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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6141257
(24)【登録日】2017年5月12日
(45)【発行日】2017年6月7日
(54)【発明の名称】Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体及びその利用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20170529BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20170529BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20170529BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 B
G01N33/543 545A
G01N33/53 R
!C07K14/47
【請求項の数】9
【全頁数】25
(21)【出願番号】特願2014-508077(P2014-508077)
(86)(22)【出願日】2013年3月29日
(86)【国際出願番号】JP2013059467
(87)【国際公開番号】WO2013147123
(87)【国際公開日】20131003
【審査請求日】2016年3月11日
(31)【優先権主張番号】特願2012-78540(P2012-78540)
(32)【優先日】2012年3月30日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000206956
【氏名又は名称】大塚製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】下村 伊一郎
(72)【発明者】
【氏名】船橋 徹
(72)【発明者】
【氏名】岸田 堅
(72)【発明者】
【氏名】小林 宏規
(72)【発明者】
【氏名】高橋 重雄
【審査官】
草川 貴史
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００５／１２１７９４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開平０２−２８７２５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Peake PW, Shen Y, Walther A, Charlesworth JA.，Adiponectin binds C1q and activates the classical pathway of complement，Biochem Biophys Res Commun.，２００８年，Vol.367, No. 3 ，Page.560-565
【文献】
Kishida K，外６名，Serum C1q- binding adiponectin in maintenance hemodialysis patients.，BMC Nephrol.，２０１３年 ２月２６日，Vol.14，doi: 10.1186/1471-2369-14-50.
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃ１ｑ及びアディポネクチンからなるＣ１ｑ−アディポネクチン複合体。
【請求項2】
請求項１に記載のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の量の測定方法であって、当該複合体の量を免疫学的測定法によって測定することを含む方法。
【請求項3】
免疫学的測定法がＥＬＩＳＡ法である請求項２に記載の測定方法。
【請求項4】
ＥＬＩＳＡ法が抗アディポネクチン抗体及び抗Ｃ１ｑ抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法である請求項３に記載の測定方法。
【請求項5】
抗アディポネクチン抗体がＦ（ａｂ’）２である請求項４に記載の測定方法。
【請求項6】
請求項２〜５のいずれかに記載の測定方法により、診断対象から採取した血液中の請求項１に記載のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の量を測定することを含む、被験者のメタボリックシンドローム又は動脈硬化のリスクの試験方法。
【請求項7】
血液中の総アディポネクチン量に対する請求項１に記載のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の量の比（Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比）を指標とする、請求項６に記載の試験方法。
【請求項8】
請求項１に記載のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の量を測定するための測定用キットであって、抗アディポネクチン抗体及び抗Ｃ１ｑ抗体の組み合わせを含有するキット。
【請求項9】
メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクを診断するための請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体（本明細書中、Ｃ１ｑ−ＡＰＮと略記する場合がある。）及びその利用に関する。また、本発明はＣ１ｑ−アディポネクチン複合体を測定する方法、及びこの複合体を測定することによりメタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクを診断する方法にも関する。【背景技術】
【0002】
メタボリックシンドローム（本明細書中、ＭｅｔＳと略記する場合がある。）に罹患している患者は、動脈硬化の危険性、並びに心臓病、及び脳卒中等の命にかかわる病気の危険性が高い状態にあると言うことができる。従って、ＭｅｔＳの予防又は治療を行うために、その適切な診断方法が求められている。【0003】
内臓脂肪蓄積を基盤とした、インスリン抵抗性及び耐糖能異常、動脈硬化惹起性リポタンパク質異常、並びに高血圧症などの症状がＭｅｔＳの主要な病態として挙げられる。ＭｅｔＳは、内臓脂肪蓄積と、２つ以上の病的状態の組み合わせとして定義され、２００５年４月に日本では内科分野の８つの学会より、その診断基準が作成された。具体的には、内臓脂肪肥満を有し、且つ高血圧、脂質代謝異常、及び空腹時高血糖のうちの２つ以上を有する場合に、ＭｅｔＳと診断される（非特許文献１）。【0004】
近年、動脈硬化性病変の程度を評価する様々な測定方法が開発され、それらの有用性が示されている。その代表的な検査方法としては、例えば、（１）頸部超音波により頸動脈内膜複合体肥厚度（intima-media thickness: IMT）を測定する頸動脈超音波検査法、（２）腕−足首間の血圧又は脈波の伝達速度を測定することで動脈硬化度を数値化するＰＷＶ（pulse wave velocity）検査又はＣＡＶＩ（cardio-ankle vascular index）検査が挙げられる。【0005】
このような診断方法に加えて、内臓脂肪蓄積に伴うＭｅｔＳ、又は動脈硬化性疾患の血液指標として総アディポネクチン（本明細書中、Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮと略記する場合がある。）量の測定法又は高分子量アディポネクチン（本明細書中、ＨＭＷ−ＡＰＮと略記する場合がある。）量の測定法（特許文献１）が開発された。【0006】
一方、後記のように、内臓脂肪蓄積に伴う血中のアディポネクチン（本明細書中、ＡＰＮと略記する場合がある。）の量の低下が、糖尿病・高脂血症・高血圧に加えて心血管疾患にも直接関与することを示す基礎研究及び臨床研究成果が集積されている。例えば、臨床的研究及び基礎的研究から、アディポネクチンは抗糖尿病作用及び抗動脈硬化作用を有することが報告されている（非特許文献２）。特に、肥満に伴う血中アディポネクチン濃度の低下は低アディポネクチン血症と呼ばれ、糖尿病（非特許文献３）又は高血圧（非特許文献４）、睡眠時無呼吸症候群（非特許文献５）、動脈硬化性心血管疾患（非特許文献６）、メタボリックシンドローム（非特許文献７）といった肥満に関連した各種疾患に深く関与することが明らかにされている。【0007】
従って、血中アディポネクチン量の測定は、ＭｅｔＳ診断マーカーとなり得る可能性が期待されている。【0008】
ところで、非特許文献８には、酸化剤（メタ過よう素酸ナトリウム）によって化学的に処理されたアディポネクチン及びＣ１ｑからなる複合体が開示されているが、天然の状態でアディポネクチンとＣ１ｑとが複合体を形成することは、これまで知られていない。【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】国際公開第２００９／０７８１５１号パンフレット
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】メタボリックシンドローム診断基準検討委員会：メタボリックシンドロームの定義と診断基準．日本内科学会雑誌94: 794-809、2005
【非特許文献2】Matsuzawa Y. Adiponectin: a key player in obesity related disorders. Curr Pharm Des. 2010;16: pp.1896-901.
【非特許文献3】Hotta K, Funahashi T, Arita Y, et al., Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000;20: pp.1595-9.
【非特許文献4】Ohashi K, Kihara S, Ouchi N, et al., Adiponectin replenishment ameliorates obesity-related hypertension. Hypertension. 2006; 47: pp.1108-16.
【非特許文献5】Nakagawa Y, Kishida K, Kihara S, et al., Nocturnal reduction in circulating adiponectin concentrations related to hypoxic stress in severe obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2008; 294: pp.E778-84.
