特許 6228089 血液凝固検査チップ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6228089

(24)【登録日】2017年10月20日

(45)【発行日】2017年11月8日

(54)【発明の名称】血液凝固検査チップ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/86 20060101AFI20171030BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20171030BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20171030BHJP

   G01N 21/41 20060101ALI20171030BHJP

   G01N 33/543 20060101ALN20171030BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/86

   G01N33/483 C

   G01N37/00 101

   G01N21/41 101

   !G01N33/543 595

【請求項の数】3

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2014-189764(P2014-189764)

(22)【出願日】2014年9月18日

(65)【公開番号】特開2016-61677(P2016-61677A)

(43)【公開日】2016年4月25日

【審査請求日】2016年9月9日

(73)【特許権者】

【識別番号】000004226

【氏名又は名称】日本電信電話株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100064621

【弁理士】

【氏名又は名称】山川 政樹

(74)【代理人】

【識別番号】100098394

【弁理士】

【氏名又は名称】山川 茂樹

(74)【代理人】

【識別番号】100153006

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 勇三

(72)【発明者】

【氏名】林 勝義

(72)【発明者】

【氏名】井上 鈴代

(72)【発明者】

【氏名】岩崎 弦

(72)【発明者】

【氏名】松浦 伸昭

(72)【発明者】

【氏名】小泉 弘

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−２３２１３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−０４１０４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／０２２１６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−０５３９５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第５５０４０１１（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｇ０１Ｎ ２１／４１

Ｇ０１Ｎ ３７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検査溶液と凝固活性化溶液が導入される導入口と、前記導入口から導入された被検査溶液と凝固活性化溶液とが直列に接触しながら流れる流路と、前記流路を流れる被検査溶液と凝固活性化溶液が導出される導出口とを備えた血液凝固検査チップにおいて、
前記導入口から導入された被検査溶液と凝固活性化溶液とは、前記直列に接触した面を界面とし、この界面で凝固反応を起こしながら、前記流路を前記導出口に向かって流れ、
前記流路の底面の一部に、前記界面付近で生じる屈折率の変化を観測する領域として金薄膜が形成され、
前記流路の底面の前記屈折率の変化を観測する領域以外の領域に、生体分子が吸着し難い材料の薄膜として酸化チタン薄膜が形成されている
ことを特徴とする血液凝固検査チップ。

【請求項2】

請求項１に記載された血液凝固検査チップにおいて、
前記流路は、直線構造とされている
ことを特徴とする血液凝固検査チップ。

【請求項3】

請求項１又は２に記載された血液凝固検査チップにおいて、
前記流路に先ず前記凝固活性化溶液が流され、続いて前記被検査溶液が流される
ことを特徴とする血液凝固検査チップ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この発明は、血液の凝固能を測定する際に用いられる血液凝固検査チップに関するものである。

【背景技術】

【0002】

凝固活性は、臨床検査の重要な項目であり、特にその一つの凝固活性指標であるプロトロンビン時間（血液凝固時間：ＰＴ（Prothrombin time））は、外因系の凝固因子への感度が高いと考えられており、外因系の凝固因子の欠損のスクリーニングや、肝機能の異常、さらに経口の抗凝血薬療法のモニタリングなどに用いられる指標である。

【0003】

従来、血液凝固時間の測定には、かくはん抵抗方式、光散乱方式、熱伝導方式、水晶振動子方式などの方法が発明されているが、一般にかくはん抵抗方式と光散乱方式が多く用いられている（例えば、非特許文献１参照）。

【0004】

かくはん抵抗方式は、サンプルを活性化剤と一緒に導入してフィンで攪拌し、攪拌の抵抗の上昇から血液凝固時間を測定する方法である。

【0005】

光散乱方式は、試験用容器内で、血漿に凝固活性化を促す成分を含む試薬を混合し、容器に対し光を入射させ、その散乱光の光量変化を測定して血液凝固時間を測定する方法である。散乱光量から血液凝固時間を得る方法としては、散乱光量をそのまま利用する方法、散乱光量の微分値を利用する方法、散乱光量がある一定値に達するまでの時間を求める方法がある。

