特許 6143818 マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6143818

(24)【登録日】2017年5月19日

(45)【発行日】2017年6月7日

(54)【発明の名称】マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/569 20060101AFI20170529BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20170529BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/569 F

   G01N33/543 521

   G01N33/543 501D

   G01N33/543 501M

   G01N33/543 541Z

   G01N33/543ZNA

【請求項の数】4

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2015-171163(P2015-171163)

(22)【出願日】2015年8月31日

(65)【公開番号】特開2017-9571(P2017-9571A)

(43)【公開日】2017年1月12日

【審査請求日】2016年1月19日

(31)【優先権主張番号】特願2015-111732(P2015-111732)

(32)【優先日】2015年6月1日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】509352945

【氏名又は名称】田中貴金属工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】特許業務法人栄光特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 啓太

(72)【発明者】

【氏名】岩本 久彦

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０２５９６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−０１９７８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１６／０１７５９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開昭６１−２７４６８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４１９８７０３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 CHANG HY, JORDAN JL, KRAUSE DC，DOMAIN ANALYSIS OF PROTEIN P30 IN MYCOPLASMA PNEUMONIAE CYTADHERENCE AND GLIDING MOTILITY，J BACTERIOL，２０１１年，Vol.193, No.7，Page.1726-1733

【文献】 BEGHETTO E，DISCOVERY OF NEW MYCOPLASMA PNEUMONIAE ANTIGENS BY USE OF A WHOLE-GENOME LAMBDA DISPLAY LIBRARY，MICROBES INFECT，２００９年，11(1)，66-73

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５６９

Ｇ０１Ｎ ３３／５４３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を検出するための免疫クロマト分析装置と、検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キットであって、
前記標識物質保持部及び検出部が、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩのうち配列番号３のアミノ酸配列を認識する抗体を含有し、
前記検体希釈液が、ＨＬＢ値が１３〜１７の非イオン性界面活性剤を含有する、
免疫クロマト分析キット。

【請求項2】

前記標識物質保持部が含有する標識物質が金コロイド粒子であり、前記標識物質保持部が前記金コロイド粒子を、０．２５〜０．７μｇ／ｃｍ^２含有する、請求項１に記載の免疫クロマト分析キット。

【請求項3】

前記検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の５０％以上が、ＨＬＢ値が１３〜１７の非イオン性界面活性剤である、請求項１または２に記載の免疫クロマト分析キット。

【請求項4】

試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、検体中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）ＨＬＢ値が１３〜１７の非イオン性界面活性剤を含有する、検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩのうち配列番号３のアミノ酸配列を認識する抗体（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）と表記する）によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
（３）前記検体及び抗体Ｐ３０（Ａ）を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出部に含まれる抗体Ｐ３０（Ａ）により検出する工程

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエの検出のための免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析キットおよびその検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

マイコプラズマ肺炎は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を主な原因とした呼吸器系の感染症である。マイコプラズマ・ニューモニエは非定型肺炎の代表的な起因菌である。マイコプラズマ肺炎患者の年齢は、幼児期、学童期、青年期（５歳から３５歳）が中心であり、初期症状は、風邪症候群様の症状、いわゆる感冒様症状を呈するが、時間の経過と共に咳が強くなり、解熱後も１ヶ月程度続くこともある。

【0003】

マイコプラズマ肺炎の診断のために、従来種々の方法が利用されており、例えば、マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体を用いた検出法が利用されている。マイコプラズマ肺炎では、抗生剤選択のために感染初期にマイコプラズマ・ニューモニエ感染の有無を判定したいという医療現場のニーズが高いが、操作が簡便な免疫クロマト分析法に応用することによって、迅速かつ簡易にマイコプラズマ・ニューモニエの検出を行うことができ、マイコプラズマ肺炎の診断を行うことができる。免疫クロマト分析法に使用する免疫クロマト分析装置の最も簡単な構造としては、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、及び吸収部が相互に繋がった構造である。

【0004】

例えば、特許文献１には、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫クロマト分析装置が開示されている。
また、特許文献２には、マイコプラズマ・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２に特異的な抗体を用いた免疫クロマト分析装置が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１３−７２６６３号公報

【特許文献2】特開２０１４−１６７４３９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、従来使用されていたマイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体を用いた免疫クロマト分析装置による診断方法では、マイコプラズマ・ニューモニエに対する感度は十分ではなく、非特異的な反応も多いため、マイコプラズマ・ニューモニエ感染の診断方法としては十分なものではなかった。

【0007】

そこで、本発明者らは、鋭意研究した結果、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１タンパク質よりも高感度で検出し得る標的タンパクとして、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に注目し、特にＰ３０タンパク質の特定の部位を認識する抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できることを見出した。
また、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質の特定の部位に結合する抗体を用いた免疫クロマト分析装置によれば、迅速かつ簡易にマイコプラズマ・ニューモニエ感染を高感度で検出できることを見出し、本発明に至った。

【課題を解決するための手段】

【0008】

したがって、本発明は以下の通りである。
１．試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を検出するための免疫クロマト分析装置であって、
前記標識物質保持部及び検出部が、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。
２．前記抗体が、前記ドメインＩＩＩのうち配列番号３のアミノ酸配列を認識する、前記１に記載の免疫クロマト分析装置。
３．前記標識物質保持部が含有する標識物質が金コロイド粒子であり、前記標識物質保持部が前記金コロイド粒子を、０．２５〜０．７μｇ／ｃｍ^２含有する、前記１または２に記載の免疫クロマト分析装置。
４．前記１〜３のいずれか１に記載の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キット。
５．前記検体希釈液が少なくとも１種の非イオン性界面活性剤を含有する、前記４に記載の免疫クロマト分析キット。
６．前記検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の５０％以上が、ＨＬＢ値が１３〜１８の非イオン性界面活性剤である、前記５に記載の免疫クロマト分析キット。
７．試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて、検体中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）と表記する）によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
（３）前記検体及び抗体Ｐ３０（Ａ）を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出部に含まれる抗体Ｐ３０（Ａ）により検出する工程

