特許 6221563 マイコバクテリウム・アビウム検出用オリゴヌクレオチドプローブおよび当該プローブを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6221563

(24)【登録日】2017年10月13日

(45)【発行日】2017年11月1日

(54)【発明の名称】マイコバクテリウム・アビウム検出用オリゴヌクレオチドプローブおよび当該プローブを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171023BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20171023BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

【請求項の数】5

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2013-198866(P2013-198866)

(22)【出願日】2013年9月25日

(65)【公開番号】特開2015-62382(P2015-62382A)

(43)【公開日】2015年4月9日

【審査請求日】2016年8月10日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】小鮒 昭徳

(72)【発明者】

【氏名】俵田 隆哉

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１３−００００９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 x52918，GenBank[online]，１９９１年 ９月 ４日，[retrieved on 6.7.2017]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X52918

【文献】 Ishiguro T et al，Anal Biochem，２００３年 ３月，Vol. 314，pp. 77-86

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３、５、および７のいずれかに記載の塩基配列またはその相補鎖からなる、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）を特異的に検出するための、オリゴヌクレオチドプローブ。

【請求項2】

配列番号１０に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドと、
配列番号１５に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドと、
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブとを含む、
マイコバクテリウム・アビウムを特異的に検出する試薬。

【請求項3】

配列番号１０に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドが、配列番号１２から１４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の試薬。

【請求項4】

（１）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、および
（６）生成したＲＮＡ転写産物を、当該転写産物の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する工程を含む、
マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを特異的に検出する方法であって、
前記第一のプライマーとして、配列番号１０に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドを、
前記第二のプライマーとして、配列番号１５に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドを、
前記オリゴヌクレオチドプローブとして、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブを、
それぞれ用いる前記方法。

【請求項5】

前記（１）の工程の前に、または前記（１）の工程と同時に、特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端側を切断する工程を行ない、
かつ前記切断用オリゴヌクレオチドとして、配列番号１９から２１のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる、請求項４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中に存在するマイコバクテリウム・アビウムを迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ、および当該プローブを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

非結核性抗酸菌のうち、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）やマイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）は、ヒトに病原性を示すことが知られており、ヒトの肺、リンパ節、皮膚などに感染し、特に肺への感染例が多い。マイコバクテリウム・アビウムやマイコバクテリウム・イントラセルラーは、結核菌のようにヒトからヒトへの感染は起こらないが、結核菌治療に用いる薬剤に対する耐性を有しており、有効な薬剤はほとんどない。このように抗酸菌感染に対する治療法は菌種の違いにより異なることから、抗酸菌の検査では菌種を迅速に同定することが不可欠となる。

【0003】

従来、マイコバクテリウム・アビウムやマイコバクテリウム・イントラセルラーの同定検査は培養法により行なわれていたが、核酸増幅法を利用した迅速同定検査法が開発され、短時間でマイコバクテリウム・アビウムやマイコバクテリウム・イントラセルラーを同定することが可能となった。マイコバクテリウム・アビウムやマイコバクテリウム・イントラセルラーの同定検査法として用いられる核酸増幅法の一例として、ＰＣＲ法（特許文献１から３）があげられる。しかしＰＣＲ法は、急激に反応温度を昇降させる必要があるため、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。

【0004】

一方で一定温度で核酸を増幅する方法も知られており、ＬＡＭＰ法（非特許文献１）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献４および５）、ＴＭＡ法（特許文献６）などがある。これらの核酸増幅法では、核酸増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させたオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションなどにより、増幅した核酸を検出するが、これらの検出法は操作が煩雑であるという課題がある。

【0005】

ＲＮＡを簡便に増幅および検出する方法としては、標的となるＲＮＡのうち特定塩基配列の５’末端側に対して相同的な配列を有するプライマーおよび３’末端側に相補的な配列を有するプライマー（前記二つのプライマーのいずれかには、その５’末端側にプロモーター配列を有する）、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、当該ＲＮＡを引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とする連鎖反応により特定塩基配列を含むＲＮＡを増幅し、増幅した特定塩基配列を含むＲＮＡを当該特定塩基配列とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する方法がある（特許文献７および非特許文献２）。ここでオリゴヌクレオチドプローブとして、標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素が相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを用いると、蛍光特性の変化によりＲＮＡ検出を簡便、一定温度（例えば、４０℃から５０℃）で実施することが可能であり、かつＲＮＡ増幅反応と同時に実施することが可能である。

