特許 6115126 ヒトＩｇＧ３の精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6115126

(24)【登録日】2017年3月31日

(45)【発行日】2017年4月19日

(54)【発明の名称】ヒトＩｇＧ３の精製方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/22 20060101AFI20170410BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20170410BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20170410BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/22

   C07K16/00

   C12P21/08

【請求項の数】2

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2012-285412(P2012-285412)

(22)【出願日】2012年12月27日

(65)【公開番号】特開2014-125472(P2014-125472A)

(43)【公開日】2014年7月7日

【審査請求日】2015年11月18日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】田中 亨

(72)【発明者】

【氏名】朝岡 義晴

(72)【発明者】

【氏名】井出 輝彦

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−０７２０９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２０６０４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 分子をデザインしてタンパク質の安定性と親和性を向上，産総研 研究成果記事一覧 2010年，p.1-3，http://www.aist.go.jp/aist_j/press_release/pr2010/pr20100317/pr20100317.html

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した吸着剤を用いた、ヒトＩｇＧ３の精製方法であって、ヒトＦｃ結合性タンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質であり、吸着剤に吸着したヒトＩｇＧ３をｐＨ３．５〜５．０で溶出させる前記方法。

【請求項2】

ヒトＩｇＧ３が、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域を含むキメラ抗体、またはヒトＩｇＧ３のＦｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質である、請求項１に記載の精製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はヒトＩｇＧ３を精製する方法に関する。特に本発明は、アフィニティークロマトグラフィーを用いてヒトＩｇＧ３を高純度に精製する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、ガンや感染症等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬）が用いられている。抗体医薬に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（たとえば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィー等を用いて高純度に精製し、製造する。

【0003】

カラムクロマトグラフィーのうち、アフィニティークロマトグラフィーは、吸着対象物質に対し特異的に結合可能な物質（リガンド）を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いたクロマトグラフィーであり、多くの夾雑物を含む培養液から吸着対象物質を特異的に吸着／分離させることができる。

【0004】

抗体精製のためのアフィニティークロマトグラフィー用吸着剤として一般に用いられているのは、黄色ブドウ球菌由来のタンパク質であるプロテインＡをリガンドとした吸着剤（プロテインＡ固定化ゲル）である。プロテインＡ固定化ゲルを用いた抗体精製は、通常、中性付近でプロテイン固定化Ａゲルに抗体を吸着させた後、平衡化緩衝液で当該ゲルを洗浄することで夾雑物を除去し、最後に酸性緩衝液で当該ゲルから吸着した抗体を溶出させることで行ない、１回の操作で抗体純度を９０％以上まで向上させることができる。

【0005】

しかしながら、プロテインＡへの吸着性を有するヒトガンマグロブリン（以下、ヒトＩｇＧとする）は、ヒトＩｇＧの４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のうち、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ４であり、ヒトＩｇＧ３への吸着能は有していない。一方で、ヒトＩｇＧ３には強い薬効を有するものが知られていること（非特許文献１）から、ヒトＩｇＧ３を精製する手法が望まれていた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６，１５１−１６０，２００５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ヒトＩｇＧ３への吸着性を有するアフィニティークロマトグラフィー用吸着剤として、連鎖球菌由来のプロテインＧをリガンドとした吸着剤（プロテインＧ固定化ゲル）が知られている。しかしながらプロテインＧ固定化ゲルは、ヒトＩｇＧ３への吸着性が高いため、当該ゲルから吸着したヒトＩｇＧ３を溶出させるには、ｐＨ２．５からｐＨ３．０の強い酸性溶液を必要とした。このような強い酸性溶液を用いると、抗体の凝集や分解が促進する可能性がある。そのため抗体医薬を製造する目的で、プロテインＧ固定化ゲルによる精製を用いるのは困難であった。

【0008】

またプロテインＧゲル以外で、ヒトＩｇＧ３への吸着性を有するアフィニティークロマトグラフィー用吸着剤として、ラクダ抗体の抗体結合部位をリガンドとした吸着剤が開発されている（製品名 ＨｉＴｒａｐ ＩｇＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア社）。しかしながら抗体結合容量も低く、高価なため、抗体医薬を製造する目的への使用には適さなかった。

