特許 6206907 抗菌活性促進剤及び該抗菌活性促進剤を含有する感染症治療薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6206907

(24)【登録日】2017年9月15日

(45)【発行日】2017年10月4日

(54)【発明の名称】抗菌活性促進剤及び該抗菌活性促進剤を含有する感染症治療薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20170925BHJP

   A61K 31/685 20060101ALI20170925BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20170925BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20170925BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170925BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/17

   A61K31/685

   A61K38/12

   A61P31/04

   A61P43/00 121

【請求項の数】2

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2013-148017(P2013-148017)

(22)【出願日】2013年7月16日

(65)【公開番号】特開2015-20951(P2015-20951A)

(43)【公開日】2015年2月2日

【審査請求日】2016年6月8日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２５年度、独立行政法人科学技術振興機構研究成果展開事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの

(73)【特許権者】

【識別番号】501481492

【氏名又は名称】株式会社ゲノム創薬研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】100125748

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 徳明

(74)【代理人】

【識別番号】100177161

【弁理士】

【氏名又は名称】日比 敦士

(74)【代理人】

【識別番号】100191972

【弁理士】

【氏名又は名称】宮坂 友梨

(72)【発明者】

【氏名】関水 和久

(72)【発明者】

【氏名】浜本 洋

(72)【発明者】

【氏名】安川 淳一朗

(72)【発明者】

【氏名】西田 智

【審査官】 茅根 文子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−００６９１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１６８８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６３−１９０８３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 慈恵医大誌，１９９２年，Vol. 107，pp. 983-995

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ４１／００−４５／０８；４８／００

Ａ６１Ｋ ３１／３３−３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００−９／７２；４７／００−４７／６９

Ａ６１Ｐ ３１／０４

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗菌剤の抗菌活性を促進する抗菌活性促進剤であって、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、若しくは、ホスファチジルエタノールアミン、又は、それらの製薬学的に許容される塩よりなり、
該抗菌剤が下記式（１）で表される化合物又はその製薬学的に許容される塩であることを特徴とする抗菌活性促進剤。

【化1】

［式（１）中、Ｒ^１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ^２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ^３はエチル基又はメチル基を示す。］

【請求項2】

請求項１に記載の抗菌活性促進剤、及び、式（１）で表される化合物又はその製薬学的に許容される塩である抗菌剤を含有する感染症治療薬。

【化2】

［式（１）中、Ｒ^１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ^２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ^３はエチル基又はメチル基を示す。］

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗菌活性促進剤及び該抗菌活性促進剤を含有する感染症治療薬に関するものである。

【背景技術】

【0002】

抗生物や抗菌剤は、感染症等の治療に必要不可欠なものとなっている。しかしながら、抗生物質の過度の使用はそれに対する耐性菌を生み、その結果多くの薬剤に耐性を有する多剤耐性菌が出現し臨床上大きな問題となっている。特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記する）は、臨床現場での出現頻度が高く、社会的な問題に発展している。更に、ＭＲＳＡに対する最終的な治療薬として用いられることの多いバンコマイシンに対して耐性を有する腸球菌（バンコマイシン耐性腸球菌、以下、「ＶＲＥ」と略記する）も、臨床現場から分離されるようになり、多剤耐性菌に対する新たな治療薬の提供が切望されている。

【0003】

そのような新たな治療薬として完全化学合成による合成抗生物質であるリネゾリドが知られている。また、各種の微生物の産生する抗生物質の中から、上記の多剤耐性菌に有効性を示す抗生物質を見出すための検討も多数行われている（特許文献１〜３）。これらのうち、特許文献１と２には、上記の多剤耐性菌に有効性を示す抗生物質を産生するリソバクター属に属する微生物とその微生物を用いた抗生物質の製造方法が記載されている。

【0004】

上記特許文献２と３には、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても有効性を示す抗生物質が記載されている。しかしながら、従来の報告例の多くは、特許文献１のようにＭＲＳＡに対する有効性だけが記載されており、ＶＲＥに対する有効性を示す抗生物質はほとんど報告されていないのが現状である。そこで耐性菌の出現の可能性を考慮すると、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも有効性を示し、特許文献２、特許文献３等の既存の抗生物質とは異なる化学構造を有し、耐性菌に対する作用機序も既存の治療薬と異なることが期待できる抗菌剤の選択肢を更に増やす必要がある。