【0006】

以上の各方法はいずれも、標的核酸に対し相同的または相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、増幅した核酸を検出するが、標的核酸がマイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡまたはその遺伝子の場合、他の抗酸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ（またその遺伝子）との間で塩基配列の相同性が高いものが多数存在するため、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡまたはその遺伝子を高感度かつ特異的に検出するプローブを設計することは極めて困難であった。特に比較的低温の一定温度（例えば、４０℃から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅が可能な増幅方法を利用する場合、オリゴヌクレオチドプローブが高次構造を形成しやすくなるため、当該プローブの設計はさらに困難であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許第４６８３１９５号公報

【特許文献2】米国特許第４６８３２０２号公報

【特許文献3】米国特許第４９６５１８８号公報

【特許文献4】特許２６５０１５９号公報

【特許文献5】特許３１５２９２７号公報

【特許文献6】特許３２４１７１７号公報

【特許文献7】特開２０００−０１４４００号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｔｈａｉ Ｈ．Ｔ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２，１９５６−１９６１（２００４）

【非特許文献2】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、試料中に存在するマイコバクテリウム・アビウムを特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ、および当該プローブを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち本発明の第一の態様は、配列番号１に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する１８塩基またはその相補鎖からなる、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブである。

【0012】

また本発明の第二の態様は、配列番号５に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する１８塩基またはその相補鎖からなる、前記第一の態様に記載のオリゴヌクレオチドプローブである。

【0013】

また本発明の第三の態様は、配列番号３、４、５、７のいずれかに記載の塩基配列またはその相補鎖からなる、前記第二の態様に記載のオリゴヌクレオチドプローブである。

【0014】

そして本発明の第四の態様は、
配列番号１０に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドと、
配列番号１５に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドと、
前記第一から第三の態様のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブとを含む、
試料中に含まれるマイコバクテリウム・アビウムを特異的に検出する試薬である。

【0015】

また本発明の第五の態様は、配列番号１０に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドが、配列番号１２から１４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記第四の態様に記載の試薬である。

【0016】

そして本発明の第六の態様は、
（１）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、および
（６）生成したＲＮＡ転写産物を、当該転写産物の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する工程を含む、
マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを特異的に検出する方法であって、
前記第一のプライマーとして、配列番号１０に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドを、
前記第二のプライマーとして、配列番号１５に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドを、
前記オリゴヌクレオチドプローブとして、請求項１から３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブを、
それぞれ用いる前記方法である。

【0017】

また本発明の第七の態様は、
前記（１）の工程の前に、または前記（１）の工程と同時に、特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端側を切断する工程を行ない、
かつ前記切断用オリゴヌクレオチドとして、配列番号１９から２１のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる、前記第六の態様に記載の方法である。

【0018】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0019】

本発明は、喀痰、胃液、血液、尿、便、体腔液、組織、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液等の生体由来試料中に存在するマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブに係る発明である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡ（またはその遺伝子）の部分配列の相補鎖（または相同鎖）からなるオリゴヌクレオチドであり、具体的には、配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４３番目から１７０番目までの領域に相当）のうち少なくとも連続する１８塩基またはその相補鎖からなるオリゴヌクレオチドである。また本発明のオリゴヌクレオチドプローブの好ましい態様として、配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４３番目から１６４番目までの領域に相当）のうち少なくとも連続する１８塩基またはその相補鎖からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに好ましい態様として、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４３番目から１６１番目までの領域に相当）、配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４３番目から１６３番目までの領域に相当）、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４３番目から１６４番目までの領域に相当）、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４７番目から１６４番目までの領域に相当）のいずれかに記載の塩基配列またはその相補鎖からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。また、配列番号１に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する１８塩基またはその相補鎖からなるオリゴヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドも、本発明のオリゴヌクレオチドプローブに含まれる。ここでいうストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃における５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム等が共存する条件下でハイブリダイズ可能な条件があげられる。