【非特許文献6】Ouchi N, Kihara S, Arita Y, et al., Novel modulator for endothelial adhesion molecules: adipocyte-derived plasma protein adiponectin. Circulation. 1999; 100: pp.2473-6.
【非特許文献7】Ryo M, Nakamura T, Kihara S, et al., Adiponectin as a biomarker of the metabolic syndrome. Circ J. 2004; 68: pp.975-81.
【非特許文献8】Peake PW et al., Adiponectin binds C1q and activates the classical pathway of complement. Biochem Biophys Res Commun.367:560-565,2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
上述のように、アディポネクチン（本明細書中、ＡＰＮと略記する場合がある。）は、ＭｅｔＳ又は動脈硬化性疾患の診断マーカーとして期待されているバイオマーカーであり、その測定法としてＴｏｔａｌ−ＡＰＮ量測定法及びＨＭＷ−ＡＰＮ量測定法が開発されている。しかし、現状では、これらの測定方法は精度が十分であるとはいえず、更に精度の高いマーカーが必要とされている。
また、Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ量測定では、ＳＤＳ存在下で加熱処理することにより立体構造を解離するため、アディポネクチンの質的変化は検出できない。更に、また、ＨＭＷ−ＡＰＮ量測定では、６量体以上のアディポネクチン多量体を検出できる一方、検出できる多量体構造に特異性はない。
【0012】
一方、アディポネクチン関連の測定法では、量的変化に加えて質的変化の検出が重要となる可能性が想定されている。血中でのアディポネクチン複合体存在様式が解明でき、血中アディポネクチン複合体の特異的な検出法が開発できれば、アディポネクチン単独測定法よりも効率良く内臓脂肪蓄積に伴ったＭｅｔＳ又は動脈硬化性疾患高リスク群を診断できる可能性がある。【0013】
従って、本発明は、ＭｅｔＳ又は動脈硬化リスクの精度が高い診断マーカーとして用いることができるバイオマーカーを提供することを課題とする。【課題を解決するための手段】
【0014】
近年、アディポネクチンは他のタンパク質と直接結合する可能性が示唆されており、インビトロでの解析から、アディポネクチンは、補体Ｃ１ｑ（非特許文献８）をはじめＦａｃｔｏｒ Ｈ（非特許文献９）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）−ＢＢ（非特許文献１０）、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ（非特許文献１１）、ＣｙｓｔａｔｉｎＣ（非特許文献１２）、リポポリサッカリド（非特許文献１３）といったタンパク質又は糖脂質と結合することが示されている。しかしながら、ヒト血中に存在している内在性アディポネクチンがこれらの因子と結合していることは解析されておらず、血中のアディポネクチンが他のタンパク質との複合体を形成しているかは不明であった。【0015】
一方、大阪大学を中心とした研究より、（１）ヒト脂肪組織は、補体の古典的活性化経路及び第２経路に関与する遺伝子群を豊富に発現していること（非特許文献１４）、（２）アディポネクチンは、Ｃ１ｑと相同性が高くＣ１ｑ受容体に結合すること（非特許文献１５）、（３）マウス関節炎モデルでの解析より、アディポネクチンはＣ１ｑ又はＣ３を阻害することにより炎症又は関節破壊を抑制することが報告されている（非特許文献１６）。【0016】
本発明者らは、本発明において、ファーウエスタンブロット法、及びタンパク質固相化プレートを用いたインビトロ相互作用解析からアディポネクチン結合タンパク質探索を進め、Ｃ１ｑがアディポネクチンと強く結合することを見出した。更に、抗ヒトアディポネクチン抗体及び抗ヒトＣ１ｑ抗体を用いた共免疫沈降法より、ヒト血清中の内在性アディポネクチンに関してもＣ１ｑと直接結合していることを世界で初めて証明した。【0017】
非特許文献９：Peake PW et al., Factor H binds to the N-terminus of adiponectin and modulates complement activation. Biochem Biophys Res Commun. 397:361-366,2010非特許文献１０：Arita Y, Kihara S, Ouchi N et al., Adipocyte-derived plasma protein adiponectin acts as a platelet-derived growth factor-BB-binding protein and regulates growth factor-induced common postreceptor signal in vascular smooth muscle cell. Circulation. 2002; 105: 2893-8.
非特許文献１１：Takemura Y, Ouchi N, Shibata R、et al., Adiponectin modulates inflammatory reactions via calreticulin receptor-dependent clearance of early apoptotic bodies. J Clin Invest. 2007; 117: 375-86.
非特許文献１２：Komura N, Kihara S, Sonoda M, et al., Increment and impairment of adiponectin in renal failure. Cardiovasc Res. 2010; 86: 471-7.
非特許文献１３：Peake PW et al., Human adiponectin binds to bacterial lipopolysaccharide. Biochem Biophys Res Commun. 341:108-115,2006.
非特許文献１４：Maeda K, Okubo K, Shimomura I, et al., Analysis of an expression profile of genes in the human adipose tissue. Gene. 1997; 190: 227-35
非特許文献１５：Yokota T, Oritani K, Takahashi I, et al., Adiponectin, a new member of the family of soluble defense collagens, negatively regulates the growth of myelomonocytic progenitors and the functions of macrophages. Blood. 2000; 96: 1723-32.
非特許文献１６：Ebina K, Oshima K, Matsuda M, et al., Adenovirus-mediated gene transfer of adiponectin reduces the severity of collagen-induced arthritis in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2009; 378: 186-91.