【0005】

本発明者は、特許文献４のカイコを実験動物として用いた「カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル」を用いて検討を行った結果、抗菌活性を示す新規化合物を見出し、マウス黄色ブドウ球菌感染モデルで、バンコマイシンと比較して高い治療効果を示す化合物を見出した（特許文献５）。

【0006】

抗菌活性を示す新規化合物の開発や、抗菌活性を示す抗生物質の検討が求められている一方、上記本発明者が見出した抗生物質を含めた、既存の抗生物質・抗菌剤の抗菌活性を促進する抗菌活性促進剤、及び、該抗菌活性促進剤を含有する感染症治療薬の開発も求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開平０８−０００２７３号公報

【特許文献2】特許第４０５４５７６号公報

【特許文献3】特許第４０５７４２６号公報

【特許文献4】特開２００７−３２７９６４号公報

【特許文献5】特開２０１２−００６９１７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の課題は、抗菌剤の抗菌活性を促進する抗菌活性促進剤を提供することにあり、また、該抗菌活性促進剤を含有する感染症治療薬を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、又は、ホスファチジルエタノールアミンが、抗菌剤の抗菌活性を促進することを見出して本発明をするに至った。

【0010】

更に、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、又は、ホスファチジルエタノールアミンが、特定の抗菌剤の抗菌活性を促進することを見出し、これらを該特定の該抗菌剤と併用することによって、抗菌活性が促進した感染症治療薬が得られることを見出して本発明をするに至った。

【0011】

すなわち、本発明は、抗菌剤の抗菌活性を促進する抗菌活性促進剤であって、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、若しくは、ホスファチジルエタノールアミン、又は、それらの製薬学的に許容される塩よりなることを特徴とする抗菌活性促進剤を提供するものである。
以下、この発明の態様を「態様１」とする。

【0012】

また、本発明は、上記の抗菌活性促進剤、及び、該抗菌活性促進剤により抗菌活性が促進される抗菌剤を含有する感染症治療薬を提供するものである。
以下、この発明の態様を「態様２」とする。

【0013】

また、本発明は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、又は、ホスファチジルエタノールアミンにより抗菌活性が促進されるものであることを特徴とする環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を提供するものである。
以下、この発明の態様を「態様３」とする。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、抗菌剤の抗菌活性を促進する抗菌活性促進剤を提供することができる。特に、耐性菌に抗菌活性を示す抗菌剤の抗菌活性を促進する抗菌活性促進剤を提供することができる。
また、上記抗菌活性促進剤、及び、「該抗菌活性促進剤により抗菌活性が促進される抗菌剤」を含有する感染症治療薬を提供することができる。

【0015】

また、本発明によれば、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、又は、ホスファチジルエタノールアミンにより抗菌活性が促進されるものであることを特徴とする環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩を提供することができる。
更には、「環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」、並びに、「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、及び、ホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその製薬学的に許容される塩」を含有する感染症治療薬を提供することができる。
特に、耐性菌に対して抗菌活性を示す、抗菌性が促進された感染症治療薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】メナキノン存在下におけるカイコシンＥの膜破壊アッセイ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｅａｋａｇｅ ａｓｓａｙ）の結果を示す図である。縦軸はカルセインが放出された割合（％）、横軸はカイコシンＥの濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。

【図2】血清濃度の変化に伴うカイコシンＥの抗菌活性の影響を示す図である。縦軸は最小発育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」と略記することがある）値（μｇ／ｍＬ）、横軸は血清濃度（％）を示す。

【図3】ＯＤＳカラムにより精製・分離したカイコシンＥの促進因子をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示す図である。

【図4】ＯＤＳカラムにより精製・分離したカイコシンＥの促進分子をＳＤＳ−トリプシンゲル電気泳動で分離した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。

【0018】

＜態様１＞
本発明の態様１は、抗菌剤の抗菌活性を促進する抗菌活性促進剤であって、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、若しくは、ホスファチジルエタノールアミン、又は、それらの製薬学的に許容される塩よりなることを特徴とする抗菌活性促進剤である。

