特許 6145257 エストロゲン活性を評価する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6145257

(24)【登録日】2017年5月19日

(45)【発行日】2017年6月7日

(54)【発明の名称】エストロゲン活性を評価する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/06 20060101AFI20170529BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALN20170529BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20170529BHJP

   C12N 5/09 20100101ALN20170529BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/06ZNA

   !C12Q1/48 Z

   !C12M1/00 C

   !C12N5/09

【請求項の数】15

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2012-231067(P2012-231067)

(22)【出願日】2012年10月18日

(65)【公開番号】特開2014-79223(P2014-79223A)

(43)【公開日】2014年5月8日

【審査請求日】2015年10月19日

(73)【特許権者】

【識別番号】000001085

【氏名又は名称】株式会社クラレ

(74)【代理人】

【識別番号】100103894

【弁理士】

【氏名又は名称】家入 健

(72)【発明者】

【氏名】綾野 賢

(72)【発明者】

【氏名】江尻 洋子

(72)【発明者】

【氏名】細田 雅也

(72)【発明者】

【氏名】成松 鎭雄

(72)【発明者】

【氏名】埴岡 伸光

(72)【発明者】

【氏名】伊豆野 祥太郎

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０６−５０４０３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５０１６７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１２６９２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１２４３５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０４７１３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Steroids, 2008, 73(1)139-147

【文献】 Environmental Health Perspectives, 1995, 103(Suppl 7):113-122

【文献】 YAKUGAKU ZASSHI, 2003, 123(6):443-452

【文献】 平野舞他, 日本薬学会年会要旨集, 2008, Vol.3, p.120, 27PW-am071

【文献】 Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2012 Mar, 110(3)253-258

【文献】 Assay Drug Technol., 2004, 2(4):345-352

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験物質が細胞に対してエストロゲン活性を有するものであるか評価する評価方法であって、
培養容器に形成される複数の培養空間内で、細胞を培養してスフェロイド形状の細胞を複数形成させる第１工程と、
前記スフェロイド形状の細胞それぞれに対して、検査する化学物質を含む第１溶液、エストロゲン活性を有することが知られている化学物質を含む第２溶液、及び、前記第１溶液から前記検査する化学物質を除いた第３溶液のうちのいずれかを作用させる第２工程と、
前記第１乃至第３溶液のうちのいずれかを作用させた各スフェロイド形状の細胞に対して、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性測定溶液を作用させて、各スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性を測定する第３工程と、
前記第１溶液を作用させた前記スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性が、前記第２溶液を作用させた前記スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性と同等あるいはそれ以上に高い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質は前記第２溶液に含まれる化学物質と等しいあるいはそれ以上のエストロゲン類似活性を有すると判定し、前記第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、前記第３溶液の活性よりも高く、前記第２溶液の活性よりも低い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質はゼロから前記第２溶液の活性値の間のエストロゲン類似活性を有すると判定し、前記第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、前記第３溶液の活性と同等あるいはそれよりも低い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質はエストロゲン類似活性をもたないと判定する第４工程と、
を含むことを特徴とし、
前記培養する細胞がエストロゲン受容体を有することを特徴とする評価方法。

【請求項2】

前記エストロゲン受容体を有する細胞が、乳がん由来、子宮がん由来、または腺管がん由来であることを特徴とする、請求項１記載の評価方法。

【請求項3】

前記培養容器が、複数のウェルを有する培養プレートの各ウェル内に、微細な凹凸構造により前記複数の培養空間を有するように形成され、前記複数の培養空間内でスフェロイド形状の細胞を形成することを特徴とする請求項１または２記載の評価方法。

【請求項4】

前記第２工程では、前記第２溶液として、エストロゲン活性値が異なる２つ以上の化学物質を用いることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項5】

前記第２工程では、前記第１乃至第３溶液を１時間以上７２時間以下、前記スフェロイド形状の細胞に作用させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項6】

前記第３工程では、前記ＵＧＴ活性を測定する試薬が、少なくとも１つ以上のＵＧＴ１Ａ種および／または少なくとも１つ以上のＵＧＴ２Ｂ種によってグルクロン酸抱合を受ける基質を含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項7】

前記第３工程では、前記ＵＧＴ活性を測定する試薬がウリジン二リン酸グルクロン酸を含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項8】

前記第３工程では、前記ＵＧＴ活性を測定する試薬を１時間以上２時間以下、細胞に作用させることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項9】

前記第３工程では、ＵＧＴ代謝反応によるグルクロン酸抱合体に由来する発光強度または蛍光強度または吸光度を用いて、前記ＵＧＴ活性を算出することを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項10】

前記第１及び第２工程、または前記第１乃至第３工程を同一のマイクロウェルプレートを用いて実施することを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項11】

前記凹凸構造により形成される前記複数の培養空間の相当直径を、前記複数の培養空間の深さで割った値が１以上２未満であることを特徴とする請求項３記載の評価方法。

【請求項12】

前記凹凸構造により形成される前記複数の培養空間の深さが１〜１０００μｍの範囲であり、一つの培養空間の一端から、前記一つの培養空間に隣接する培養空間の一端までである、凸形状及び凹形状の組合せのピッチが１〜１０００μｍの範囲であることを特徴とする請求項３記載の評価方法。

【請求項13】

前記培養容器がポリプロピレン系樹脂、ポリエチレン系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、アクリル系樹脂、ポリエステル系樹脂、スチレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、塩化ビニル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、シリコン樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アクリル・スチレン系共重合樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、フッ素系樹脂、熱可塑性エラストマー、及びこれらの組合せからなる群から選択される樹脂成形品であることを特徴とする請求項３記載の評価方法。

【請求項14】

前記培養空間の表面の水接触角が４５度以下であることを特徴とする、請求項３記載の評価方法。

【請求項15】

スフェロイド形成処理と前記第１乃至第３溶液の接触処理とを同一の前記培養容器で実施することを特徴とする、請求項３記載の評価方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、環境中に存在する、または合成された化学物質について、エストロゲン類似活性を評価する方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