【0018】
本発明者らは、次に、臨床的意義を明確にすることを目的に、ヒト血清中のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体を簡便に測定することが可能なサンドイッチＥＬＩＳＡ法の開発を行った。Ｃ１ｑには、抗体のＦｃ領域に結合し補体経路を活性化させる生理機能が知られている。この生理機能が非特異反応の原因となりＣ１ｑ−アディポネクチン複合体のＥＬＩＳＡ測定法の構築を困難にさせていた。本課題を解決するためにＦｃ領域を除去したＦ（ａｂ’）２抗体を作製し、固相化抗体として用いることで非特異反応の除去を実現した。以上の条件検討より、プレート固相化抗体として抗ヒトアディポネクチン−Ｆ（ａｂ’）２抗体を用い、検出抗体として抗ヒトＣ１ｑ抗体を用いることで血清中のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体を簡便に特異的かつ高精度に検出できるＥＬＩＳＡ法を完成するに至った。【0019】
アディポネクチン複合体のヒト血清中での存在様式及び臨床的意義は、本発明にて構築したＣ１ｑ−アディポネクチン複合体ＥＬＩＳＡ法を用いることにより世界で初めて可能となった。本発明者らは、まず、ゲル濾過クロマトグラフィーにてヒト血清を分子量分画し、各分画におけるＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の存在量を測定した。本解析から、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体は、高分子量及び中分子量分画のアディポネクチンと同一の分子量サイズに存在していることを見出した。
【0020】
本発明者らは、次に、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体の臨床的意義を評価することを目的として、健常者３２９例における血中量を測定した。本解析では、総アディポネクチン（Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ）量に対するＣ１ｑ−アディポネクチン複合体（Ｃ１ｑ−ＡＰＮ）の存在量比（Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比）を新たな血液指標として開発した。興味深いことに、本指標は、非リスク群と比較して内臓脂肪蓄積に伴うＭｅｔＳ及び心血管疾患高リスク群にて有意に高値を示していた。【0021】
以上の結果より、本測定法及び解析法は、血中アディポネクチンの量的変化に加えて、アディポネクチンの質的変化という新たな観点からの評価を可能とした。したがって、本指標の臨床利用は、内臓脂肪蓄積に伴うＭｅｔＳ又は動脈硬化性疾患高リスク群を効率良く抽出するために非常に重要である。【0022】
すなわち、本発明は、次の各態様を含む。【0023】
項１．Ｃ１ｑ及び天然型アディポネクチンを含有するＣ１ｑ−アディポネクチン複合体。項２．項１に記載のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の量の測定方法であって、当該複合体の量を免疫学的測定法によって測定することを含む方法。
項３．免疫学的測定法がＥＬＩＳＡ法である項２に記載の測定方法。
項４．ＥＬＩＳＡ法が抗アディポネクチン抗体及び抗Ｃ１ｑ抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法である項３に記載の測定方法。
項５．抗アディポネクチン抗体がＦ（ａｂ’）２である項４に記載の測定方法。
項６．項２〜５のいずれかに記載の測定方法により、診断対象から採取した血液中の項１に記載のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の量を測定することを含む、メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクの診断方法。
項７．血液中の総アディポネクチン量に対する項１に記載のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の量の比（Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比）を指標とする、項６に記載の診断方法。
項８．項１に記載のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の量を測定するための測定用キットであって、抗アディポネクチン抗体及び抗Ｃ１ｑ抗体を含有するキット。
項９．メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクを診断するための項８に記載のキット。
【発明の効果】
【0024】
本発明により、メタボリックシンドローム又は動脈硬化のバイオマーカ−として有用なＣ１ｑ−アディポネクチン複合体及びその測定方法が提供される。また、従来の総アディポネクチン測定法及び高分子量アディポネクチン測定法より精度の高いＭｅｔＳ又は動脈硬化リスクの診断を行うことが可能になる。【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1.A】ヒトアディポネクチン組換えタンパク質と補体Ｃ１ｑ精製タンパク質との結合解析におけるファーウエスタンブロットの写真である（実施例１）。
【図1.B】ヒトアディポネクチン組換えタンパク質と補体Ｃ１ｑ精製タンパク質との結合解析の結合評価結果のグラフである（実施例１）。
【図1.C】ヒトアディポネクチン組換えタンパク質と補体Ｃ１ｑ精製タンパク質との結合解析の結合評価結果のグラフである（実施例１）。
【図2.A】ヒト血清中におけるアディポネクチンとＣ１ｑの結合解析において、アディポネクチン及びＣ１ｑの多量体構造の検出を示すウエスタンブロットの写真である（実施例２）。
【図2.B】ヒト血清中におけるアディポネクチンとＣ１ｑの結合解析において、アディポネクチン免疫沈降結果を示すウエスタンブロットの写真である（実施例２）。
【図2.C】ヒト血清中におけるアディポネクチンとＣ１ｑの結合解析において、Ｃ１ｑ免疫沈降結果を示すウエスタンブロットの写真である（実施例２）。
【図3.A】ＥＬＩＳＡ法の開発において作成した標準曲線である（実施例３、実施例４）。
【図3.B】ＥＬＩＳＡ法の開発において作成した希釈曲線である（実施例３、実施例４）
【図3.C】ヒト血清中Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体のゲル濾過分画の様式を示すグラフである（実施例３、実施例４）。
【図4.A】ヒト血清中のＣ１ｑ測定ＥＬＩＳＡ法の構築において作成した標準曲線である（実施例５）。
【図4.B】ヒト血清中のＣ１ｑ量の測定結果のグラフである（実施例５）。
【図4.C】タンパク質濃度と吸光度の相関を示すグラフである（実施例５）。
【図5】健常者３２９例における血清中の、Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ、ＨＭＷ−ＡＰＮ、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ、Ｃ１ｑの相関関係を示すグラフである（実施例６）。
【図6】健常者３２９例において、メタボリックシンドローム有無判定に対するＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線解析を示すグラフである（実施例７）。
【図7】内臓脂肪蓄積における各種アディポネクチン関連指標と肥満関連心血管リスクファクター集積との関係を示すグラフ（Box-and-whisker表記）である（実施例８）。
【発明を実施するための形態】
【0026】
１．Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体
【0027】
本発明のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体は、天然型アディポネクチン及びＣ１ｑを含有する。本発明のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体は、好ましくは、天然型アディポネクチン及びＣ１ｑからなる。【0028】
１．１ 天然型アディポネクチンアディポネクチンは２４４アミノ酸より構成される生理活性タンパク質であり、脂肪細胞から分泌される。Ｎ末端側にはシグナルペプチド・コラーゲン様ドメイン、そしてＣ末端側には球状ドメインを有する。特に球状ドメインは、コラーゲンＶ又はＶＩＩＩ、そして補体成分Ｃ１ｑと高いホモロジーを有することが知られている（非特許文献１７）。ヒトにおいてアディポネクチンは、４〜３０μｇ／ｍＬの濃度にて血中に存在しており、内臓脂肪の蓄積に伴い低下することが示されている（非特許文献１８）。アディポネクチンはコラーゲン様ドメインなど特徴的な立体構造を有していることから、血液中では、３量体、６量体、それ以上の多量体（HMW；High molecular weight multimer）といった多様な立体構造を形成していることが想定されている（非特許文献１９）。
本発明における天然型アディポネクチンは、これらのいずれであってもよく、また、これらの混合物であってよい。
【0029】
非特許文献１７：Okamoto Y, Arita Y, Nishida M, et al., An adipocyte-derived plasma protein, adiponectin, adheres to injured vascular walls. Horm Metab Res. 2000; 32:47-50.非特許文献１８：Arita Y, Kihara S, Ouchi N, et al., Paradoxical decrease of an adipose-specific protein, adiponectin, in obesity. Biochem Biophys Res Commun. 1999; 257:79-83