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質の特定の部位に結合する抗体を用いた免疫クロマト分析装置を用いることによって、高感度にマイコプラズマ・ニューモニエを、迅速かつ簡易に検出できる。すなわち、肺炎マイコプラズマの診断をより確実かつ迅速に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明の一実施形態の免疫クロマト分析装置の構造を説明するための断面図である。

【図2】本発明の免疫クロマト分析装置を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエの検出を行い、その発色強度を測定した結果を示すグラフである。

【図3】本発明の免疫クロマト分析装置を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエの検出を行い、その発色強度を測定した結果を示すグラフである。

【図4】本発明の免疫クロマト分析装置を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質の検出を行い、その発色強度を測定した結果を示すグラフである。

【図5】試験例４において、抗体Ｐ３０（Ａ）を使用して、ペプチド１またはペプチド２を抗原とした競合阻害ＥＬＩＳＡ試験を行い、その発色強度を測定した結果を示すグラフである。

【図6】試験例４において、抗体Ｐ３０（Ｂ）を使用して、ペプチド１またはペプチド２を抗原とした競合阻害ＥＬＩＳＡ試験を行い、その発色強度を測定した結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下に、本発明を実施するための形態を説明する。

【0012】

本発明の、マイコプラズマ・ニューモニエを検出するための免疫クロマト分析装置は、検体を添加する試料添加部と、標識物質を保持する標識物質保持部と、マイコプラズマ・ニューモニエを検出する検出部を有するクロマトグラフ媒体部と、検出部を通過した液体を吸収する吸収部とを備え、標識物質保持部及び検出部が、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体を含有することを特徴としている。

【0013】

本発明の免疫クロマト分析装置に使用する抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）ともいう）である。
マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質とは、配列番号１に示される２７４のアミノ酸からなり、プロリンに富み（２０．７％）、分子量２９，７４３の接着タンパク質である。

【0014】

また、配列番号２に示されるＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩは、Ｐ３０タンパク質（配列番号１）のうちアミノ酸配列の１７７番目から２７４番目に相当する領域であり、特定のアミノ酸の繰り返し配列に富むドメインである。ドメインＩＩＩにおけるアミノ酸の繰り返し配列は３種類あり、配列番号３（ＰＧＭＡＰＲ）に示されるアミノ酸配列が７箇所、配列番号４（ＰＧＭＰＰＨ）に示されるアミノ酸配列が３箇所、配列番号５（ＰＧＦＰＰＱ）に示されるアミノ酸配列が３箇所存在する。

【0015】

本発明に使用する抗体Ｐ３０（Ａ）は、このアミノ酸の繰り返し配列に富むドメインＩＩＩを認識するため、本発明の免疫クロマト分析装置を用いて分析を行うことにより、下記に示すようなサンドイッチ構造が形成され、検出感度が格段に向上し、顕著にその効果を発揮するものと推測される。すなわち、本発明の免疫クロマト分析装置の標識物質保持部及び検出部に抗体Ｐ３０（Ａ）を含有させた場合、まず、標識物質保持部に担持された抗体Ｐ３０（Ａ）（以下、第１抗体ともいう）が、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質の中でドメインＩＩＩの繰り返し配列の一部に結合する。続いて、検出部に固定化された抗体Ｐ３０（Ａ）（以下、第２抗体ともいう）が、標識物質保持部に担持された抗体Ｐ３０（Ａ）（第１抗体）が結合した箇所と別の箇所に存在する同じ繰り返し配列に結合することによって、Ｐ３０タンパク質を抗体Ｐ３０（Ａ）で挟むようにしてサンドイッチの構造を形成し、マイコプラズマ・ニューモニエを検出する。このように、抗体Ｐ３０（Ａ）は、上記繰り返し配列を有するドメインＩＩＩを認識するため、Ｐ３０タンパク質の複数の箇所を認識することができ、マイコプラズマ・ニューモニエの検出感度を高めることができるものと推測される。
本発明に使用する抗体Ｐ３０（Ａ）は、好ましくは、上記ドメインＩＩＩのアミノ酸の繰り返し配列のうち、少なくとも配列番号３（ＰＧＭＡＰＲ）のアミノ酸配列を認識するものであることが好ましい。下記実施例の結果にも示されているように、上記配列を認識する抗体は、より強くマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを認識するため、高感度にマイコプラズマ・ニューモニエを検出できる。

【0016】

本発明における抗体Ｐ３０（Ａ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体であるとは、具体的には、下記プロトコールに従いＥＬＩＳＡ法を行ったとき、ブランクを引いた４５０ｎｍの吸光度が０．２Ａｂｓ以上となる抗体として定義できる。

【0017】

まず、Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ３０（（アミノ酸９６−２７４）を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質Ｐ３０Ａｇ）４ｎｇ／ｍＬ ｉｎ ５０ｍＭ 炭酸バッファーｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートする。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。

【0018】

ブロッキング液として、５％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。

【0019】

一次抗体として、抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（Ａ））５μｇ／ｍＬ ｉｎ ５０％ ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートする。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。

【0020】

二次抗体として、Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４−１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７℃、１．５時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。

【0021】

ウェルに発色基質として、Ｓｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３−００−０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させる。
マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定する。

【0022】

上記方法で、ブランク（一次抗体を入れずに二次抗体、発色反応を行ったウェル）の吸光度を引いた値が、０．２Ａｂｓ以上となる抗体を、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体とした。

【0023】

また、本発明における抗体Ｐ３０（Ａ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体であるとは、具体的には、全長のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ３０タンパク質（アミノ酸１−２７４：配列番号１）あるいはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ３０タンパク質のアミノ酸９６−２７４断片（これらのタンパク質をタンパク質Ａとする）と、ドメインＩＩＩあるいはドメインＩＩＩにおけるアミノ酸の３種類の繰り返し配列（配列番号３〜５）を一以上含むドメインＩＩＩの断片（これらのタンパク質をタンパク質Ｂとする）との、ＥＬＩＳＡ法による競合阻害試験（競合阻害ＥＬＩＳＡ試験）を行ったときに、タンパク質Ａに対する抗体の反応がタンパク質Ｂの存在により反応が阻害される場合におけるその抗体とも定義できる。競合阻害ＥＬＩＳＡ試験としては、直接競合法と間接競合法の何れの試験方法によっても定義できる。