【0020】

本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いた検出は、電気泳動や液体クロマトグラフィーを利用した方法で行なうことができる。また本発明のオリゴヌクレオチドプローブに、標識物質を結合した後、ハイブリダイゼーション法により検出してもよい。標識物質としては、酵素、蛍光色素、放射性同位元素、発光色素等の公知のものが利用できる。なお本発明のオリゴヌクレオチドプローブを、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ（米国特許５９２５５１７号公報、米国特許６１０３４７６号公報）、ＴａｑＭａｎプローブ（米国特許５２１００１５号公報、米国特許５４８７９７２号公報）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（特許３４３７８１６号公報）、サイクリングプローブ（米国特許５０１１７６９号公報、米国特許５４０３７１１号公報）、インターカレーター性蛍光色素標識プローブ（ＩＮＡＦプローブ、特許文献７および非特許文献２）等に適用すると、検出操作を簡便に行なえるため好ましい。

【0021】

中でもインターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成すると当該蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、後述する核酸増幅反応と同時に増幅した核酸の検出を行なうことができ、後述する増幅用プライマーセット、酵素および酵素基質等を含む試薬類とともに容器に投入するだけで、増幅工程と検出工程を実施できるため、特に好ましい。前記特に好ましい態様では、上記の試薬等を予め容器に投入しておき、一定量の試料を分注するという操作のみで増幅・検出操作を迅速に実施可能である。さらに蛍光色素が発する信号を外部から検出可能なように容器の一部を透明な材料で構成すると、試料を分注後、容器を密閉したままの状態で検出工程を行なえるため、試料間のコンタミネーションを防止することもできる。インターカレーター性蛍光色素として特に限定はなく、オキサゾールイエローやアゾールオレンジ等のシアニン色素、ヘミシアニン色素、エチジウムブロマイド、メチルレッド等のアゾ色素、またはこれらの誘導体が例示できる。例えばオキサゾールイエローは、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４７０ｎｍ）が顕著に増加する色素である。このような色素は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端、５’末端、リン酸ジエステル部または塩基部分に適当なリンカーを介して結合させればよい。なお、増幅工程の過程で検出も行なう場合、３’末端側の水酸基からの伸長を防止する目的で、本発明のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端にある水酸基を修飾すると好ましい。

【0022】

通常、試料中に存在するマイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡ（またはその遺伝子）の存在量は微量である。そのため、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、試料中に存在するマイコバクテリウム・アビウムを特異的に検出する際は、試料中に存在するマイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡ（またはその遺伝子）を増幅させてから、または増幅させると同時に検出するとよい。

【0023】

マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを増幅させるためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１６７番目から１９０番目までの領域に相当）のうち少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせであればよい。配列番号１０に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドの好ましい態様としては、配列番号１２、配列番号１３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の３０番目から５２番目までの領域に相当）、配列番号１４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の８０番目から１０１番目までの領域に相当）のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。一方配列番号１５に記載の塩基配列のうち少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドの好ましい態様としては、配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１６７番目から１８９番目までの領域に相当）または配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１７４番目から１９０番目までの領域に相当）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

【0024】

マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅方法としては、ＰＣＲ法（特許文献１から３参照）、ＬＡＭＰ法（非特許文献１参照）、ＴＲＣ法（特許文献７および非特許文献２参照）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献４および５参照）、ＴＭＡ法（特許文献６参照）が例示できるが、本発明のオリゴヌクレオチドプローブが高次構造を取りにくい領域に存在する特定塩基配列に向けられたものであることから、一定温度（比較的低温）で簡便かつ迅速に実施可能なＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法が好ましい。

【0025】

特に好ましい増幅法であるＴＲＣ法は、
（１）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、標的ＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、および
（５）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
により標的ＲＮＡのうち特定塩基配列のＲＮＡを増幅する方法である。なお、ここで第一のプライマーとは特定塩基配列の一部と相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドのことをいい、第二のプライマーとは特定塩基配列の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのことをいい、第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている。

