特許 6229908 プロテインタグ、タグ化タンパク質及びタンパク質精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6229908

(24)【登録日】2017年10月27日

(45)【発行日】2017年11月15日

(54)【発明の名称】プロテインタグ、タグ化タンパク質及びタンパク質精製方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171106BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20171106BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20171106BHJP

   C07K 1/30 20060101ALI20171106BHJP

   C07K 1/107 20060101ALI20171106BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20171106BHJP

   C12P 21/06 20060101ALI20171106BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20171106BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20171106BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20171106BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/435

   C07K19/00

   C07K1/30

   C07K1/107

   C12P21/02 C

   C12P21/06

   C07K16/00

   G01N33/53 D

   G01N37/00 102

【請求項の数】13

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2016-133111(P2016-133111)

(22)【出願日】2016年7月5日

(62)【分割の表示】特願2014-509001(P2014-509001)の分割

【原出願日】2012年11月21日

(65)【公開番号】特開2017-18095(P2017-18095A)

(43)【公開日】2017年1月26日

【審査請求日】2016年8月2日

(31)【優先権主張番号】特願2012-87214(P2012-87214)

(32)【優先日】2012年4月6日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 第３４回日本分子生物学会年会にて発表 ２０１１年１２月１３日

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100112874

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 薫

(72)【発明者】

【氏名】五島 直樹

(72)【発明者】

【氏名】福田 枝里子

(72)【発明者】

【氏名】森 正敏

【審査官】 西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５３７８１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５３１２５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５３２６３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−１２３７４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本分子生物学会年会プログラム要旨集[online]，２０１１年１１月２１日，[2011年11月21日検索]インターネット<URL http://www.aeplan.co.jp/mbsj2011/>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

Ｃ１２Ｐ ２１／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＭａｆＧタンパク質由来の配列番号３に示すアミノ酸配列からなるプロテインタグ。

【請求項2】

ＭａｆＧタンパク質由来の配列番号３に示すアミノ酸配列からなるプロテインタグによりタグ化されたタンパク質。

【請求項3】

ドデシル硫酸ナトリウム濃度０．０４〜０．２％（ｗ／ｖ）を含む溶媒で可溶化される、請求項２に記載のプロテインタグによりタグ化されたタンパク質。

【請求項4】

請求項２又は３に記載のタンパク質を支持体に固定したプロテインアレイ。

【請求項5】

請求項１に記載のプロテインタグを発現するベクター。

【請求項6】

タグ化する目的タンパク質と前記プロテインタグとの融合タンパク質を発現する請求項５に記載のベクター。

【請求項7】

ＭａｆＧタンパク質由来の配列番号３に示すアミノ酸配列からなるプロテインタグにより、目的タンパク質をタグ化する融合タンパク質調製手順と、
タグ化された前記目的タンパク質を不溶画分に回収する精製手順と、
タグ化された前記目的タンパク質を可溶化する融合タンパク質可溶化手順
を含み、
前記融合タンパク質可溶化手順はドデシル硫酸ナトリウムの存在下で行い、該ドデシル硫酸ナトリウムは、濃度０．０４〜０．２％（ｗ／ｖ）であり、
前記ドデシル硫酸ナトリウムを含む溶媒の水素イオン指数が、ｐＨ７．８〜ｐＨ９．２である、
タンパク質精製方法。

【請求項8】

前記融合タンパク質調製手順は、無細胞タンパク質合成系又は細胞タンパク質合成系において、前記目的タンパク質と前記プロテインタグとの融合タンパク質を発現するベクターを用いて、該融合タンパク質を合成する手順である請求項７に記載のタンパク質精製方法。

【請求項9】

前記無細胞タンパク質合成系が、コムギ無細胞タンパク質合成系である請求項８記載のタンパク質精製方法。

【請求項10】

前記精製手順は、タグ化された前記目的タンパク質を遠心分離する手順である請求項７〜９のいずれか一項に記載のタンパク質精製方法。

【請求項11】

タンパク質に対する抗体を精製する方法であって、
前記タンパク質と、請求項１に記載されたプロテインタグと、の融合タンパク質を用いることを特徴とする抗体精製方法。

【請求項12】

目的タンパク質と融合し、得られた融合タンパク質を濃度０．０４〜０．２％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム含有溶媒で可溶化するための、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド。

【請求項13】

前記得られた融合タンパク質は不溶化されている、請求項１２に記載のペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プロテインタグ、タグ化タンパク質及びタンパク質精製方法等に関する。より詳しくは、組換えタンパク質を不溶化させることで簡便な回収を可能とするタンパク質タグ等に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、組換えタンパク質の精製は、目的とするタンパク質をアフィニティタグとの融合タンパク質として発現させ、アフィニティタグが他の分子との間で示す特異的親和性を利用して可溶画分から融合タンパク質を単離することによって行われている。アフィニティタグは、目的タンパク質の可溶性を高め、融合タンパク質を可溶化させて発現させるためにも機能する。

【0003】

アフィニティタグとしては、Ｈｉｓタグ（ヒスチジンタグ）、ＧＳＴタグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ）、ＭＢＰタグ（マルトース結合タンパク質タグ）及びＦＬＡＧタグなどが汎用されている。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基を６〜１０個程度含むペプチドであり、ニッケルなどの金属イオンと特異的に結合する。ＧＳＴタグ及びＭＢＰタグは、それぞれグルタチオン及びマルトースといった低分子化合物と特異的に結合する。

【0004】

例えば、ニッケルイオンを固定化したキレート樹脂にＨｉｓタグでタグ化されたタンパク質の溶液を通流させて吸着させる。続いて、樹脂にニッケルイオン、又はイミダゾールなどのニッケルイオンと結合する低分子化合物を通流させれば、吸着された融合タンパク質を溶出させて回収することができる。

【0005】

ＦＬＡＧタグは、抗原抗体反応を利用したタグ（エピトープタグ）であり、ＦＬＡＧタグでタグ化されたタンパク質は、抗ＦＬＡＧ抗体と結合させることによって可溶画分から単離できる。エピトープタグとしては、他にｍｙｃタグ及びＨＡタグなどがあり、上述のＨｉｓタグやＧＳＴタグもエピトープタグとしての使用が可能である。

【0006】

また、これらのアフィニティタグにおいては、プロテアーゼ処理によって融合タンパク質を目的タンパク質とタグとに切断し、目的タンパク質からタグを切り離すことができるように設計することも行われている。例えば、タグを介して樹脂に吸着された融合タンパク質をプロテアーゼ処理し、目的タンパク質とタグとの間を切断すれば、目的タンパク質のみを樹脂から遊離させて回収することができる。

【0007】

特許文献１には、ＨｉｓタグとＦＬＡＧタグとから成る複合タグで標識したタンパク質をニッケル結合担体及び抗ＦＬＡＧ抗体結合担体と特異的に反応させてタンパク質を分離精製する技術が開示されている。また、特許文献２には、セルロース分解酵素のセルロース結合領域を含むペプチド鎖をアフィニティタグとして用い、プロテアーゼ処理により融合タンパク質からタグを分離して目的タンパク質を回収する方法が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２００３−２９２５００号公報

【特許文献2】特開平６−２７７０８８号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】"Human protein factory for converting the transcriptome intoan in vitro-expressed proteome." Goshima,N., et al., Nature Methods. 2008, Vol.5, No.12, p.1011-1017

【非特許文献2】"Molecular Cloning,SECOND EDITION", 1989, 17.37-17.41, Cold Spring Harbor Laboratory Press

【非特許文献3】"CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY", 1990, Vol.2 UNIT 16.5-16.5.4 CURRENT PROTOCOLS