非特許文献１９：Pajvani UB, Du X, Combs TP, Berg AH, Rajala MW, Schulthess T, Engel J, Brownlee M, Scherer PE. Structure-function studies of the adipocyte-secreted hormone Acrp30/adiponectin. Implications fpr metabolic regulation and bioactivity. J Biol Chem. 2003 Mar 14;278(11):9073-85
【0030】
本明細書中、天然型アディポネクチンとは、自然界から単離されるアディポネクチンを意味する。従って、酸化剤等によって化学的に処理されて構造が改変されたアディポネクチンは、本発明における天然型アディポネクチンからは除外される。【0031】
アディポネクチンは、天然には、脂肪細胞によって産生され、血液等の中に含有される。天然型アディポネクチンは、好ましくは、血液から単離されるアディポネクチンである。なお、本明細書中、「血液から単離される」とは、間接的に血液から単離されることを包含する。すなわち、例えば、血清から単離されるアディポネクチンは、血液から単離されるアディポネクチンである。
【0032】
このような天然型アディポネクチンは、血液から抽出した粗精製の天然型アディポネクチンを、所望により、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等の公知のタンパク質精製法によって精製することによって得られる。【0033】
一方、本発明における天然型アディポネクチンには、自然界から単離されるアディポネクチンと同じ構造を有するアディポネクチンも包含される。天然型アディポネクチンは、自然界から単離されるアディポネクチンと同じ構造を有する限り、遺伝子工学的手法によって製造された、組換えアディポネクチンであってもよい。組換えアディポネクチンは、この分野で周知慣用の手法に従って、大腸菌、酵母、又は哺乳動物細胞株（例、293細胞、CHO細胞）の遺伝子組換えによって作製することができる。
【0034】
１．２ Ｃ１ｑＣ１ｑは、１８サブユニット（各６分子ずつのＡ鎖・Ｂ鎖・Ｃ鎖）より構成される約４６２ｋＤａのタンパク質であり、非特許文献２０によれば、ヒト血中には８０μｇ／ｍＬにて存在している。Ｃ１ｑは補体活性化経路の第１因子Ｃ１の主要構成因子であり、抗原抗体複合体を認識する。
本発明におけるＣ１ｑは、特に限定されず、例えば自然界から単離されるＣ１ｑであることができる。
【0035】
非特許文献２０：Sunyer,J.O. and Lambris,J.D.（1999). Complement. Encyclopedia of Life Sciences【0036】
Ｃ１ｑは、例えば、特開平９−１７８７４５に記載の方法のように、血清又は血漿を透析して得られるＣ1ｑ粗精製物溶液をＩｇＧ固定化不溶性担体に接触させた後、当該不溶性担体に吸着したＣ1ｑを分離回収する方法などの、公知の方法によって調製することができる。【0037】
本発明のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体においては、天然型アディポネクチンとＣ１ｑとが、直接的に、かつ非共有結合によって結合している。【0038】
本発明のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体における、天然型アディポネクチンとＣ１ｑとの重量比は、通常１：１０〜１０：１、好ましくは１：３〜３：１、より好ましくはおよそ１：１である。【0039】
本発明のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体は、水系溶媒（例、リン酸緩衝液）中で、天然型アディポネクチンと、Ｃ１ｑとを、前記の比率で、混合、及び攪拌することによって得られる。【0040】
攪拌時間は、通常、１〜４８時間、好ましくは、１２〜３６時間である。攪拌時の温度は、好ましくは、２０〜４０℃である。
【0041】
２．Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体の量の測定方法
【0042】
本発明の、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体の量を測定する方法（以下、単に本発明の測定方法と称する場合がある）は、免疫学的測定法によって当該複合体の量を測定することを特徴とする。【0043】
本発明の測定方法において使用できる生体試料としては、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体を含有し得る試料であれば特に限定されず、ヒト、サル、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット及びその他の哺乳類の動物から得られた血液（血清、血漿）などの体液、組織抽出液、組織由来細胞の培養上清液などが挙げられる。ヒトのＭｅｔＳ、又は動脈硬化リスクの診断が測定の目的である場合は、生体試料は、好ましくは、ヒトの血液（血清、血漿）である。試料の採取方法は、測定の目的等に応じて適宜決定すればよいが、例えば、空腹時の検査対象からの採血などによって行われる。
【0044】
免疫学的測定法としては、例えば、ウェスタンブロッティング法、ドットブロット法、免疫沈降法、酵素免疫測定法（EIA；enzyme-immuno assay、ELISA；enzyme-linked immunosorbent assay）、放射線免疫測定法（RIA；radio-immuno assay）、蛍光抗体法（FIA；fluorescent immuno assay）、免疫組織染色、又は免疫クロマトグラフィー法等の公知の免疫学的測定法を採用することができる。このような、免疫学的測定法は、それぞれについて慣用の方法に従って実施すればよい。
【0045】
本発明の測定方法における免疫学的測定法では、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体を認識する抗体が用いられる。当該抗体は、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体を認識できるものであれば特に限定無く用いることができる。当該抗体は、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体に対する特異的抗体（抗Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体抗体）であってもよく、抗アディポネクチン抗体と抗Ｃ１ｑ抗体の組み合わせであってもよいが、好ましくは、抗アディポネクチン抗体と抗Ｃ１ｑ抗体の組み合わせである。【0046】
当該抗体は、モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体であることができ。当該抗体は、例えば、アディポネクチン、Ｃ１ｑ、又はそれらの部分ペプチドを抗原として用いて得ることができるが、これらの抗体は、市販品として入手することも可能である。
以下に、抗アディポネクチン抗体、及び抗Ｃ１ｑ抗体の製造方法を説明する。
【0047】
モノクローナル抗体は、公知の方法に基づいて作製することができる。具体的には、温血動物（例、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ）に抗原を感作させ、免疫された個体の免疫関連細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、その中から目的の特異的抗体を産生するハイブリドーマを選択する。温血動物に感作させる抗原であるアディポネクチン及びＣ１ｑとしては、それぞれ前記で説明したアディポネクチン及びＣ１ｑ又はそれらの部分ペプチドを用いればよい。当該部分ペプチドは、アディポネクチン及びＣ１ｑをそれぞれ適当なペプチダーゼで切断すること、又は固相合成法等の化学的合成方法によって合成すること等の公知の製造方法によって得ることができる。
これらの抗原は、そのまま、又は免疫動物の抗体産生能を高めるため、フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント等のアジュバントと混合、又はエマルションを調製して前記動物に投与してもよい。
通常、０．１〜１００μｇ／ｂｏｄｙの量の抗原を用い、１回から数回程度（隔週程度で免疫する）の免疫を行う。抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に、牌臓、胸腺、又はリンパ節を摘出し、それらから採取した細胞を、マウスミエローマ細胞株（例、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１）とポリエチレングリコール法等の公知の方法を用いて融合させ、ハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマの選別は、抗原を吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、次いで標識した抗免疫グロブリン抗体等を反応させることにより、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法等の公知の方法によって行うことができる。