【0024】

間接競合法による試験を例示すると、Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、全長タンパク質のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ３０（アミノ酸１−２７４：配列番号１）４ｎｇ／ｍＬ ｉｎ ５０ｍＭ 炭酸バッファーｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートする。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。

【0025】

ブロッキング液として、５％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除き、全長タンパク質固定ウェルを作成する。

【0026】

次に、全長タンパク質固定ウェルに一次抗体として、抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（Ａ））５μｇ／ｍＬ ｉｎ ５０％ ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートする。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。

【0027】

また、上記一次抗体のみを加えたものとは別に、一次抗体の抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（Ａ））５μｇ／ｍＬと、上記一次抗体量の４０倍量または８０倍量のドメインＩＩＩあるいはドメインＩＩＩにおけるアミノ酸の３種類の繰り返し配列を一以上含むドメインＩＩＩの断片とを含む５０％ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートする。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。

【0028】

二次抗体として、Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４−１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、上記作成した２種の夫々のウェルに加え、３７℃、１．５時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュする。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除く。
ウェルに発色基質として、Ｓｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３−００−０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させる。
マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定する。

【0029】

上記方法で、一次抗体のみを加えたウェルの吸光度より一次抗体とドメインＩＩＩまたはドメインＩＩＩにおけるアミノ酸の３種類の繰り返し配列を一以上含むドメインＩＩＩの断片を加えたウェルの吸光度が減少することが確認でき、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」ことが確認できる。本発明においては、ドメインＩＩＩあるいはドメインＩＩＩにおけるアミノ酸の３種類の繰り返し配列を一以上含むドメインＩＩＩの断片を一次抗体の４０倍量用いた場合の吸光度が３０％以上減少、または一次抗体の８０倍量用いた場合の吸光度が５０％以上減少すれば、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩをより強く認識することが確認できる。

【0030】

本発明に使用する抗体Ｐ３０（Ａ）としては、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が挙げられる。感度の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。抗体Ｐ３０（Ａ）は、例えば、Ｆｕｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から、商品名：Ｍｐ−Ｐ３０−３−ＡＢを購入し、入手できる。

【0031】

次に、図面を参照しながら本発明の免疫クロマト分析装置の一実施形態について説明する。なお本明細書において、「固定」とは、抗体が移動しないように膜等の担体に配置されていることを意味し、「担持」とは、膜等の担体の中または表面を移動可能に配置されることを意味する。

【0032】

本発明の免疫クロマト分析装置の一実施形態としては、図１に示すように、試料添加部（サンプルパッドともいう）（１）、標識物質保持部（コンジュゲートパッドともいう）（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、吸収部（５）およびバッキングシート（６）から構成されている。

【0033】

試料添加部（１）は、免疫クロマト分析装置において、検体（サンプル）を滴下する部位である。試料添加部（１）では検体試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに検体試料が移動していくような性質の多孔質シートで構成することができる。多孔質シートとしては、例えば、セルロース濾紙、ガラスファイバー濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等が挙げられる。

【0034】

標識物質保持部（２）は、後述する標識物質（マーカー物質）を含有しており、該標識物質は上記抗体Ｐ３０（Ａ）と結合した標識抗体として標識物質保持部（２）に担持されている。標識物質保持部内を検体が移動する際に、上記標識抗体と検体中のマイコプラズマ・ニューモニエとが結合する。標識物質保持部（２）には、グラスファイバーまたはセルロースの膜が通常使用される。

【0035】

標識物質保持部中の抗体Ｐ３０（Ａ）（第１抗体）の含有量は、通常０．０６〜０．２５μｇであり、好ましくは０．１〜０．２μｇであり、より好ましくは０．１〜０．１５μｇである。また、標識物質保持部の単位面積当たりの抗体Ｐ３０（Ａ）（第１抗体）の含有量は、通常０．１〜０．４２μｇ／ｃｍ^２であり、好ましくは０．１７〜０．３３μｇ／ｃｍ^２であり、より好ましくは０．１７〜０．２５μｇ／ｃｍ^２である。

【0036】

免疫クロマト分析における検出試薬の標識には、一般に酵素等も使用されるが、被検出物質の存在を目視で判定するのに適していることから、標識物質としては不溶性担体を用いることが好ましい。抗体Ｐ３０（Ａ）（第１抗体）を不溶性担体に感作することにより標識化した検出試薬を調製することができる。なお、抗体Ｐ３０（Ａ）（第１抗体）を不溶性担体に感作する手段は、公知の方法に従えばよい。

【0037】

標識物質としての不溶性担体には、金、銀もしくは白金のようなコロイド状金属粒子、酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコロイド状非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、またはその他を用いることができる。特に、金コロイド粒子が、検出が簡便であり、かつ凝集しづらく非特異的な発色が起こりにくい点で好ましい。金コロイドの粒子の平均粒径は、例えば１０ｎｍ〜２５０ｎｍ、好ましくは３５ｎｍ〜１２０ｎｍである。平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：日本電子（株）製、ＪＥＭ−２０１０）により、撮影した投影写真を用いて無造作に１００個の粒子を粒子の投影面積円相当径を計測し、その平均値から算出することができる。標識物質保持部が含有する金コロイド粒子は、標識物質保持部の単位面積あたり、通常０．２５〜０．７μｇ／ｃｍ^２であり、好ましくは０．３〜０．６５μｇ／ｃｍ^２であり、より好ましくは０．４〜０．６μｇ／ｃｍ^２である。前記範囲に設定することによって、標識された粒子が分散したまま展開し、抗体の認識部位が阻害されず高感度化できるからである。

【0038】

不溶性担体は、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには有色であることが好ましい。コロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を呈するものであり、その色彩を標識として利用することができる。