【0006】

最近では、屈折率変化を用いて血液の凝固能を測定する手法も提案されている。この屈折率変化を用いて血液の凝固能を測定する手法では、マイクロ流路内における異なる地点の屈折率変化と時間、溶液の移動距離から流速を算出し、その流速が血漿の凝固活性度の違いにより変化することを利用して血液凝固を検査する（例えば、特許文献１〜３参照）。

【0007】

また、従来の血液凝固検査は、血液凝固カスケードの最終生成物であるフィブリンによる物理的、光学的変化を捉えることにより行われてきたが、近年ではフィブリンと同時に生成される低屈折率成分の屈折率と血液の凝固能との間に相関があることが報告されている（例えば、非特許文献１，２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０１１−２３２１３７号公報

【特許文献2】特開２０１３−０５３９５９号公報

【特許文献3】特開２０１３−０５３９６０号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Inoue et al.,「SUB-SECOND DETERMINATION OF BIOGENIC PROTEIN POLYMERIZATION ACTIVITY USING FLOW INDUCED REFRACTIVE INDEX “VALLEY”」,Micro TAS 2013,pp.230-232.年１０月発表）

【非特許文献2】Hayashi et al.,「POLYMERIZATION OF BIOLOGICAL MOLECULES IN A MICROCHANNEL GENERATES BOTH HIGH AND LOW-REFRACTIVE INDEX INGREDIENTS」,Micro TAS 2013,pp.898-900.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

屈折率変化を用いて血液の凝固能を測定する手法では、マイクロ流路内における異なる地点の屈折率変化と時間、溶液の移動距離から流速を算出し、その流速が血漿の凝固活性度の違いにより変化することを利用して血液凝固を検査する。この検査では、マイクロ流路を備える血液凝固検査チップを用い、流路に血漿と凝固試薬（凝固活性化剤）を流しながら、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定法で屈折率の変化を観測する。

【0011】

従来の血液凝固検査チップにおいては、流路に先ず凝固活性化溶液として凝固試薬を流し、次に被検査溶液として血漿を流し、流路内で血漿と凝固試薬とを直列に接触させ、その血漿と凝固試薬とが接触した面を界面とし、この界面で凝固反応を生じさせていた。そして、その界面付近で生じる屈折率の変化をＳＰＲ測定法で観測していた。

【0012】

ＳＰＲ測定法で屈折率の変化を観測する場合、一般に流路の底面の全体を金薄膜としたガラス等の基板を用いるが、金薄膜上には血漿中に含まれるフィブリノゲン等の生体分子もしくは凝固反応による生成物であるフィブリンが吸着しやすく、これにより界面付近で生じる屈折率の変化を観測する領域（センシング部分）が汚染され、感度が変化して行くという問題があった。特に、血漿と凝固試薬とが最初に接する流路の入口付近では、凝固物による送液不良が起こりやすい。このような理由から、従来の血液凝固検査チップでは、血液の凝固能の測定を繰り返し行ううちに、測定精度が低下してしまうという問題があった。

【0013】

本発明は、このような課題を解決するためになされたもので、その目的とするところは、センシング部分や流路内の汚染を抑制し、測定精度の低下を抑えることができる血液凝固検査チップを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0014】

このような目的を達成するために本発明は、被検査溶液と凝固活性化溶液が導入される導入口と、導入口から導入された被検査溶液と凝固活性化溶液とが直列に接触しながら流れる流路と、流路を流れる被検査溶液と凝固活性化溶液が導出される導出口とを備えた血液凝固検査チップにおいて、導入口から導入された被検査溶液と凝固活性化溶液とは、直列に接触した面を界面とし、この界面で凝固反応を起こしながら、流路を導出口に向かって流れ、流路の底面の一部に、界面付近で生じる屈折率の変化を観測する領域として金薄膜が形成され、流路の底面の屈折率の変化を観測する領域以外の領域に、生体分子が吸着し難い材料の薄膜として酸化チタン薄膜が形成されていることを特徴とする。