【0009】

そこで本発明の目的は、従来の方法では精製が困難であったヒトＩｇＧ３を、穏和な条件下で高純度かつ大量に精製可能な方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した吸着剤を用いることで、穏和な条件で高純度かつ大量にヒトＩｇＧ３を精製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0011】

すなわち、本発明は以下の（Ａ）から（Ｃ）の態様を包含する。

【0012】

（Ａ）ヒトＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した吸着剤を用いた、ヒトＩｇＧ３の精製方法。

【0013】

（Ｂ）ヒトＩｇＧ３が、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域を含むキメラ抗体、またはヒトＩｇＧ３のＦｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質である、（Ａ）に記載の精製方法。

【0014】

（Ｃ）ヒトＦｃ結合性タンパク質が、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、（Ａ）または（Ｂ）に記載の精製方法。

【0015】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0016】

ヒト体内には４種類のＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４）が存在しており、それぞれ特有の機能を担っている。その中でもヒトＩｇＧ３はＣＤＣ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ：補体依存性細胞傷害）活性が他の３種よりも高いことが示されており、この構造を基にした医薬品開発が期待される。

【0017】

ヒトＩｇＧ３を工業に生産するためには、アフィニティークロマトグラフィーを用いた実用的な精製法が必要である。その必要要件は、第一に高純度（例えば、純度９０％以上）のヒトＩｇＧ３が得られること、第二にヒトＩｇＧ３の凝集や分解を最小限に抑えるような穏和な条件で精製可能であること、第三に精製に要するコストや時間を最小限に抑られるだけの十分な抗体吸着容量を有することである。特にヒトＩｇＧ３を抗体医薬目的で利用する場合は、一回の治療で比較的大量に投与する必要があるため、高純度なヒトＩｇＧ３を安価にかつ大量に製造する必要がある。そのため前記第一および第三の要件は必須である。また、ヒトＩｇＧ３は構造上複数のサブユニットがジスルフィド結合などによって会合した構造を有しているため、生理条件から大きく外れる極端なｐＨ、温度、塩濃度、酸化還元状態により、凝集や分解が促進される。そのため、高品質のヒトＩｇＧ３を歩留り良く製造するためには、前記第二の要件も必須である。

【0018】

抗体精製目的で通常用いられるプロテインＡ固定化ゲルは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ４の精製は可能であるが、ヒトＩｇＧ３を精製することができないため、ヒトＩｇＧ３を製造する目的で使用することはできない。プロテインＧ固定化ゲルは、ヒトＩｇＧ３を精製することはできるが、前述したようにゲルへの吸着性が高く、また抗体結合容量も低いため、前記第二および第三の要件が不十分であった。

【0019】

そこで本発明者らはＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルについて、前記第一から第三の要件を検討した結果、以下に示すように、三つ全ての要件を満たしていることが明らかとなった。まず第一の要件について検討した結果、ヒトＩｇＧ３を含む細胞培養液からＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いた精製を行なうことで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびゲルろ過分析による測定で、純度９０％以上のヒトＩｇＧ３を取得できた（実施例４）ことから、第一の要件は満たしているといえる。次に第二の要件について検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルに吸着したヒトＩｇＧ３を溶出させる際、ｐＨ３．０からｐＨ４．０、好ましくはｐＨ３．２からｐＨ３．８程度の比較的弱い酸性溶液でヒトＩｇＧ３を溶出することができる（実施例５）。プロテインＧ固定化ゲルに吸着したヒトＩｇＧ３を溶出させるにはｐＨ２．５からｐＨ３．０の溶液が必要なことから（実施例５）、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いた精製はプロテインＧ固定化ゲルを用いた精製と比較して穏和な条件下で精製できるため、第二の要件も満たしているといえる。そして第三の要件について検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルは、カラム滞留時間５．８分でゲル１ｍＬあたり３０ｍｇ以上のヒトＩｇＧ３を吸着した（実施例６）。ヒトＩｇＧ３の生産コストを考慮すると、少なくともゲル１ｍＬあたり２０ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくはゲル１ｍＬあたり３０ｍｇ以上の動的吸着量が必要となるが、本結果は前記条件を満たしており、第三の要件も満たしているといえる。

