌクレオチドをベクターに挿入する工程であり、これにより遺伝子ライブラリーを構築することができる。ポリヌクレオチドのベクターへの挿入は、本技術分野に公知の方法により、リガーゼを用いて行なうことができ、例えば予め制限酵素切断部位を付与したプライマーを制限酵素で切断し、リガーゼを用いてベクターの所望のクローニング部位に挿入することができる。挿入するベクターの種類は特に限定はなく、自律複製型ベクターでもよいし、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。本発明に用いるベクターは、ベクターに組み込まれたポリヌクレオチドがコードする酵素を発現させる観点から、好ましくは発現ベクターであり、当該発現ベクターにおいて前記変異を導入したポリヌクレオチドは、プロモーターといった転写に必要な要素や、転写後のｍＲＮＡにおいて翻訳に必要なシャインダルガノ配列やコザック配列などの要素に機能的に連結されている。これらの要素は、宿主の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌を宿主とした場合、使用できるプロモーターにはｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーターなどがあげられる。発現ベクターとしては、大腸菌を宿主とした場合、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｕ１３８７２）、ｐＣＤＦ−１ｂ（タカラバイオ製）といった発現用プラスミドが例示できるが、当業者が入手し得る一般的な大腸菌用ベクターの中から適宜選択して使用してもよい。さらに、前記変異を導入したポリヌクレオチドの５’末端又は３’末端、又はその両方に酵素の精製のために有用な配列を付加できるベクターが選択されてもよい。このようなベクターを選択することで、例えばシグナルペプチドを付加して細胞外分泌型酵素としたり、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、又はＭｙｃタグなどのタグ配列を付加して酵素の精製を容易にすることができる。このような配列を付加できるベクターに、ポリヌクレオチドを挿入する場合、ポリヌクレオチドがこれらの要素に機能的に連結することが必要である。もっとも、シグナルペプチドやタグの種類や、これらのペプチドと本酵素の結合方法は上記方法に限定されることはなく、当業者が利用可能な任意のペプチドを利用することができる。

【0021】

工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）に記載の方法で構築した遺伝子ライブラリー（変異を導入した前記ポリヌクレオチドを挿入したベクターの集合）で宿主を形質転換する工程である。工程（Ｃ）で用いる宿主としては、目的の酵素が発現する宿主であればいかなる宿主でも適宜使用できる。原核細胞においては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌、真核細胞としては酵母のサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する菌、キャンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する菌、ポンベ（Ｐｏｍｂｅ）属に属する菌、糸状菌のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属する菌などを例示することができ、さらには、昆虫細胞や動物細胞を例示することができる。好ましい宿主細胞の一例として培養や取り扱いが容易な大腸菌があげられる。大腸菌株としては、遺伝子工学の分野において用いられる任意の株が使用されてもよいが、高い遺伝子転換能力を有するという観点から好ましくは大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株、大腸菌Ｗ３１１０株であり、より好ましくは大腸菌Ｗ３１１０株が使用される。なお前述した大腸菌に対し、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチル等の化学物質、紫外線、放射線等の従来公知の手段により変異処理した大腸菌変異株を使用してもよい。プラスミドベクターを用いて大腸菌を形質転換する方法は、遺伝子工学の分野において使用される任意の方法を用いることができ、例えば、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，ｐ．４６９−６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓやＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，ｐ．３０５−６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載された方法により行なうことができる。

【0022】

工程（Ｄ）は、工程（Ｃ）から得られた形質転換体を培養し、酵素を発現させる工程である。形質転換体の培養条件は、ベクターに挿入した酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件であれば任意の公知条件であってもよく、形質転換体を前培養した後に、発現ベクターに応じた誘導剤を添加することで酵素を発現させてもよい。例えば大腸菌を用いてトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を発現させる方法として、２×ＹＴ−Ｐｎａ培地（ｐＨ６．０）（１６ｇ／Ｌ トリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、１４．５ｇ／Ｌ 第一リン酸ナトリウム・二水和物、２．５ｇ／Ｌ 第二リン酸ナトリウム・十二水和物）、３７℃・１６０ｒｐｍで３時間振とう培養を行ない、さらに培養液に誘導剤を添加し、２５℃・１６０ｒｐｍで三晩振とう培養を行なう方法が例示できる。使用する誘導剤は、ベクターに用いられるプロモーターの種類により適宜選択することができ、例えばｌａｃプロモーターを含むベクターであれば、ＩＰＴＧを使用することができる。

