特許 6230103 細胞培養装置および細胞培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6230103

(24)【登録日】2017年10月27日

(45)【発行日】2017年11月15日

(54)【発明の名称】細胞培養装置および細胞培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20171106BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20171106BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20171106BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20171106BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 C

   C12M3/00 A

   C12N1/00 A

   C12N5/07

【請求項の数】5

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2013-211409(P2013-211409)

(22)【出願日】2013年10月8日

(65)【公開番号】特開2015-73468(P2015-73468A)

(43)【公開日】2015年4月20日

【審査請求日】2016年7月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(72)【発明者】

【氏名】杉浦 慎治

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 琢

(72)【発明者】

【氏名】金森 敏幸

【審査官】 北田 祐介

(56)【参考文献】

【文献】 LEE JB et al., Organ-on-a-chip technology and microfluidic whole-body models for pharmacokinetic drug toxicity screening, Biotechnol J. [online], 8(11), p.1258-1266, 2013.08.23, <Retrieved on 2017.06.23>, <URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201300086/abstract>

【文献】 SUGIURA S et al., Pressure-driven perfusion culture microchamber array for a parallel drug cytotoxicity assay, Biotechnol Bioeng. [online], 100(6), p.1156-1165, Epub 2008.02.19, <Retrieved on 2017.06.23>, <URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.21836/abstract>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｍ ３／００

Ｃ１２Ｎ ５／０７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体培地を貯留する密閉構造の第１貯留槽および第２貯留槽と、
前記第１貯留槽と前記第２貯留槽とを互いに連通する１または複数の連絡用流路、および、１または複数の培養用流路が形成された流路デバイスと、
前記連絡用流路から前記第１貯留槽への前記液体培地の流れを許容し、かつ前記第１貯留槽から前記連絡用流路への前記液体培地の流れを阻止する第１逆止弁と、
前記培養用流路から前記第２貯留槽への前記液体培地の流れを許容し、かつ前記第２貯留槽から前記培養用流路への前記液体培地の流れを阻止する第２逆止弁と、
前記第１貯留槽および第２貯留槽内を加圧可能な加圧手段と、を備え、
前記培養用流路は、前記第１貯留槽から導入された液体培地によって細胞を培養するとともに、前記液体培地を前記第２貯留槽に向けて流通させ、
前記加圧手段は、異なる加圧用経路でそれぞれ前記第１貯留槽と前記第２貯留槽とに接続され、前記加圧用経路を通して前記第１貯留槽と前記第２貯留槽とを個別に加圧可能であることを特徴とする細胞培養装置。

【請求項2】

前記第１貯留槽および第２貯留槽は、液体培地を貯留する容器状の槽本体と、前記槽本体の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養装置。

【請求項3】

前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、
前記蓋部押圧部は、前記槽本体を支持する基体部と、基体部に支持された前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材とを有することを特徴とする請求項２に記載の細胞培養装置。

【請求項4】

前記複数の培養用流路は、共通の前記第１貯留槽に接続され、
前記複数の連絡用流路は、共通の前記第１貯留槽および前記第２貯留槽に接続されていることを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【請求項5】

請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置を用いて細胞を培養する方法であって、
前記加圧手段によって前記第１貯留槽内を加圧することにより、前記第１貯留槽内の液体培地を前記培養用流路に導入して、前記培養用流路の内面に付着した細胞を培養するとともに、前記液体培地を前記第２貯留槽に向けて流通させる第１工程と、
前記加圧手段によって、前記第２貯留槽内を加圧することにより、前記第２貯留槽内の液体培地を、前記連絡用流路を通して前記第１貯留槽に導入する第２工程と、を有することを特徴とする細胞培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞を培養する装置およびこれを用いて細胞を培養する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体内において生理的な環境下で機能を発現している細胞は、生体外で培養する際には培養環境を整えることが重要である。
このような細胞として、血管内皮細胞がある。血管内皮細胞は、血管生物学に関する学術研究や、血管をターゲットとした薬剤の開発のために培養される。
血管内皮細胞は、体内では血流の剪断力に応答してその機能を発現しているため、理想的には剪断力がかかる環境下で培養されるのが好ましいが、そのような培養環境を整えるのは容易ではなく、マイクロプレートを用いた静置培養が行われることが多い。
この問題に対応すべく、液体培地の送入により剪断力が加えられる環境下で血管内皮細胞を培養できるマイクロ流体デバイスが開発されている（非特許文献１、２を参照）。また、液体培地を低速で灌流しながら培養することができる、圧力駆動のマイクロ流体デバイスも報告されている（非特許文献３を参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】K. Hattori et al., Proc. ISMM, P-I-70 (2013)