【0048】
ポリクローナル抗体は、前記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、当該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。【0049】
本発明の測定方法における免疫学的測定法としては、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。また、本発明の測定方法における免疫学的測定法としては、サンドイッチ法が好ましい。本発明の測定方法における免疫学的測定法として、特に好ましくは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法である。当該サンドイッチＥＬＩＳＡ法、慣用の条件、及び手法に準じて実施される。【0050】
本発明の測定方法におけるサンドイッチＥＬＩＳＡの好ましい態様は、抗アディポネクチン抗体を不溶化する段階、
当該不溶化された抗体に試料を接触させて、当該抗体に試料中のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体を結合させる段階、
前記Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体に、抗Ｃ１ｑ抗体を結合させる段階、及び
標識された抗体（二次抗体）を前記Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体に結合した抗Ｃ１ｑ抗体に結合させる段階
を含む。
【0051】
抗アディポネクチン抗体の不溶化は、例えば、プレート及びその他の容器壁、ビーズ、スライド、樹脂膜、カラム等公知の担体に抗アディポネクチン抗体を化学結合又は物理結合することによって行うことができる。【0052】
当該測定方法に用いられる抗体は、完全抗体分子であってもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＶＨ等のフラグメントであってもよく、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｄｓＦｖ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子であってもよく、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾された誘導体などであってもよい。ここで、Ｃ１ｑは、抗アディポネクチン抗体のＦｃ領域に不都合に結合し得るので、抗アディポネクチン抗体としては、Ｆ（ａｂ’）２が好ましい。
前記フラグメントは、抗体をパパイン又はペプシン等の酵素で処理するか、又はこれら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを任意の宿主細胞中で発現させることで得ることができる。
【0053】
抗Ｃ１ｑ抗体に結合させる標識された抗体（二次抗体）は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、又はβ−ガラクトシダーゼ等の酵素；１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ、又は３Ｈ等の放射性同位体；或いはフルオロセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光化合物等により慣用の方法で標識されたＩｇＧ抗体である。【0054】
３．メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクの診断方法本発明のメタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクの診断方法は、診断対象から採取した血液中のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の量を測定することを含む。
【0055】
本発明のメタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクの診断方法では、当該Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体の量自体、又はこれから導かれる数値を指標として用いて、メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクを診断する。すなわち、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体は、メタボリックシンドローム又は動脈硬化のマーカーとして有効に用いられる。
【0056】
本発明の診断方法で指標として用いられる数値としては、例えば、血液中のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の量、
血液中の総アディポネクチン量に対するＣ１ｑ−アディポネクチン複合体量の比（Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比）、
血液中の高分子量アディポネクチン（ＨＭＷ−ＡＰＮ）量に対するＣ１ｑ−アディポネクチン複合体量の比（Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／ＨＭＷ−ＡＰＮ比）
が挙げられる。
これらのなかでも、メタボリックシンドローム又は動脈硬化との相関関係の高さから、好ましくは、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比、又はＣ１ｑ−ＡＰＮ／ＨＭＷ−ＡＰＮ比であり、より好ましくはＣ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比である。ここで、高分子量アディポネクチン量と、総アディポネクチン量とは、相関性が高いことが知られている。
【0057】
これらの数値の算出に用いられる総アディポネクチン量、及び高分子量アディポネクチン量の測定は、公知の方法によって行うことができる。このような公知の方法としては、例えば、前記特許文献１に記載の高分子量アディポネクチン測定法が挙げられる。また、市販の測定キットを用いて測定してもよい。【0058】
メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクの診断においては、診断対象について得られた数値を、例えば、メタボリックシンドローム又は動脈硬化に罹患していないことが知られている対象について得られた数値、及びメタボリックシンドローム又は動脈硬化に罹患していることが知られている対象について得られた数値に基づいて決定された基準値（又は、カットオフポイント）と比較する。例えば、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比を用いる場合、かかる基準値より高い場合に、メタボリックシンドローム又は動脈硬化に罹患しているか、或いはそのリスクが高いと判断される。
【0059】
当該指標は、単独で用いられてもよく、メタボリックシンドローム又は動脈硬化リスクの診断においては、これらの診断において用いられる他の指標と組み合わせて用いられてもよい。【0060】
４．キット本発明によれば、前記方法を利用した、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体を選択的に測定するためのキットもまた提供される。
本発明のキットは、抗Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体抗体、又は抗アディポネクチン抗体及び抗Ｃ１ｑ抗体の組み合わせを備える。
これらの抗体としては、それぞれ前記したものを用いることができる。
【0061】
好ましくは、抗Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体抗体は、又は抗アディポネクチン抗体及び抗Ｃ１ｑ抗体のいずれか一方は、ＥＬＩＳＡプレートに結合している。【0062】
当該キットは、好ましくは、標準として、抗Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体抗体を備える。【0063】
当該キットは、好ましくは、使用説明書を備える。【実施例】
【0064】
以下に本発明の実施例を示すが、これに限定されるものではない。【0065】
まず、本発明の実施例の材料及び方法を説明する。【0066】
１−１．ファーウエスタンブロット法（１）Ｃ１ｑに対するアディポネクチンの結合評価
組換えアディポネクチンタンパク質（ｒｈＡＰＮ、２００μｇ）のビオチン標識は、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて添付文書に従い行った。ヒトＣ
１ｑ精製タンパク質（１００ｎｇ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分離後、ニトロセルロースメンブレン（Protran BA 85 Nitrocellulose Membrane）（Ｗｈａｔｍａｎ社）に転写した。前記メンブレンはＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（ＤＳ ｐｈａｒｍａ社）にて室温で１時間ブロッキングを行った。その後、前記メンブレンを、１μｇ／ｍＬに希釈したビオチン標識ｒｈＡＰＮにて４℃で１８時間インキュベートした。ＰＢＳＴにて３回洗浄した後、１００００倍希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて室温で１時間攪拌した。最後に、再度３回洗浄した後、ECL Plus Western Blotting Detection Reagent（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて検出した。