【0023】

工程（Ｅ）は、前記形質転換体の培養液から前記酵素を抽出する工程であり、各宿主に適した公知の方法で発現した酵素を抽出すればよい。例えば大腸菌において適切な条件下で超音波破砕を行ない、未破砕の菌体を遠心分離により分離する方法や、シグナル配列を付けることで酵素が分泌される場合には、大腸菌を破砕することなく、遠心分離により菌体を分離する方法があげられる。なお界面活性剤を用いた抽出方法は、並列処理が容易な点で好ましい例としてあげられる。また前記酵素を抽出する工程において、抽出した前記酵素をさらに精製してもよい。酵素の精製は、後工程の核酸合成において阻害物質となる物質を酵素と分離できればいかなる精製方法でも良く、阻害物質が許容できる濃度であれば精製方法は希釈でも良い。ポリメラーゼをその他のタンパク質から分離するにはストレプトマイシン塩酸塩やポリミンＰを添加することで核酸と共沈させることにより効率的に沈澱回収する方法が好ましい例としてあげられる。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィーを単独または組み合わせて適用することにより、より高純度に精製することができる。さらに、酵素にタグ配列が付加されている場合には、タグ配列に応じた精製法、例えばプルダウン法やアフィニティークロマトグラフィー法を用いて精製することができる。クロマトグラフィーは並列処理に適したバッチ法がより好ましい例としてあげられる。

【0024】

工程（Ｆ）は、酵素の性能を評価する工程であり、工程（Ｅ）で抽出された酵素を用いて、前記（１）から（３）のうちの１以上の活性を必要とする核酸合成を行なうことで、かかる酵素を評価する。核酸合成法は、（１）から（３）のうちいずれか１以上の活性を必要とする方法であれば特に限定はなく、例えばＲＴ−ＰＣＲ法などが挙げられる。好ましくは前記（１）から（３）のうちの２以上の活性の組合せを必要とする方法であり、さらに好ましくは（１）から（３）のうちの全てを必要とするＴＲＣ法やＮＡＳＢＡ法である。これらの方法を用いて酵素の性能評価を行なうには、特定塩基配列を含む標的ＲＮＡと、特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加している）、並びに酵素群を用意し、下記（Ｉ）から（Ｖ）の工程により前記特定塩基配列又はその配列に相補的な配列を含むＲＮＡを合成することで評価すればよい。
（Ｉ）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列又はその配列に相補的な配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（ＩＩ）ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（ＩＩＩ）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列又はその配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（ＩＶ）ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記プロモーター配列から、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（Ｖ）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（Ｉ）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。

【0025】

１の態様では、第一のプライマーの５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加しており、その場合、下記（Ｉ’）〜（Ｖ’）の工程により前記特定塩基配列を含むＲＮＡを合成することで評価すればよい。
（Ｉ’）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（ＩＩ’）ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（ＩＩＩ’）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列を転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（ＩＶ’）ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（Ｖ’）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（Ｉ）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。

【0026】

別の態様では、第二のプライマーの５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加しており、その場合、下記（Ｉ’’）〜（ＩＸ’’）工程により前記特定塩基配列に相補的な配列を含むＲＮＡを合成することで評価すればよい。
（Ｉ’’）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（ＩＩ’’）ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（ＩＩＩ’’）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的配列を転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（ＩＶ’’）ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（Ｖ’’）前記ＲＮＡ転写産物が、第一のプライマーおよびＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列のｃＤＮＡを合成する工程、
（ＶＩ’’）ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（ＶＩＩ’’）第二のプライマーおよびＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的な配列を転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（ＶＩＩＩ’’）ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（ＩＸ’’）前記（ＶＩＩＩ’’）のＲＮＡ転写産物が、前記（Ｖ’’）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的に特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡ転写産物を生成する工程。