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

従来のアフィニティタグを用いたタンパク質精製は、アフィニティタグの特異的親和性を利用して可溶画分から融合タンパク質を単離するため、融合タンパク質を可溶性を有する状態で発現させ、可溶画分中に分画する必要がある。また、融合タンパク質中のアフィニティタグが他の分子との特異的親和性を維持している必要がある。

【0011】

しかし、目的とするタンパク質によっては可溶化させ難いものがあり、タンパク質間で可溶化率にも大きな差がある。また、融合タンパク質中のアフィニティタグが、目的タンパク質の影響を受けて他の分子と十分な親和性を発揮できない場合もある。

【0012】

そのため、従来のアフィニティタグを用いたタンパク質精製では、融合タンパク質の可溶性の程度（可溶化率）やアフィニティタグの親和性の程度（親和性維持率）にタンパク質の回収率が依存し、回収率が非常に低くなってしまう場合があった。また、従来の精製方法では、多数のタンパク質をその可溶化率及び親和性維持率によらずに網羅的に合成して精製することは困難であった。

【0013】

そこで、本発明は、タンパク質を高収率かつ簡便に回収することを可能とし、網羅的なタンパク質精製を可能とする技術を提供することを主な目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

組換えタンパク質を発現させる場合、その発現させるタンパク質の種類によって可溶となるタンパク質と不溶となるタンパク質が存在する。また、1種類のタンパク質でも可溶と不溶の２つの画分に分離する場合もある。

【0015】

本発明者らは、鋭意検討した結果、タンパク質の種類にかかわらず、発現させたタンパク質を不溶化させ、不溶画分から発現タンパク質を画一的に精製・回収することを可能にする不溶化タグを見出した。また、本発明に係る不溶化タグは、インクルージョンボディーのタンパク質を可溶化するための溶媒に含まれる界面活性剤の一般的な濃度よりも低濃度で再可溶化することが可能であることを見出した。

【0016】

本発明は、上記課題解決のため、ＭａｆＧタンパク質の全長又は一部のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、を含んでなるプロテインタグを提供する。
このプロテインタグによれば、ＭａｆＧタンパク質に由来する高い不溶性をタグ化されるタンパク質に付与できる。
このプロテインタグにおいて、プロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸は、トリプシンの切断部位であるアルギニンとできる。
このプロテインタグは、具体的には配列番号１〜４に記載のアミノ酸配列を含んでなるものとできる。
また、本発明は、ＭａｆＧタンパク質の全長又は一部のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、を含んでなるプロテインタグによりタグ化されたタンパク質を提供する。
このタグ化タンパク質は、例えばタンパク質を支持体に固定したプロテインアレイとして応用が可能である。
さらに、本発明は、ＭａｆＧタンパク質の全長又は一部のアミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を含んでなるプロテインタグによりタグ化されたタンパク質をプロテアーゼ処理して得られるペプチドをも提供する。
プロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を含んでなるプロテインタグによりタグ化されたタンパク質をプロテアーゼ処理して得られるペプチドは、タグ由来のペプチドが非常に短くなるように設計できるため、質量分析の対象とするタンパク質についての質量分析用標準ペプチドとして好適である。

【0017】

また、本発明は、上記のプロテインタグを発現するベクターを提供する。このベクターは、タグ化する目的タンパク質とプロテインタグとの融合タンパク質を発現するものとされる。

【0018】

さらに、本発明は、ＭａｆＧタンパク質の全長又は一部のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、を含んでなるプロテインタグにより、目的タンパク質をタグ化する融合タンパク質調製手順と、タグ化された前記目的タンパク質を不溶画分に回収する精製手順と、を含むタンパク質精製方法を提供する。
上記プロテインタグによれば、ＭａｆＧタンパク質に由来する高い不溶性を目的タンパク質に付与し、融合タンパク質を不溶化させることができるため、融合タンパク質を不溶画分に高い収率で回収できる。
このタンパク質精製方法において、前記融合タンパク質調製手順は、無細胞タンパク質合成系（例えばコムギ無細胞タンパク質合成系）又は細胞タンパク質合成系において、前記目的タンパク質と前記プロテインタグとの融合タンパク質を発現するベクターを用いて、該融合タンパク質を合成する手順とされる。また、前記精製手順は、タグ化された前記目的タンパク質を遠心分離する手順とされる。

【0019】

併せて、本発明は、タンパク質に対する抗体を精製する方法であって、前記タンパク質と、ＭａｆＧタンパク質の全長又は一部のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、を含んでなるプロテインタグと、の融合タンパク質を用いることを特徴とする抗体精製方法をも提供する。

【発明の効果】

【0020】

本発明により、タンパク質を高収率かつ簡便に回収することを可能とし、網羅的なタンパク質精製を可能とする技術が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】本発明に係るプロテインタグ（不溶化タグ）及びタグ化タンパク質を説明する図である。

【図2】不溶化タグ及びタグ化タンパク質のプロテアーゼ切断部位を説明する図である。

【図3】不溶化タグにおけるプロテアーゼ切断部位の設計を説明する図である。

【図4】本発明に係るベクターの基本配列を説明する図である。

【図5】本発明に係るタンパク質精製方法の手順の一例を説明する図である。

【図6】多重反応モニタリング（ＭＲＭ：multiple reaction monitoring）の測定原理を説明する図である。

【図7】本発明に係る抗体精製方法の手順の一例を説明する図である。

【図8】不溶化タグを用いてシグナル伝達タンパク質を精製した結果を示す図面代用写真である（実施例１）。

【図9】不溶化タグと蛍光タンパク質との融合タンパク質の蛍光性を評価した結果を示す図面代用グラフである（実施例２）。

【図10】不溶化タグと脱リン酸化酵素との融合タンパク質の酵素活性を評価した結果を示す図面代用グラフである（実施例２）。

【図11】不溶化タグとリン酸化酵素との融合タンパク質の酵素活性を評価した結果を示す図面代用グラフである（実施例２）。

【図12】不溶化タグを用いて網羅的なタンパク質精製を行った結果を示す図面代用グラフである（実施例３）。

【図13】実施例４において作製されたプロテインアレイによる自己抗体の検出結果を示す図面代用写真である（実施例５）。

【図14】実施例４において作製されたプロテインアレイによる自己抗体の検出結果を示す図面代用写真である（実施例５）。

【図15】実施例４において作製されたプロテインアレイによる自己抗体の検出結果を示す図面代用グラフである（実施例５）。

【図16】実施例４において作製されたプロテインアレイによる自己抗体の検出結果を示す図面代用グラフである（実施例５）。

【図17】大腸菌細胞発現系で用いるベクターを説明する図である（実施例６）。

【図18】不溶化タグを用いてタンパク質を精製した結果を示す図面代用写真である（実施例６）。

【図19】不溶化タグのドメインを説明する図である（試験例１）。

【図20】不溶化タグのドメイン化を行った結果を示す図面代用写真である（試験例１）。

【図21】プロテアーゼの切断部位を挿入した不溶化タグを用いたタンパク質精製結果を説明する図面代用写真である（試験例２）。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。

１．プロテインタグ
（１−１）不溶化タグ
（１−２）プロテアーゼによる切断部位の設計
２．タンパク質精製方法
（２−１）融合タンパク質調製手順
（２−１−１）ベクター
（２−１−２）発現系
（２−２）精製手順
３．タグ化タンパク質とその応用
（３−１）タグ化タンパク質
（３−２）質量分析用標準ペプチド
（３−３）抗体精製