【0026】

前述した増幅法は、
（Ａ）１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、
（Ｂ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素、
（Ｃ）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、および
（Ｄ）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、
により進行する。これらの酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよく、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。具体的には、前記（Ａ）から（Ｃ）の酵素活性を有する逆転写酵素と、前記（Ｄ）とを組み合わせた態様が例示できる。もっとも、前記（Ａ）から（Ｃ）の酵素活性を有する逆転写酵素および前記（Ｄ）に、必要に応じて前記（Ｂ）をさらに添加した態様であってもよい。前記（Ａ）から（Ｃ）の酵素活性を有する逆転写酵素として、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素またはこれらの誘導体が例示でき、その中でもＡＭＶ逆転写酵素またはその誘導体が特に好ましい。前記（Ｄ）としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはこれらの誘導体が例示できる。

【0027】

前述した増幅反応を進行させるためには、試料と前記各酵素に加えて、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸およびリボヌクレオシド−三リン酸を添加し、さらに反応効率を調節するために必要に応じて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖等を添加し、適当な条件下で増幅反応を進行させる。例えば、前記（Ａ）から（Ｃ）の酵素活性を有する逆転写酵素としてＡＭＶ逆転写酵素を、前記（Ｄ）としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを、それぞれ用いる場合、反応温度を３５℃から６５℃の範囲、好ましくは４０℃から５０℃の範囲で設定すればよい。

【0028】

前述した増幅反応において、第一のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＲＮＡ転写産物は鋳型となるＲＮＡと相同の配列を含み、第二のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＲＮＡ転写産物は鋳型となるＲＮＡの相補的配列を含むことになる。プロモーター配列としては、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始し得る配列であればよく、種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的な公知のプロモーター配列を使用することができる。例えば、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター等の分子生物学的実験で通常用いられるプロモーター配列があげられる。なおプロモーター配列に加えて、さらに、エンハンサー配列等の転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。Ｔ７プロモーターおよびエンハンサー配列の一例として、配列番号１１に記載の塩基配列があげられる。

【0029】

前記した増幅反応を実施する場合、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端にプロモーター配列を付加しておけばよいが、第一のプライマーにプロモーター配列を付加する場合には、第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、標的ＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程（前記（１）の工程）の前に、または前記（１）の工程と同時に、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端側を切断する工程を行なうと好ましい。前記工程により、特定塩基配列の５’末端部位を切断しておくことで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、ｃＤＮＡの３’末端を伸長させることで効率的に合成でき、結果として効率的に機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成することができる。切断方法としては、当該部位を特異的に切断できれば特に限定されないが、標的ＲＮＡのうち特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内の５’末端部位を含む部分配列）に重複し、かつ５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、「切断用オリゴヌクレオチド」とする）を添加してＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、当該２本鎖中のＲＮＡ部分をＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素などにより切断する方法が、切断特異性及び簡便性から好ましい。また切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は、伸長反応を防止するために、例えばアミノ化等、適当な修飾を行なうと好ましい。

【0030】

マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡおよび／またはマイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを増幅するために用いる切断用オリゴヌクレオチドの一例として、
第一のプライマーとして配列番号１２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる場合は、配列番号１９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが、
第一のプライマーとして配列番号１３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる場合は、配列番号２０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４番目から３７番目までの領域に相当）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが、
第一のプライマーとして配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる場合は、配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の６４番目から８７番目までの領域に相当）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが、
それぞれあげられる。

【発明の効果】

【0031】

本発明のオリゴヌクレオチドプローブはマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）１６Ｓ ｒＲＮＡに特異的な配列（特定塩基配列）にハイブリダイズすることが可能なプローブであり、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いることで試料中に存在するマイコバクテリウム・アビウムを特異的に検出することができる。さらに本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、４０℃から５０℃という、比較的低温条件でもダイマーやループ等の高次構造を形成しにくいため、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを増幅するためのプライマーセット（オリゴヌクレオチドの組み合わせ）、および核酸増幅試薬（酵素、基質など）を添加することで、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを一定温度で増幅し検出することが可能となる。

【0032】

なお、インターカレーター性蛍光色素で標識した本発明のオリゴヌクレオチドプローブ存在下で、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅反応を行ない、その過程で蛍光強度を経時的に測定することで、有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、増幅に要する時間を加味しても、試料中に存在するマイコバクテリウム・アビウムの測定を３０分程度で終了することが可能である。つまり本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いることで、試料中に存在するマイコバクテリウム・アビウムを迅速、高感度かつ特異的に検出することが可能となる。