【0027】

上記の酵素群は、当該核酸合成反応に必要な活性、すなわち（１）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性と（２）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、及び（３）リボヌクレアーゼＨ活性を有する１以上の酵素と、（４）ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素との組合せである。（１）から（３）のうちの１以上の活性について性能を評価する場合、評価対象の活性以外の活性を有する酵素を添加することが必要となる。例えば、（１）ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性と（２）ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性を評価するスクリーニング方法の場合、（４）ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の他に、（３）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を添加する必要がある。

【0028】

工程（Ｆ）は、特定塩基配列を含む標的ＲＮＡと、特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加している）、並びに酵素群、さらには核酸合成反応に必要なその他の成分、例えばｄＮＴＰｓ、ＮＴＰｓ、並びに酵素活性に必要な緩衝液及び塩を含む１の反応容器内で連続的に行なわれる。この反応における温度は、公知のＴＲＣ法やＮＡＳＢＡ法で用いられる温度を用いることができるが、所望の性能を有する酵素をスクリーニングする観点から、反応条件は適宜選択することができる。

【0029】

また工程（Ｆ）の後に更に工程（Ｆ）が繰り返し行なわれてもよい。２回目以降の工程（Ｆ）が行われる場合、工程（Ｄ）及び（Ｅ）を伴ってもよいし、工程（Ｆ）のみが繰り返されてもよい。工程（Ｄ）及び（Ｅ）を伴う場合には、さらに酵素の精製度を高める抽出若しくは精製工程が行なわれてもよい。最初の工程（Ｆ）と二回目以降の工程（Ｆ）は同じ性能評価工程であってもよいし、異なる性能評価工程であってもよい。例えば、最初の工程（Ｆ）は、いわゆる一次スクリーニングであり、（１）から（３）のうちの１以上の活性を有する酵素をスクリーニングし、２回目以降の工程（Ｆ）で、所望の性能を有した酵素をスクリーニングすることもできる。さらに別の態様では、スクリーニングで所望の性能を有する酵素を取得した後に、当該酵素のポリヌクレオチドに対してさらに工程（Ａ）から（Ｆ）を行なうことにより、より優れた性能の酵素をスクリーニングすることもできる。

【0030】

核酸合成を行なった後は、合成した核酸量を測定することで、酵素活性を測定し、酵素の性能を評価すればよい。合成した核酸量の測定には、アガロース電気泳動とエチジウムブロミドによる核酸の分離と可視化、合成過程で生じる産物、例えばピロリン酸の定量などが例示できる。より好ましい例として蛍光プローブを用いたリアルタイム検出があげられ、目的の核酸合成により増幅した核酸を蛍光の増幅や減少で定量する方法が公知である。

【0031】

本発明のスクリーニング方法で得られる、所望の性能を有した変異体とは、前記の測定方法において差異として認められる機能であればいかなる機能でも適応可能であるが、発現量が向上した変異体、耐熱性が向上した変異体、界面活性剤の影響を受けない変異体、有機溶媒の影響を受けない変異体などが例示できる。例えば耐熱性が向上した変異体を取得したい場合には、前述の核酸合成の温度を通常よりも高くしたり、または核酸合成前の酵素を所定の時間、恒温の状態で放置したりすればよい。例えば、３７℃より高い温度、好ましくは４５℃より高い温度、より好ましくは５０℃より高い温度、より好ましくは５５℃より高い温度において酵素が働くために充分に長い時間、例えば、１分よりも長い時間、好ましくは５分より長い時間、より好ましくは１０分より長い時間、より好ましくは２０分より長い時間、より好ましくは３０分より長い時間保持される。

【実施例】

【0032】

以下、所望の性能を有したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素のスクリーニング法の実施例を用いて、本発明を詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。

【0033】

実施例１ トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素遺伝子の変異体ライブラリーの作製
特許文献４に記載の方法で大腸菌コドン型のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子（配列番号５）を持つプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢを作製した。プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢの塩基配列情報を配列番号７に示す。作製したプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢのＡＭＶ逆転写酵素遺伝子に以下の手順で変異を導入した。
（１）プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢを鋳型プラスミドとして、表１に示した反応液組成に基づいてエラープローンＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用い、９５℃で２分加熱後、９５℃・３０秒、５５．７℃・３０秒、７２℃・３．５分の温度サイクルを４０回繰り返した。