【非特許文献2】M. Y. Rotenberg et al., Lab Chip, 11, 4235-4240 (2011)

【非特許文献3】S. Sugiura et al., Biotechnol. Bioeng. 100, 1156-1165 (2008)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

前述のマイクロ流体デバイスでは、外部動力源（シリンジポンプやペリスタポンプなど）により液体培地の送液を行っている。
しかしながら、外部動力源を用いた培養は、多数のアッセイを並列的に行おうとすると、その数だけ外部動力源が必要となり、装置構成が複雑になるという問題がある。
また、剪断力を付与するには液体培地の流動が必要となる。例えばシリンジポンプを用いる場合は長期間にわたって多量の液体培地を流すために、大量の液体培地の用意、もしくは頻繁な液体培地の補充が必要となる。このため、現実的には多数のアッセイを並列的に行うことは困難である。この問題は圧力駆動のマイクロ流体デバイスを用いた場合も同様である。
ペリスタポンプを用いる場合も、外部装置に液体培地を循環させるために大量の液体培地を必要とする。また、無菌的に液体培地を循環する流路を構築する作業は煩雑である。
本発明は、前記事情に鑑みてなされたもので、構造が簡略であり、かつ細胞に剪断力を加えつつ培養を行うことができる細胞培養装置および細胞培養方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の構成は以下のとおりである。
（１）液体培地を貯留する密閉構造の第１および第２貯留槽と、前記２つの貯留槽を互いに連通する１または複数の連絡用流路、および、１または複数の培養用流路が形成された流路デバイスと、前記連絡用流路から前記第１貯留槽への前記液体培地の流れを許容し、かつ前記第１貯留槽から前記連絡用流路への前記液体培地の流れを阻止する第１逆止弁と、前記培養用流路から前記第２貯留槽への前記液体培地の流れを許容し、かつ前記第２貯留槽から前記培養用流路への前記液体培地の流れを阻止する第２逆止弁と、前記第１および第２貯留槽内を加圧可能な加圧手段と、を備え、前記培養用流路は、前記第１貯留槽から導入された液体培地によって細胞を培養するとともに、前記液体培地を前記第２貯留槽に向けて流通させる細胞培養装置。
（２）前記第１および第２貯留槽は、液体培地を貯留する容器状の槽本体と、前記槽本体の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部とを有する（１）に記載の細胞培養装置。
（３）前記蓋部を前記槽本体に向けて押さえつけて保持する蓋部押圧部をさらに備え、前記蓋部押圧部は、前記槽本体を支持する基体部と、基体部に支持された前記槽本体に向けて前記蓋部を押圧する押圧部材とを有する（１）または（２）に記載の細胞培養装置。
（４）前記複数の培養用流路は、共通の前記第１貯留槽に接続され、前記複数の連絡用流路は、共通の前記第１貯留槽および前記第２貯留槽に接続されている（１）〜（３）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置。
（５）（１）〜（４）のうちいずれか１つに記載の細胞培養装置を用いて細胞を培養する方法であって、前記加圧手段によって、前記第１貯留槽内を加圧することにより、前記第１貯留槽内の液体培地を前記培養用流路に導入して、前記培養用流路の内面に付着した細胞を培養するとともに、前記液体培地を前記第２貯留槽に向けて流通させる第１工程と、前記加圧手段によって、前記第２貯留槽内を加圧することにより、前記第２貯留槽内の液体培地を、前記連絡用流路を通して前記第１貯留槽に導入する第２工程と、を有する細胞培養方法。

【発明の効果】

【0006】

本発明によれば、装置構造が簡単であるため、コストを抑制するとともに、操作を容易にすることができる。よって、容易な操作で細胞に剪断力を加えつつ培養を行うことができる。
また、液体培地を、第１貯留槽と培養用流路と第２貯留槽との間で循環使用するため、液体培地の使用量を削減でき、かつ無菌的操作も容易になる。このため、複数の試験を並列的に行うのが容易となり、創薬スクリーニング等において効率の高い試験が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】本発明の一実施形態にかかる細胞培養装置を示す模式図である。

【図2】図１の細胞培養装置の動作を示す模式図である。

【図3】図１の細胞培養装置を示す斜視図である。

【図4】図１の細胞培養装置を示す分解斜視図である。

【図5】図１の細胞培養装置の槽本体を示す平面図である。

【図6】図１の細胞培養装置の槽本体を示す斜視図である。

【図7】図１の細胞培養装置の蓋部を示す斜視図である。

【図8】図１の細胞培養装置の槽本体とマイクロチップを示す平面図である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