エストロゲンは生体内に存在するステロイドホルモンの一種で、様々な生理作用を有する物質である。このエストロゲンとは異なる化学物質であって、環境中に存在する、または合成された化学物質が体内でエストロゲンと類似した作用を及ぼすことがある。このような化学物質は一般に内分泌攪乱物質と呼ばれ問題になっている。例えば、非特許文献１には、ある化学物質がエストロゲン類似活性を示すかどうか調べるための方法として、ヒト乳がん由来細胞株ＭＣＦ−７（以降適宜、「ヒト乳がん由来細胞株ＭＣＦ−７」を「ＭＣＦ−７細胞」と称する）の細胞増殖を指標とする方法が開示されている。また、非特許文献２には、ＭＣＦ−７細胞のようにエストロゲン受容体を有するエストロゲン類似活性化合物の活性評価方法が開示されている。特許文献１には、エストロゲン類似活性を評価する方法が開示されている。この方法では、まず、エストロゲン類似活性化合物において、標準物質である１７β−エストラジオールにより発現量が３倍以上に上昇することが確認された遺伝子及び／またはＥＳＴ（expressed sequence tag 、発現遺伝子配列断片）をマイクロアレイ基板上に固定する。そして、エストロゲン類似活性を評価したい化学物質で処理した細胞から調製した核酸試料を、このマイクロアレイ基板に接触させることによってハイブリダイズした核酸を検出、比較する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許第４８３２４１２号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ana M. Soto, Carlos Sonnenschein, Kerrie L. Chung, Mariana F. Fernandez, Nicolas Olea, Fatima Olea Serrano著、"The E-SCREEN Assay as a Tool to Identify Estrogens: An Update on Estrogenic Environmental Pollutants"、Environmental Health Perspectives volume 103、１９９５年１０月、ｐｐ．１１３−１２２

【非特許文献2】J. Odum, S. Tittensor, J. Ashby著、"Limitations of the MCF-7 Cell Proliferation Assay for Detecting Xenobiotic Oestrogens"、Toxicology in Vitro 12、１９９８年、ｐｐ．２７３−２７８

【非特許文献3】Athena Starlard-Davenport, Beverly Lyn-Cook, Anna Radominska-Pandya著、"Novel identification of UDP-glucuronosyltransferase 1A10 as an estrogen-regulated target gene"、steroids 73、２００８年、ｐｐ．１３９−１４７

【非特許文献4】Nobumitsu Hanioka, Hiroyuki Iwabu, Hiroyuki Hanafusa, Shintaro Nakada, Shizuo Narimatsu著、"Expression and Inducibility of UDP-glucuronosyltransferase 1As in MCF-7 Human Breast Carcinoma Cells"、Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 110、２０１２年、ｐｐ．２５３-２５８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

非特許文献１に開示されているＭＣＦ−７細胞の増殖を指標とする方法は、非特許文献２において、エストロゲン無添加の状態でＭＣＦ−７細胞を長期間培養した場合、環境の変化に適応してエストロゲン無添加の状態でも高い増殖活性を示す細胞が現れることが指摘されている。従って、非特許文献１の方法を用いる場合には、誤った評価結果を招く恐れがある。
特許文献１は、エストロゲン存在下で発現量が増大することが確認された遺伝子及び／またはＥＳＴを指標とする点で非特許文献１の技術よりに優れるが、検査したい化合物１つに対して１つのマイクロアレイを作製する必要がある。このため、多数の化合物を検査する場合、多大な費用がかかる。
従来の技術では、評価結果の信頼性を向上させようとすると、手続は煩雑になるとともにコストがかかるという問題があった。
このように、正確性と簡便性を兼ね備えるエストロゲン類似活性の評価方法が見出されていなかった。

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明者らは、細胞のＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）の酵素活性を指標とすることで、エストロゲン類似活性が生体に与える影響をより正確かつ簡便に評価する方法を見いだした。

【0007】

本発明に係る評価方法の一態様は、被験物質が細胞に対してエストロゲン活性を有するものであるか評価する評価方法であって、少なくとも次の工程を実施する。
・細胞を培養してスフェロイド形状の細胞を複数形成させる第１工程。
・前記スフェロイド形状の細胞それぞれに対して、第１乃至第３溶液のいずれかを作用させる第２工程。第１溶液は、検査する化学物質（被験化学物質）を含む。第２溶液は、エストロゲン活性を有することが知られている化学物質を含む。第３溶液はエストロゲン活性を持たないことが知られている化学物質を含む。言い換えると第３溶液は、前記第１溶液から前記検査する化学物質を除いた溶液である。
・前記第１乃至第３溶液のうちのいずれかを作用させた各スフェロイド形状の細胞に対して、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性測定溶液を作用させて、各スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性を測定する第３工程。
・測定結果に基づいて、第１溶液が含む化学物質のエストロゲン類似活性を判定する工程。具体的には、（１）前記第１溶液を作用させた前記スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性が、前記第２溶液を作用させた前記スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性と同等あるいはそれ以上に高い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質は前記第２溶液に含まれる化学物質と等しいあるいはそれ以上のエストロゲン類似活性を有すると判定する。（２）前記第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、前記第３溶液の活性よりも高く、前記第２溶液の活性よりも低い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質はゼロから前記第２溶液の活性値の間のエストロゲン類似活性を有すると判定する。（３）前記第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、前記第３溶液の活性と同等あるいはそれよりも低い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質はエストロゲン類似活性をもたないと判定する。
これにより、正確性と簡便性とを備えるエストロゲン類似活性の評価方法を提供することができる。

【0008】

また、本発明に係る評価方法の一態様において、前記培養する細胞がエストロゲン受容体を有することが好ましい。さらに、前記培養容器が、複数のウェルを有する培養プレートの各ウェル内に、微細な凹凸構造により前記複数の培養空間を有するように形成され、前記複数の培養空間内でスフェロイド形状の細胞を形成することが好ましい。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、正確性と簡便性を兼ね備えるエストロゲン類似活性の評価方法を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。

【図2A】図１に示す培養プレートのＩＩ−ＩＩ線断面図である。

【図2B】図１に示す培養プレートの他のＩＩ−ＩＩ線断面図である。

【図3】本発明の一実施形態で用いる培養容器の全体を示す図である。

【図4】図３に示す培養容器のＩＶ−ＩＶ線断面図である。

【図5A】培養空間でスフェロイドを培養する状態を表す概略図である。

【図5B】培養空間で培養したスフェロイドの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す図である。

【図6A】培養空間の他の形状例を示す図である。

【図6B】培養空間のさらに他の形状例を示す図である。

【図7A】培養空間の他の側面の形状例を示す断面図である。

【図7B】培養空間のさらに他の側面の形状例を示す断面図である。

【図7C】培養空間のさらに他の側面の形状例を示す断面図である。

【図8】実施例１で用いる培養プレートの一例を示す写真である。

【図9】実施例１の培養後の細胞の写真である。

【図10】実施例１の活性測定結果を示すグラフである。

【図11】実施例２の活性測定結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、実施形態について、図面を参照しながら説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。

【0012】

本明細書では次の用語を用いる。
用語「スフェロイド」は、細胞が多数凝集して細胞塊を形成し、３次元状態になったものである。
用語「ウェルプレート」は、多数のくぼみ（穴またはウェル）のついた平板からなる実験・検査器具であり、各ウェルを試験管あるいはシャーレとして利用するものをいう。ウェルの数には例えば、６、２４、９６、３８４などがあり、それ以上の数のものもある。ウェルの底は平らなもの、丸いもののほか、細長いマイクロチューブを多数組み合わせた形式のもの（ディープウェルプレート）もある。