【0039】

クロマトグラフ媒体部（３）は、クロマトグラフの展開部位である。クロマトグラフ媒体部（３）は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性の膜である。クロマトグラフで使用される検出試薬、固定化試薬または被検出物質などと反応性を有しないという観点から、また、本発明の効果が向上するという観点から、例えば、ニトロセルロース製のメンブレン（以下、ニトロセルロースメンブレンともいう）や、酢酸セルロース製のメンブレン（以下、酢酸セルロースメンブレンともいう）が好ましく、ニトロセルロースメンブレンがさらに好ましい。なお、セルロース類メンブレン、ナイロンメンブレン及び多孔質プラスチック布類（ポリエチレン、ポリプロピレン）も使用可能である。

【0040】

ニトロセルロースメンブレンとしては、ニトロセルロースが主体で含まれていればよく、純品またはニトロセルロース混合品などニトロセルロースを主材とするメンブレンを使用することができる。

【0041】

ニトロセルロースメンブレンは、さらに毛細管現象を促進させる物質を含有させることもできる。該物質としては、膜面の表面張力を低下させ、親水性をもたらす物質が好ましい。例えば、糖類、アミノ酸の誘導体、脂肪酸エステル、各種合成界面活性剤またはアルコール等の両親媒性の作用を有する物質であって、被検出物質の移動に影響がなく、マーカー物質（例えば金コロイド粒子など）の発色に影響を及ぼさない物質が好ましい。

【0042】

ニトロセルロースメンブレンは、多孔性であって、毛細管現象を示す。この毛細管現象の指標は、吸水速度（吸水時間：ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｌｏｗ ｔｉｍｅ）を測ることで確認できる。吸水速度は、検出感度と検査時間に影響する。

【0043】

上記のようなニトロセルロースメンブレンや酢酸セルロースメンブレンに代表されるクロマトグラフ媒体部（３）の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。

【0044】

さらに操作をより簡便にするためには、クロマトグラフ媒体部（３）の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。

【0045】

検出部（４）は、前記クロマトグラフ媒体部（３）上に形成される。すなわち、被検出物質のマイコプラズマ・ニューモニエと結合する前記抗体Ｐ３０（Ａ）が、クロマトグラフ媒体部（３）上の任意の位置に固定化される。前記抗体Ｐ３０（Ａ）の固定化は常法に従って行うことができる。

【0046】

検出部（４）における抗体Ｐ３０（Ａ）（第２抗体）の含有量は、通常０．１〜２．５μｇであり、好ましくは０．３〜２．０μｇであり、より好ましくは０．３〜１．０μｇである。また、検出部（４）の単位面積当たりの抗体Ｐ３０（Ａ）（第２抗体）の含有量は、通常０．０４〜１．０ｇ／ｃｍ^２であり、好ましくは０．１２５〜０．８μｇ／ｃｍ^２であり、より好ましくは０．１２５〜０．４２μｇ／ｃｍ^２である。

【0047】

また、クロマトグラフ媒体部（３）上には、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体部（３）に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼインまたはゼラチン等のタンパク質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。

【0048】

吸収部（５）は、クロマトグラフ媒体部（３）の末端に、検出部（４）を通過した検体や展開液等の液体を吸収させるために設置される。本発明の免疫クロマト分析装置において、吸収部（５）は、例えばグラスファイバーからなることができる。吸収部（５）がグラスファイバーからなることによって、試料液の液戻りを大幅に低減することができる。

【0049】

バッキングシート（６）は、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより、片面が粘着性を有し、該粘着面上に試料添加部（１）、標識物質保持部（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、および吸収部（５）の一部または全部が密着して設けられている。バッキングシート（６）は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。

【0050】

上記のようにして作製した免疫クロマト分析装置は、製品化する前に、通常乾燥処理に施される。乾燥温度は例えば２０〜５０℃、乾燥時間は０．５〜１時間である。

【0051】

本発明の免疫クロマト分析キットは、上記の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む。

【0052】

本発明の免疫クロマト分析キットにおいて検体希釈液は、展開液としても使用することができるものであるが、通常溶媒として水を用い、これに緩衝液、塩、および非イオン性界面活性剤、さらに、例えば抗原抗体反応の促進または非特異的反応を抑制するためのタンパク質、高分子化合物（ＰＶＰ等）、イオン性界面活性剤もしくはポリアニオン、または、抗菌剤、キレート剤等々の１種もしくは２種以上を加えてもよい。

【0053】

特に、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａの細胞接着器官に存在するタンパク質複合体（Ｐ１、Ｐ９０、Ｐ４０、Ｐ３０）からＰ３０を単離し、抗Ｐ３０抗体の抗原認識部位を露出させるために非イオン性界面活性剤を検体希釈液に含有させることが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ＮＰ−４０（商品名 ノニテッド４０）、Ｂｒｉｊ３５が挙げられ、１種もしくは２種以上を加えてもよい。

【0054】

好ましくは、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の５０％以上が、ＨＬＢ値が１３〜１８の非イオン性界面活性剤である。さらに好ましくは、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の６０％以上が、ＨＬＢ値が１３〜１７の非イオン性界面活性剤であり、特に好ましくは、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤の１００％が、ＨＬＢ値が１３〜１７の非イオン性界面活性剤である。具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＨＬＢ値：１３．７）とＴｗｅｅｎ２０（ＨＬＢ値：１６．７）の２種を、質量比率で１：１の割合で含有させることが好ましい。

【0055】

検体希釈液を展開液として用いる場合には、検体と展開液を予め混合したものを、試料添加部上に供給・滴下して展開させることもできるし、先に検体を試料添加部上に供給・滴下した後、展開液を試料添加部上に供給・滴下して展開させてもよい。

【0056】

本発明の免疫クロマト分析方法は以下の工程（１）〜（４）を含み、上記の免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）と表記する）によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
（３）前記検体及び抗体Ｐ３０（Ａ）を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出部に含まれる抗体Ｐ３０（Ａ）により検出する工程
各工程について以下に説明する。