【0015】

本発明において、流路の底面の屈折率の変化を観測する領域以外の領域には、フィブリノゲン等の生体分子が吸着し難い材料の薄膜を形成するようにする。本発明では、例えば、被検査溶液を血漿とし、凝固活性化溶液を凝固試薬とするが、この場合、流路の底面に吸着する生体分子や凝固物の量が減り、流路の底面に積層される生体分子や凝固物の厚みが薄くなる。これにより、流路内の汚染が抑制されると共に、屈折率の変化を観測する領域（センシング部分）の汚染が抑制され、繰り返し血液の凝固能の測定を行っても、精度が安定した測定結果を得ることが可能となる。

【0016】

生体分子が吸着し難い材料としては、チタン及びチタン合金、コバルト−クロム合金などが挙げられるが、本発明では、屈折率の変化を観測する領域を金薄膜とし、屈折率の変化を観測する領域以外の領域に酸化チタン薄膜を形成するようにする。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、流路の底面の屈折率の変化を観測する領域以外の領域に生体分子が吸着し難い材料の薄膜を形成するようにしたので、流路の底面に吸着する生体分子の量が減り、流路の底面に積層される生体分子や凝固物の厚みが薄くなり、センシング部分や流路内の汚染を抑制して、測定精度の低下を抑えることができるようになる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】本発明の原理を説明する図である。

【図2】本発明の原理において血漿と凝固試薬とが直列に接触しながら流れて行く様子を示す図である。

【図3】本発明の原理において流路の底面の一部に屈折率の変化を観測する領域を形成した状態を示す図である。

【図4】実施の形態の血液凝固検査チップを構成する流路基板を示す図である。

【図5】実施の形態の血液凝固検査チップを構成する測定用基板を示す図である。

【図6】流路基板と測定用基板とを組み合わせた状態を示す側断面図である。

【図7】実施の形態の血液凝固検査チップにおいて血漿と凝固試薬とが直列に接触しながら流れて行く様子を示す図である。

【図8】血漿と凝固試薬を血液凝固検査チップの流路内に導入したときの時間に対する屈折率変化の様子を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

〔発明の原理〕
本発明において、血液凝固検査チップは、被検査溶液と凝固活性化溶液が導入される導入口と、この導入口から導入された被検査溶液と凝固活性化溶液とが直列に接触しながら流れる流路と、この流路を流れる被検査溶液と凝固活性化溶液が導出される導出口とを備えている。

【0020】

この構成において、本発明では、流路の底面の一部に、被検査溶液と凝固活性化溶液との接触面を界面とし、この界面付近で生じる屈折率の変化を観測する領域を形成し、この流路の底面の屈折率の変化を観測する領域以外の領域に、生体分子が吸着し難い材料の薄膜を形成する。

【0021】

例えば、図１に示すように、チップ１に導入口２と導出口３を設け、この導入口２と導出口３とを直線構造の流路（直線流路）４でつなぐ。そして、導出口３と吸引ポンプ５との間をチューブ６で接続し、吸引ポンプ５を用いて流路４内を吸引した状態で、導入口２から先ず凝固活性化溶液として凝固試薬７を導入し、続いて被検査溶液として血漿８を導入する。

【0022】

すると、導入口２から導入された凝固試薬７と血漿８は、流路４内を直列に接触しながら流れる（図２参照）。図２において、９は血漿８と凝固試薬７との接触面（界面）である。