【0013】

以下の説明において、「値Ａから値Ｂの範囲」という場合には、特に明記していない限り、「値Ａ以上値Ｂ以下」を意味する。
加えて、「Ａ、Ｂ、・・・、Ｃ、及びこれらの組合せ」という記載の「これらの組合せ」は、その前に記載のＡ、Ｂ、・・・、Ｃのうちの二つ以上の任意の数の組合せであることを意味する。言い換えると、「Ａ、Ｂ、・・・、Ｃ、及びこれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、・・・、Ｃのうちのいずれか一つと、これらの任意の数の組合せとのうちの一方、ということもできる。

【0014】

一実施形態では、細胞のＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（以下適宜、「ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素」を「ＵＧＴ」と称する）の酵素活性を指標とすることで、エストロゲン類似活性が生体に与える影響をより正確かつ簡便に評価する方法を提供する。ここで、まず上述した二つの課題を解決する手法について、その概略を説明する。

【0015】

一つ目の課題である正確な評価方法は、ＵＧＴ活性を指標とすることによって実現する。ＵＧＴは生体内でエストロゲンおよびエストロゲン類似物質の代謝・排出に関わる酵素である。例えば、非特許文献３ではＭＣＦ−７細胞にエストロゲンまたはエストロゲン類似物質を作用させた場合、ＵＧＴ１Ａ１０の発現量が増大することが報告されている。しかし、非特許文献３にはエストロゲンによる発現誘導が濃度依存的ではないことが示されている。そのため、ＵＧＴの発現量を指標とした場合、検査したい化学物質の濃度によっては、エストロゲン類似活性があるにも関わらず検出できない可能性がある。一方、ＭＣＦ−７細胞に対して一般的にＵＧＴ誘導効果が知られている化学物質を作用させた場合、ＵＧＴ発現量に大きな変化が見られないにも関わらず、ＵＧＴ活性は８〜９倍に向上することを、発明者らは非特許文献４で報告している。
即ち、検査したい化学物質を細胞に作用させたときのＵＧＴ活性の向上を調べることで、遺伝子発現量を指標とする従来技術よりも正確に、その化学物質がエストロゲン類似活性を有するものであるかどうか評価することができる。そのため、検査する化学物質を細胞に作用させる工程が必要であり、この工程の手法を見出した。

【0016】

二つ目の課題である簡便な評価方法は、細胞に対して検査物質を作用させる工程と酵素活性測定用試薬を作用させる工程とを同一の細胞培養ウェルプレート上で行なうことで提供される。一般にＵＧＴ酵素活性は代謝産物であるグルクロン酸抱合体の生成量を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）や液体クロマトグラフィーによって測定することで表される。しかし薄層クロマトグラフィーを行なうためには放射性同位体で標識されたＵＤＰ−グルクロン酸を用意する必要がある。その結果、放射線物質漏洩を防ぐため、ＲＩ（Radioisotope）施設の設置や、届出などの特別なケアが必要となり、汎用性に課題がある。また液体クロマトグラフィーと比較した場合、薄層クロマトグラフィーは、定量性に劣るという欠点がある。一方、液体クロマトグラフィーはグルクロン酸抱合体の生成量を精度よく測定することができるが、直接測るためには検査対象の検出波長が既知である必要がある。このため、未知の化学物質を速やかに調べることができない。

【0017】

そこで、まず、検査する化学物質を細胞に作用させてＵＧＴ活性を変化させた後に、ＵＤＰ−グルクロン酸抱合によって蛍光波長がシフトすることが知られている試薬を作用させる。次に、プレートリーダーまたは液体クロマトグラフィーによって、シフトした蛍光波長を測定する。この手順によって、ＵＧＴ活性を評価する方法を見いだした。しかしながら、この方法では作用させたエストロゲン濃度に依存的なＵＧＴ活性の上昇は見られない、またはわずかな上昇幅であるため精度よく検出することができない。そのため、ウェルプレート内で細胞を三次元的に培養し、ＵＧＴ活性を高めることで、プレートリーダーや液体クロマトグラフィーで充分測定可能な蛍光を検出できる方法を発見した。

【0018】

続いて、一実施形態の評価方法の詳細を説明する。評価方法は、被験物質（被験化学物質）が細胞に対してエストロゲン活性を有するものであるか否かを評価する。例えば、第１乃至第４工程の手順を実施することにより実現する。以下に第１乃至第４工程の概略を説明する。なお、第１乃至第４工程は説明を容易にするために工程を分けたものであり、これに限られるものではない。
第１工程は、細胞を培養してスフェロイド形状の細胞を形成する培養処理である。以降の説明において、「スフェロイド形状の細胞」を「スフェロイド」と称することもある。
第２工程は、培養したスフェロイド形状の細胞へ、化学物質を含む溶液を作用させる作用処理である。
第３工程は、第１乃至第３溶液のいずれかを作用させた各スフェロイド形状の細胞に対して、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性測定溶液を作用させて、各スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性を測定する測定処理である。
第４工程は、測定結果に基づいて、被験物質がエストロゲン類似活性を有するか否かを判定する判定処理である。

【0019】

以下、一実施形態の評価方法について、最初に、培養処理で用いる培養容器について説明し、次に、培養処理から判定処理までを実施する評価方法の手順について詳細に説明する。

【0020】

１．培養容器
＊ 培養容器の概略
図１は、本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。図２Ａは、図１に示す培養プレートのＩＩ−ＩＩ線断面図であり、図２Ｂに、他の態様の断面図を示す。培養プレート１は、複数のウェル２１を備える。複数のウェル２１は、仕切り部２２によって、隣り合うウェル２１と隔てられる。複数のウェル２１それぞれには、培養容器１０が形成されている。
図３に、本発明の実施形態で用いる培養容器の構成例を示す。図４は、図３に示す培養容器のＩＶ−ＩＶ線断面図である。
培養容器１０は、培養空間１１と、壁１２と、底部１３とを有する。
培養空間１１は、壁１２と底部１３とで仕切られた領域であり、細胞を培養する三次元の空間領域（培養領域）となる。培養空間１１は、単に「空間」、または「マイクロ空間」とも称する。
壁１２は、培養空間１１を仕切る隔壁であり、培養容器１０に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。培養空間１１が仕切り部２２に隣接する場合、壁１２は、図２Ａに示すように、仕切り部２２の壁面の一部分と同じになってもよいし、図２Ｂに示すように、仕切り部２２の壁面に隣接して壁１２が配置されてもよい。
底部１３は、培養容器１０の基板として機能するとともに、培養空間１１が配置される側の表面は、培養領域（培養表面）の一部となる。底部１３は、培養プレート１に形成された各ウェル２１の底部と同じ領域であり、各ウェル２１の底部が用いられる。底部１３は、培養空間１１の底を形成する。底部１３のうち、培養空間１１を形成する面の一部分であり、かつ、培養領域となる底部の表面を、「底部培養面１４」とも称する。