【0019】

上記抗菌剤は、本発明の「抗菌活性促進剤」で抗菌活性が促進されるものであれば特に限定はされない。
本発明は、「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、若しくは、ホスファチジルエタノールアミン、又は、それらの製薬学的に許容される塩」（以下、括弧内を単に「本発明の抗菌活性促進剤」と略記することがある）が、抗菌剤の抗菌活性を促進することを初めて見出してなされたものであり、該特定化合物が抗菌活性促進剤として作用する発明範囲において、促進される側である抗菌剤は、「本発明の抗菌活性促進剤」で抗菌活性が促進されるものであれば特に限定はされない。

【0020】

本発明の抗菌活性促進剤は、抗菌剤がメナキノンを標的とするものであることが好ましく、また、抗菌剤が環状ペプチド化合物であるであることが好ましく、後記式（１）で表される化合物又はその製薬学的に許容される塩である環状ペプチド化合物であるであることが好ましい。

【0021】

＜態様２＞
本発明の態様２は、「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、若しくは、ホスファチジルエタノールアミン、又は、それらの製薬学的に許容される塩」、及び、「該抗菌活性促進剤により抗菌活性が促進される抗菌剤」を含有する感染症治療薬である。
すなわち、本発明の態様２は、態様１の上記「本発明の抗菌活性促進剤」と、該抗菌活性促進剤により抗菌活性が促進される抗菌剤との少なくとも２以上の化合物を含有する感染症治療薬である。

【0022】

抗菌効果を促進される側である抗菌剤としては、限定はされないが、メナキノンを標的とする抗菌剤、又は、環状ペプチド化合物であることが好ましい。

【0023】

メナキノンを標的とする抗菌剤の作用機序は、細胞膜でメナキノンと結合し、細胞膜の破壊を引き起こすことである。従って、メナキノンを標的とする抗菌剤であれば、後記する同じくメナキノンを標的とする抗菌剤である「カイコシンＥ」の抗菌効果を実際に促進することが見出された「本発明の抗菌活性促進剤」が、その抗菌剤の抗菌効果をも促進する場合があることは明確である。
従って、本発明の抗菌活性促進剤、及び、該抗菌活性促進剤により抗菌活性が促進され、メナキノンを標的とする抗菌剤を含有する感染症治療薬は、抗菌効果が促進された結果、明らかに優れた感染症治療薬となる。

【0024】

また、抗菌効果を有する環状ペプチド化合物の抗菌剤としての作用機序は、細胞膜で標的分子と結合し、細胞膜の破壊を引き起こすことであると考えられる。従って、環状ペプチド化合物である抗菌剤であれば、後記する同じく環状ペプチド化合物である「カイコシンＥ」の抗菌効果を実際に促進することが見出された「本発明の抗菌活性促進剤」が、その環状ペプチド化合物の抗菌効果をも促進する場合があることは明確である。
従って、本発明の抗菌活性促進剤、及び、該抗菌活性促進剤により抗菌活性が促進され、環状ペプチド化合物である抗菌剤を含有する感染症治療薬は、抗菌効果が促進された結果、明らかに優れた感染症治療薬となる。

【0025】

促進される側である抗菌剤として、特に好ましくは、メナキノンを標的とする環状ペプチド化合物であり、更に好ましくは、下記式（１）で表される化合物（以下、「カイコシン」と記載する場合がある）である。

【化1】

［式（１）中、Ｒ^１は置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ^２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ^３はエチル基又はメチル基を示す。］

【0026】

カイコシンは、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から得られるものであることが好ましい。

【0027】

特に、前記式（１）で表される抗菌剤は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルだけでなく、マウス黄色ブドウ球菌感染モデルでも、バンコマイシンに比して高い治療効果が確認されたものがあり、感染症治療薬の有効成分として好適に用いることができる。

【0028】

上記式（１）中のＲ^１は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示す。上記アシル基の炭素数には「Ｃ＝Ｏ」の炭素数（１個）も含まれる。置換基を除いた「炭素数が７、８又は９のアシル基」は、「Ｒ’−Ｃ（＝Ｏ）−」で表わされ、ここで、Ｒ’は、炭素数が６、７又は８のアルキル基を示す。また、Ｒ’は直鎖であっても分岐を有していてもよいが、分岐を有していることが好ましい。また、分岐された部分はメチル基であることが好ましく、特に限定はないが、Ｒ’の「Ｃ＝Ｏ」とは反対側の末端は、「ＣＨ_３（ＣＨ_３）ＣＨ−」となっていることが特に好ましい。また、Ｒ’すなわちＲ^１が分岐を有する場合には、上記Ｒ^１の炭素数（７、８又は９）には、分岐された部分の炭素数も含まれる。また、上記式（１）中のＲ^１の置換基は、水酸基であることが好ましい。