【実施例】

【0033】

以下実施例により本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

【0034】

実施例１ インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）から（Ｈ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、「ＩＮＡＦプローブ」と記載する）を非特許文献２に記載の方法を参照して作製した。
（Ａ）配列番号２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１３８番目から１５４番目までの領域に相当）からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から９番目のチミンの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入後、当該アミノ基にオキサゾールイエローを標識し、さらに３’末端をビオチンで修飾して得られた、ＩＮＡＦプローブ。
（Ｂ）配列番号３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４３番目から１６１番目までの領域に相当）からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から３番目のグアニンと４番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識して得られた、ＩＮＡＦプローブ。
（Ｃ）配列番号４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４３番目から１６３番目までの領域に相当）からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から５番目のグアニンと６番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介して下記化合物（ａ）を標識して得られた、ＩＮＡＦプローブ。

【0035】

【化1】

（Ｄ）配列番号５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４３番目から１６４番目までの領域に相当）からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から６番目のグアニンと７番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを標識して得られた、ＩＮＡＦプローブ。
（Ｅ）配列番号６に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４７番目から１６２番目までの領域に相当）からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から７番目のグアニンと８番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを標識して得られた、ＩＮＡＦプローブ。
（Ｆ）配列番号７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４７番目から１６４番目までの領域に相当）からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から９番目のグアニンと１０番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを標識して得られた、ＩＮＡＦプローブ。
（Ｇ）配列番号８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１４７番目から１６６番目までの領域に相当）からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から８番目のグアニンと９番目のアデニンとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してオキサゾールイエローを標識して得られた、ＩＮＡＦプローブ。
（Ｈ）配列番号９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ５２９１８の１５２番目から１７０番目までの領域に相当）からなるオリゴヌクレオチドのうち、５’末端から１３番目のアデニンの位置に、市販の試薬（Ｌａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いてアミノ基を導入後、当該アミノ基にオキサゾールイエローを標識し、さらに３’末端をビオチンで修飾して得られた、ＩＮＡＦプローブ。

【0036】

実施例２ マイコバクテリウム・イントラセルラー１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの評価
表１に示した組み合わせに記載のＩＮＡＦプローブ、第一のプライマー、第二のプライマーおよび切断用オリゴヌクレオチド（以下、「オリゴヌクレオチドの組み合わせ」と記載する）を用いて、（１）から（５）に示す方法で抗酸菌１６Ｓ ｒＲＮＡを検出し検出性能および特異性の評価を行なった。
（１）マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、マイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、およびマイコバクテリウム・カンサシー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をそれぞれクローニングし、インビトロ転写後、転写産物を精製することで、各抗酸菌１６Ｓ ｒＲＮＡを調製した（以下、「標準ＲＮＡ」と記載する）。また特異性評価用として、マイコバクテリウム・マリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）培養液、マイコバクテリウム・フロレンティナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ）培養液、マイコバクテリウム・コロンビエンゼ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｏｍｂｉｅｎｓｅ）培養液（ＯＤ_{６００ｎｍ}＝０．１）をＥＸＴＲＡＧＥＮ ＭＢ（東ソー製）でそれぞれ核酸抽出し得られた、各抗酸菌ＲＮＡ溶液も用意した。
（２）各抗酸菌標準ＲＮＡを、ＲＮＡ希釈液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））を用いて、それぞれ以下に示す濃度に調整し、これらをＲＮＡ試料として用いた。なおマイコバクテリウム・マリナムは、（１）で調製したマイコバクテリウム・マリナムＲＮＡ溶液をそのまま、または前記ＲＮＡ希釈液で１０倍希釈したものをＲＮＡ試料として用い、マイコバクテリウム・フロレンティナムおよびマイコバクテリウム・コロンビエンゼは、（１）で調製したマイコバクテリウム・フロレンティナムＲＮＡ溶液またはマイコバクテリウム・コロンビエンゼＲＮＡ溶液を前記ＲＮＡ希釈液でそれぞれ１０倍希釈したものをＲＮＡ試料として用いた。
マイコバクテリウム・アビウム標準ＲＮＡ：１０^３コピー／５μＬ
マイコバクテリウム・イントラセルラー標準ＲＮＡ、結核菌標準ＲＮＡおよびマイコバクテリウム・カンサシー標準ＲＮＡ：１０^９コピー／５μＬ
（３）以下の組成の反応液２０μＬを市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。