【0057】

（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
工程（１）では、第１に、検体を、測定精度を低下させることなく、免疫クロマトグラフ媒体中をスムーズに移動する程度の濃度に、検体希釈液で調整または希釈して検体含有液とするのが好ましい。検体希釈液は上述したものを使用できる。第２に、検体含有液を試料添加部（１）上に、所定量（通常、０．１〜２ｍｌ）滴下する。検体含有液が滴下されると、検体含有液は試料添加部（１）中で移動を開始する。

【0058】

本発明において使用する検体は、被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエを含む可能性がある検体であり、例えば、生体試料のうち、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、喀痰、肺胞洗浄液等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0059】

（２）標識物質保持部に保持されている、配列番号２のアミノ酸配列からなるマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）と表記する）によりマイコプラズマ・ニューモニエを認識させる工程
工程（２）は、工程（１）において試料添加部に添加された検体含有液を、標識物質保持部（２）へと移動させ、標識物質保持部に保持されている標識物質が結合した抗体Ｐ３０（Ａ）により検体中の被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエにおける、Ｐ３０タンパク質のドメインＩＩＩを認識させる工程である。

【0060】

標識物質は上記のものを使用できる。前記標識物質が結合した抗体Ｐ３０（Ａ）（第１抗体）は、Ｐ３０タンパク質のドメインＩＩＩのアミノ酸配列のうち、上記特定の繰り返し配列の一部を認識し結合する。

【0061】

（３）前記検体及び抗体Ｐ３０（Ａ）を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
工程（３）は、工程（２）において被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエが標識物質保持部において標識物質が結合した抗体Ｐ３０（Ａ）（第１抗体）に認識された後、検体および抗体Ｐ３０（Ａ）（第１抗体）を、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過させる工程である。

【0062】

（４）展開された移動相中のマイコプラズマ・ニューモニエを、検出部に含まれる抗体Ｐ３０（Ａ）により検出する工程
工程（４）は、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過した検体中のマイコプラズマ・ニューモニエが、抗原・抗体の特異的結合反応により、検出部に保持、即ち、固定されている抗体Ｐ３０（Ａ）（第２抗体）と、前記工程（２）において標識物質が結合した抗体Ｐ３０（Ａ）（第１抗体）とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部が着色する工程である。

【0063】

本工程（４）では、検出部に固定化された抗体Ｐ３０（Ａ）（第２抗体）が、標識物質保持部に担持された抗体Ｐ３０（Ａ）（第１抗体）が結合した箇所と別の箇所に存在する同じ繰り返し配列にサンドイッチ状に挟まれるように結合する。

【0064】

被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエが存在しない場合には、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフ媒体部上の検出部を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部が着色しない。

【0065】

最後に、検体含有液の水分は、吸収部（５）へと移動する。

【実施例】

【0066】

以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されるものではない。

【0067】

［試験例１］
本試験では、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを認識する種類の異なる２つの抗体を用意し、それぞれ抗体がＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩのどの部位を認識するかを調べた。使用した抗体は、Ｆｕｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、商品名：Ｍｐ−Ｐ３０−３−ＡＢ（以下、抗体Ｐ３０（Ａ）と表記する）と、Ｆｕｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、商品名：Ｍｐ−Ｐ３０−９−ＡＢ（以下、抗体Ｐ３０（Ｂ）と表記する）の２種類である。この抗体Ｐ３０（Ａ）および抗体Ｐ３０（Ｂ）が、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩのどの箇所に結合するのかを、下記の免疫クロマト分析法により検証した。
まず、上記ドメインＩＩＩにおける３種類のアミノ酸の繰り返し配列（配列番号３〜５）のいずれかを含むような以下の２種類のペプチドをペプチドの化学合成法の常法であるペプチド固相合成法により作製した。
ペプチド１：ＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲ（配列番号６）
ペプチド２：ＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰＧＭＡＰＲ（配列番号７）

【0068】

上記ペプチド１は、配列番号４に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＰＰＨ）と配列番号３に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＡＰＲ）を有するペプチドである。上記ペプチド２は、配列番号５に示すアミノ酸配列（ＰＧＦＰＰＱ）と配列番号３に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＡＰＲ）を有するペプチドである。

【0069】

抗体Ｐ３０（Ａ）または抗体Ｐ３０（Ｂ）がドメインＩＩＩのどの箇所に結合するのかは、以下のようにして判定可能である。
（１）試料添加部の作製
試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
（２）標識物質保持部の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した抗体Ｐ３０（Ａ）（Ｆｕｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、商品名：Ｍｐ−Ｐ３０−３−ＡＢ）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。
次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。

【0070】

（３）クロマトグラフ媒体部および検出部の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、上記抗体Ｐ３０（Ａ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部位（検出ライン）に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。
（４）免疫クロマト分析装置の作製
次に、バッキングシートから成る基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。

【0071】

（５）検体希釈液
１質量％の非イオン性界面活性剤ナカライテスク社製ＮＰ−４０（商品名：ノニデットＰ−４０、ＨＬＢ値１７．７）、日油社製商品名ノニデットＭＮ−８１１（ＨＬＢ値 ９．３）の１：１混合物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
（６）測定
マイコプラズマ・ニューモニエ、及びペプチド１またはペプチド２を含有する検体試料を使用して、上記作製した免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を測定した。マイコプラズマ・ニューモニエを含有する検体試料には、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ３０（（アミノ酸９６−２７４）を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質Ｐ３０Ａｇ）を使用した。このＰ３０Ａｇを上記抽出液で目的濃度１０ｐｇ/ｍＬに調整し、さらにペプチド１またはペプチド２が４００ｎｇ展開されるように、ペプチド１またはペプチド２を調製し、検体試料とした。
上記の検体試料１５０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い（発色強度）をデンシトメーターにより測定した（表中の単位はｍＡｂｓ）。