【0029】

具体的には、上記式（１）中のＲ^１は、３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基、３−ヒドロキシ−６−メチル−ヘプタノイル基又は３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基であることが好ましい。

【0030】

また、上記式（１）で示される「環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」は、Ｒ^１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基であり、Ｒ^２がメチル基であり、Ｒ^３がエチル基であるものが好ましく、Ｒ^１が３−ヒドロキシ−７−メチル−オクタノイル基であり、Ｒ^２がメチル基であり、Ｒ^３がエチル基であるものが好ましい。
本発明においては、上記式（１）で示される「環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」であって、Ｒ^１が３−ヒドロキシ−５−メチル−ヘキサノイル基であり、Ｒ^２がメチル基であり、Ｒ^３がエチル基であるものを「カイコシンＥ」と記載する。

【0031】

本発明の抗菌活性促進剤を得る方法に限定はなく、如何なる方法で得られたものでもよい。例えば、化学合成によって得られたものであってもよく、微生物を用いて発現させたものであってもよく、生物体から分離したものであってもよい。
また、抗菌剤も、如何なる方法で得られたものでもよい。例えば、化学合成によって得られたものでもよく、微生物が産生したものでもよく、それらを組み合わせて得られたものでもよい。

【0032】

本発明の「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、又は、ホスファチジルエタノールアミン、又は、それらの製薬学的に許容される塩」は、単離されたものが好ましく、単離・精製されたものがより好ましい。

【0033】

＜態様３＞
本発明の態様３は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、又は、ホスファチジルエタノールアミン（本発明の抗菌活性促進剤）により抗菌活性が促進されるものであることを特徴とする環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩である。

【0034】

本発明の態様３の上記環状ペプチド化合物はメナキノンを標的とするものであることが好ましい。
本発明の態様３は、「上記の環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」、並びに、「アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−II、及び、ホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその製薬学的に許容される塩」を含有する感染症治療薬でもある。

【0035】

本発明の「環状ペプチド化合物又はその製薬学的に許容される塩」を得る方法は、特に限定されない。例えば、化学合成によって得られるもの、該環状ペプチド化合物を産生する微生物の培養によって得られるものであってもよい。

【0036】

＜感染症治療薬＞
本発明の抗菌活性促進剤、及び、該抗菌活性促進剤により抗菌活性が促進される抗菌剤を含有する感染症治療薬は、感染症に対して優れた治療効果を奏する。
本発明の態様２、３の感染症治療薬は、耐性菌のよる感染症に対して優れた治療効果を奏する。

【0037】

上記抗菌剤は、「本発明の抗菌活性促進剤」で抗菌活性が促進されるものであれば特に限定はされない。メナキノンを標的とする抗菌剤であることがより好ましく、前記式（１）で表される化合物であることが特に好ましい。

【0038】

上記抗菌剤を得る方法は、特に限定されない。例えば、化学合成によって得られるもの、該環状ペプチド化合物を産生する微生物の培養によって得られるものであってもよい。
独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＲＨ２１８０−５株、又はその株と同様の化合物を産生する能力を有する変異株を培養し、その培養物から得られるものであることが好ましい。

【0039】

中でも、特に、前記式（１）で表される抗菌剤は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルだけでなく、マウス黄色ブドウ球菌感染モデルでも、バンコマイシンに比して高い治療効果が確認されたものがあり、感染症治療薬の有効成分として好適に用いることができる。

【0040】

上記の感染症治療薬中の、環状ペプチド化合物、並びに、本発明の抗菌活性促進剤の含有量には特に制限はなく、目的や投与方法に応じて含有量を適宜選択して用いればよい。
上記の本発明の感染症治療薬中の、抗菌活性促進剤及び抗菌剤の含有量比には特に制限はなく、目的や投与方法に応じて決められるが、抗菌活性促進剤（ａ）の抗菌剤（ｂ）に対する質量割合は、ａ／ｂ＝０．１〜１０００が好ましく、ａ／ｂ＝１〜５００がより好ましく、ａ／ｂ＝１０〜１００が特に好ましい。