【0023】

１．プロテインタグ
（１−１）不溶化タグ
本発明者らは、無細胞発現系（コムギ無細胞系）を用いて高い不溶性を示すタンパク質を網羅的に検索した。その結果、ＭａｆＧタンパク質を見出した。ＭａｆＧタンパク質は、ＨｉｓタグやＧＳＴタグ等の従来用いられている可溶化タグとの融合タンパク質として発現させた場合にも全く可溶性を示さないことが明らかになった。ＭａｆＧタンパク質は、転写因子の一つであり、１６２残基のアミノ酸配列（配列番号１）からなる。ＭａｆＧ遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号５に示す。

【0024】

本発明に係るプロテインタグは、上記のＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列の全長又は一部のアミノ酸配列を含んでなるものである。この、ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列の全長又は一部のアミノ酸配列を含んで構成されるプロテインタグは、ＭａｆＧタンパク質に由来する高い不溶性をタグ化されるタンパク質に付与するものである。すなわち、本発明に係るプロテインタグは、可溶性を有するタンパク質にタグ化されて、タグ化タンパク質全体として不溶化させる「不溶化タグ」として機能する（図１参照）。本発明者らは、キナーゼやフォスファターゼなどの各種酵素及び蛍光タンパク質などに関して、これらのタンパク質をこの不溶化タグとの融合タンパク質として発現させた場合にも、融合タンパク質が酵素活性又は蛍光性を維持することを確認している（実施例２参照）。

【0025】

不溶化タグに含まれるＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列は、ＭａｆＧタンパク質が示す高い不溶性を維持し得る限り、ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列の全配列であっても部分配列であってもよい。また、部分配列とする場合、当該部分配列は、ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列全長の任意の部分であってよく、当該部分配列のアミノ酸残基数も特に限定されない。さらに、不溶化タグは、ＭａｆＧタンパク質が示す高い不溶性を維持し得る限り、ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列の全長又は一部のアミノ酸配列に加えて、そのＮ末端あるいはＣ末端に任意残基数のアミノ酸配列を有していてもよい。

【0026】

また、不溶化タグに含まれるＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列は、ヒトＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）に限定されず、マウスやラットを含む他種ホモログのアミノ酸配列であってもよい。

【0027】

不溶化タグの具体的なアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列を挙げることができる。このアミノ酸配列は、ヒトＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列全長と同一である。また、不溶化タグのアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に１あるいは２以上のアミノ酸を付加したアミノ酸配列であってもよい。

【0028】

さらに、不溶化タグの具体的なアミノ酸配列は、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列としてもよい。このアミノ酸配列は、ヒトＭａｆＧタンパク質の部分配列であって、全長のＮ末端から５６〜１６２残基に対応する。本発明者らは、ヒトＭａｆＧタンパク質のうちＮ末端から５６〜１６２残基の部分が不溶性に寄与していることを見出している（試験例１参照）。また、不溶化タグのアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に１あるいは２以上のアミノ酸を付加したアミノ酸配列であってもよい。

【0029】

（１−２）プロテアーゼによる切断部位の設計
本発明に係る不溶化タグは、タグ化されたタンパク質を後述する質量分析用標準ペプチドの作成に適用するため、ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列の全長又は一部のアミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を含んでなることが好ましい。図２は、不溶化タグ及びタグ化タンパク質のプロテアーゼ切断部位を示す模式図である。不溶化タグのアミノ酸配列中に設計された切断部位を点線で、目的タンパク質のアミノ酸配列に内在する切断部位を一点破線でそれぞれ示す。点線で示す不溶化タグの切断部位には、ＭａｆＧタンパク質に内在する切断部位と、新たに設けられた切断部位との両方が含まれる。

【0030】

挿入するアミノ酸は、プロテアーゼの種類に応じて適宜選択できる。例えば、リシン及びアルギニンのカルボキシル基側に開裂特異性を有するトリプシンの場合、リシン又はアルギニンを挿入する。プロテアーゼとしては、トリプシンの他に、ＬｙｓＣ、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、Ｖ８などが用いられ得る。

【0031】

ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列の全長又は一部のアミノ酸配列に挿入されるプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸の挿入位置は、特に限定されないが、プロテアーゼ処理後に得られるタグ由来ペプチドの長さが６残基以下となるような位置に挿入されることが好ましい。また、切断部位となるアミノ酸の挿入数も特に限定されないものとする。

【0032】

プロテアーゼがトリプシンである場合、不溶化タグの好適なアミノ酸配列として配列番号３に示すアミノ酸配列が挙げられる（図３参照）。配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列に１０残基のアルギニンが挿入された配列であり、配列番号２に示すアミノ酸配列をアルギニンとアルギニンとの間のアミノ酸数が６残基以下となるように改変した配列である。図３に示すアミノ酸配列において、下線を付した「Ｒ」は野生型（Wild-type）のＭａｆＧタンパク質に内在するアルギニンを示し、矢印を付した「Ｒ」は挿入付加されたアルギニン（１０個）を示す。

【0033】

また、配列番号４に示すアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列に１７残基のアルギニンが挿入された配列であり、配列番号３に示すアミノ酸配列に比べてアルギニンとアルギニンとの間のアミノ酸数がさらに少なくなるように改変した配列である。図３に示すアミノ酸配列において、矢印を付した「Ｒ」は、配列番号３に示すアミノ酸配列にさらに挿入付加されたアルギニン（７個）を示す。

【0034】

２．タンパク質精製方法
（２−１）融合タンパク質調製手順
上述の不溶化タグを用いたタンパク質精製方法について説明する。タンパク質精製方法は、融合タンパク質調製手順と精製手順とを含む。

【0035】

融合タンパク質調製手順では、精製対象とする目的タンパク質を不溶化タグとの融合タンパク質として調製する。融合タンパク質は、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列に不溶化タグをコードするＤＮＡ配列をつないで、目的タンパク質を不溶化タグとのフュージョンタンパク質として発現可能に構成されたベクターを発現系に導入することによって得られる。

【0036】

（２−１−１）ベクター
図４に、ベクターの基本配列の一例を示す。図に示すベクターは、目的タンパク質のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡが挿入される位置（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ））の上流（５´側）に、不溶化タグのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（タグ配列）が配置された構成を有している。タグ配列のさらに上流には、転写プロモーター配列と翻訳エンハンサー配列が位置している。転写プロモーター配列及び翻訳エンハンサー配列は、ここではそれぞれＳＰ６プロモーター配列及びコムギ無細胞タンパク質合成系でよく用いられるオメガ配列を例示するが、これらに限定されない。また、タグ配列は、ＯＲＦｓの下流（３´側）に繋ぐこともできる。すなわち、不溶化タグは、Ｎ末端タグとしてもＣ末端タグとしても使用できる。

【0037】

タグ配列及びＯＲＦｓの前後には、遺伝子組換えのための配列を設けても良い。ここでは、タグ配列の上流に制限酵素ＸｈｏＩサイト、下流にＫｐｎＩサイトを設け、ＯＲＦｓの上流にａｔｔＢ１サイト、下流にａｔｔＢ２を設ける例を図示した。

【0038】

（２−１−２）発現系
発現系には、無細胞系あるいは細胞系を用いることができ、特にコムギ無細胞発現系を用いることができる。無細胞系のタンパク質合成系としては、他に、大腸菌、昆虫、ウサギ網状赤血球などが挙げられる。細胞系のタンパク質合成系としては、例えば、大腸菌、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母等が挙げられる。

【0039】

無細胞系による融合タンパク質の発現では、まず、上記のベクターからＰＣＲ等の核酸増幅法によって目的タンパク質とプロテインタグとをコードするＤＮＡ配列（タグ付きｃＤＮＡ）を増幅する。次に、タグ付きｃＤＮＡからインビトロトランスクリプションによってＲＮＡ（タグ付きＲＮＡ）を転写する。そして、タグ付きＲＮＡをコムギ細胞抽出物との混合液としてインビトロトランスレーションを行う（図５参照）。