【0067】
（２）アディポネクチンに対するＣ１ｑの結合評価ｒｈＡＰＮ（２００ｎｇ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離後、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンはＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（ＤＳ ｐｈａｒｍａ社）にて室温、１時間ブロッキングを行った。その後、１μｇ／ｍＬに希釈したヒトＣ１ｑ精製タンパク質にて室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳＴにて３回洗浄した後、１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体にて室温で１時間攪拌した。最後に、再度３回洗浄した後、前記１）と同様にＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬にて検出した。
【0068】
１−２．免疫沈降法各１００μｇの抗ヒトアディポネクチン−Ｆ（ａｂ’）２抗体、及び抗ヒトＣ１ｑ−Ｆ（ａｂ’）２抗体は、添付文書に従い磁気ビーズ（Dynabeads M-280 tosylactivated）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にカップリングさせた。検体希釈液（１％ Ｔｗｅｅｎ２０、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００を含むＰＢＳ（−））にて希釈したヒト血清は、各抗体を結合させた前記磁気ビーズと混合し、４℃で１８時間転倒混和した。
前記磁気ビーズを検体希釈液にて３回洗浄した後、各免疫沈降産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングに用いた。
【0069】
１−３．ヒトＣ１ｑ−アディポネクチン複合体ＥＬＩＳＡ法抗アディポネクチンモノクローナル抗体は、市販のキット（ImmunoPure IgG1 Fab and F(ab')2 Preparation Kit）（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用い使用説明書に従ってＦ（ａｂ’）２抗体を作製した。ＥＩＡ／ＲＩＡ用９６ウェルマイクロタイタープレート（96-Well EIA/RIA 1x8 Stripwell Plate、Ｃｏｒｎｉｇ社）に３μｇ／ｍＬに調整した抗アディポネクチン−Ｆ（ａｂ’）２抗体を１００μＬ添加して４℃で１８時間インキュベートして固相化した。その後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（−））にて１回洗浄し、ブロッキング液（１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５％ Ｄ−Ｓｏｒｂｉｔｏｌを含むＤ−ＰＢＳ（−））を３００μＬにて添加し４℃で１８時間インキュベートした。プレートは、ブロッキング液を除去し、ドライルーム内にて乾燥し使用時まで４℃保存した。
【0070】
Ｃ１ｑ−アディポネクチン（ＡＰＮ）複合体標準品は、組換えヒトアディポネクチンタンパク質、及びヒトＣ１ｑ精製タンパク質を各１０μｇ／ｍＬずつ混合し、３７℃で２４時間攪拌することにより作製した。なお、本標準品を８００倍希釈したものを１単位／ｍＬのＣ１ｑ−ＡＰＮ複合体任意量として定義した。【0071】
標準曲線作製には、前記で作製したＣ１ｑ−ＡＰＮ複合体標準品を検体希釈液（１％ ＢＳＡ、１％ ブタ血清、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００を含むＰＢＳ（−））にて希釈し、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６単位／ｍＬを調製した。標準液及びヒト血清（検体希釈液にて８０倍希釈）を各１００μＬずつウェルに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。次に、各ウェルを洗浄液３５０μＬにて３回洗浄後、一次抗体希釈液（１％ ＢＳＡ、１％ ブタ血清、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００を含むＰＢＳ（−））にて５０００倍希釈した抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社）を１００μＬ添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。その後、３回洗浄後、二次抗体希釈液（１％ ＢＳＡ、１％ ブタ血清、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００を含むＰＢＳ（−））にて１００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体を１００μＬ添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。最後に、各ウェルを洗浄液で３回洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色液１００μＬを添加し、室温で１５分間発色させた。発色後のウェルは、１Ｎ希硫酸１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍ吸光度（参照波長６５０ｎｍ）（Abs(450-650nm)）をマイクロプレートリーダーＶｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）にて測定した。血清中のＣ１ｑ−ＡＰＮ複合体量は、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）にて標準曲線を作成し算出した。
【0072】
１−４．ヒト血清のゲル濾過分画法ヒト血清（１５０μＬ）は、０．２２ μｍシリンジフィルターにて濾過後、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に接続したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）クロマトグラフィーにて分画した。各フラクションは、２８０ｎｍ吸収を測定下、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎにて分取した。
【0073】
１−５．ヒトＣ１ｑ ＥＬＩＳＡ法【0074】
抗ヒトＣ１ｑ−Ｆ（ａｂ’）２抗体は、ペプシン消化法により作製した。抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体は、５００μｇを０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ４．４にて希釈し、２０μｇ ペプシン（和光純薬工業）にて３７℃で１８時間消化した。その後、Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィー及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）クロマトグラフィーにて精製した。ＥＩＡ／ＲＩＡ用９６ウェルマイクロタイタープレートに３μｇ／ｍＬに調整した抗ヒトＣ１ｑ−Ｆ（ａｂ’）２抗体を１００μＬ添加して４℃で１８時間インキュベートして固相化した。その後、洗浄液にて１回洗浄し、ブロッキング液を３００μＬ添加して４℃で１８時間インキュベートした。プレートは、ブロッキング液を除去しドライルーム内にて乾燥後、使用時まで４℃保存した。【0075】
ヒトＣ１ｑ標準品は、ヒトＣ１ｑ精製タンパク質を検体及び抗体希釈液（０．５％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００を含むＰＢＳ（−））にて希釈し、１５０、７５、３７．５、１８．７５、９．３８、４．６９、２．３４ｎｇ／ｍＬを調製した。標準液及びヒト血清（検体希釈液にて３０００倍希釈）を各１００μＬずつウェルに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。次に、各ウェルを洗浄液３５０μＬにて３回洗浄後、検体及び抗体希釈液にて４００００倍希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体を１００μＬずつ添加し、２５℃にて１時間インキュベートした。以降は、前記のＣ１ｑ−ＡＰＮ複合体ＥＬＩＳＡ法と同一手法にて検出・定量を行った。今回、検出抗体として使用したＨＲＰ標識抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体は、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用い添付文書に従い作製した。【0076】
実施例１ インビトロでのアディポネクチンとＣ１ｑの結合評価ファーウエスタンブロット法によるアディポネクチンとＣ１ｑの結合評価結果を図１に示した。還元・加熱下にて組換えアディポネクチンタンパク質（ｒｈＡＰＮ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、ブロットしたメンブレンをヒトＣ１ｑ精製タンパク質と反応させ、その後、抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体にて検出した（図１．Ａ 左（ＡＰＮ））。