【0037】

反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ 塩化マグネシウム
６１．７ｍＭ 塩化カリウム
０．０１％ コール酸ナトリウム
各０．３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ ＩＴＰ
０．０８から０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（３’末端の水酸基をアミノ基で修飾）
０．５から１μＭ 第一のプライマー（各配列番号記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号１１）を付加したもの）
０．５から１μＭ 第二のプライマー
１０から１００ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製したもの）
１０．５％ ＤＭＳＯ
（４）上記の反応液を４３℃または４６℃で５分間保温後、予め４３℃で２分間保温した酵素液Ａまたは酵素液Ｂ（組成は下記参照）を５μＬを添加した。

【0038】

酵素液Ａの組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％ ソルビトール
５．１から６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
７１から１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
０．１２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
酵素液Ｂの組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２３％ グリセロール
０．４Ｍ トレハロース
３３．３ｍＭ 塩化カリウム
５．１から６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
７１から１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
０．０５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
０．０１％ アジ化ナトリウム
０．００３％ 青色１号
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接検出可能な温調機能付き蛍光分光光度計に供し、４３℃または４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４５０ｎｍ−蛍光波長４９０ｎｍ、励起波長４７０ｎｍ−蛍光波長５１０ｎｍまたは励起波長５００ｎｍ−蛍光波長５４０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。

【0039】

各オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、各抗酸菌のＲＮＡ試料を測定した結果を表１に示す。表１において、検出性能はＲＮＡ試料としてマイコバクテリウム・アビウムＲＮＡ試料を用いたときの結果であり、酵素添加時を反応開始時（０分）とし、反応開始後３０分以内に反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った比）が１．８０以上に達した場合を陽性判定（「＋」と表記）とし、反応開始後３０分後の時点で蛍光強度比１．８０未満の場合を陰性判定（「−」と表記）としている。また特異性はＲＮＡ試料としてマイコバクテリウム・アビウム以外の抗酸菌（マイコバクテリウム・イントラセルラー、結核菌、マイコバクテリウム・カンサシー、マイコバクテリウム・マリナム、マイコバクテリウム・フロレンティナムおよびマイコバクテリウム・コロンビエンゼ）ＲＮＡ試料を用いたときの結果であり、酵素添加時を反応開始時（０分）とし、反応開始後３０分以内に反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った比）が１．４０未満の場合を陰性判定（「−」と表記）、１．１５未満を強陰性判定（「−−」と表記）としている。

【0040】

【表1】

表１より、オリゴヌクレオチドの組み合わせ［２］から［４］および［６］から［８］がマイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを特異的に検出しており、特にオリゴヌクレオチドの組み合わせ［２］から［４］および［６］がマイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡに対する特異性が高いことがわかる。マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを検出しなかった、組み合わせ［１］で使用したＩＮＡＦプローブ（配列番号２）および組み合わせ［５］で使用したＩＮＡＦプローブ（配列番号６）と、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを特異性高く検出した、組み合わせ［２］で使用したＩＮＡＦプローブ（配列番号３）とは、それぞれ１２塩基、１５塩基一致している。またマイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを検出しなかった、組み合わせ［５］で使用したＩＮＡＦプローブ（配列番号６）は、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを特異性高く検出した、組み合わせ［６］で使用したＩＮＡＦプローブ（配列番号７）の５’末端側２塩基を削除したものと同一である。さらにマイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡに対する特異性があまり高くなかった、組み合わせ［７］で使用したＩＮＡＦプローブ（配列番号８）の塩基配列は、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを特異性高く検出した、組み合わせ［６］で使用したＩＮＡＦプローブ（配列番号７）の５’末端側に２塩基（ＴＣ）を付加した塩基配列と同一である。つまり、標的核酸（マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡ）に対する位置が互いに近いＩＮＡＦプローブを用いても、当該位置の違いにより検出性能と特異性が大きく変化することがわかる。したがって、マイコバクテリウム・アビウム１６Ｓ ｒＲＮＡを特異的かつ高感度に検出するためには、ＩＮＡＦプローブの標的核酸に対する位置を厳密に設計する必要があることがわかる。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]