【0021】

図３，４では、培養容器１０に形成される培養空間１１に関して、相当直径Ｄ、高さ（深さ）Ｈ、壁１２の幅（厚さ）Ｗ、及び、底部１３の厚さＴを示す。図３，４では、底部１３は、壁１２と一体として作製された場合を示している。
相当直径Ｄは、培養空間１１に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｄは、培養空間１１の底部１３と平行する面の形状（正面の形状）、言い換えると、培養空間１１の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。培養空間１１の正面の形状が、高さＨに応じて異なる場合、株化肝細胞を培養する空間領域の最大値を相当直径の相当直径とする。
高さＨは、培養空間１１の底（底部培養面１４）から壁１２の上面までの長さであり、培養空間１１の深さでもあるともいえる。また、底部培養面１４が平面の場合、高さＨは、壁１２の高さと同じである。
壁１２の幅Ｗは、壁１２の厚さであるとともに、隣接する培養空間１１間を隔てる距離であるともいえる。

【0022】

培養容器１０内（言い換えると、各ウェル２１内）において、複数の培養空間１１は、図３に示すようにアレイ状に配置される。培養容器１０に含まれる培養空間１１の数または大きさは、培養プレート１に作製されるウェル２１の数（ウェル２１の大きさ）と培養空間１１及び壁１２の大きさに依存するものである。具体的には、ウェル２１の数が多くなるに従って、培養空間１１の数が小さくなる関係にある。同じ大きさのウェル２１のとき、ウェル２１の中の培養空間１１の数は、相当直径Ｄが大きい場合や幅Ｗが大きい場合に小さくなる関係にある。図１乃至４では、構成をわかりやすく説明するため、培養空間１１の数を少なくして表した概略図であり、培養容器１０に含まれる培養空間１１の数は実際とは異なる。加えて、図３，４では、９個の培養空間１１を示している。これは説明のために示したものであり、実際の培養容器１０（各ウェル２１）に含まれる培養空間１１の数に対応するものではない。

【0023】

発明者らは、相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１〜５倍であり、高さＨが相当直径Ｄの０．３倍〜２倍である培養空間１１を複数有するとともに、該培養空間表面の水接触角が４５度以下である培養容器１０を使用し、各培養空間１１で株化肝細胞を培養することによって、均一な直径の株化肝細胞のスフェロイドを培養することができることを見出した。従って、所望するスフェロイドの大きさに応じて、培養容器１０に配置される培養空間１１の大きさを選択することにより、培養するスフェロイドの大きさを制御することが可能になる。一実施形態では、株化肝細胞として、ヒト由来の株化肝細胞を培養してスフェロイド形成させる。以下に詳細を説明する。

【0024】

図１乃至４を参照して、所望のスフェロイドを形成させるためのマイクロオーダの培養空間１１の大きさ、形状等と、培養表面の特性を説明する。
＊ 培養空間の大きさ、形状等
培養空間１１の相当直径Ｄについて、細胞が増殖するに従いスフェロイドの直径が大きくなることを考慮する必要がある。そこで重要なことは、スフェロイドが隣り合う培養空間１１の細胞と接触しないような培養空間１１を確保することである。このため、培養空間１１の相当直径Ｄは、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲が好ましく、１．２〜４倍の範囲がより好ましい。
例えば、直径１００μｍの株化肝細胞のスフェロイドを形成させるために、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、即ち、相当直径Ｄが１００〜５００μｍの範囲で、高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３〜２の範囲の培養空間１１が規則的に配置されている底部１３を有する培養容器１０を用いる。

【0025】

株化肝細胞の培養空間１１の表面との細胞接着性を強めることで、増殖・維持させているような場合は、十分に細胞が底面に接着性していることから培地交換時に細胞が剥離することがない。そのため、本実施形態のような、培養空間１１の相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、高さＨが相当直径Ｄの０．３〜２倍の範囲という、深い空間は必要ないため、そのような空間での培養は行わない。
一方、一実施形態では、後述するように細胞接着性を抑制しているため、アミノ酸や酸素などの供給が可能、かつ、スフェロイドが脱離しない最適な高さＨを設計する必要がある。好ましい範囲のスフェロイドを形成させるために好ましい高さＨ、相当直径Ｄを検討した結果、細胞増殖によりスフェロイドが過剰に大きくなることを防ぐためには、相当直径Ｄが１００μｍ〜２００μｍの範囲、高さＨが５０μｍ〜１００μｍの範囲が好ましい。培養空間１１の底までアミノ酸等の栄養分を十分に供給するため、かつ老廃物の蓄積を防ぐために、培養空間１１の高さＨは、培地交換や試験溶液交換時にスフェロイドが剥離しない限り低い方が好ましい。具体的には、培養空間１１の高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３〜２の範囲が好ましく、０．５〜１の範囲がより好ましいことを見いだした。

【0026】

一実施形態では、試験溶液をスフェロイド中心部まで拡散または輸送させるためには、スフェロイドの直径は最大２００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ以下が好ましい。さらに加えて、細胞間の相互作用の効果を最大限に引き出すためには、スフェロイドの直径は、最小５０μｍが好ましく、６０μｍ〜１５０μｍの範囲がより好ましい。ここで、細胞間の相互作用は、細胞同士の接着、あるいは細胞間での物質のやり取りのことを指す。また細胞間の相互作用による効果とは、本発明においては、検査する化学物質（例えば、エストラジオール）の吸収、代謝、排出機能の向上を指す。

【0027】

壁１２の幅Ｗは、培養空間１１と隣接する培養空間１１を隔てる壁１２の厚みである。従って、壁１２の幅Ｗは、壁１２の上面での細胞増殖を防ぐため、かつ、細胞が培養空間１１内に入りやすくするため、２〜５０μｍの範囲がよく、好ましくは、細胞体１個以下の大きさ、即ち５〜３０μｍの範囲が好ましく、５〜１０μｍの範囲がより好ましい。さらに、同様の観点から、壁１２の上面と培養空間１１の側面とのなす角θは、９０〜１３５度の範囲が好ましく、９０度〜１２０度の範囲がより好ましい。