【0023】

この場合、血漿８と凝固試薬７とは界面９で接触するため、界面９で凝固反応が起こる。すなわち、血漿８と凝固試薬７とは、直列に接触した面を界面９とし、この界面９で凝固反応を起こしながら、流路４を導出口３に向かって流れて行く。そこで、図３に示すように、流路４の底面の一部に、界面９付近で生じる屈折率の変化を観測する領域をセンシング部分１０として形成するようにし、このセンシング部分１０で観測される屈折率の変化をもとに血漿８の凝固能を決定する。すなわち、血漿８の凝固能は、屈折率変化が大きい場合に高い。この屈折率変化をもとに血漿８の凝固能を血液の凝固能として決定する。

【0024】

また、流路４の底面の全部を金薄膜とした場合、この金薄膜上に血漿８中に含まれるフィブリノゲン等の生体分子もしくは凝固反応による生成物であるフィブリンが吸着しやすく、これによりセンシング部分１０が汚染され、感度が変化して行くという虞がある。また、血漿８と凝固試薬７とが最初に接する流路４の入口付近では、凝固物による送液不良が起こりやすい。

【0025】

そこで、流路４の底面のセンシング部分１０以外の領域に、生体分子が吸着し難い材料の薄膜として例えば酸化チタン薄膜１１を形成する。これにより、流路４の底面に吸着する生体分子の量が減り、流路４の底面に積層される生体分子や凝固物の厚みが薄くなり、流路４内の汚染が抑制されると共に、センシング部分１０の汚染が抑制される。このセンシング部分１０や流路４内の汚染の抑制により、繰り返し血液の凝固能の測定を行っても、精度が安定した測定結果を得ることができるようになる。

【0026】

なお、屈折率の変化を検出する検出器としては、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定装置を用いる。ＳＰＲ測定装置は、ＬＥＤ等の光源と偏光板、集光レンズ、ＣＣＤカメラから構成されている。

【0027】

〔実施の形態〕
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。
図４は本実施の形態の血液凝固検査チップを構成する流路基板を示す図であり、図４（ａ）は平面図、図４（ｂ）は図４（ａ）におけるＡ−Ａ線断面図である。

【0028】

この流路基板２０１はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いて作製されており、その下面に導入口２０２と導出口２０３とをつなぐ直線構造の流路（直線流路）２０４が形成されている。

【0029】

なお、流路２０４の高さｈは５０μｍ、幅ｗは０．５ｍｍとされている。また、導入口２０２および導出口２０３は、流路基板２０１の上面に開口している。

【0030】

図５は本実施の形態の血液凝固検査チップを構成する測定用基板であり、図５（ａ）は平面図、図５（ｂ）は図５（ａ）におけるＢ−Ｂ線断面図である。

【0031】

この測定用基板２０５の材質はガラス（ＢＫ７）とされている。測定用基板２０５の上面には、流路基板２０１に形成されている流路２０４に対応する位置に、その平面形状を流路２０４の平面形状と同じとした金属薄膜２０８が形成されている。金属薄膜２０８は金薄膜２０６と酸化チタン薄膜２０７とから構成されている。

【0032】

金薄膜２０６は、凝固試薬と血漿との界面付近で生じる屈折率の変化を観測する領域（センシング部分（ＳＰＲ観測領域））として、流路２０４の平面形状に対応する領域の一部に形成されており、酸化チタン薄膜２０７は、流路２０４の平面形状に対応する領域のＳＰＲ観測領域を除く全ての領域に形成されている。

【0033】

図６は流路基板２０１と測定用基板２０５とを組み合わせた状態を示す側断面図である。本実施の形態の血液凝固検査チップ２００は、図４に示した流路基板２０１と図５に示した測定用基板２０５とを、反応性イオンエッチング装置を用いて酸素プラズマで処理した後に、流路２０４の平面形状と金属薄膜２０８の平面形状とが合致するように貼り合わせて作製される。

【0034】

この血液凝固検査チップ２００は、血液凝固検査装置の主要部品として用いられ、ＳＰＲ測定装置に設置される。また、導出口２０３には内径が１ｍｍのチューブが接続され、このチューブには吸引ポンプが接続される。また、血漿や凝固試薬を血液凝固検査チップ２００に分注するための分注装置が設けられる。この血液凝固検査装置の構成については図示していない。