【0020】

本発明においてヒトＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域を構成するポリペプチドのうち、少なくともヒトＩｇＧ３のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のヒトＦｃ結合性タンパク質や、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質（特願２０１２−２７０３７５号）や、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列において以下の（１）から（４２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１２−２７０３７５号）があげられる。
（１）配列番号１の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（２）配列番号１の３８番目のプロリンがセリンに置換
（３）配列番号１の５３番目のロイシンがグルタミンに置換
（４）配列番号１の６２番目のグルタミン酸がバリンに置換
（５）配列番号１の６３番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（６）配列番号１の６６番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７）配列番号１の６７番目のセリンがプロリンに置換
（８）配列番号１の６９番目のアラニンがバリンまたはスレオニンに置換
（９）配列番号１の７１番目のセリンがスレオニンまたはロイシンに置換
（１０）配列番号１の７８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１１）配列番号１の８１番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号１の８４番目のセリンがスレオニンに置換
（１３）配列番号１の８８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の１１９番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１６）配列番号１の１２７番目のバリンがアラニンに置換
（１７）配列番号１の１４６番目のアルギニンがリジンに置換
（１８）配列番号１の１４７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の１５１番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２０）配列番号１の１７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（２１）配列番号１の１９１番目のアルギニンがリジンに置換
（２２）配列番号１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（２３）配列番号１の２００番目のロイシンがメチオニンに置換
（２４）配列番号１の２１３番目のスレオニンがアラニンに置換
（２５）配列番号１の２１６番目のバリンがアラニンに置換
（２６）配列番号１の２２１番目のロイシンがアルギニンに置換
（２７）配列番号１の２２９番目のセリンがアスパラギンに置換
（２８）配列番号１の２３６番目のイソロイシンがリジンに置換
（２９）配列番号１の２４４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（３０）配列番号１の２５３番目のスレオニンがアラニンに置換
（３１）配列番号１の２９０番目のアルギニンがグルタミンに置換
（３２）配列番号１の２９３番目のリジンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号１の２９７番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３４）配列番号１の３０６番目のプロリンがスレオニンに置換
（３５）配列番号１３の３４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（３６）配列番号１３の４５番目のグルタミンがリジンに置換
（３７）配列番号１３の８２番目のグルタミンがプロリンに置換
（３８）配列番号１３の１７７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３９）配列番号１３の２１３番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１３の２４２番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４１）配列番号１３の２５３番目のスレオニンがセリンに置換
（４２）配列番号１３の２７１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
本発明において不溶性担体とは、ヒトＩｇＧ３の吸着／溶出に用いる溶液や溶剤に対して不溶性であり、かつ前述したＦｃ結合性タンパク質を共有結合で固定化するための官能基（例えばヒドロキシ基）を有した物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。

【0021】

なお担体表面に有する官能基がヒドロキシ基の場合、活性化剤を用いて、当該ヒドロキシ基から、ヒトＩｇＧ３と共有結合可能な活性化基を形成させるとよい。前記活性化剤の具体例として、エピクロロヒドリン（活性化基としてエポキシ基を形成）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（活性化基としてエポキシ基を形成）、トレシルクロリド（活性化基としてトレシル基を形成）、ビニルブロミド（活性化基としてビニル基を形成）があげられる。また、ヒドロキシ基をアミノ基やカルボキシル基などに変換した後、活性化剤を作用させて活性化基を形成させてもよく、当該活性化剤の具体例として３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（活性化基としてマレイミド基を形成）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（活性化基としてカルボニルイミダゾール基を形成）があげられる。

【0022】

本発明の方法で精製するヒトＩｇＧ３は、少なくとも、本発明の方法で用いる吸着剤のリガンドであるＦｃ結合性タンパク質と吸着可能な、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域を含んでいればよく、完全な形のヒトＩｇＧ３である必要はない。具体的には、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域を含むキメラ抗体や、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域と他のタンパク質との融合体が例示できる。