【0040】

また、細胞系のタンパク質合成系としては、大腸菌、昆虫細胞及び哺乳類細胞を用いた従来公知の系を用いることができる。細胞内への遺伝子導入は、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法及びマイクロインジェクション法などの公知のトランスフェクション法に従って行うことができる。

【0041】

（２−２）精製手順
次に、精製手順において、不溶化タグとのフュージョンタンパク質として発現された目的タンパク質を不溶画分に回収する。不溶化タグによりタグ化された目的タンパク質は、タグ化タンパク質全体として不溶化する。従って、無細胞発現系におけるインビトロトランスレーション後の混合液又は細胞発現系における細胞溶解液などを遠心分離すれば、目的タンパク質を不溶画分にペレットダウンして簡単に回収することができる（図５参照）。

【0042】

遠心分離は定法に従って行うことができるが、一例として１５，０００ｘｇ、２０分、４℃の条件が挙げられる。可溶性タンパク質が夾雑タンパク質として不溶画分へ混入するのを防止するため、遠心分離を行う溶液にはＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を添加することが好ましい。

【0043】

また、不溶化タグによりタグ化された目的タンパク質は、フィルターを用いて、フィルター不透過画分に回収することもできる。無細胞発現系におけるインビトロトランスレーション後の混合液又は細胞発現系における細胞溶解液などを、ポアサイズ０．２２μｍ程度のフィルターに通液させる。これにより、フィルターを透過する可溶性タンパク質と、フィルターに捕捉される目的タンパク質とを分離できる。

【0044】

本発明に係る不溶化タグは、ＭａｆＧタンパク質に由来する高い不溶性をタグ化される目的タンパク質に付与することができ、可溶性の高い目的タンパク質であってもタグ化タンパク質全体として不溶化させることが可能である。従って、この不溶化タグを用いたタンパク質精製方法によれば、アフィニティタグを用いた従来方法と異なり、目的タンパク質をその可溶性の程度（可溶化率）に依存することなく、高い回収率で精製できる。

【0045】

また、本発明に係るタンパク質精製方法では、遠心分離という簡便な手法によってタグ化された目的タンパク質を回収できる。従って、この方法では、従来のアフィニティタグを用いた方法と異なり、融合タンパク質中のタグの親和性の程度（親和性維持率）を問題とせず、常に高い回収率で目的タンパク質を精製できる。

【0046】

さらに、本発明に係るタンパク質精製方法によれば、従来方法では可溶化率又は親和性維持率が低いために精製が困難であったタンパク質であっても精製し得るため、多数のタンパク質をその可溶化率及び親和性維持率によらずに網羅的に合成して精製することが可能である。

【0047】

回収された不溶化タグタンパク質は、界面活性剤による処理や、タンパク質変性剤である７Ｍ塩酸グアニジン又は７Ｍ尿素等による処理、酸又はアルカリ性溶液で可溶化することができる。さらに、本発明に係るタグ化タンパク質は、０．０４〜１％（ｗ／ｖ）の濃度におけるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で可溶化が可能である（試験例３及び４参照）。

【0048】

一般に、不溶化したタンパク質の再可溶化には、グアニジン塩酸塩などの変性力の高いカオトロピック塩を用いる場合や（非特許文献２、非特許文献３）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために２％程度のＳＤＳや還元剤が加えられたいわゆるＳＤＳバッファーを用いる場合も多い。しかし、カオトロピック塩や界面活性剤が高い濃度で含まれる溶媒中では、目的タンパク質が変性して、例えば目的タンパク質が酵素であれば、その酵素活性を保てないことがある。また、カオトロピック塩や界面活性剤が高い濃度で含まれる溶媒で可溶化されたタンパク質を、プロテアーゼなどの酵素を添加して、生化学的なアッセイ等に用いるためには、希釈や透析、限外膜ろ過などを行って溶媒中のカオトロピック塩や界面活性剤の濃度を下げる必要がある。

【0049】

一方、本発明に係るタグ化タンパク質は、例えば、０．０４〜１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳの濃度において可溶化され得る。このため、希釈や透析、限外膜ろ過などの煩雑な作業を行うことなく、不溶化画分に回収されたタグ化タンパク質を次の手順に用いることができる。次の手順とは、例えば、後述するタグ化タンパク質の質量分析用標準ペプチドとしての利用におけるプロテアーゼ処理手順や、タグ化タンパク質のプロテインアレイ基板への結合手順である。

【0050】

３．タグ化タンパク質とその応用
（３−１）タグ化タンパク質
本発明に係るタグ化タンパク質は、上述のタンパク質精製方法によって得られ、不溶化タグによりタグ化されていることを特徴とする。タグ化タンパク質は、使用するベクターの構造によって、目的タンパク質のＮ末端及びＣ末端の少なくとも一方に不溶化タグが繋がれたものとされる。

【0051】

また、本発明に係るタグ化タンパク質は、上述したように、不溶性を示す状態から可溶化することが可能である。このため、本発明は、ＭａｆＧタンパク質の全長又は一部のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、を含んでなるプロテインタグにより、目的タンパク質をタグ化する融合タンパク質調製手順と、タグ化された目的タンパク質を不溶画分に回収する精製手順と、不溶画分に回収されたタグ化された目的タンパク質を溶媒に再可溶化させる可溶化手順を含む、タンパク質製造方法とすることもできる。溶媒としては、０．０４〜１％（ｗ／ｖ）の濃度でＳＤＳを含むものが好ましい。

【0052】

本発明に係る不溶化タグによれば、多数のタンパク質をその可溶化率及び親和性維持率によらずに合成して精製できる。従って、一般に入手可能なｃＤＮＡライブラリーをベクターのＯＲＦｓに挿入して発現クローンライブラリーを作成し、タンパク質の発現及び精製を行うことで、網羅的なタンパク質ライブラリー（インビトロプロテオーム）を調製できる。

【0053】

インビトロプロテオームとして調製したタンパク質ライブラリーは、例えば、プロテインアレイなどへの応用が可能である。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤、塩酸グアニジンや尿素などの変性剤、又は酸またはアルカリ性溶液などを用いてタンパク質を可溶化し、ニトロセルロース膜、各種アレイ基板などの支持体に固定化し、プロテインアレイを作成する。プロテインアレイは、例えば、血清中の自己抗体のスクリーニングなどの用途に利用できる。

【0054】

（３−２）質量分析用標準ペプチド
本発明に係るタグ化タンパク質は、質量分析用標準ペプチド（内部標準用ペプチド）の作成に応用できる。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Liquid chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry）、ＣＥ／ＭＳ／ＭＳ（capillary electrophoresis/mass spectrometry/mass spectrometry）及びＧＣ／ＭＳ／ＭＳ（gas chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry）において、選択反応モニタリング（ＳＲＭ：selected reaction monitoring）及び多重反応モニタリング（ＭＲＭ：multiple reaction monitoring）と称される分析が行われている。ＳＲＭ及びＭＲＭは、極めて特異性が高いため、超微量成分の定量性に優れている。

【0055】

図６に、一般的なＭＲＭの測定原理を示す。ＭＲＭでは、まず、イオン化プローブでイオン化したさまざまなイオンに対し、Ｑ１（第一の質量分析装置）において特定のイオン（プリカーサーイオン）を選択する。次に、コリジョンセル（Ｑ２，衝突室）でプリカーサーイオンを壊し（衝突誘起解離）、Ｑ３（第二の質量分析計）において壊したイオン（プロダクトイオン）の中から特定のイオンを検出する。