また、同様に、ヒトＣ１ｑ精製タンパク質をブロットしたメンブレンをビオチン標識ｒｈＡＰＮと反応後にＨＲＰ標識ストレプトアビジンにて反応させた（図１．Ａ 右（Ｃ１ｑ））。以上の手法より、アディポネクチンとＣ１ｑの直接結合をインビトロにて証明した。
【0077】
次に、ｒｈＡＰＮ及びヒトＣ１ｑ精製タンパク質結合プレートを用いた結合評価を実施した。図１．Ｂには、ｒｈＡＰＮ固相化プレート（１μｇ／ｍＬ）に対し、ヒトＣ１ｑ精製タンパク質を表記濃度にて添加し、その後、抗ヒトＣ１ｑ抗体にて検出した結果を示した。また、図１．Ｃには、ヒトＣ１ｑ精製タンパク質固相化プレート（１μｇ／ｍＬ）に対し、ｒｈＡＰＮを表記濃度にて添加し、その後、抗ヒトアディポネクチン抗体にて検出した結果を示した。これらＥＬＩＳＡプレートを用いた結合実験からも、アディポネクチンとＣ１ｑの直接結合を確認した。一方、ｒｈＡＰＮ、ヒトＣ１ｑ精製タンパク質ともに対照であるＢＳＡプレートへの結合はほとんど認められなかった。【0078】
実施例２ ヒト血清におけるＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の検出ヒト血清を、還元及び加熱、非還元及び加熱、又は非還元及び非加熱条件下にて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びウェスタンブロッティングを行うことにより、アディポネクチン及びＣ１ｑの多量体構造を検出した。結果を図２．Ａに示した。加熱及び還元処理下では、３１ｋＤａ付近にアディポネクチンに由来するシグナルを、また３１、３０、２６ｋＤａ付近にＣ１ｑに由来するシグナルを検出した。一方、非還元及び非加熱処理下においては、１１４ｋＤａ以上に、アディポネクチン及びＣ１ｑの高分子量体を検出した。
【0079】
次に、ヒト血清を用いた共免疫沈降法により血中に存在するＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の直接検出を実施した。血清中のアディポネクチン及びＣ１ｑを免疫沈降し、その後、各々の免疫沈降産物を抗ヒトアディポネクチン抗体、あるいは抗ヒトＣ１ｑ抗体にてウェスタンブロッティングを行った。図２．Ｂにはアディポネクチン免疫沈降結果を、図２．ＣにはＣ１ｑ免疫沈降結果を示した。その結果、アディポネクチン免疫沈降産物中にはＣ１ｑに特異的なシグナルが検出され、同様にＣ１ｑ免疫沈降産物についてもアディポネクチンに特異的なシグナルが検出された。以上、共免疫沈降法による検討結果から、ヒト血清中においてもＣ１ｑ−アディポネクチン複合体が存在していることを証明した。これまでに、インビトロでの検討にて、アディポネクチンとＣ１ｑが結合することは報告されていた［非特許文献８］。しかしながら、ヒト血清中にＣ１ｑ−アディポネクチン複合体が存在することを証明したことは本発明が初めてである。
【0080】
実施例３ ヒト血清中のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体測定ＥＬＩＳＡ法の構築【0081】
ヒト血清に存在するＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の臨床的意義を解析する目的にて、血清中のＣ１ｑ−アディポネクチン複合体量の測定のためのＥＬＩＳＡ法を開発した。抗アディポネクチン−Ｆ（ａｂ’）２抗体固相化プレートに対し、複合体標準品及び８０倍希釈ヒト血清を各ウェルに添加した。検出抗体には、抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体及びＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を使用した。Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体標準品は、５−０．３１５単位／ｍＬまで段階希釈したものにより標準曲線を作成した（図３．Ａ）。ヒト血清希釈検体は、図３．Ｂに示すように良好な希釈曲線が得られ、対照として用いたマウスＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２抗体固相化プレートでは吸光度は確認されなかった。
【0082】
実施例４ ヒト血清中Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体のゲル濾過分画様式アディポネクチンは循環血中に高分子分画（High-molecular weight; HMW）、中分子分画（Middle-molecular weight; MMW）、低分子量分画（Low-molecular weight; LMW）の分画パターンにて存在していることが報告されている［Komura N, Kihara S, Sonoda M, et al., Clinical significance of high-molecular weight form of adiponectin in male patients with coronary artery disease. Circ J. 2008 Jan;72(1):23-8］。本発明では、ヒト循環血中においてＣ１ｑ−アディポネクチン複合体がどのような分布様式にて存在しているかゲル濾過クロマトグラフィー法にて解析した。ヒト血清をＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００クロマトグラフィーにて分画し、各フラクションにおける総アディポネクチン量及びＣ１ｑ−アディポネクチン複合体量を測定した。図３．Ｃに示すように、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体は、ＨＭＷ及びＭＭＷ分画のアディポネクチン中に存在している可能性が示唆された。
【0083】
実施例５ ヒト血清中のＣ１ｑ測定ＥＬＩＳＡ法の構築血清中Ｃ１ｑに特異的なＥＬＩＳＡ測定法の構築を行った。抗ヒトＣ１ｑ−Ｆ（ａｂ’）２抗体固相化プレートに対し、ヒトＣ１ｑ標準品及び３０００倍希釈ヒト血清を各ウェルに添加した。検出抗体には、ＨＲＰ標識抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体を使用した。
ヒトＣ１ｑ標準品は、１５０−２．３４ｎｇ／ｍＬまで段階希釈し標準曲線を作成した（図４．Ａ）。希釈したヒト血清は、図４．Ｂに示すように良好な希釈曲線が得られ、対照として用いたウサギＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２抗体固相化プレートでは吸光度は確認されなかった。
【0084】
Ｃ１ｑを構成するサブユニット（Ｃ鎖）とアディポネクチンは、特に高い相同性を有することが報告されている［Maeda K, Okubo K, Shimomura I et al., cDNA cloning and expression of a novel adipose specific collagen-like factor, apM1(AdiPose Most abundant Gene transcript 1). Biochem Biophys Res Commun. 1996 Apr 16;221(2):286-9.］。次に、本発明にて構築したヒトＣ１ｑ ＥＬＩＳＡ測定法について、組換えアディポネクチンタンパク質（ｒｈＡＰＮ）を測定することによりアディポネクチンとの反応交差性を検討した。図４．Ｃに示すように、最大２５０ｎｇ／ｍＬにてｒｈＡＰＮを添加した場合についても吸光度は認められなかった。以上の検討から、本法はヒト血清中Ｃ１ｑに特異性の高いＥＬＩＳＡ法であると結論付けた。【0085】
実施例６ 循環血中Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体量とＣ１ｑ量の相関関係日立健康管理センターにてあらかじめ本研究内容を説明し同意を得た２０１０年度検診受診者より血清を提供してもらった。３０歳から７４歳までの腹部ＣＴスキャンを受診している重症疾患（癌、脳血管疾患、心筋梗塞）の罹病歴のない男性３２９名を対象とした。表１に各検体の臨床背景を示した。対象者を内臓脂肪面積（ＶＦＡ）＜１００ｃｍ２の非内臓脂肪型肥満者（１１３名、平均ＶＦＡ；６６±２４ｃｍ２）、及びＶＦＡ≧１００ｃｍ２の内臓脂肪型肥満者（２１６名、平均ＶＦＡ；１４９±３８ｃｍ２）に分類した。
表１中、データは、平均値 ± SD (range) 又は分析対象数 (n)である。
略号は以下の通りである。
ＢＭＩ；ボディー・マス・インデックス、ＷＣ；腹囲、ＶＦＡ；内臓脂肪面積、ＳＦＡ；皮下脂肪面積、ＳＢＰ；収縮期血圧、ＤＢＰ；拡張期血圧、ＢＧ；血中グルコース、ｆＩＲＩ；空腹時免疫反応性インスリン、ＴＣ；総コレステロール 、ＨＤＬ−Ｃ；高密度リポタンパク質コレステロール、ｅＧＦＲ；推定糸球体濾過量（＝194×Cr−1.094×年齢−0.287）、ＡＳＴ；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ；アラニンアミノトランスフェラーゼ、γ−ＧＴＰ；γ−グルタミルトランスフェラーゼ、Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ；総アディポネクチン、ＨＭＷ−ＡＰＮ；高分子量アディポネクチン、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ；Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体