【0041】

本発明の抗菌活性促進剤を用いることにより、抗菌剤の有する抗菌活性を１．１倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上促進することができる。

【0042】

また、通常の抗生物質を製剤化する際に用いられる担体や賦形剤等の添加剤を、適宜、剤形等の要求に応じて、抗菌効果を損なわない範囲内で選択して用いることができる。

【0043】

前記の感染症治療薬の剤形は、投与の目的や方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、液剤等の経口投与剤；注射剤、経静脈剤、坐剤、経皮、経鼻、経腸、吸入剤等の非経口投与剤の何れであってもよい。
経口投与剤のための賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ポリビニルピロリドン等、公知の賦形剤を用いることができ、液剤とする場合は、抗菌活性促進剤及び抗菌剤に、不活性な溶媒、例えば、精製水、エタノール等と共に、薬学的に許容される乳剤、懸濁剤、可溶化剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、芳香剤、防腐剤等を含有させて用いることができる。

【0044】

注射剤として用いる場合は、注射用の蒸留水や生理食塩水のような無菌の水性液剤を用いることができ、非水性の液剤としては、オリーブ油等の植物油；エタノール、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類等を用いることができる。更に、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を含んでいてもよい。

【0045】

以上のように製剤化した本発明の感染症治療薬の投与量は、症状、年齢、性別、剤形、投与方法、１日の投与回数等を考慮して適宜決定すればよいが、一般的な投与量は、成人１日当たり１０ｍｇ〜１０００ｍｇである。しかしながら、耐性菌に対する治療で多用される重症化患者に点滴によって経静脈剤として用いられる場合等には、更に多い投与量を必要とする場合もあり得る。

【実施例】

【0046】

以下、実施例、試験例及び検討例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。

【0047】

実施例１
＜カイコシンＥの調製＞
カイコシンＥは、ＲＨ２１８０−５株を培養し、培養液を精製し得られたものを使用した。培養及び精製手順は、特開２０１２−００６９１７号公報に掲載されている手順に従った。

【0048】

検討例１
＜カイコシンＥの膜破壊作用に対するメナキノンの関与＞
カイコシンＥ処理後に細胞分解が観察されること、及び、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（以下、「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」と略記する場合がある））にカイコシンＥを加えるとすぐに膜電位が消失することから、カイコシンＥは膜破壊に関与していることが考えられる。
カイコシンＥの標的分子の探索を行った結果、カイコシンＥ抵抗性変異体で、ｆｎｉ又はｍｅｎＡ遺伝子に変異が生じていることが分かった。両遺伝子は、メナキノン生合成経路に関与している。そして、メナキノンをカイコシンＥと混合すると、水中で複合体を形成したことより、カイコシンＥの標的分子がメナキノンであることが示唆された。

【0049】

そこで、カイコシンＥによる膜破壊に対するメナキノンの役割を確認するために、カルセイン封入リポソームを調製し、膜破壊アッセイ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｅａｋａｇｅ ａｓｓａｙ）を行った。結果を図１に示す。

【0050】

図１中の「ＰＧ」は、ホスファチジルグリセロール、「ＰＣ」はホスファチジルコリン、「ＭＫ」はメナキノンを示す。
図１の結果より、メナキノンを含有していないリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ）に比べて、メナキノンを含有しているリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｗｉｔｈ ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ）においてリポソーム破壊が観察された。
一方、ＭＲＳＡ感染治療用リポペプチド系抗菌薬であるダプトマイシンで同様の実験を行ったが、メナキノンを含有しているか否かでリポソーム破壊の変化は生じなかった。
以上の結果から、メナキノンはカイコシンＥによる膜破壊に関与していることが分かった。

【0051】

検討例２
＜カイコシンＥとメナキノンとの結合相互作用の確認＞
等温滴定型熱量計によりカイコシンＥとメナキノンとの結合作用の確認を行った。その結果、カイコシンＥとメナキノンはモル比率１：１のとき、結合定数（Ｋａ）２．２±０．４×１０^５Ｍで結合していた。
実施例１と２の結果から、細胞膜でカイコシンＥとメナキノンが結合し、膜破壊が誘導されることが示唆される。