【0072】

＜判定方法＞
ペプチド１で阻害されペプチド２で阻害されない場合：抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＰＰＨ）に結合する。
ペプチド１で阻害されずペプチド２で阻害される場合：抗体は、配列番号５に示すアミノ酸配列（ＰＧＦＰＰＱ）に結合する。
ペプチド１で阻害されペプチド２でも阻害される場合：抗体は、配列番号３に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＡＰＲ）に結合する。

【0073】

なお、ペプチド１又はペプチド２を検体のＰ３０Ａｇとともに展開させることにより阻害が生じる場合のメカニズムを以下に説明する。ペプチド１及びペプチド２は検体のＰ３０Ａｇと比較して分子量がはるかに小さく、また展開させる量もはるかに多いため、Ｐ３０Ａｇよりも早く標識物質保持部に到達し、同部位に担持された第一抗体と結合して検出部の方へと展開される。しかし、ペプチド１及びペプチド２が有する抗体結合部位はＰ３０Ａｇと比較してはるかに少ないので（１〜２箇所）、第一抗体がすでに結合した状態の多くの上記ペプチドは、検出部に担持された第二抗体が結合できる箇所が少ないもしくは存在せず、多くのペプチドが検出部で捕捉されぬまま吸収部へと流れていくことになり検出部に捕捉され堆積する標識物質が減少することにより発色強度が減少する。一方、標識物質保持部に担持された一次抗体は、Ｐ３０Ａｇより先にペプチド１及びペプチド２に結合することにより、後から展開されるＰ３０Ａｇに結合する第一抗体の量が、ペプチド１又はペプチド２が存在しない場合と比較して少なくなるため、検出部で捕捉されるＰ３０Ａｇは、第一抗体が結合していないものが相対的に多くなり、その結果検出部で検出されるＰ３０Ａｇに起因する発色強度が低くなり、阻害がかかるということになる。

【0074】

本試験では、抗体Ｐ３０（Ａ）を使用しかつ上記ペプチド１及び２のいずれも使用しなかった場合、抗体Ｐ３０（Ａ）を使用しかつペプチド１を使用した場合、抗体Ｐ３０（Ａ）を使用しかつペプチド２を使用した場合の３パターンについて、免疫クロマト分析を行い、発色強度を測定した結果を表１に示す。
また、抗体Ｐ３０（Ａ）を抗体Ｐ３０（Ｂ）に変更して同様の試験を行った結果を表２に示す。

【0075】

【表1】

【0076】

【表2】

【0077】

表１の結果からわかるように、抗体Ｐ３０（Ａ）について、ペプチドなしの場合と比較して、ペプチド１を使用した場合及びペプチド２を使用した場合のいずれの場合も発色強度が減少しており、抗体Ｐ３０（Ａ）はペプチド１及びペプチド２のいずれにも阻害を受けることがわかる。したがって、抗体Ｐ３０（Ａ）は配列番号３に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＡＰＲ）を認識することが分かった。

【0078】

また、表２の結果からわかるように、抗体Ｐ３０（Ｂ）について、ペプチドなしの場合と比較して、ペプチド１を使用した場合は、発色強度に変化は見られなかったが、ペプチド２を使用した場合では発色強度が減少しており、抗体Ｐ３０（Ｂ）はペプチド１の阻害を受けずペプチド２の阻害を受けることがわかる。したがって、抗体Ｐ３０（Ｂ）は配列番号５に示すアミノ酸配列（ＰＧＦＰＰＱ）を認識することが分かった。

【0079】

［試験例２］
本試験では、下記試験例３で作製する本願発明の免疫クロマト装置に使用する、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを認識する抗体（抗体Ｐ３０（Ａ））が、該ドメインＩＩＩを「強く」認識する抗体であるかを確認するため、段落［００１７］〜［００２２］に記載のＥＬＩＳＡ法による試験及び段落［００２４］〜［００２９］に記載の競合阻害ＥＬＩＳＡ試験を行った。

【0080】

まず、試験例１で使用した抗体Ｐ３０（Ａ）がマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体であるか否か確認するため、段落［００１７］〜［００２２］に記載のプロトコールに従ってＥＬＩＳＡ法による試験を行った。具体的には、抗体Ｐ３０（Ａ）が、ブランクを引いた４５０ｎｍの吸光度が０．２Ａｂｓ以上となる抗体であるか否か、以下のように実験した。

【0081】

まず、Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートにＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ３０（（アミノ酸９６−２７４）を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質Ｐ３０Ａｇ）４ｎｇ／ｍＬ ｉｎ ５０ｍＭ 炭酸バッファー ｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートした。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。ブロッキング液として、５％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。

【0082】

一次抗体として前記抗体Ｐ３０（Ａ）５μｇ／ｍＬ ｉｎ ５０％ブロッキング溶液（一抗体溶液）１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした後、一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ
ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
二次抗体として、Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４−１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７℃１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ウェルに発色基質としてＳｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３−００−０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0083】

上記方法でＥＬＩＳＡ試験を行ったところ、ブランク（一次抗体を入れずに二次抗体、発色反応を行ったウェル）の吸光度を引いた４５０ｎｍの吸光度が０．４０３Ａｂｓであり、０．２Ａｂｓ以上であることが確認できた。すなわち、抗体Ｐ３０（Ａ）が「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」ことが確認できた。

【0084】

つづいて、この抗体Ｐ３０（Ａ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体であるか否かさらに確認するため、段落［００２４］〜［００２９］に記載のプロトコールに従い競合阻害ＥＬＩＳＡ試験（間接競合法）を行った。具体的には、抗体Ｐ３０（Ａ）を用いて競合阻害ＥＬＩＳＡ試験を行った結果、吸光度が３０％以上減少するか否か、以下のように実験した。

【0085】

Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、全長タンパク質のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ３０（アミノ酸１−２７４：配列番号１）４ｎｇ／ｍＬ ｉｎ ５０ｍＭ 炭酸バッファーｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートした。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。

【0086】

ブロッキング液として、５％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除き、全長タンパク質固定ウェルを作成した。

【0087】

次に、全長タンパク質固定ウェルに一次抗体として、抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（Ａ））５μｇ／ｍＬ ｉｎ ５０％ ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。