【表1】

（２）ＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）精製したＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を含むＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化後、同酵素で消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＡＭＶ逆転写酵素遺伝子変異体ライブラリーとした。
（４）さらに作製したライブラリーを定法に従い大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換し、３７℃のＬＢ／Ｃｒｂ寒天培地（１０ｇ／Ｌ ポリペプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ 精製寒天、０．１ｍｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））で一晩培養し変異体候補株を得た。

【0034】

実施例２ 変異体候補株の培養
９６穴プレート（グライナー・ジャパン社製）に２×ＹＴ−Ｐｎａ培地（ｐＨ６．０）（１６ｇ／Ｌ トリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、１４．５ｇ／Ｌ 第一リン酸ナトリウム・二水和物、２．５ｇ／Ｌ 第二リン酸ナトリウム・十二水和物、０．１ｍｇ／ｍＬ カルベニシリンナトリウム）２００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、実施例１で作製した変異体候補株を１コロニーずつ植菌し、３７℃・２０００ｒｐｍで一晩振とう培養を行なうことで前培養を行なった。前培養液の一部はグリセロールストックとし−８０℃で保存した。
９６穴ディープウェルプレート（グライナー・ジャパン社製）に２×ＹＴ−Ｐｎａ培地（ｐＨ６．０）（１６ｇ／Ｌ トリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、１４．５ｇ／Ｌ 第一リン酸ナトリウム・二水和物、２．５ｇ／Ｌ 第二リン酸ナトリウム・十二水和物、０．１ｍｇ／ｍＬ カルベニシリンナトリウム）５００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、前培養液を５０μＬずつ植菌し、３７℃・１５００ｒｐｍで３時間振とう培養を行なった。さらに各ウェルに５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、２５℃・２０００ｒｐｍで三晩振とう培養を行なうことでトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の発現を促した。
培養菌体を４℃・２５００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行ない、上清を捨てることで菌体を回収し、−３０℃で保存した。

【0035】

実施例３ トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素抽出液の酵素活性評価
実施例２で回収した菌体に抽出液（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商品名）（メルク社製）溶液、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．２ｍｇ／ｍＬ 卵白リゾチーム、２５Ｕ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）（メルク社製）、１０ｍＭ ＤＴＴ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、２５℃・１５００ｒｐｍで一時間振とうし、続いて４℃・２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行ない、上清を回収し抽出液とした。
酵素活性の測定は、特許文献２に記載の核酸増幅法をもとに行なった。表２に記載した組成の反応液（ミックス試薬とする）１５μＬをＰＣＲ用９６穴プレート（ＡＢＩ社製）に分注し、前記抽出液を１０ｍＭ ＤＴＴ水溶液で１０倍に希釈しものを５μＬ加えた。

【表2】

続いて各ウェルに開始溶液（１８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＫＣｌ、３．８％（ｗ／ｖ） グリセロール、１０．４％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ）を１０μＬ混合し、ＡＢＩ７３００ＲｅａｌＴｉｍｅ−ＰＣＲ装置（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、４６℃・１５秒、４７℃・３０秒、４６℃・１５秒の温度サイクルを３０回繰り返し、サイクルごとに蛍光強度を測定した。
野生型のＡＭＶ逆転写酵素と比較し蛍光強度の増加が早いサイクルで観察される変異体を耐熱性変異株として取得した。

【0036】

実施例４ トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の調製
実施例３で選択した耐熱性変異株について耐熱性の評価を行なうために、耐熱性変異株の培養と精製を行なった。
（１）試験管に２×ＹＴ−Ｐｎａ培地（ｐＨ６．０）（１６ｇ／Ｌ トリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、１４．５ｇ／Ｌ 第一リン酸ナトリウム・二水和物、２．５ｇ／Ｌ 第二リン酸ナトリウム・十二水和物、０．１ｍｇ／ｍＬ カルベニシリンナトリウム）２ｍＬ分注し、実施例２で作製したグリセロールストックを２０μＬ植菌し、３７℃・１６０ｒｐｍで一晩振とう培養を行なうことで前培養を行なった。