【0028】

図５Ａに、培養空間１１でスフェロイドを培養する状態を表す概略図を示す。図５Ａでは、図４に示す断面図を用い、スフェロイド９を、○印で示す。スフェロイド９は、複数の培養空間１１それぞれにおいて培養される。
図１に示す培養プレート１で培養する場合、ウェル２１毎に培養条件の設定、培地の交換等を実施することになる。そのため、各ウェル２１に複数の培養空間１１を形成するため、各ウェル２１において、同条件で複数のスフェロイドを培養することが可能になる。加えて、ウェルプレートを用いてスフェロイドを培養することができるため、従来の細胞培養で用いる装置等を利用することが可能になる。
スフェロイド９の直径ＤＳＰを値ｄｓｐ（ｄｓｐは正の数値）とすると、培養空間１１の相当直径Ｄは、値ｄｓｐから値ｄｓｐの５倍の範囲（ｄｓｐ≦Ｄ≦５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。また、培養空間１１の高さＨは、値ｄｓｐの０．３倍から値ｄｓｐの２５倍（５×５）の範囲（０．３ｄｓｐ≦Ｈ≦２５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。

【0029】

図５Ｂに、培養空間で培養したスフェロイドの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す。図５Ｂは、スフェロイド９の相当直径Ｄに沿って切断した切断部端面を模式的に示した図である。上述したように、スフェロイドの直径の平均が５０μｍ以上２００μｍ未満であることが好ましく、特に、６０μｍ〜１５０μｍの範囲が好ましい。図５Ｂでは、スフェロイド９の切断部端面が５個の細胞８により形成されている様子を示す。例えば、細胞８の直径ＤＣＬが２０μｍであり、スフェロイド９の直径ＤＳＰが６０μｍのスフェロイド９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に３個並ぶことにより形成される。同様に、スフェロイド９の直径ＤＳＰが１５０μｍのスフェロイド９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に５個並ぶことにより形成される。図５Ｂは説明を容易にするために細胞８を直線上に並べて模式的に示したものであり、細胞８は必ずしも直線上に並ぶとは限らない。

【0030】

加えて、１試験領域（１ウェル、１シャーレ）にあるスフェロイドは、その直径が半値幅の範囲内にあるものが全体の７０％以上含まれることが好ましい。言い換えると、スフェロイドの直径の大きさがそろっていることが好ましい。その理由は以下の通りである。まず、スフェロイドの大きさによって代謝活性値が異なることが知られていることから、様々な直径のスフェロイドが混在していると精度の高い結果が得られない。また、小さい（５０μｍ以下の）スフェロイドの代謝機能は極端に低いことが知られている。そのため、このようなスフェロイドが多く含まれている場合、代謝機能を減衰させるようなサイトカインを評価する際に測定限界値以下となり、代謝機能の減衰の有無が判定できない可能性がある。
「半値幅の範囲」とは、１試験領域にあるスフェロイドの総個数ＮＴうち、直径の大きさと存在する個数との対応を取ったときに、存在する個数が最大となる直径Ｄ１の個数Ｎ１に対して、個数Ｎ１の半分の個数（Ｎ１／２）となる複数の直径のうち、最小の直径Ｄ２から最大の直径Ｄ３までの範囲に存在するスフェロイドの個数Ｎ２をいう。
スフェロイドの大きさを一様にするために、上述した総個数ＮＴに対して個数Ｎ２が７０％以上であることが好ましく、総個数ＮＴに対する個数Ｎ２の割合が高くなることがより好ましい。

【0031】

培養空間１１の形状（正面の形状）、あるいは、底部１３と平行な面の形状は、図３に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図６Ａ〜６Ｂに示すような形状であっても、その他の形状（楕円や菱形など）であってもよい。より高密度で均一な直径を有するスフェロイドを形成させるためには、左右対称構造であることが好ましい。
培養空間１１の側面の形状は、図４に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図７Ａ〜７Ｃに示すような形状であってもよい。

【0032】

培養容器１０を構成する材料としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、シリコン樹脂、及びこれらの組合せからなる群から選択される。

【0033】

培養容器１０の底部１３の厚さＴは、観察性の観点から、１ｍｍ以下が好ましい。ただし、顕微鏡での観察に支障をきたさない限り、１ｍｍ以上であってもよく、底部１３の厚さＴを限定するものではない。培養容器の底部１３の観察性を確保することにより、培養プレートをそのまま用いて、培養したスフェロイドを観察することが可能になる。培養容器の観察性を確保することにより、培養容器をそのまま用いて、免疫組織学法による蛍光染色観察や、Green Fluorescent Protein（ＧＦＰ）などのレポータ遺伝子を使用したin situ法が可能となる。
加えて、培養容器１０の底部１３を構成するポリマーの全光線透過率が、８５％以上９９％未満であることが好ましい。全光線透過率（total luminous transmittance）は、日本工業規格（ＪＩＳ Ｋ７３７５）により測定する。全光線透過率を高くすることにより、底部１３の上に培養されたスフェロイドの観察性を確保することができる。

【0034】

＊ 培養表面の特性
次に、細胞を培養する培養表面、すなわち、培養空間１１を囲む壁１２及び底部培養面１４の特性、特に親水化処理について説明する。培養表面は、各培養空間１１内に培地を入れるため、また、コーティング溶液を用いる場合には、その溶液が培養空間１１内に入り込まなければ表面を覆うことができない。このため、水接触角を４５度以下にすることが好ましい。より好ましくは０度〜２０度の範囲である。また、水接触角の値は、培養空間１１と壁１２の凹凸パターンが形成されていない平板を、培養容器１０と同条件で作製して測定した値を前提とする。

【0035】

培養空間１１をアレイ状に配置した表面に関して、当該表面の疎水性が高く水接触角が４５度を超えると、すなわち濡れ性が低い場合は、培地やコート溶液を添加した際、空間に気泡が入りやすくなり、細胞が培養できない空間が生じることがある。そのため、水接触角が４５度以下になるよう、親水化を行うことが必要である。親水化する方法としては、ＳｉＯ_２を蒸着する方法や、プラズマ処理を行う方法が挙げられる。

【0036】

加えて、培養容器１０で効率よくスフェロイドを形成させるため、細胞接着性を抑制することが好ましい。細胞接着性を抑制するためには、水接触角が４５度以下、好ましくは４０度以下、より好ましくは２０度以下になるような表面を用いることで可能になる。細胞接着性を抑制することと、水接触角との関係については、例えば、Y Ikada著、"Surface modification of polymers for medical applications"、 Biomaterials 1994, vol.15 No.10, pp. 725-736に記載されている。水接触角を４５度以下にする方法としては、ガラスを底部培養面１４に蒸着する方法、プラズマ処理法を用いて、表面に官能基を形成させる方法が挙げられる。プラズマ処理などにより、表面に官能基を形成させる。
また、水接触角を４５度以下にすることで、細胞接着性を抑制する物質をコートしてより接着性を抑制することにより、効率よくスフェロイドを形成させることができる。例えば、プラズマ処理を施し、水接触角を４５度以下にした後、リン脂質・高分子複合体やポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）をコートしてもよい。