【0088】

また、上記一次抗体のみを加えたものとは別に、一次抗体の抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（Ａ））５μｇ／ｍＬと、前記一次抗体Ｐ３０（Ａ）の４０倍量である、試験例１で使用した上記ペプチド１（配列番号６：ＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲ）またはペプチド２（配列番号７：ＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰＧＭＡＰＲ）とを含む５０％ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。

【0089】

二次抗体として、Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４−１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、上記作成した２種の夫々のウェルに加え、３７℃、１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ウェルに発色基質として、Ｓｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３−００−０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた。
マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0090】

その結果、一次抗体と上記ペプチド１またはペプチド２を加えたウェルの吸光度は、一次抗体のみを加えたウェルの吸光度と比較して、３０％以上減少したことが確認できた。すなわち、抗体Ｐ３０（Ａ）が「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」ことが確認できた。

【0091】

［試験例３］
＜本願発明の免疫クロマト分析装置の作製＞
［実施例１］
（１）試料添加部の作製
試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。

【0092】

（２）標識物質保持部の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した抗体Ｐ３０（Ａ）（Ｆｕｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、商品名：Ｍｐ−Ｐ３０−３−ＡＢ）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。

【0093】

次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。

【0094】

（３）クロマトグラフ媒体部および検出部の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、上記抗体Ｐ３０（Ａ）を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部位（検出ライン）に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。

【0095】

（４）免疫クロマト分析装置の作製
次に、バッキングシートから成る基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。

【0096】

（５）検体希釈液
１質量％の非イオン性界面活性剤ナカライテスク社製ＮＰ−４０（商品名：ノニデットＰ−４０、ＨＬＢ値１７．７）、日油社製商品名ノニデットＭＮ−８１１（ＨＬＢ値 ９．３）の１：１混合物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。

【0097】

（６）測定
マイコプラズマ・ニューモニエを含有する検体試料を使用して、上記作製した免疫クロマト分析装置を用いた場合の、検出部における発色強度を測定した。マイコプラズマ・ニューモニエを含有する検体試料には、市販の不活化マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製、商品名Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＦＨ））、または肺炎マイコプラズマ感染者の咽頭拭い液を用いた。咽頭拭い液は、市販の綿棒を用いて咽頭を拭うことで被験者２名の肺炎マイコプラズマ感染者からそれぞれ採取した。
市販の不活化マイコプラズマ・ニューモニエは、上記抽出液で目的濃度に調整し、検体試料とした（表３中、市販検体と記載）。
また、採取した咽頭拭い液は、上記検体希釈液で２０倍に希釈し、検体試料とした（表３中、被験者１及び被験者２と記載）。

【0098】

上記それぞれの検体試料１５０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部上に載せて展開させ、検出部の着色の度合い（発色強度）をデンシトメーターにより測定した（表中の単位はｍＡｂｓ）。結果を表３及び図２に示す。

【0099】

［比較例１］
検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、試験例１で使用した抗体Ｐ３０（Ｂ）（Ｆｕｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、商品名：Ｍｐ−Ｐ３０−９−ＡＢ）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表３及び図２に示す。
なお、この抗体Ｐ３０（Ｂ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」か否か確認するため、段落［００１７］〜［００２２］に記載のＥＬＩＳＡ法による試験及び段落［００２４］〜［００２９］に記載の競合阻害ＥＬＩＳＡ試験を行った。
まず、抗体Ｐ３０（Ｂ）がマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体であるか否か確認するため、段落［００１７］〜［００２２］に記載のプロトコールに従ってＥＬＩＳＡ法による試験を行った。具体的には、抗体Ｐ３０（Ｂ）が、ブランクを引いた４５０ｎｍの吸光度が０．２Ａｂｓ以上となる抗体であるか否か、以下のように実験した。

【0100】

Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ３０（（アミノ酸９６−２７４）を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質Ｐ３０Ａｇ）４ｎｇ／ｍＬ ｉｎ ５０ｍＭ 炭酸バッファー ｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートした。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。ブロッキング液として、５％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ （ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。

【0101】

一次抗体として前記抗体Ｐ３０（Ｂ）５μｇ／ｍＬ ｉｎ ５０％ ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした後、一次抗体溶液抗体Ｐ３０（Ｂ）を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。
二次抗体として、Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４−１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７℃１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ウェルに発色基質としてＳｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３−００−０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0102】

上記方法でＥＬＩＳＡ試験を行ったところ、ブランク（一次抗体を入れずに二次抗体、発色反応を行ったウェル）の吸光度を引いた４５０ｎｍの吸光度が０．０６１Ａｂｓであり、０．２Ａｂｓ未満であることが確認できた。すなわち、抗体Ｐ３０（Ｂ）が「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体ではないことが確認できた。

【0103】

つづいて、この抗体Ｐ３０（Ｂ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体であるか否かさらに確認するため、段落［００２４］〜［００２９］に記載のプロトコールに従い競合阻害ＥＬＩＳＡ試験（間接競合法）を行い、吸光度が３０％以下に減少するか否か、以下のように実験した。

【0104】

Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、全長タンパク質のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ３０（アミノ酸１−２７４：配列番号１）１０ｎｇ／ｍＬ ｉｎ ５０ｍＭ 炭酸バッファーｐＨ９．５を１００μＬ加え、４℃にて１６時間インキュベートした。１６時間後、Ｐ３０溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。

【0105】

ブロッキング液として、５％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳＴ（ＢＳＡ：オリエンタル酵母社製）を３００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートする。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除き、全長タンパク質固定ウェルを作成した。

【0106】

次に、全長タンパク質固定ウェルに一次抗体として、抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（Ａ））５μｇ／ｍＬ ｉｎ ５０％ ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。

【0107】

また、前記一次抗体のみを加えたものとは別に、一次抗体の抗Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐ３０抗体（抗体Ｐ３０（Ｂ））５μｇ／ｍＬと、一次抗体Ｐ３０ （Ｂ）量の４０倍量である量、試験例１で使用したペプチド１（配列番号６：ＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲ）またはペプチド２（配列番号７：ＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰＧＭＡＰＲ）とを含む５０％ブロッキング溶液１００μＬをウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした。その後一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。