【発明の効果】

【0023】

本発明は、ヒトＩｇＧ３を精製する際、ヒトＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した吸着剤を用いることを特徴としている。本発明により、これまで穏和な条件下での高純度かつ大量の精製が困難であったヒトＩｇＧ３の精製が可能となったため、ヒトＩｇＧ３を利用した抗体医薬の製造に有用といえる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いてＩｇＧ３を含むＣＨＯ培養上清を精製したとき（実施例４）の、素通り画分と溶出画分をゲルろ過分析した結果を示す図。

【図2】ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いてＩｇＧ３を含むＣＨＯ培養上清を精製したとき（実施例４）の、素通り画分と溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す図。

【図3】プロテインＡ固定化ゲルを用いてＩｇＧ３を含むＣＨＯ培養上清を精製したとき（比較例１）の、素通り画分と溶出画分をゲルろ過分析した結果を示す図。

【図4】プロテインＡ固定化ゲルを用いてＩｇＧ３を含むＣＨＯ培養上清を精製したとき（比較例１）の、素通り画分と溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を示す図。

【図5】ヒトＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ）固定化ゲルとプロテインＧ固定化ゲル（ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ）との、ｐＨグラジエント法によるヒトＩｇＧ３の溶出性を比較した図（実施例５）。

【実施例】

【0025】

以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0026】

実施例１ ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルの調製
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌を形質転換して得られた形質転換体を培養し、得られた菌体から前記Ｆｃ受容体タンパク質を精製することで、不溶性担体に固定化させるリガンドを調製した。
（２）ビニルポリマーゲル（トヨパール、東ソー社製）が有するヒドロキシ基に１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテルおよびエチレンジアミンを順次反応させることによってアミノ基を導入後、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルを反応させて、マレイミド基にて活性化されたトヨパールを得た。
（３）得られた前記活性化トヨパールに（１）で調製したリガンドを反応させることにより、ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを作製した。

【0027】

実施例２ ヒトＩｇＧ３試料の調製
以下に示す方法で、ヒト血漿分画製剤であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所）からヒトＩｇＧ３試料の調製を行なった。
（１）プロテインＡゲルであるＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−６５０Ｆ（東ソー社製）５０ｍＬをＸＫ２６／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填することでアフィニティーカラムを作製した。
（２）（１）で作製したアフィニティーカラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化後、緩衝液Ａで４５ｍｇ／ｍＬに希釈したガンマグロブリン製剤２５ｍＬを流速５ｍＬ／ｍｉｎでアフィニティーカラムに添加し、素通り画分を回収した。
（３）（２）で回収した素通り画分を限外ろ過膜（ミリポア社製）にて５ｍＬまで濃縮後、あらかじめ緩衝液Ｂ（０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したゲルろ過カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（２１．５ｍｍφ×３０ｃｍ）、東ソー社製）に、流速３ｍＬ／ｍｉｎで添加し、３ｍＬずつ画分を回収した。
（４）（３）で回収した画分の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認後、ヒトＩｇＧ３を多く含む画分を集めて、限界ろ過膜（ミリポア社製）にて濃縮した。
（５）上記（１）から（４）の操作を繰り返すことで、約５０ｍｇのヒトポリクローナルＩｇＧ３を調製した。

【0028】

実施例３ ヒトＩｇＧ３を含むＣＨＯ細胞培養上清の調製
（１）抗ＩＬ−８抗体（ヒトＩｇＧ１）を生産するＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１２４４５）を培養し、清澄化してＣＨＯ細胞培養液を得た。
（２）得られた培養液を、プロテインＡゲルを充填したカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥヘルスケア社製）に添加することで抗ＩＬ−８抗体を吸着させ、素通り画分を回収することで抗体を含まないＣＨＯ細胞培養液を得た。
（３）（２）で調製した培養液に、実施例２で調製したヒトＩｇＧ３試料を、終濃度０．８ｍｇ／ｍＬとなるように添加することで、ヒトＩｇＧ３を含むＣＨＯ細胞培養上清を調製した。

【0029】

実施例４ ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルによるＣＨＯ細胞培養上清からのヒトＩｇＧ３精製
実施例３で調製したヒトＩｇＧ３を含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを、実施例１で作製したヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲル（５ｍｍφ×２０ｍｍ、容量０．４ｍＬ）を用いて精製した。精製条件を表１に示す。