【0037】

（２）１００ｍＬフラスコに２×ＹＴ−Ｐｎａ培地（ｐＨ６．０）（１６ｇ／Ｌ トリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、１４．５ｇ／Ｌ 第一リン酸ナトリウム・二水和物、２．５ｇ／Ｌ 第二リン酸ナトリウム・十二水和物、０．１ｍｇ／ｍＬ カルベニシリンナトリウム）２０ｍＬ分注し、前培養液を２００μＬ植菌し、３７℃・１６０ｒｐｍで３時間振とう培養を行なった。さらに培養液に５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、２５℃・１６０ｒｐｍで三晩振とう培養を行なうことでＡＭＶ逆転写酵素の発現を促した。その後、培養液を４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで菌体を回収し、−３０℃で凍結保存した。

【0038】

（３）凍結菌体を５ｍＬ／湿菌体質量のバッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、４ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁し、ソニケーター（Ｉｎｓｏｎａｔｏｒ ２０１Ｍ、久保田製作所社製）を使用して１５０Ｗ・４℃の条件で超音波破砕を行なった後、４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで未破砕の菌体を取り除き抽出液を得た。

【0039】

（４）（３）の抽出液に０．８３％（ｗ／ｖ）になるようにストレプトマイシン塩酸塩（和光純薬社製）を溶解し、４℃で３０分間撹拌した。その後、４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することでＡＭＶ逆転写酵素を沈澱として回収し、取り除いた上清と等量のバッファーＡへ再度懸濁した。この再懸濁液をさらに４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した上清を回収した。この上清５００μＬとバッファーＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、４ｍＭ ＤＴＴ、１７０ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム）５００μＬを混和した後、バッファーＣ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、４ｍＭ ＤＴＴ、８５ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム）で平衡化したトヨパールＰＰＧ−６００Ｍ（東ソー社製）の５０％スラリー５００μＬと混和し、４℃で１０分間転倒撹拌することで吸着を行なった。４℃・５０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、未吸着分を取り除いた。続いて、吸着させたゲルへ１．７ｍＬのバッファーＤ（バッファーＡとバッファーＣを２：８で混和したバッファー）を加え、数回転倒撹拌した後４℃・５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ない、上清を取り除くことでゲルを洗浄した。さらにこの洗浄をさらにもう一度繰り返し、洗浄したゲルにバッファーＡを２５０μＬ加え、４℃で１０分間転倒撹拌しゲルから溶出させた後、４℃・５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ない、ゲルを取り除いた上清を各耐熱性変異株のＡＭＶ逆転写酵素液として回収し４℃で保存した。

【0040】

実施例５ トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素液の耐熱性評価
実施例４で調製した各耐熱性変異株由来のＡＭＶ逆転写酵素液の耐熱性評価を行なった。
（１）ＡＭＶ逆転写酵素液３．２μＬに対し４０．３μＬの滅菌水を加え、さらに５．２μＬのＤＭＳＯ（終濃度１０．４％（ｖ／ｖ））を加え混和し酵素反応液とし４℃に保持した。この酵素反応液を非加熱酵素反応液とし、この非加熱酵素反応液の一部をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、４６℃で１０分加熱後、４℃で３分冷却し加熱酵素反応液とした。
（２）実施例３に記載した組成でミックス試薬を調製し１５μＬを０．５ｍＬ容ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、前記非加熱酵素反応液もしくは前記加熱酵素反応液を５μＬ加え、４６℃で２分保温した。続いて各ＰＣＲチューブに開始溶液（１８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＫＣｌ、３．８％（ｗ／ｖ） グリセロール、１０．４％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ）を１０μＬ混合し、ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー社製）を用いて蛍光強度の変化を測定した。