【0035】

〔血液凝固検査〕
血液凝固検査チップ２００を用いて血液凝固検査を行う場合、吸引ポンプを動作させ、続いてあらかじめ導入口２０２に凝固試薬を滴下し、流路２０４内で吸引ポンプによる圧力と毛細管力が釣り合い、凝固試薬が静止した状態で、血漿を導入口２０２に滴下する。

【0036】

すると、２つの溶液は、図７に示すように、直列に接触した状態で、流路２０４内を導出口２０３に向かって流れて行く。なお、図７において、３０１は血漿であり、３０２は凝固試薬である。また、３０３は血漿３０１と凝固試薬３０２との界面である。３０４はＳＰＲを観測するラインであり、ＳＰＲを観測するライン３０４が流路２０４を跨ぐように、血液凝固検査チップ２００はマウントされている。

【0037】

図８に血漿と凝固試薬を血液凝固検査チップ２００の流路２０４内に導入したときの時間に対する屈折率変化の様子を示す。図８の横軸は時間を示しており、縦軸はＳＰＲ観測点での屈折率変化を示している。図８のｎ１は凝固試薬の屈折率であり、ｎ２は血漿の屈折率である。ｎ４の屈折率が得られたのは凝固活性率が８６％の血漿を用いた場合である。

【0038】

しかし、流路２０４の底面の金属薄膜２０８をすべて金薄膜とした場合、血漿の屈折率はｎ３となり、ＳＰＲ観測領域のみを金薄膜とした場合に比べて観測される屈折率が増加することがわかった。これはＳＰＲ観測領域の金薄膜上により多くの凝固物の付着等が起こったためである。

【0039】

金薄膜表面の汚染は血漿中に含まれる成分の吸着および凝固物の付着によると考えられるが、本実施の形態のように金薄膜２０６が形成されているＳＰＲ観測領域以外の部分に生体分子の吸着を抑制する酸化チタン薄膜２０７を形成することで、流路２０４の底面に吸着する生体分子や凝固物の量が減り、流路２０４の底面に積層される生体分子や凝固物の厚みが薄くなる。これにより、流路２０４内の汚染が抑制されると共に、ＳＰＲ観測領域上の金薄膜２０６の汚染が抑制され、繰り返し血液の凝固能の測定を行っても、精度が安定した測定結果を得ることが可能となる。

【0040】

なお、流路２０４の底面の金薄膜２０６を除く領域に酸化チタン薄膜２０７を形成する代わりに、金薄膜２０６上にフィブリノゲン等の吸着を抑制することのできる生体適合性の高いポリマーを修飾するようにしてもよい。

【0041】

また、流路２０４の底面の金薄膜２０６を除く領域に酸化チタン薄膜２０７を形成せず、ガラス基板のままとすることも考えられるが、金薄膜２０６を除く領域に酸化チタン薄膜２０７を形成して積極的に生体分子が吸着し難くすることによって、より大きな効果を得ることができる。

【0042】

また、上述した実施の形態では、被検査溶液を血漿とし、血漿の凝固能を血液の凝固能として測定するようにしたが、被検査溶液は血漿に限定されるものではない。

【0043】

〔実施の形態の拡張〕
以上、実施の形態を参照して本発明を説明したが、本発明は上記の実施の形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明の技術思想の範囲内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。

【符号の説明】

【0044】

１…チップ、２…導入口、３…導出口、４…流路、７…凝固試薬、８…血漿、９…界面、１０…センシング部分、１１…酸化チタン薄膜、２００…血液凝固検査チップ、２０１…流路基板、２０２…導入口、２０３…導出口、２０４…流路（直線流路）、２０５…測定用基板、２０６…金薄膜（センシング部分（ＳＰＲ観測領域））、２０７…酸化チタン薄膜、２０８…金属薄膜、３０１…血漿、３０２…凝固試薬、３０３…界面。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】