【0056】

ＭＲＭでは、一度の測定で複数のチャンネルを設定することができ、クルードなタンパク質（タンパク質粗精製物）中から特定の数種のタンパク質のみを検出して定量することが可能である。ＭＲＭによるタンパク質定量は、定量対象ペプチドと内部標準である安定同位体標識ペプチドとのピークエリア比と検量線から、定量対象ペプチドの絶対量を決定することにより行われる。

【0057】

高精度な定量のためには、定量対象とするタンパク質から生成するペプチドの中からイオン化効率が高いペプチドを内部標準用ペプチドとして予め選定しておく必要がある。内部標準用ペプチドの選定は、定量対象とするタンパク質を実測し、ＭＳ／ＭＳスペクトルを確認しながら行われるため、実測用のために精製された定量対象タンパク質を用意する必要がある。

【0058】

また、内部標準用ペプチドは、タンパク質粗精製物（サンプル）中の定量対象タンパク質に由来するペプチドと区別可能なように安定同位体により標識され、サンプルと混合されて測定に供される。このため、ＭＲＭでは、測定の都度に内部標準用ペプチドを用意する必要がある。

【0059】

本発明に係るタグ化タンパク質は、タンパク質の可溶化率及び融合タンパク質の親和性維持率によらずに全てのタンパク質について合成及び精製が可能であるため、上記の内部標準用ペプチドの選定のためのタンパク質、及び内部標準用ペプチドの調製のためのタンパク質として好適に利用できる。すなわち、精製されたタグ化タンパク質を、プロテアーゼ処理しＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析することで、ＭＲＭに最適な内部標準用ペプチドを選定できる。しかも、予めタグ化タンパク質からタグを取り除くことなく、タグが付加された状態でプロテアーゼ処理を行うことができる。このため、精製のために付加されたタグを精製後のタグ化タンパク質から取り除く作業が不要である。さらに、安定同位体により標識されたタグ化タンパク質をプロテアーゼ処理して得られるペプチド混合物は、ＭＲＭの内部標準用ペプチドとしてそのまま利用が可能である。

【0060】

本発明に係るタグ化タンパク質をＭＲＭ等の内部標準用ペプチドに用いる場合には、プロテインタグを構成するアミノ酸残基の数は、少ない方が好ましい。プロテインタグを構成するアミノ酸残基の数が増加するほど、プロテアーゼ消化産物に含まれるペプチドが長くなりやすく、質量分析において検出されるペプチドが目的タンパク質の測定を妨害しやすくなるためである。従って、ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列において、不溶性に関与する配列番号２を含む部分をプロテインタグとして用いることが好ましい。配列番号２に示すアミノ酸配列をタグとして用いることで、プロテインタグのアミノ酸残基の数を減らし、かつプロテインタグの不溶性を保持することができる。

【0061】

さらに、不溶化タグとして、ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸配列の全長又は一部のアミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列（配列番号３、４参照）を含んでなるものを用いて合成及び精製されたタグ化タンパク質は、好適な利用が可能である。

【0062】

プロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸は、不溶化タグに由来してプロテアーゼ処理後に得られるペプチド（タグ由来ペプチド）の長さが６残基以下となるような位置に挿入されている（図２参照）。プロテアーゼ処理後に得られる不溶化タグ由来ペプチドの長さが６残基以下となるようにしておくことで、タグ化タンパク質をプロテアーゼ処理した内部標準用ペプチドにおいて、タグ由来のペプチドとタンパク質由来のペプチドとを明確に区別できる。そして、その結果、タグ由来のペプチドを内部標準用ペプチドとして誤って選定したり、ＭＲＭ測定時にタグ由来のペプチドがノイズとなったりすることを防止できる。

【0063】

例えば、プロテアーゼとしてトリプシンを用いる場合には、本発明に係るプロテインタグのアミノ酸配列に挿入されるアミノ酸には、アルギニン又はリジンが好ましい。プロテインタグのアミノ酸配列中に、トリプシンの切断部位であるアルギニン又はリジンが増加することによって、プロテインタグに由来するペプチドの長さをより短くすることができる。一方、親水性を有するアミノ酸であるアルギニンやリジンを、不溶性を示すプロテインタグに挿入すると、プロテインタグの性質が変化するおそれがある。

【0064】

配列番号２に示す１０７アミノ酸残基からなるタグプロテインに挿入されるアルギニン残基が、特に１７個未満の場合、タグプロテインの不溶性が保持されつつ、タグプロテイン由来のペプチドの長さをより短くすることができる。このため、１７個未満のアルギニン残基が配列番号２に示すアミノ酸配列に挿入されたプロテインタグは、質量分析における内部標準用ペプチドを精製するために用いるタグとして好適である。特に、配列番号２に示すアミノ酸配列に挿入されるアルギニン残基の数は、１以上１６以下が好ましく、特に６以上１０以下が好ましい。

【0065】

（３−３）抗体精製
また、本発明に係るタグ化タンパク質は、抗体の精製に応用できる。

【0066】

図７を参照して、抗体精製の手順を説明する。まず、精製対象とする抗体（抗タンパク質Ｔ抗体）を含む抗体液とタグ化されたタンパク質Ｔを混合し、遠心分離（例えば１５，０００ｘｇ、２０分、４℃）する。遠心分離後、抗タンパク質Ｔ抗体はタグ化タンパク質Ｔに結合した複合体として沈渣中に分離される。次に、抗体解離バッファーを用いて複合体から抗タンパク質Ｔ抗体を解離させ、再度遠心分離を行う。この遠心分離によって、タグ化タンパク質Ｔは沈渣となり不溶画分に移動するため、上清中に抗タンパク質Ｔ抗体を回収することができる。

【0067】

本発明に係るタグ化タンパク質は、タンパク質の可溶化率及び融合タンパク質の親和性維持率によらずに全てのタンパク質について合成及び精製が可能であるため、全ての抗タンパク質抗体の精製を実現できる。なお、ここでは、遠心分離によってタンパク質‐抗体複合体を分離する例を示したが、フィルター等によるトラップによって複合体を分離することもできる。フィルターによりトラップされた複合体を抗体解離バッファーで処理することにより、複合体から解離した抗タンパク質抗体を溶出させて回収できる。

【実施例】

【0068】

＜実施例１＞
１．不溶化タグを用いたシグナル伝達タンパク質の精製（コムギ無細胞発現系）
本実施例では、コムギ無細胞発現系を用いて、本発明に係る不溶化タグとシグナル伝達タンパク質との融合タンパク質の合成及び精製を行った。

【0069】

シグナル伝達タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列がクローン化されたエントリークローンと、図４に示したコムギ無細胞発現系用の不溶化タグ融合用デスティネーションベクターとを用い、非特許文献１記載の方法に従って、コムギ胚芽抽出液（WEPRO7240、セルフリーサイエンス社）を用いたタンパク質合成を行った。シグナル伝達タンパク質の遺伝子記号（Gene symbol）、パブリックデータベース（GenBank：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）のアクセションナンバー及びエントリークローンの番号（ＩＤ）を「表１」〜「表３」に示す。
合成後の溶液（クルードタンパク質溶液）を、精製時に混入する共雑タンパク質を少なくするためにＰＢＳで４倍に希釈し、１５，０００ｘｇ、２０分間、４℃で遠心分離した。上清画分を除き、得られた沈渣（不溶画分）を精製タンパク質画分とした。
比較のため、ＧＳＴタグ融合用デスティネーションベクターを用いて同様にタンパク質合成を行った。合成後の溶液をＰＢＳで４倍希釈し、グルタチオンレジン（ＧＥファルマシア）に吸着させ、０．８Ｍグルタチオンで溶出し、精製タンパク質を回収した。