［細胞培養装置］
以下、本発明の一実施形態である細胞培養装置１０について、図面を参照して説明する。
図１および図４に示すように、細胞培養装置１０は、液体培地Ｍ１を貯留する貯留槽１１と、マイクロチップ３（流路デバイス）と、第１貯留槽１と連絡用流路３２との間の液体培地Ｍ１の流れを調整する第１逆止弁４と、第２貯留槽２と培養用流路３１との間の液体培地Ｍ１の流れを調整する第２逆止弁５と、貯留槽１、２内を加圧可能な加圧ポンプ６（加圧手段）と、貯留槽１、２の蓋部１３を押さえつけて保持するホルダ７（蓋部押圧部）と、を備えている。

【0009】

図３および図４に示すように、貯留槽１１は、液体培地Ｍ１を貯留する容器状の槽本体１２と、貯留槽１１の開口を開閉自在かつ気密に閉止する蓋部１３とを備えている。
図５および図６に示すように、槽本体１２は、平面視矩形（詳しくは長方形）の底壁１４と、底壁１４の長辺である側縁部１４ａ、１４ａに立設された側壁１５、１５と、底壁１４の短辺である端縁部１４ｂ、１４ｂに立設された端壁１６、１６と、側壁１５、１５の間に設けられた隔壁１７とを備えている。
以下、一方の側壁１５を第１側壁１５Ａといい、他方の側壁１５を第２側壁１５Ｂということがある。また、一方の端壁１６を第１端壁１６Ａといい、他方の端壁１６を第２端壁１６Ｂということがある。
図１等において、Ｘ方向は底壁１４の長手方向であり、側縁部１４ａの延在方向である。Ｙ方向は底壁１４に平行な面内でＸ方向に直交する方向であって、端縁部１４ｂの延在方向である。Ｚ方向はＸ方向およびＹ方向と直交する高さ方向である。

【0010】

図５および図６に示すように、隔壁１７は、一方の端壁１６Ａの内面から他方の端壁１６Ｂの内面にかけて形成されており、側壁１５と平行であって、側壁１５と同じ高さとすることができる。
隔壁１７は、底壁１４、側壁１５および端壁１６で囲まれた内部空間１８を２つの空間１ａ、２ａに分割している。
図示例では、隔壁１７は、端壁１６Ａ、１６Ｂの幅方向（Ｙ方向）の中央に設けられており、２つの空間１ａ、２ａの形状および大きさは互いに等しい。

【0011】

底壁１４と、側壁１５Ａと、端壁１６、１６と、隔壁１７とを有し、これらに囲まれた直方体状の内部空間１ａを有する構造を第１貯留槽１という。第１貯留槽１の上部開口を第１開口１９ａという。
底壁１４と、側壁１５Ｂと、端壁１６、１６と、隔壁１７とを有し、これらに囲まれた直方体状の内部空間２ａを有する構造を第２貯留槽２という。第２貯留槽２の上部開口を第２開口１９ｂという。
第１および第２貯留槽１、２は、それぞれ内部空間１ａ、２ａに液体培地Ｍ１を貯留できる。

【0012】

図１、図５、図６および図８に示すように、側壁１５と隔壁１７との間に、１または複数の補強用の補強壁部２０を設けてもよい。これによって、槽本体１２の構造的な強度を高めることができる。
補強壁部２０は、端壁１６に平行に、端壁１６から離れた位置に形成されている。
図示例では、側壁１５Ａと隔壁１７との間、および側壁１５Ｂと隔壁１７との間に、それぞれＸ方向に間隔をおいて２つの補強壁部２０が形成されている。
側壁１５Ａと隔壁１７との間の補強壁部２０（第１貯留槽１内の補強壁部２０）を補強壁部２０Ａといい、側壁１５Ｂと隔壁１７との間の補強壁部２０（第２貯留槽２内の補強壁部２０）を補強壁部２０Ｂという。

【0013】

第１貯留槽１は、補強壁部２０によってＸ方向に並ぶ３つの空間に区画されている。これらの空間をそれぞれ第１〜第３区画２７ａ〜２７ｃという。
第１〜第３区画２７ａ〜２７ｃ内の底壁１４には、それぞれ、導入用流路３３に通じる導出口３６（３６ａ〜３６ｃ）と、連絡用流路３２（３２ａ〜３２ｃ）に通じる導入口３８（３８ａ〜３８ｃ）とが形成されている。