【0030】

【表1】

【0031】

精製前の培養上清、素通り画分、溶出画分について、ゲルろ過分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ない組成と純度を確認した。なおゲルろ過分析は、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍΦ×３０ｃｍ、東ソー社製）を、溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで測定した。ゲルろ過分析の結果（クロマトグラム）を図１に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図２にそれぞれ示す。両分析の結果、ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる精製で、純度９０％以上のヒトＩｇＧ３が得られることを確認した。

【0032】

比較例１ プロテインＡ固定化ゲルによるＣＨＯ細胞培養上清からのＩｇＧ３精製
実施例３で調製したヒトＩｇＧ３を含むＣＨＯ細胞培養上清１ｍＬを、１ｍＬ容のプロテインＡゲルカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。精製条件を表２に示す。

【0033】

【表2】

【0034】

精製前の培養上清、素通り画分、溶出画分について、実施例４と同様のゲルろ過分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ない組成と純度を確認した。ゲルろ過分析の結果（クロマトグラム）を図３に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図４にそれぞれ示す。両分析の結果、ヒトＩｇＧ３は全て素通り画分中にあり、ヒトＩｇＧ３の精製ができていないことがわかる。

【0035】

実施例５ ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルとプロテインＧ固定化ゲルのヒトＩｇＧ３溶出性の比較
（１）実施例１で作製したヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルおよび市販のプロテインＧ固定化ゲル（ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ＨＰ、ＧＥヘルスケア社製）を、それぞれ空カラム（５ｍｍφ×５ｍｍ）に充填して、アフィニティーカラムを作製した。
（２）作製した各アフィニティーカラムに対し、実施例２で調製したヒトＩｇＧ３試料を添加してヒトＩｇＧ３を吸着させ、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄後、ｐＨグラジェントをリニアにかける溶出を行なうことで、アフィニティーカラムからのヒトＩｇＧ３の溶出し易さを評価した。実験条件を表３に示す。

【0036】

【表3】

【0037】

得られたクロマトグラムを図５に示す。ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いた場合、プロテインＧ固定化ゲルを用いた場合と比較して、ヒトＩｇＧ３が中性側で溶出されていることがわかる。つまり、ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いたヒトＩｇＧ３の精製は、従来のゲル（プロテインＧ固定化ゲル）を用いた精製と比較し、より穏和な条件で精製できることがわかる。

【0038】

実施例６ ヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルのヒトＩｇＧ３動的結合量測定
（１）実施例１で作製したヒトＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルを４．６ｍｍφ×３５ｍｍのステンレス製カラムに充填してアフィニティーカラムを作製した。
（２）実施例２で調製したヒトＩｇＧ３試料を濃度１ｍｇ／ｍＬとなるようＰＢＳで希釈後、（１）で作製したアフィニティーカラムに、流速０．１ｍＬ／分で添加した。本条件でのアフィニティーカラム滞留時間は５．８分となる。
（３）アフィニティーカラムから溶出した液を吸光度２８０ｎｍでモニターし、溶出液の濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ（１０％破過）となるまでヒトＩｇＧ３試料溶液を通液した。

【0039】

結果、１０％破過までに要する時間は１７６分であり、それまでに添加したヒトＩｇＧ３量はゲル１ｍＬあたり３０．３ｍｇであった。本測定で添加したヒトＩｇＧ３量は動的吸着量と同じ意味である。なお同様の測定を流速０．３ｍＬ／分、すなわち滞留時間１．９分で行なったところ、１０％破過までに要する時間は４７分であり、添加したヒトＩｇＧ３量（動的吸着量）はゲル１ｍＬあたり２４．１ｍｇであった。

【産業上の利用可能性】

【0040】

本発明は、従来の抗体用アフィニティークロマトグラフィー用吸着剤では精製が困難であったヒトＩｇＧ３を、穏和な条件下で高純度かつ大量に精製することができる。ヒトＩｇＧ３は、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性がヒトＩｇＧの他のサブクラスよりも高いことが知られていることから、本発明によりヒトＩｇＧ３を利用した抗体医薬の開発や利用が促進されることが期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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