【0052】

検討例３
＜血清によるカイコシンＥの抗菌活性促進＞
カイコシンＥ、ダプトマイシン及びバンコマイシンの、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性の検討を行った。
Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ培地に１０％血清（ヒト血漿、仔ウシ血清、ウサギ血清、ヒツジ血清又はマウス血清）を添加した場合と血清を添加しなかった場合のそれぞれのＭＩＣ値を、ＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。測定結果を表１に示す。

【0053】

【表1】

【0054】

表１の結果より、仔ウシ血清を加えるとカイコシンＥの抗菌活性の促進効果が確認された。ヒト血漿、ウサギ血清、ヒツジ血清、及びマウス血清を、それぞれ培地に加えた場合も同様にカイコシンＥの抗菌活性が促進された。
一方、血清を加えても、ダプトマイシン及びバンコマイシンの抗菌活性は促進されなかった。

【0055】

検討例４
＜血清濃度変化によるカイコシンＥの抗菌活性への影響＞
カイコシンＥのＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性の検討を行った。
血清濃度を０〜２０質量％に変化させた場合のそれぞれのＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。測定結果を図２に示す。

【0056】

縦軸をＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）、横軸を血清濃度（％）でプロットすると、血清濃度の増加に伴って逆シグモイド曲線のグラフとなった。

【0057】

検討例５
＜カイコシンＥの活性促進因子の精製＞
表１の結果より、血清の中にカイコシンＥの抗菌活性を促進させる因子が含有することが示唆された。次に、血清をエタノール抽出及びＯＤＳカラムを用いたクロマトグラフィーにより精製した。ＯＤＳカラムにより精製・分画された各フラクションの活性を測定した。測定結果を表２に示す。

【0058】

【表2】

【0059】

６０％エタノール抽出により精製された血清をＯＤＳカラムに吸着させ、有機溶媒濃度を変化させて、カラムに吸着した血清を分画した。表２中、１μｇ／ｍＬカイコシン存在下において黄色ブドウ球菌の増殖を阻害する最小濃度を１ユニットと定義する。
表２の結果より、７５％エタノールにより溶出されたフラクションの比活性は精製前の血清より１９０倍上昇した。

【0060】

検討例６
＜プロテアーゼ処理による抗菌活性の促進効果への影響＞
カイコシンＥの活性促進因子がタンパク質であるか否かの検討を行った。まず、トリプシン処理によるカイコシンＥの抗菌活性への影響を調べた。その結果を表３に示す。
次に、検討例５における７５％エタノールにより溶出されたフラクションについて、トリプシン処理による抗菌活性の促進活性（Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）への影響を調べた。その結果を表４に示す。

【0061】

【表3】

【0062】

【表4】

【0063】

表３の結果より、トリプシン処理によりカイコシンＥの抗菌活性は変化しなかった。
一方、表４の結果より、７５％エタノールにより溶出されたフラクションについては、トリプシン処理により抗菌活性の促進活性がトリプシン処理前に比べて９７％減少した。
以上より、血清中のタンパク質がカイコシンＥの抗菌活性の促進に関与していることが示唆された。

【0064】

検討例７
＜促進因子の同定＞
促進因子を同定するために、検討例５で得た各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した。その結果を図３に示す。
また、血清をサイズ排除カラムによるクロマトグラフィーにより精製・分離された各フラクションをＳＤＳ−トリプシンゲル電気泳動によりタンパク質を分離した。その結果を図４に示す。

【0065】

図３中の「Ｓｅｒｕｍ」は精製する前の血清である。「ＥｔＯＨ ｆｒ．」は６０％エタノール抽出により精製された血清である。「Ｆｒ．１」は、６０％エタノール抽出により精製された血清をＯＤＳカラムに供した際の素通り画分、「Ｆｒ．２」は２５％エタノールにより溶出されたフラクション、「Ｆｒ．３」は５０％エタノールにより溶出されたフラクション、「Ｆｒ．４」は７５％エタノールにより溶出されたフラクション、「Ｆｒ．５」は１００％エタノールにより溶出されたフラクションである。「ＮＤ」は抗菌活性の促進活性が確認されなかったことを意味する。図４中の上段の値は、抗菌活性促進活性（Ｕｎｉｔｓ）を示している。

【0066】

図３と図４の結果より、抗菌活性の促進活性が確認されたすべてのフラクションで２４ｋＤａにバンドが検出された。バンドの濃度に比例して抗菌活性の促進活性が強くなった。以上のことから、２４ｋＤａのタンパク質がカイコシンＥの効果を促進させる因子であることが考えられた。