【0037】

上述したように培養空間１１を有する培養容器１０で効率よくスフェロイドを形成させるためには、細胞接着を抑制する方が好ましい。一方、培地交換や試験溶液交換の際にスフェロイドが培養空間１１から離脱することを防ぐ目的から、スフェロイドの一部は培養表面（壁１２の表面または底部培養面１４）に接着している方が好ましい。そのため、培養表面への細胞の接着を阻害するポリマーと、培養表面への細胞の接着を促進するポリマーとの混合物を培養表面にコートしてもよい。培養表面への細胞の接着を阻害するポリマーは、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン、及びこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーである。細胞接着性を促進するポリマーは、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーである。コート溶液の一例として、リン脂質、リン脂質・高分子複合体である２−メタ クリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマーとポリ−Ｌ−リシン溶液との混合物が挙げられる。ＭＰＣ溶液濃度は０．００１％〜１％の範囲が好ましく、０．０１％〜０．１％の範囲がより好ましい。ポリ−Ｌ−リシン溶液の濃度は０．００１〜０．１％の範囲が好ましく、０．００５〜０．０１５％の範囲がより好ましい。ＭＰＣ溶液とポリ−Ｌ−リシン溶液の混合比は５０：５０〜１００：０の範囲が好ましく、７５：２５〜９０：１０の範囲がより好ましい。

【0038】

２．培養処理から判定処理までの手順
一実施形態の評価方法は、操作性の観点から、複数のウェルを備える培養プレートを用いることが好ましい。特に、培養処理（第１工程）と、作用処理（第２工程）とを同一のウェル内で行うことが好ましい。さらに加えて、測定処理（第３工程）を培養処理及び作用処理と同一のウェル内で行うことがより好ましい。そのため、一実施形態では、例えば、図１に示す培養プレート１の複数のウェル２１を用い、複数のウェル２１のうち、一つのウェル２１内で培養処理から測定処理までの各工程を実施する場合を説明する。言い換えると、一つのウェル内で培養から測定までの処理において、処理の途中で細胞を別のウェル２１に移動させることはない。培養プレート１が有するウェル２１の数は、検査したい化学物質の種類等に応じて選択する。

【0039】

＊ 培養処理
培養処理では、上述した培養容器１０によって形成される培養空間１１を用いて、ウェルプレート内で細胞を培養してスフェロイドを複数形成させる。言い換えると、ウェルプレート内で細胞を三次元的に培養し、所望の大きさの複数のスフェロイドを形成する。
一実施形態の評価方法では、培養する細胞として、エストロゲンレセプターを有するヒトがん細胞由来の株化細胞および初代細胞を用いる。株化細胞の例として、乳がん由来のＭＣＦ−７細胞やＴ−４７Ｄ細胞、子宮がん由来のＲＬ−９５−２細胞、腺管がん由来のＺＲ−７５−１細胞などを用いることができる。エストロゲンレセプターの発現有無はＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）などの細胞資源バンクが提供する細胞のデータシートによって確認することができる。

【0040】

細胞を維持するための培養液には、ｐＨ６．８から８．４の間に緩衝作用のある培地または緩衝液を用いる。さらにグルコース及びアミノ酸、ビタミン類などの栄養素が含まれているものが好ましい。またＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）などの血清を含んでいても良い。例えば、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ（Minimum essential medium）、Ｌ−１５（L-15 medium modified）、及びＤＭＥＭ（Dulbecco Modify Eagle Medium）などを用いることができる。
細胞を培養する際は、温度３７℃、気相の二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％に維持することが好ましい。
上述した細胞容器を用いることにより、細胞が本来有する接着性を利用して、スフェロイドと呼ばれる凝集塊を形成させる。スフェロイドを形成させることによって、ＵＧＴ活性を向上させることができる。
検査する化学物質を細胞に作用させる際には、スフェロイドの相当直径が５０μｍ以上２００μｍ未満、より好ましくは６０μｍ以上１５０μｍ以下であるものを用いる。このような直径が好ましい理由は、上述の培養容器で説明した通りである。
培養容器１０を形成する凹凸パターン（凹凸構造）により形成される複数の培養空間１１の相当直径を、複数の培養空間の深さで割った値が１以上２未満であることが好ましい。
加えて、培養容器１０を形成する凹凸パターンにより形成される複数の培養空間１１の深さが１〜１０００μｍの範囲であることが好ましい。さらに加えて、一つの培養空間の一端から、一つの培養空間に隣接する培養空間の一端までである、凹凸パターンの凸形状及び凹形状の組合せのピッチが１〜１０００μｍの範囲であることが好ましい。

【0041】

スフェロイド形状の株化肝細胞を得る方法として、ローラーボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養など特に限定されない。しかし、これらの方法では培養方法に応じた装置を使用するため、スフェロイド形成処理と接触処理とを別々の容器で行う必要が生じる。発明者らは、上述した培養容器１０が形成されたウェル２１を用いることにより、同一の容器でスフェロイド形成処理と接触処理とを実施できることを発見した。これにより、操作が簡便になり、形成したスフェロイドを移動させることなく、細胞に第１乃至第３溶液を作用させることが可能になる。特に、多くの化合物を一度に評価するような医薬品のスクリーニングにおいて、自動培養装置に利用することが可能となる。加えて、細胞の損傷や汚染を防止することが可能になる。

【0042】

スフェロイドを形成するための培養容器１０の好ましいサイズについては上述したが、スフェロイド形成処理から接触処理を実施する場合には、特に次の培養容器１０のサイズが好ましいことを発見した。
培養容器１０は、高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．５〜２の範囲であって、相当直径Ｄが１００μｍ〜１０００μｍの範囲の培養空間１１が、少なくとも２個以上配置されていることが好ましい。加えて、培養空間１１を隔てる壁１２の幅Ｗは２μｍから５０μｍの範囲であることが好ましい。このような培養容器１０を用いることで、簡単にかつ均一な直径のスフェロイドを得ることができる。

【0043】

培養容器１０を用いてスフェロイド形成を行う場合の細胞播種密度は特に限定されないが、５０００個／ｃｍ^２〜１，０００，０００個／ｃｍ^２の範囲が好ましく、５０〜１５０μｍの直径のスフェロイドを形成させるためには、５０個〜２５０個の細胞が１１の区画に存在していることが好ましいことから、１００，０００個／ｃｍ^２〜５００，０００個／ｃｍ^２の範囲がより好ましい。スフェロイドを形成させるための培養時間は１日〜１５日であればよい。