【0086】
【表1】
【0087】
図５に循環血中の総アディポネクチン（Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ）量、高分子アディポネクチン（ＨＭＷ−ＡＰＮ）量、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体（Ｃ１ｑ−ＡＰＮ）量、及びＣ１ｑ量との相関図を示した。図５中、○（白丸）は、ＶＦＡ≧１００ｃｍ２を示し、●（黒丸）は、ＶＦＡ＜１００ｃｍ２の群を示す。Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ量とＨＭＷ−ＡＰＮ量は、有意な正の相関関係が認められ（ｒ＝０．９５１８、ｐ＜０．０００１、図５Ａ）、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ量とは分散した正の相関関係が認められた（ｒ＝０．５６５７、ｐ＜０．０００１、図５Ｂ）。一方で、Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ量とＣ１ｑ量との相関関係は認められなかった（図５Ｄ）。
ＨＭＷ−ＡＰＮ量は、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ量と有意な正の相関関係が認められたが（ｒ＝０．５５７７、ｐ＜０．０００１、図５Ｃ）、Ｃ１ｑ量との相関関係は認められなかった（図５Ｅ）。一方で、Ｃ１ｑ量は、Ｃ１ｑ−アディポネクチン複合体量と弱い相関関係が認められた（ｒ＝０．１１４０、ｐ＝０．０４１１、図５Ｆ）。
【0088】
次に、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ量又はＣ１ｑ量と各種臨床パラメーターとの相関を解析した。各相関係数を表２に示した。ＩＲＩ、ＴＧ、ＡＬＴ、γ−ＧＴＰ、及びＣ１ｑ−ＡＰＮ量は非対称な分散を示したため、Ｌｏｇ変換して解析に使用した。Ｌｏｇ Ｃ１ｑ−ＡＰＮは、ＨＤＬ−Ｃと正に相関しており、ＢＭＩ、ＷＣ、ＶＦＡ、ＳＦＡ、ｌｏｇ−ＩＲＩ、ＨｂＡ１ｃ、ｌｏｇ−ＴＧ、ＵＡ、ｌｏｇ−ＡＬＴ、ｌｏｇ−γ−ＧＴＰとは負に相関していた。一方で、Ｌｏｇ Ｃ１ｑ−ＡＰＮとリスクファクター数との相関は認めなかった。Ｃ１ｑは、ＢＭＩ、ＷＣ、ＶＦＡ、ＳＦＡ、ＳＢＰ、ＤＢＰ、ｌｏｇ ＩＲＩ、ＴＣ、ｌｏｇ ＴＧ、Ｌｏｇ ＡＬＴ、及びリスクファクター数との正の相関が認められ、ＨＤＬ−Ｃとの負の相関が認められた。
更に、ステップワイズ重回帰分析（Stepwise multiple regression）解析から、ＢＭＩ（multivariate BMI）、ＶＦＡ（multivariate VFA）、及びＳＦＡ（multivariate SFA）がＣ１ｑ−ＡＰＮ複合体量の有意な規定因子であった。一方、ＢＭＩ、ＶＦＡ、ＳＦＡはＣ１ｑの有意な規定因子ではなかった。
表２において、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ、ＩＲＩ、ＴＧ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及びγ−ＧＴＰのレベルのデータは、歪んだ分布を示し、分析前に対数変換した。有意水準は、ｐ＜０．０５(*)に設定した。逐次重回帰分析を実施して、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ又はＣ１ｑに有意に相関するこれらのパラメーターを決定した。次いで、ｐ＜０．０５及びＦ＞４．０のパラメータを独立変数として回帰分析に投入した(*)。
これらの略号は表１に同じである。
【0089】
【表2.A】
【表2.B】
【0090】
実施例７ メタボリックシンドローム有無判定に対するＲＯＣ曲線解析循環血中の総アディポネクチン（Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ）量は、メタボリックシンドロームのバイオマーカーであることが知られている［非特許文献７］。絶対量だけでなく、Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮに占める高分子アディポネクチン（ＨＭＷ−ＡＰＮ）の存在割合（ＨＭＷ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比）又は総アディポネクチン量に占めるＣ１ｑ−アディポネクチン複合体の存在割合（Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比）といったアディポネクチンの血中での構造を示す相対指標についても質的変化を観察する上で重要と考えられた。これら循環血中のＣ１ｑ−ＡＰＮ量、Ｃ１ｑ量、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比、ＨＭＷ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比、又はＣ１ｑ−ＡＰＮ／Ｃ１ｑ比と、メタボリックシンドロームとの関係については全く不明であった。
【0091】
表３には、内臓脂肪蓄積者をＶＦＡ≧１００ｃｍ２あるいはＷＣ≧８５ｃｍに基づき規定した場合のメタボリックシンドローム有無判断に対する各種臨床指標のＲＯＣ曲線を示した。内臓脂肪蓄積群をＶＦＡ≧１００ｃｍ２にて規定した場合（図６、表３）、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ：Area under the specificity-sensitivity curves）は、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比が０．７０４（９５％ＣＩ、０．６３２−０．７７５、図６Ｅ）、Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ量が０．６６８（９５％ＣＩ、０．５９６−０．７４０、図６Ａ）、そしてＨＭＷ−ＡＰＮ量が０．６４８（９５％ＣＩ、０．５７７−０．７２０、図６Ｂ）であった。一方、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ量は、０．５３５（９５％ＣＩ、０．４５７−０．６１３、図６Ｃ）であった。本結果に関しては、ＷＣにてメタボリックシンドロームを規定した場合に関しても同様の結果が得られた（表３）。表３では、ＡＵＣが高い順に並べている。表３の略号は、以下の通りである。ＡＵＣ；特異度−感度曲線下面積、９５％ ＣＩ；９５％信頼区間、その他は略号は表１に同じ。【0092】
【表3.A】
【表3.B】
【0093】
以上の結果から、Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ量又はＨＭＷ−ＡＰＮ量と比較して、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比がアディポネクチン関連指標の中で、最もメタボリックシンドローム判定の最も有効なバイオマーカーである可能性が判明した。一方で、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ単独量は有効な指標ではなかった。【0094】
実施例８ 内臓脂肪蓄積における各種アディポネクチンと肥満関連心血管リスクファクター集積脂質異常・高血圧・血糖異常（メタボリックシンドロームの構成要因）を有する集団について、各種アディポネクチン関連指標との関連性を評価した。対象を、ＶＦＡ＜１００ｃｍ２とＶＦＡ≧１００ｃｍ２の２群に分類し、日本人の内臓脂肪蓄積基準に基づきカットオフ値を選定した。表１にこれら２群の臨床的特徴を示した。
【0095】
ＶＦＡ＜１００ｃｍ２の集団については、血清中のＴｏｔａｌ−ＡＰＮ量、ＨＭＷ−ＡＰＮ量、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ量、ＨＭＷ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比、又はＣ１ｑ−ＡＰＮ／ＨＭＷ−ＡＰＮ比と、肥満関連心血管リスクファクター集積との関連性は認められなかった（図７Ａ）。一方で、ＶＦＡ≧１００ｃｍ２の集団については、血清中のＴｏｔａｌ−ＡＰＮ量とＨＭＷ−ＡＰＮ量が肥満関連心血管リスクファクター集積と有意な負の相関が認められた（ｐ＝０．０１９１、［図７Ｂ ａ］、ｐ＝０．０４５０、［図７Ｂ ｂ］、Kruskal-Wallis test）。Ｃ１ｑ量はリスクファクター集積と有意な正の相関が認められたが（ｐ＝０．０１９１、［図７Ｂ ｄ］）、Ｃ１ｑ−ＡＰＮとの相関は認められなかった（ｐ＝０．５６６９、［図７Ｂ ｄ］）。更に、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比、及びＣ１ｑ−ＡＰＮ／ＨＭＷ−ＡＰＮ比は、肥満関連心血管リスクファクターの集積と有意な正の相関関係（ｐ＝０．０００３、［図７Ｂ ｅ］、ｐ＝０．００６５、［図７Ｂ ｆ］、Kruskal-Wallis test）が認められた一方で、ＨＭＷ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比及びＣ１ｑ−ＡＰＮ／Ｃ１ｑ比はリスクファクター集積との相関は認められなかった（図７Ｂ ｇ、ｈ）。【0096】
以上の結果から、各種指標と比較して、Ｃ１ｑ−ＡＰＮ／Ｔｏｔａｌ−ＡＰＮ比が最も肥満関連心血管リスクファクター集積を反映するバイオマーカーであることが判明した。以上から、本指標は動脈硬化症と関連する可能性が強く示唆された。