【0014】

第２貯留槽２は、補強壁部２０によってＸ方向に３つの空間に区画されている。これらの空間をそれぞれ第１〜第３区画２８ａ〜２８ｃという。
第１〜第３区画２８ａ〜２８ｃ内の底壁１４には、それぞれ、導出用流路３４（３４ａ〜３４ｃ）に通じる導入口３７（３７ａ〜３７ｃ）と、連絡用流路３２（３２ａ〜３２ｃ）に通じる導出口３９（３９ａ〜３９ｃ）とが形成されている。

【0015】

補強壁部２０は、側壁１５、端壁１６および隔壁１７に比べて低く形成することができる。側壁１５、端壁１６および隔壁１７の上部には補強壁部２０がないため、第１貯留槽１の上部において、第１〜第３区画２７ａ〜２７ｃは互いに連通している。このため、これら第１〜第３区画２７ａ〜２７ｃ内を均圧化できる。
同様に、第２貯留槽２の上部において、第１〜第３区画２８ａ〜２８ｃは互いに連通しているため、これら第１〜第３区画２８ａ〜２８ｃ内を均圧化できる。

【0016】

図４および図７に示すように、蓋部１３は、矩形の板状体とすることができる。図示例の蓋部１３は、長さ寸法（Ｘ方向の寸法）および幅寸法（Ｙ方向の寸法）が底壁１４とほぼ同じである。
蓋部１３の下面１３ａ（図７参照）は、側壁１５、端壁１６および隔壁１７の上縁部１５ｃ、１６ｃ、１７ｃ（図４参照）に隙間なく当接して貯留槽１、２の開口１９ａ、１９ｂを気密に閉止することができる。
蓋部１３が開口１９ａ、１９ｂを気密に閉止する構造としては、蓋部１３の下面１３ａが直接、上縁部１５ｃ、１６ｃ、１７ｃに当接する構造であってもよいし、パッキン（図示略）を介して上縁部１５ｃ、１６ｃ、１７ｃに当接する構造であってもよい。

【0017】

図４に示すように、蓋部１３の端縁部１３ｂ、１３ｂの上面１３ｃには、端縁部１３ｂ、１３ｂの全長にわたってそれぞれ切欠き２１、２１が形成されている。切欠き２１、２１が形成された部分は薄肉部２２、２２となっている。切欠き２１、２１によって形成された段部２３には、後述する押圧バー４２が係止可能である。

【0018】

図７に示すように、蓋部１３の下面１３ａには、下面１３ａと上縁部１５ｃ、１６ｃ、１７ｃとの間に設けられるパッキン（図示略）を係止する係止凸部２４ａ、２４ｂを設けてもよい。
係止凸部２４ａ、２４ｂの形状は、これらの外周縁に係止するパッキン（図示略）が、それぞれ第１開口１９ａおよび第２開口１９ｂを包囲可能となるように定められる。
係止凸部２４ａ、２４ｂの下面には、第１開口１９ａおよび第２開口１９ｂに入り込むことができる嵌合凸部２５ａ、２５ｂを形成してもよい。嵌合凸部２５ａ、２５ｂを形成することによって、蓋部１３を槽本体１２に対して位置合わせするのが容易となる。

【0019】

蓋部１３には、第１貯留槽１および第２貯留槽２内に気体を送入し、貯留槽１、２内の圧力を高めるための第１および第２の気体供給孔２６ａ、２６ｂを形成することができる。
第１の気体供給孔２６ａは、一端２６ａ１が蓋部１３の一方の側面１３ｄに開口し、他端２６ａ２が係止凸部２４ａの下面に開口しているため、第１の気体供給孔２６ａを通して内部空間１ａに気体を送入できる。
第２の気体供給孔２６ｂは、一端２６ｂ１が蓋部１３の側面１３ｄに開口し、他端２６ｂ２が係止凸部２４ｂの下面に開口しているため、第２の気体供給孔２６ｂを通して内部空間２ａに気体を送入できる。

【0020】

槽本体１２および蓋部１３は、例えば樹脂（プラスチック）、ガラス等が使用できる。培養用流路３１内の培養細胞を光学的に観察することが容易であることから、前記材料は透明材料であることが好ましく、具体的には樹脂およびガラスが好ましい。
樹脂としては、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ）)、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ））、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）、ポリビニルピリジン系樹脂（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、ポリオレフィン系樹脂（例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂）、ポリエステル樹脂（ポリエチレンテレフタレート樹脂（ＰＥＴ））、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
なかでも、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ）)、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ））、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）は、高い透明性を有するため好ましい。

【0021】

貯留槽１１は、槽本体１２と、槽本体１２の開口１９ａ、１９ｂを開閉自在に閉止する蓋部１３とを備えた構造であるため、液体培地Ｍ１や洗浄液を貯留槽１、２に注入または排出する作業が容易になる。