【0070】

【表1】

【0071】

【表2】

【0072】

【表3】

【0073】

結果を図８に示す。図８Ａは、ＧＳＴタグを用いて精製したタンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す。図８Ｂは、不溶化タグを用いて精製したタンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す。図８Ｂでは、図８Ａと異なり全てのタンパク質でバンドが確認でき、かつ各タンパク質のバンドが図８Ａに比して濃く観察されている。この結果から、不溶化タグを用いることにより、ＧＳＴタグを用いた従来の精製方法に比して、タンパク質を高率かつ高収量で精製できることが示された。

【0074】

＜実施例２＞
２．不溶化タグを用いた蛍光タンパク質又は酵素の精製
本実施例では、本発明に係る不溶化タグと蛍光タンパク質又は酵素との融合タンパク質を精製し、精製後の融合タンパク質が蛍光性又は酵素活性を維持していることを確認した。

【0075】

実施例１と同様にして、蛍光タンパク質と不溶化タグとの融合タンパク質を合成した。蛍光タンパク質には、ｍＶｅｎｕｓ（ＶｅｎｕｓＡ２０６Ｋ, GenBank accession No. DQ092360.1）を用いた。クルードタンパク質溶液の蛍光（励起波長５１５ｎｍ, 蛍光波長５２８ｎｍ）を測定した結果を図９に示す。

【0076】

不溶化タグを融合した蛍光タンパク質（Ｎ末端タグ）でも、タグ化していない蛍光タンパク質の半分程度の強度の蛍光が確認された。また、Ｃ末端に不溶化タグを融合した蛍光タンパク質でも、蛍光が確認された。

【0077】

また、実施例１と同様にして、脱リン酸化酵素及びリン酸化酵素と不溶化タグとの融合タンパク質を合成した。脱リン酸化酵素には、ＤＵＳＰ３、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ６を用いた。また、リン酸化酵素にはチロシンキナーゼＷＥＥ１、Ｈｃｋ１を用いた。各酵素のパブリックデータベースのアクセションナンバーを「表４」に示す。

【0078】

【表4】

【0079】

以下の方法で、フォスファターゼ活性を測定した。実施例１と同様にしてクルードタンパク質溶液を遠心分離して精製タンパク質画分を得た。精製タンパク質画分については、精製度を高めるために、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ，ｐＨ７．５）による再懸濁と遠心分離を各々２回繰り返して夾雑タンパク質を除去した。遠心分離後のペレットに緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ， ｐＨ７．５）を３．０μｌ添加し、超音波処理を行って懸濁した。懸濁液とｐＮｐｐ発色基質を用いて定法に従って、吸光度測定によりフォスファターゼ活性を測定した。

【0080】

結果を図１０に示す。ＤＵＳＰ３、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ６のそれぞれについて、クルードタンパク質溶液を遠心分離して得た上清画分の酵素活性をグラフ左に、不溶画分（精製タンパク質画分）の酵素活性をグラフ右に示す。いずれの酵素においても、不溶化タグとの融合タンパク質が活性を維持していることが確認された。

【0081】

以下の方法で、チロシンキナーゼ活性を測定した。実施例１と同様にしてクルードタンパク質溶液を遠心分離して得た精製タンパク質画分をＬＤＳサンプルバッファー（ライフテクノロジーズ）に溶解後、ＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム（ライフテクノロジーズ）による電気泳動とウェスタンブロッティングを行い、チロシンキナーゼの自己リン酸化能を評価した。１次抗体にはＰ−Ｔｙｒ−１００抗体（マウスＩｇＧ、セルシグナリング社）、２次抗体には抗マウスＩｇＧ抗体（ヒツジＩｇＧ、ＨＲＰラベル、ＧＥヘルスケア）を用い、ＥＣＬ−ＰＬＵＳ化学発光検出キット（ＧＥヘルスケア）を用いて検出を行った。

【0082】

結果を図１１に示す。レーン１はタグ化していないＷＥＥ１のクルードタンパク質画分、レーン２は不溶化タグ融合ＷＥＥ１のクルードタンパク質溶液、レーン３は不溶化タグ融合ＷＥＥ１の遠心分離した上清画分、レーン４は不溶化タグ融合ＷＥＥ１の遠心分離した沈査の精製タンパク質画分である。また、レーン５はタグ化していないＨｃｋ１のクルードタンパク質画分、レーン６は不溶化タグ融合Ｈｃｋ１のクルードタンパク質溶液、レーン７は不溶化タグ融合Ｈｃｋ１の遠心分離した上清画分、レーン８は不溶化タグ融合Ｈｃｋ１の遠心分離した沈査の精製タンパク質画分である。レーン４、８で抗リン酸化チロンシン抗体（Ｐ−Ｔｙｒ−１００抗体）と結合するバンド（図中丸印参照）が検出されており、いずれの酵素においても不溶化タグとの融合タンパク質が自己リン酸化能を維持していることが確認された。

【0083】

本実施例の結果から、不溶化タグによるタンパク質のタグ化は当該タンパク質の蛍光性及び酵素活性に影響を与えないことが確認された。

【0084】

＜実施例３＞
３．不溶化タグを用いた網羅的なタンパク質精製
本実施例では、本発明に係る不溶化タグを用いて、網羅的なタンパク質精製を行った。

【0085】

実施例１と同様にして、ＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome.jp/kegg/kegg_ja.html）に登録されている代謝系タンパク質の１０２６種類について、不溶化タグとの融合タンパク質を合成し、遠心分画法によって沈査画分に回収して精製を行った。

【0086】

精製されたタンパク質についてタンパク質蛍光プレラベル法による電気泳動定量を行った結果を図１２に示す。タンパク質蛍光プレラベル法は、アミンカップリングによってリジン残基に蛍光色素Ｃｙ５を導入することにより行った。

【0087】

＜実施例４＞
４．プロテインアレイの作製
本実施例では、本発明に係る不溶化タグを用いて精製されたタンパク質を基板に結合して、プロテインアレイを作製した。

【0088】

実施例１と同様にして、表５に示すタンパク質のＯＲＦ配列がクローン化されたエントリークローンを用い、タンパク質（表５参照）と不溶化タグとの融合タンパク質を合成し、遠心分離によって沈渣（不溶画分）を精製タンパク質画分として得た。精製タンパク質画分については、溶解液（０．０４％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．８））に懸濁し、１分程度振とう混和させた後、１分間の超音波処理（高周波出力１６０Ｗ，４０ｋＨｚ）を３回行い、不溶化タグ付きの精製タンパク質の可溶化液を得た。

【0089】

【表5】

【0090】

本実施例のプロテインアレイの基板として、Ａｒｒａｙｉｔ社製のＳｕｐｅｒＮＨＳと、ＧＥヘルスケア社製のＦＡＳＴ Ｓｌｉｄｅ １−Ｐａｄの２種類の基板を用意した。各融合タンパク質を含む可溶化液を微量分注器あるいはピンツールを用いて各基板上にスポット状に付着させ、各基板の提供元のプロトコールに従い、融合タンパク質と基板表面との結合反応を起こさせた。また、後述する実施例５においてネガティブコントロール又はポジティブコントロールとするために、蛍光タンパク質のＶｅｎｕｓと精製ヒトＩｇＧについても、上記の基板に付着させた。

【0091】

基板については、付着させたタンパク質を含む可溶化液を乾燥させた後、ＴＢＳＴ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１３４ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて基板表面を洗浄して、基板表面に結合されなかったタンパク質を取り除き、プロテインアレイを完成させた。