【0108】

二次抗体として、Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４−１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、上記作成した２種の夫々のウェルに加え、３７℃、１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ウェルに発色基質として、Ｓｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３−００−０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた。
マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0109】

その結果、一次抗体と上記ペプチド１またはペプチド２を加えたウェルの吸光度は、一次抗体のみを加えたウェルの吸光度と比較して、ペプチド１では減少が見られず、ペプチド２では約２２％しか減少せず、その減少率は３０％未満であることが確認できた。すなわち、抗体Ｐ３０（Ｂ）が「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体ではないことが確認できた。

【0110】

［比較例２］
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（Ａ）及び検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（Ａ）の両方を、上記抗体Ｐ３０（Ｂ）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表３及び図２に示す。

【0111】

［比較例３］
検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１タンパク質に対する抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製、商品名ＭＡｂ ｔｏ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ１（ｃｌｏｎｅ Ｂ１９４７Ｍ）：以下、抗体Ｐ１（Ｂ）と表記する）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表３及び図２に示す。

【0112】

［比較例４］
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１タンパク質に対する抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製、商品名ＭＡｂ ｔｏ
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｐ１（ｃｌｏｎｅ Ｂ１９４８Ｍ）：以下、抗体Ｐ１（Ａ）と表記する）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表３及び図２に示す。

【0113】

［比較例５］
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、抗体Ｐ１（Ａ）に、検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、抗体Ｐ１（Ｂ）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表３及び図２に示す。

【0114】

【表3】

【0115】

［実施例２］
検体希釈液の組成を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬社製、商品名、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ値：１３．７）、Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製、商品名、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＨＬＢ値：１６．７）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表４及び図３に示す。
［比較例６］
検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、抗体Ｐ３０（Ｂ）に変更したこと以外は、実施例２を繰り返した。結果を表４及び図３に示す。

【0116】

［比較例７］
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（Ａ）及び検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（Ａ）の両方を、抗体Ｐ３０（Ｂ）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表４及び図３に示す。

【0117】

【表4】

【0118】

［実施例３］
検出検体を、Ｐ３０タンパク質（（アミノ酸９６−２７４）を、大腸菌を利用した常法で発現、精製したタンパク質Ｐ３０Ａｇ）に変更し、検体希釈液の組成を、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００（和光純薬社製、商品名、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ値：１３．７）、Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製、商品名、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＨＬＢ値：１６．７）１：１混合物に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。
［比較例８］
検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、抗体Ｐ３０（Ｂ）に変更したこと以外は、実施例３を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。

【0119】

［比較例９］
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（Ａ）及び検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（Ａ）の両方を、抗体Ｐ３０（Ｂ）に変更したこと以外は、実施例３を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。

【0120】

［比較例１０］
検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、抗体Ｐ１（Ｂ）に変更したこと以外は、実施例３を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。

【0121】

［比較例１１］
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、抗体Ｐ１（Ａ）に変更したこと以外は、実施例３を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。

【0122】

［比較例１２］
標識物質保持部に添加した標識物質溶液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、抗体Ｐ１（Ａ）に、検出部に塗布した抗体希釈液中の抗体Ｐ３０（Ａ）を、抗体Ｐ１（Ｂ）に変更したこと以外は、実施例３を繰り返した。結果を表５及び図４に示す。

【0123】

【表5】

【0124】

以上の結果より、標識物質保持部及び検出部の両方に、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する抗体Ｐ３０（Ａ）を含有させた場合は（実施例１〜３）、それ以外の場合（比較例１〜１２）と比較して、マイコプラズマ・ニューモニエ、またはＰ３０タンパク質の検出感度が顕著に高いことが分かった。

【0125】

［試験例４］
試験例２における抗体Ｐ３０（Ａ）および比較例１における抗体Ｐ３０（Ｂ）が、「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体であるか確認するため、競合阻害ＥＬＩＳＡ試験（間接競合法）を行った。本試験では、競合させるドメインＩＩＩの断片として、試験例１で使用した上記ペプチド１またはペプチド２のいずれかを使用し、さらに上記ペプチドの濃度を下記表６、７のように変更して（×１〜×６４０）、試験例２または比較例１に記載の方法と同様にして競合阻害ＥＬＩＳＡ試験（間接競合法）を行った。結果を表６、７に示す。表６は、抗体として抗体Ｐ３０（Ａ）を使用した結果であり、表７は、抗体として抗体Ｐ３０（Ｂ）を使用した結果である。また表６の結果を図５、表７の結果を図６に示す。

【0126】

【表6】

【0127】

【表7】

【0128】

表６及び図５の結果より、ペプチド濃度を一次抗体抗Ｐ３０（Ａ）抗体濃度の４０倍とした場合に、ウェルの吸光度がコントロールと比較して３０％以上減少し、８０倍量とした場合でも５０％以上減少することが確認できた。なお、抗体Ｐ３０（Ａ）はペプチド１及びペプチド２のいずれにも阻害を受けることから、抗体Ｐ３０（Ａ）は配列番号３に示すアミノ酸配列（ＰＧＭＡＰＲ）を認識することが本試験でも確認できた。

【0129】

また、表７及び図６の結果より、ペプチド濃度を一次抗体Ｐ３０（Ｂ）量の４０倍とした場合でも、ウェルの吸光度がコントロールと比較して約２２％しか減少せず、３０％未満であった。すなわち、抗体Ｐ３０（Ｂ）が「マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質のドメインＩＩＩを強く認識する」抗体ではないことが確認できた。なお、抗体Ｐ３０（Ｂ）はペプチド１の阻害を受けずペプチド２の阻害を受けることから、配列番号５に示すアミノ酸配列（ＰＧＦＰＰＱ）を認識することが本試験でも確認できた。

【符号の説明】

【0130】

１ 試料添加部（サンプルパッド）
２ 標識物質保持部
３ クロマトグラフ媒体部
４ 検出部
５ 吸収部
６ バッキングシート

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]