【0067】

上記２４ｋＤａのバンドを切り出し、トリプシン消化することにペプチドに断片化した。そして、ペプチドマスフィンガープリンティング法により質量分析を行った結果、上記２４ｋＤａのタンパク質はアポリポタンパク質Ａ−Ｉであることが分かった。

【0068】

実施例２
＜アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−IIによるカイコシンＥの抗菌活性の促進＞
１０％仔ウシ血清（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、検討例５で得られた７５％エタノールにより溶出させたフラクション（３０μｇ／ｍＬ）、ヒト組換え型アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ｒｈＡｐｏＡ−Ｉ、９０μｇ／ｍＬ）、ヒトアポリポタンパク質Ａ−II（ｈＡｐｏＡ−II、３０μｇ／ｍＬ）をそれぞれＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ培地に添加し、カイコシンＥの抗菌活性を確認した。９０μｇ／ｍＬ ｒｈＡｐｏＡ−Ｉは、血清１０％に相当する量を添加したことになる。その結果を表５に示す。

【0069】

【表5】

【0070】

表５の結果より、ヒト組換え型アポリポタンパク質Ａ−Ｉ存在下でカイコシンＥの抗菌活性は、血清非存在下に比べて約３１倍上昇した。また、アポリポタンパク質Ａ−Ｉと構造が類似しているアポリポタンパク質Ａ−IIでも、カイコシンＥの抗菌活性が上昇した。
以上のことから、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びＡ−IIは、カイコシンＥの抗菌活性を促進させる因子であることが確認された。

【0071】

検討例８
＜肺サーファクタントに含まれるカイコシンＥの抗菌活性を促進する因子の精製＞
牛の肺サーファクタントに含まれるカイコシンＥの抗菌活性を促進する因子の精製を行った。牛肺サーファクタントをブタノールに転溶し、有機溶媒画分をさらにエタノール抽出により精製を行った。その結果を表６に示す。

【0072】

【表6】

【0073】

表６において、１μｇ／ｍＬカイコシン存在下において黄色ブドウ球菌の増殖を阻害する最小濃度を１ユニットと定義した。表６の結果から、ブタノール転溶及びエタノール抽出により、カイコシンＥの抗菌活性を促進する因子の精製をすることができた。

【0074】

検討例９
＜カイコシンＥの抗菌活性の促進関与因子の同定＞
カイコシンＥは、リポタンパク質であること、及び細胞膜でカイコシンＥとメナキノンが結合し、膜破壊が誘導されることが示唆されることから、細胞膜の構成成分であるリン脂質がカイコシンＥの抗菌活性の促進に関与しているか否かの検討を行った。その結果を表７に示す。

【0075】

【表7】

【0076】

表７の結果より、ホスファチジルエタノールアミン（以下、「ＰＥ」と略記する場合がある）が、カイコシンＥの抗菌活性の促進に関与していることが示唆された。

【0077】

実施例３
＜ＰＥのカイコシンＥの抗菌活性促進作用の検討＞
次に、ホスファチジルエタノールアミンがカイコシンＥの抗菌活性に対して促進作用を有するか検討を行った。その結果を表８に示す。

【0078】

【表8】

【0079】

表８の結果より、ホスファチジルエタノールアミンがカイコシンＥの抗菌活性を促進することが分かった。

【0080】

実施例４
＜抗菌活性促進剤及び抗菌剤の製剤化＞
＜＜錠剤＞＞
カイコシンＥ５．０ｍｇ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ５０ｍｇ、ラクトース４０ｍｇ、デンプン２０ｍｇ、及び、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース５ｍｇを均一に混合した後、ヒドロキシプロピルメチルセルロース８質量％水溶液を結合剤として湿式造粒法で打錠用顆粒を製造した。これに滑沢性を与えるのに必要なステアリン酸マグネシウムを０．５ｍｇから１ｍｇ加えてから打錠機を用いて打錠し、錠剤とした。

【0081】

カイコシンＥ２．０ｍｇ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ２０ｍｇを、２質量％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液１０ｍＬに溶解し、注射用液剤とした。

【産業上の利用可能性】

【0082】

本発明の抗菌活性促進剤及び感染症治療薬は、製薬産業、その関連産業等において広く利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】