【0044】

＊ 作用処理
作用処理では、培養したスフェロイドに評価したい化学物質を作用させる。
スフェロイドは、評価したい化学物質を作用させる前の、少なくとも２４時間以上、より好ましくは２４時間以上１２０時間未満、培地または緩衝液で培養されたものを用いる。
評価したい化学物質に加え、当該化学物質を評価するために必要となる他の化学物質をスフェロイドに作用させる。例えば、検査する化学物質を含む第１溶液、エストロゲン活性を有することが知られている化学物質を含む第２溶液、及び、エストロゲン活性を持たないことが知られている化学物質を含む第３溶液を用いる。第３溶液は、例えば、化学物質を含まず、ＤＭＳＯ（Dimethyl Sulfoxide）などの溶媒のみを含む溶液を用意する。

【0045】

効率や信頼性の観点から、一度に第１乃至第３溶液に含まれる化学物質を、２以上のサンプリング数で検査することが好ましい。このために細胞はあらかじめウェルプレート上で培養されていることが好ましい。また検査する化学物質を含む溶液を細胞に対して作用させる処理も、同一のウェルプレートで行なうことが好ましい。
第２溶液として、異なるエストロゲン活性を有する２つ以上の化学物質溶液を用意することが好ましい。これにより、第１溶液のエストロゲン類似活性をより詳細に評価することができる。例えば、３種類の第２溶液Ａ〜Ｃを用いる場合には、第２溶液Ａとしてエストラジオール、第２溶液Ｂとしてエストロン、第２溶液Ｃとしてエストリオールを含む溶液を用意する。この場合、それぞれの化学物質のエストロゲン活性は相対的に第２溶液Ａが１００、第２溶液Ｂが５０、第２溶液Ｃが１０であり、第３溶液がゼロと表現することができる。これらの溶液をスフェロイドに作用させたときのＵＧＴ活性と、第１溶液を作用させたときのＵＧＴ活性を比較する。これにより、第１溶液に含まれる評価する化学物質がゼロから１００の間でどの程度のエストロゲン活性を有するのかを評価することができる。
なお、化学物質のエストロゲン活性値は独立行政法人国立環境研究所から「化学物質のエストロゲン活性データ」（http://www.nies.go.jp/archiv-edc/estrogen/index.html）として公開されている。

【0046】

第１乃至第３溶液に含まれる化学物質は、まずＤＭＳＯなどの有機溶媒に溶かし、これを浸透圧２００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ_２Ｏ以上３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ_２Ｏ未満、ｐＨが６．８から８．４の間に緩衝作用をもつバッファー液に希釈する。このとき最終的な有機溶媒の濃度は体積分率０．１ｖｏｌ％以下となるように調製する。また希釈に用いるバッファー液は、細胞培養に用いた培地または緩衝液を用いても良い。
スフェロイドを形成した細胞に対して、第１乃至第３溶液のいずれかを、１時間以上７２時間以下、より好ましくは１時間以上２４時間以下、作用させる。スフェロイドを形成した細胞へ第１乃至第３溶液のいずれかを作用させる時間を「化学物質作用時間」と称する。化学物質作用時間は、化学物質の活性が上昇するまでに要する時間を考慮すると、１時間以上であることが好ましい。加えて、化学物質作用時間が長時間になると、細胞が死に至ることが懸念されるため、２４時間以下であることが好ましい。

【0047】

＊ 測定処理
測定処理では、上述した化学物質作用時間終了後、スフェロイドを形成した細胞に作用させた第１乃至第３溶液を取り除き、スフェロイドを形成した細胞をバッファー液で洗浄する。その後、速やかにＵＧＴ代謝基質およびＵＤＰグルクロン酸を含むＵＧＴ活性測定溶液を少なくとも１時間、より好ましくは１時間以上２時間以下、各細胞に作用させる。スフェロイドを形成した細胞へＵＧＴ活性測定溶液を作用させる時間を「測定溶液作用時間」と称する。測定溶液作用時間は、ＵＧＴ活性測定溶液が細胞に作用するまでにかかる時間と、ＵＧＴ活性測定溶液が細胞に悪影響を及ぼす時間とを考慮して決定する。
ＵＧＴ代謝基質は、ＵＧＴによってグルクロン酸抱合を受ける物質であり、抱合体が発光を示すもの、あるいは抱合体の吸収波長または励起／蛍光波長があらかじめ知られているものを用いる。例えば4-Methylumbelliferone、p-Nitrophenol、7-hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin（7-HFC）、Estradiolなどを用いることができる。

【0048】

ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いる場合は、測定溶液作用時間内にＵＧＴの代謝反応を停止させた後、速やかに溶液を回収し、遠心分離とフィルター濾過によって精製する。その後、ＨＰＬＣによってグルクロン酸抱合体の産生量を測定する。代謝反応を停止するためには、用いたＵＧＴ代謝基質に適したものを選択すればよく、例えば7-hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin（7-HFC）を用いた場合、アセトニトリル／酢酸（９４ｖｏｌ％／６ｖｏｌ％）溶液を用いる。
マイクロプレートリーダーを用いる場合は、測定溶液作用時間内にＵＧＴの代謝反応を停止させた後、ＵＧＴ活性測定溶液に含まれるＵＧＴ代謝基質のグルクロン酸抱合体由来の発光または吸光または蛍光を測定する。この際、同一のマイクロプレート内に測定対象であるグルクロン酸抱合体の希釈系列を設けることで、得られた発光強度または吸光度または蛍光強度からグルクロン酸抱合体の産生量を算出することができる。

【0049】

マイクロプレートリーダーを用いて発光を測定する場合は、側面および底面が白色不透明なプレートを用いて細胞を培養することが望ましい。あるいは側面が白色不透明で底面が透明なプレートを用いて細胞を培養し、ＵＧＴ活性を測定する際に底面に白色シールを貼り付けてもよい。またはＵＧＴ活性測定溶液を回収し、速やかに側面および底面が白色不透明なプレートに移し変えて発光を測定してもよい。
マイクロプレートリーダーを用いて吸光を測定する場合は、底面が透明なプレートを用いて細胞を培養しなければならない。あるいは細胞の培養からＵＧＴ活性測定を作用させる処理までを底面が不透明なプレートで実施し、ＵＧＴ活性測定溶液を回収して速やかに底面が透明なプレートに移し変えて吸光度を測定してもよい。
マイクロプレートリーダーを用いて蛍光を測定する場合は、側面が黒色不透明で底面が透明なプレートを用いて細胞を培養することが望ましい。あるいは細胞の培養からＵＧＴ活性測定を作用させる処理までを底面が不透明なプレートで実施し、ＵＧＴ活性測定溶液を回収して速やかに底面が透明かつ側面が黒色不透明なプレートに移し変えて蛍光強度を測定してもよい。