【0092】

＜実施例５＞
５．プロテインアレイによる自己抗体の検出
実施例４において作製されたプロテインアレイを用いて、血清中の自己抗体の検出を行った。

【0093】

自己抗体として抗ＴＲＩＭ２１抗体と抗ＣＴ４５Ａ５抗体とが含まれるヒト血清を用意した。このヒト血清を３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含むＴＢＳＴで１０００倍に希釈し、１次抗体溶液とした。実施例４で作製されたプロテインアレイについては、予め、３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含むＴＢＳＴに室温で１時間浸し、基板表面のブロッキングを行った。ブロッキングの後、基板の表面を１次抗体溶液に浸し、１次抗体溶液を振とうさせながら、室温に１時間置いた。その後、ＴＢＳＴを用いて基板表面を洗浄した。

【0094】

１次抗体溶液に含まれる自己抗体を検出するために、２次抗体として、蛍光色素Ａｌｅｘａ６４７で標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用意し、この抗ヒトＩｇＧ抗体を３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含むＴＢＳＴで１０００倍に希釈したものを２次抗体溶液とした。基板の表面を２次抗体溶液に浸し、２次抗体溶液を振とうさせながら、室温に１時間置いた。その後、ＴＢＳＴを用いて基板表面を洗浄した。２次抗体による処理後、蛍光スキャナーを用いて、励起波長を６３５ｎｍとし、ＳｕｐｅｒＮＨＳのプロテインアレイについてはＰＭＴを４２０Ｖで、ＦＡＳＴ Ｓｌｉｄｅの基板については、ＰＭＴを２００Ｖで、各々基板表面から発せられる蛍光を測定した。

【0095】

本実施例の結果を図１３〜図１６に示す。図１３及び図１４は、基板上の各タンパク質が付着したスポットから発せられる蛍光の測定結果である。図１３は、基板としてＳｕｐｅｒＮＨＳを用いた結果を示し、図１４は、基板としてＦＡＳＴ Ｓｌｉｄｅ １−Ｐａｄを用いた結果を示す。また、図１５は、図１３に示す各スポットの蛍光強度を数値化したグラフであり、図１６は、図１４に示す各スポットの蛍光強度を数値化したグラフである。なお、図１４中矢頭で示すスポットは、基板へのタンパク質の結合が不十分であった部分のため、蛍光の測定対象から除外した。

【0096】

図１３〜図１６に示すように、血清中に自己抗体が含まれるＴＲＩＭ２１及びＣＴ４５Ａ５のスポットでは、２次抗体由来の蛍光が測定された。また、測定された蛍光強度は、基板に付着されたタンパク質の量に比例した。このことは、基板に結合したタンパク質に１次抗体が特異的に結合していることを示している。一方、血清に抗体が含まれていないタンパク質であるＭＧＬＬのスポットについては、測定された蛍光強度が、上記のＴＲＩＭ２１又はＣＴ４５Ａ５のスポットで測定された蛍光強度に比べ低くかった。また、ポジティブコントロールである精製ヒトＩｇＧのスポットでは、ＴＲＩＭ２１と同程度の蛍光強度が測定された。一方、ネガティブコントロールであるＶｅｎｕｓのスポットでは、測定された蛍光強度は、上記のＭＧＬＬのスポットと同程度であった。

【0097】

本実施例の結果から、本発明に係る不溶化タグを用いて精製されたタンパク質は、プロテインアレイを用いた解析において抗体による特異的な検出に適する程度に精製されていることが確認された。従って、本発明に係る不溶化タグを用いて精製されたタンパク質は、基板上に結合させることによって、プロテインアレイに用いることが可能である。

【0098】

＜実施例６＞
６．不溶化タグを用いたタンパク質の精製（大腸菌細胞内発現系）
本実施例では、大腸細胞内発現系を用いて、本発明に係る不溶化タグとＧＳＴとの融合タンパク質の精製を行った。

【0099】

本実施例では、図１７に示す大腸菌発現用ベクター（ｐＤＥＳＴ１５）を用いた。図１７Ａは、不溶化タグが付加されたＧＳＴを合成するためのベクターである。一方、図１７Ｂは、ＧＳＴのみを合成するためのベクターのである。図１７Ａ及び図１７Ｂに示すベクターを大腸菌に導入し、形質転換された大腸菌を得た。形質転換された大腸菌を一晩３７℃で培養し、得られた大腸菌培養液をＯＤ_６００が０．５となるように希釈した後、この希釈液において、濃度が０．１％となるようにＬ−ａｒａｂｉｎｏｓｅを加えて発現誘導を開始した。発現誘導直後（０時間）と発現誘導後３時間の時点で各々希釈液を回収し、遠心分離によって菌体を回収した。

【0100】

得られた菌体に１００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁し、１分間の超音波処理（高周波出力１６０Ｗ，４０ｋＨｚ）を２０回行った。超音波処理の後、菌体を含む懸濁液については、一部をそのままＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。また、懸濁液を１９０００ｘｇ、２０分、４℃で遠心分離し、上清と沈査を得た。これらの上清と沈査についてもＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。

【0101】

本実施例の結果を図１８に示す。発現後３時間において、図１７Ａに示すベクターが導入された大腸菌から得られた懸濁液において、Ｃ末に不溶化タグが付加されたＧＳＴと判断される分子量の位置にバンドが認められた（図１８Ａ、Ｔ参照）。一方、図１７Ｂに示すベクターが導入された大腸菌から得られた懸濁液において、ＧＳＴと判断される分子量の位置にバンドが認められた（図１８Ｂ、Ｔ参照）。

【0102】

また、懸濁液を遠心して得られた上清と沈査については、Ｃ末に不溶化タグが付加されたＧＳＴは、ほぼ全て沈査（図１８Ａ、矢頭参照）に認められた。一方、ＧＳＴは、ほぼ全て上清（図１８Ｂ、矢頭参照）に認められた。

【0103】

本実施例の結果から、本発明に係る不溶化タグは、大腸菌細胞発現系を用いてタンパク質を合成した場合であっても、不溶化タグが付加された融合タンパク質を不溶化させることが確認された。

【0104】

＜試験例１＞
７．不溶化タグのドメイン化
本試験例では、ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸全長のうち、特に不溶性に寄与している部分配列（ドメイン）を同定した。

【0105】

ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸全長を３つのドメインに分割し、ドメインＡをＮ末端から１〜５５番目のアミノ酸、ドメインＢをＮ末端から５６〜１０９番目のアミノ酸、ドメインＣをＮ末端から１１０〜１６２番目のアミノ酸とした（図１９参照）。全長、ドメインＡのみ、ドメインＡ及びドメインＢ、ドメインＢのみ、ドメインＢ及びドメインＣ、ドメインＣのみのアミノ酸配列からなる５種類の不溶化タグを発現可能なベクターを構築した。各不溶化タグのＮ末端にはメチオニンが付加されている。ベクターのＯＲＦｓには、蛍光タンパク質ｍＶｅｎｕｓあるいは可溶性の高いタンパク質であるＧＳＴのｃＤＮＡを挿入した。これらのベクターを用いてコムギ無細胞系で融合タンパク質を合成し、遠心分離後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

【0106】

５種類の不溶化タグ間での回収量を比較した結果を図２０に示す。Ｖｅｎｕｓとの融合タンパク質及びＧＳＴとの融合タンパク質のいずれにおいても、ドメインＢ及びドメインＣのアミノ酸配列からなる不溶化タグ（Ｂ＋Ｃ）は、全長アミノ酸配列からなる不溶化タグ（ＭＧ）と同程度の回収量であった。これに対して、ドメインＡのみ（Ａ）、ドメインＡ及びドメインＢ（Ａ＋Ｂ）、ドメインＢのみ（Ｂ）、ドメインＣのみ（Ｃ）のアミノ酸配列からなる不溶化タグでは、全長アミノ酸配列からなる不溶化タグ（ＭＧ）に比して回収量が減少した。この結果から、ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸全長のうち特にドメインＢ及びドメインＣが不溶性に寄与しており、不溶化タグはドメインＢ及びドメインＣの１０７残基まで縮小化しても機能できることが明らかとなった。