【0041】

（３）適宜バッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、４ｍＭ ＤＴＴ）で希釈したＡＭＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて同様の方法で蛍光強度の変化を測定し、蛍光強度が初期蛍光の１．２倍になる時間から逆転写酵素のユニット数を見積もる検量線を作成した（図３）。この検量線を用いて非加熱酵素反応液と加熱酵素反応液それぞれのトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の活性を見積もり、加熱酵素反応液の活性を非加熱酵素反応液の活性で除することで残存活性を算出した。この残存活性を野生型由来と各耐熱性変異株由来のＡＭＶ逆転写酵素反応液と比較した結果、各耐熱性変異株由来の酵素は野生型由来と比較して耐熱性が向上していることが判った（図４）。

【0042】

実施例６ トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素遺伝子の塩基配列決定
実施例４で培養した菌体の一部から、定法によりプラスミドを抽出し、抽出したプラスミドに含まれるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素遺伝子の塩基配列決定を以下の方法で行なった。
（１）Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付のバッファー２．０μＬ、プレミックス４．０μＬ、合成ＤＮＡプライマー３．２ｐｍｏｌ、鋳型プラスミド５００ｎｇを滅菌水にて２０μＬに調製し、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用い、９６℃で１分加熱後、９６℃・１０秒、５０℃・５秒、６０℃・４分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）（１）で調製した塩基配列決定用サンプルをＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、以下に示す方法で精製した。
（２−１）Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラムに滅菌水を８００μＬ加え、ボルテックスにより乾燥したゲルを十分に水和させた。
（２−２）カラムに気泡がないことを確認後、室温にて２時間以上放置した。
（２−３）上のキャップ、下のストッパーを順に外しカラム内の滅菌水をゲル表面まで自然落下させた後、７３０×ｇで２分間遠心分離を行なった。
（２−４）（２−１）から（２−３）により作製したスピンカラムの中央に塩基配列決定用サンプルをアプライし、７３０×ｇで２分間遠心分離によりサンプルをチューブに回収した。
（２−５）回収したサンプルについて減圧乾燥を行なった後、ホルムアミドに溶解した。
（３）（２）で調製した塩基配列決定用サンプルを９５℃で２分間処理し、氷上で急冷後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０−ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析することで、塩基配列を決定した。塩基配列決定に使用した合成ＤＮＡプライマーは、配列番号１５から２２に記載のものを必要に応じて選択し使用した。
（４）決定した塩基配列はＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１１．０．１（商品名）（ゼネティクス製）を使用して解析を行なった。

【0043】

解析の結果、耐熱性変異株から以下に示す７株の変異体がそれぞれ同定された。
（Ａ）配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６５８番目のセリンがグリシンに置換されている変異体。この変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をＳ６５８Ｇ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号２３に、アミノ酸配列を配列番号２４にそれぞれ示す。
（Ｂ）配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の８１３番目のバリンがアラニンに置換されている変異体。この変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をＶ８１３Ａ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号２５に、アミノ酸配列を配列番号２６にそれぞれ示す。
（Ｃ）配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の１９２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換された変異と、７１５番目のトレオニンがメチオニンに置換された変異を持つ変異体。この変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を（Ｄ１９２Ｅ，Ｔ７１５Ｍ）変異体とし、その遺伝子配列を配列番号２７に、アミノ酸配列を配列番号２８にそれぞれ示す。また、１９２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換された変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をＤ１９２Ｅ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０にそれぞれ示し、７１５番目のトレオニンがメチオニンに置換された変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をＴ７１５Ｍ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３１に、アミノ酸配列を配列番号３２にそれぞれ示す。
（Ｄ）配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の５８３番目のアラニンがトレオニンに置換されている変異体。この変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をＡ５８３Ｔ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３３に、アミノ酸配列を配列番号３４にそれぞれ示す。
（Ｅ）配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６５番目のセリンがグリシンに置換されている変異体。この変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をＳ６５Ｇ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３５に、アミノ酸配列を配列番号３６にそれぞれ示す。
（Ｆ）配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の１１３番目のフェニルアラニンがセリンに置換されている変異体。この変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をＦ１１３Ｓ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３７に、アミノ酸配列を配列番号３８にそれぞれ示す。
（Ｇ）配列番号１記載の当該逆転写酵素アミノ酸配列の６８９番目のアラニンがバリンに置換されている変異体。この変異を有するトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をＡ６８９Ｖ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３９に、アミノ酸配列を配列番号４０にそれぞれ示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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