【0050】

＊判定処理
判定処理では、具体的には次のように判定する。ＵＧＴ活性は、言い換えると、グルクロン酸抱合体産生量である。
（１）第１溶液を作用させたスフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性が、第２溶液を作用させたスフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性と同等あるいはそれ以上に高い場合、第１溶液に含まれる化学物質は第２溶液に含まれる化学物質と等しいあるいはそれ以上のエストロゲン類似活性を有すると判定する。例えば、第２溶液のエストロゲン活性値を［Ｂ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ］として、第１溶液に含まれる化学物質のエストロゲン類似活性は［Ｂ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ］以上と評価される。
（２）第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、第３溶液の活性よりも高く、第２溶液の活性よりも低い場合、第１溶液に含まれる化学物質はゼロから第２溶液の活性値の間のエストロゲン類似活性を有すると判定する。第１溶液に含まれる化学物質のエストロゲン類似活性はゼロから［Ｂ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ］の間であると評価される。
（３）第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、第３溶液の活性と同等あるいはそれよりも低い場合、第１溶液に含まれる化学物質はエストロゲン類似活性をもたないと判定する。

【実施例】

【0051】

実施例及び比較例について説明する。一実施形態はこれら実施例に限定されるものではない。
マイクロ空間が形成された３次元（３Ｄ）の培養プレートを用いる場合（実施例１）と、培養領域（培養底面）が平坦な２次元（２Ｄ）の平板プレートを用いる場合（比較例１）とにおいて、グルクロン酸抱合酵素活性の測定をおこなった。さらに実施例１と比較例１で培養した細胞に対してエストロゲンを作用させ、ＵＧＴ活性上昇の濃度依存性を検証した（実施例２）。

【0052】

［実施例１］
１．試験条件
（Ｓｔｅｐ１−１）細胞の準備（培養処理）
培養する細胞はヒト乳がん由来細胞ＭＣＦ−７を使用した。
培養容器は、図８に示す２４個のウェル２１ａを有する培養プレート（２４ウェル培養プレート）１ａ（３Ｄ）を使用した。各ウェル２１ａの底部培養面には、凹凸パターン（微細パターン）によって培養容器１０ａが形成されている。各培養容器１０ａは、相当直径Ｄが２００μｍ、高さＨが１００μｍで形成される培養空間１１ａを有する。また、壁１２ａの幅Ｗは１０μｍである。
細胞間接着を促進し立体的な組織構造を作製するために、底部培養面を０．０５ｖｏｌ％ＭＰＣポリマーでコートした。
培地はグルコース濃度０．３５ｖｏｌ％のＲＰＭＩ培地を用いた。細胞播種密度が１×１０^５個／ｃｍ^２となるように、各ウェルに細胞懸濁液を導入し、３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ_２環境下で３日間培養した。

【0053】

実施例１の比較対象として、培養プレートを変更した比較例１を実施した。
比較例１の培養容器は市販の細胞培養グレード品であって、培養面が平坦な平板プレート（２Ｄ）を使用した。平板プレートを用いる以外は実施例１と同じ条件で実施した。

【0054】

（Ｓｔｅｐ１−２）（測定処理：ＵＧＴ活性測定溶液の作用）
実施例、比較例ともに次の条件で試験を実施した。
細胞を培養後、培地（上澄み）を取り除いた後、7-hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin（7-HFC）を１０μｍｏｌ／Ｌ含む培地を添加した。さらに２０ｍｍｏｌ／ＬのＵＤＰＧＡ（ウリジン二リン酸グルクロン酸）をそれぞれ添加し３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ_２環境下で１時間インキュベートした。

【0055】

（Ｓｔｅｐ１−３）（測定処理：活性測定）
ウェル内の培地をマイクロピペットで回収し、０．４５μｍ孔径のメンブレンフィルターによって精製した。精製したものをＨＰＬＣ装置に導入した。カラムはInertsil ODS-SP（5μm 4.6mm i.d. × 150 mm）を使用し、移動相は２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ３．５）／アセトニトリル／メタノール（６８：２６：６，ｖ／ｖ／ｖ）とした。波長３２８ｎｍにて励起を行い、波長４１０ｎｍの蛍光を検出した。

【0056】

２．試験結果
図９に培養後の細胞の形態写真を、図１０に活性測定結果を示した。
図１０の活性測定結果から立体的に細胞を培養（３Ｄ）することで、グルクロン酸抱合酵素活性が飛躍的に向上することが明らかになった。

【0057】

［実施例２］
１．試験条件
（Ｓｔｅｐ２−１）細胞の準備（培養処理）
実施例１のＳｔｅｐ１−１と同様の操作方法で培養細胞を準備した。比較対象も同様に市販の平板プレート（２Ｄ）を用いた。
（Ｓｔｅｐ２−２）作用処理
化学物質添加群はエストロゲン活性を有する化学物質１７β−エストラジオール）を２５０、５００、１０００ｎｍｏｌ／Ｌ含む培地に、非添加群は１７β‐エストラジオールの溶媒であるＤＭＳＯを含む培地に交換して、３７度４時間インキュベートした。
（Ｓｔｅｐ２−３）（測定処理：ＵＳＴ活性測定溶液の作用）
上澄みを取り除いた後、7-hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin（7-HFC）を１０μｍｏｌ／Ｌ含む培地を添加し、さらに２０ｍｍｏｌ／ＬのＵＤＰＧＡ（ウリジン二リン酸グルクロン酸）をそれぞれ添加し３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２環境下で１時間インキュベートした。
（Ｓｔｅｐ２−４）（測定処理：活性測定）
実施例１のＳｔｅｐ１−３と同様の方法で分析を行った。

【0058】

２．試験結果
平板プレートで培養した細胞にＤＭＳＯを含む培地を作用させたときのＵＧＴ活性値を１として、立体培養した細胞と平板培養した細胞に各濃度の１７β‐エストラジオールを作用させたときのＵＧＴ活性値を図１１に示した。図１１の測定結果から立体的に細胞を培養することで１７β‐エストラジオールの濃度依存的にＵＧＴ活性値が上昇することが明らかになった。一方、比較対象の平板プレートの活性値は１７β‐エストラジオールの濃度依存的なＵＧＴ活性の上昇傾向が小さく、差が明らかではなかった。

【0059】

なお、本発明は上記に示す実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲において、上記実施形態の各要素を、当業者であれば容易に考えうる内容に変更、追加、変換することが可能である。

【符号の説明】

【0060】

１、１ａ 培養プレート
８ 細胞
９ スフェロイド
１０、１０ａ 培養容器
１１、１１ａ 培養空間
１２ 壁
１３ 底部
１４ 底部培養面
２１、２１ａ ウェル
２２ 仕切り部

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】