【0107】

＜試験例２＞
８．プロテアーゼ切断部位の挿入
本試験例では、試験例１で得られたドメインＢ及びドメインＣのアミノ酸配列にプロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸を挿入し、不溶化タグのアミノ酸配列の改変を行った。

【0108】

ＭａｆＧタンパク質のアミノ酸全長（配列番号１）からなる不溶化タグをＶｅｒｓｉｏｎ１とし、ドメインＢ及びドメインＣのアミノ酸配列に１０個のアルギニンを挿入したＶｅｒｓｉｏｎ２（配列番号３）、Ｖｅｒｓｉｏｎ２にさらに７個のアルギニンを挿入したＶｅｒｓｉｏｎ３（配列番号４）の不溶化タグを作成した。各不溶化タグの具体的なアミノ酸配列は、図３を参照できる。Ｖｅｒｓｉｏｎ２の不溶化タグは、トリプシン処理後に得られるタグ由来ペプチドの長さが６残基以下となるようにアルギニンを挿入付加したものである。Ｖｅｒｓｉｏｎ３の不溶化タグは、さらに多くのアルギニンを挿入付加したものである。

【0109】

これらの不溶化タグと１２種のタンパク質（表６参照）との融合タンパク質を発現可能なベクターを用いてコムギ無細胞系でタンパク質合成を行い、遠心分離後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って融合タンパク質の回収量を比較した。

【0110】

【表6】

（表中のレーン番号は、図２１中のレーン番号に対応する。パブリックデータベースEnsemblはhttp://asia.ensembl.org/index.htmlを参照できる）

【0111】

結果を図２１に示す。図２１ＡはＶｅｒｓｉｏｎ１、図２１ＢはＶｅｒｓｉｏｎ２、図２１ＣはＶｅｒｓｉｏｎ３の不溶化タグとの融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。Ｖｅｒｓｉｏｎ２の不溶化タグでは、Ｖｅｒｓｉｏｎ１の不溶化タグと同等のタンパク質回収率が得られた。一方、Ｖｅｒｓｉｏｎ３の不溶化タグでは、Ｖｅｒｓｉｏｎ１の不溶化タグに比してタンパク質回収率がやや低下した。この結果から、不溶化タグのアミノ酸配列として試験例１でドメイン化された最短のアミノ酸配列（１０７残基）を用いる場合、プロテアーゼによる切断部位となるアミノ酸の好適な挿入数は１７未満であることが示唆された。挿入するアミノ酸を多くするほどプロテアーゼ処理後に得られるタグ由来ペプチドの長さを短くできるが、多くし過ぎると不溶化タグの不溶性が低下し、融合タンパク質の可溶性が高まって遠心分離による回収効率が低下する場合があることが示唆された。

【0112】

＜試験例３＞
９．タグ化タンパク質の再可溶化条件の検討
不溶化画分として回収された不溶化タグが付加された融合タンパク質（タグ化タンパク質）の再可溶化について、適切な溶媒を検討した。

【0113】

実施例１と同様にして、蛍光タンパク質ｍＶｅｎｕｓ（ＶｅｎｕｓＡ２０６Ｋ, GenBank accession No. DQ092360.1）と不溶化タグとの融合タンパク質を、コムギ無細胞発現系を用いて合成した。また、immunoglobulin heavy chain gamma 3 constant region（ＩｇＨＧ３, GenBank accession No. AK097355）のＯＲＦ配列がクローン化されたエントリークローン（エントリークローンＩＤ FLJ40036AAAF）を用い、IgHG3と不溶化タグとの融合タンパク質を、同じくコムギ無細胞発現系を用いて合成した。

【0114】

合成されたタグ化タンパク質を含む懸濁液については、１９，０００ｘｇ、２０分、４℃の条件で遠心分離を行い、タグ化タンパク質を不溶化画分として回収した。得られた不溶化画分には、表７に示す溶媒のうち、何れか一種類の溶媒を加え、１分間振とう混和後、１分間の超音波処理（高周波出力１６０Ｗ、４０ｋＨｚ）を３回行った。タグ化タンパク質を含む懸濁液を再び１９，０００ｘｇ、２０分、４℃で遠心分離し、上清をタグ化タンパク質の溶解液とした。

【表7】

【0115】

タグ化タンパク質の溶解液については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色し、融合タンパク質に由来するバンドの発色強度を測定した。また、所定の濃度でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＢＳＡ溶解液を用いて、タンパク質の量に対するＣＢＢの発色強度を示す検量線を得た。この検量線に基づき、タグ化タンパク質の溶解液に含まれるタグ化タンパク質の量を算出し、不溶化画分に回収された後に再度可溶化されたタグ化タンパク質の割合を調べた。

【0116】

本試験例の結果を表８に示す。なお、表中「−」は、未検討を示す。表８に示すように、ｍＶｅｎｕｓと不溶化タグとの融合タンパク質は、溶媒２、１１、１２、１５を用いた場合、ほぼ再可溶化することができなかった。また、ＩｇＨＧ３と不溶化タグとの融合タンパク質は、溶媒１、４〜８を用いた場合、ほぼ再可溶化することができなかった。一方、溶媒１０、１８、２３を用いた場合には、両方の融合タンパク質について、不溶化画分に回収された融合タンパク質がほぼ全量再可溶化された。

【0117】

【表8】

【0118】

また、溶媒１６〜２０における可溶化率に示すように、ＳＤＳの濃度が０．０４〜１％（ｗ／ｖ）の範囲で含まれる溶媒を用いた場合、不溶化画分に回収されたＶｅｎｕｓと不溶化タグとの融合タンパク質は、ほぼ全て再可溶化された（表８）。さらに、溶媒２１〜２４における可溶化率に示すように、０．０４％（ｗ／ｖ）の濃度でＳＤＳを含む溶媒では、ｐＨ７．８〜ｐＨ９．２において、タグ化タンパク質の可溶化率が高く、不溶化画分に回収されたＩｇＨＧ３と不溶化タグとの融合タンパク質は、ほぼ全量再可溶化された（表８）。

【0119】

＜試験例４＞
１０．溶媒による不溶化タグとの融合タンパク質の再可溶化
試験例３において検討された溶媒２３（表７参照）について、さらに複数の、不溶化タグとの融合タンパク質（タグ化タンパク質）の再可溶化に適しているか検証した。

【0120】

実施例１と同様にして、表９に示すタンパク質のＯＲＦ配列がクローン化されたエントリークローンを用い、タンパク質（表９参照）と不溶化タグとの融合タンパク質を合成し、遠心分離によって沈渣（不溶画分）を精製タンパク質画分として得た。精製タンパク質画分へ、試験例３と同様に溶媒２３を添加し、タグ化タンパク質の溶解液を得た。溶解液に含まれるタグ化タンパク質の定量は、試験例３と同様に行った。

【0121】

【表9】

【0122】

不溶化タグが付加された２８種類のタンパク質（表９）は、不溶化画分に含まれる量に対しほぼ全量が溶媒２３によって再可溶化された。本試験例の結果から、本発明に係るプロテインタグが付加されたタグ化タンパク質は、不溶化画分に回収された後に、ＳＤＳを０．０４％（ｗ／ｖ）の濃度で含む溶媒を用いることによって再可溶化が可能であることが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0123】

本発明に係るプロテインタグ等によれば、組換えタンパク質を高収率かつ簡便に回収でき、網羅的なタンパク質精製が可能となる。従って、本発明に係るプロテインタグ等は、医学、薬学及び生物学等の分野におけるタンパク質やペプチド、抗タンパク質抗体などを用いた基礎研究及び臨床研究に利用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]