【0022】

図１および図８に示すように、マイクロチップ３は、細胞を培養する培養用流路３１（３１ａ〜３１ｃ）、第１貯留槽１と第２貯留槽２との間を連絡する連絡用流路３２（３２ａ〜３２ｃ）、第１貯留槽１内の液体培地Ｍ１を培養用流路３１に導く導入用流路３３（３３ａ〜３３ｃ）、および、培養用流路３１内の液体培地Ｍ１を第２貯留槽２に導く導出用流路３４（３４ａ〜３４ｃ）が形成されている。

【0023】

図８に示すように、培養用流路３１は、３つの培養用流路３１ａ〜３１ｃを有する。培養用流路３１ａ〜３１ｃは、互いにＸ方向に位置を違えて形成されている。
培養用流路３１ａ〜３１ｃは、それぞれ、Ｙ方向に沿って直線的に延在する直線部３１ｄと、折返し部３１ｅとが繰り返される蛇行構造となっている。

【0024】

培養用流路３１ａ〜３１ｃの一端部３１ｆは、それぞれ導入用流路３３ａ〜３３ｃによって、第１貯留槽１の第１〜第３区画２７ａ〜２７ｃの導出口３６（３６ａ〜３６ｃ）に通じている。このため、培養用流路３１ａ〜３１ｃは、導入用流路３３ａ〜３３ｃを介して第１貯留槽１に接続されている。
培養用流路３１ａ〜３１ｃの他端部３１ｇは、それぞれ導出用流路３４ａ〜３４ｃによって、第２貯留槽２の第１〜第３区画２８ａ〜２８ｃの導入口３７（３７ａ〜３７ｃ）に通じている。このため、培養用流路３１ａ〜３１ｃは、導出用流路３４ａ〜３４ｃを介して第２貯留槽２に接続されている。
なお、培養用流路３１ａ〜３１ｃの一端部３１ｆは、直接、第１貯留槽１の導出口３６に接続されていてもよい。他端部３１ｇは、直接、第２貯留槽２の導入口３７に接続されていてもよい。

【0025】

培養用流路３１は、マイクロチップ３の内部に形成された細胞培養用の流路であって、幅Ｗ１は、例えば幅０．１〜５ｍｍとすることができる。
培養用流路３１の断面積は、例えば０．１ｍｍ^２〜１０ｍｍ^２とすることができる。
培養用流路３１は、ここに示したマイクロチップ３の構成に限られない。培養用流路の形状や大きさや数、流路の幅、深さ、経路、数等は、細胞培養装置の用途などに応じて適宜設計することができる。

【0026】

連絡用流路３２は、３つの連絡用流路３２ａ〜３２ｃを有する。連絡用流路３２ａ〜３２ｃは、互いにＸ方向に位置を違えて形成されている。
連絡用流路３２ａ〜３２ｃの一端部は、それぞれ第１貯留槽１の第１〜第３区画２７ａ〜２７ｃの導入口３８（３８ａ〜３８ｃ）に通じている。
連絡用流路３２ａ〜３２ｃの他端部は、それぞれ第２貯留槽２の第１〜第３区画２８ａ〜２８ｃの導出口３９（３９ａ〜３９ｃ）に通じている。
このため、連絡用流路３２ａ〜３２ｃは、第１貯留槽１と第２貯留槽２とを連通する流路である。

【0027】

マイクロチップ３は、例えば、流路３１〜３４となる溝状凹部を有する基板に天板を重ね合わせることにより作製することができる。
基板および天板の材料は特に制限されず、例えば樹脂（プラスチック）、ガラス等が使用できる。培養細胞を光学的に観察することが容易であることから、前記材料は透明材料であることが好ましく、具体的には樹脂およびガラスが好ましい。
樹脂としては、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ）)、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ））、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）、ポリビニルピリジン系樹脂（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、ポリオレフィン系樹脂（例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂）、ポリエステル樹脂（ポリエチレンテレフタレート樹脂（ＰＥＴ））、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
なかでも、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン(ＰＤＭＳ）)、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ））、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン）は、高い透明性を有するため好ましい。

【0028】

溝状凹部を有する基板は、レプリカモールディング法によって形成することができる。溝状凹部を形成するには、ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）、レーザー加工、ＮＣ加工、光造形加工、射出成型加工、ナノインプリント加工などを採用してもよい。

【0029】

図１および図８に示すように、第１逆止弁４は、底壁１４に、それぞれ導入口３８（３８ａ〜３８ｃ）を閉止可能に設置されている。
具体的には、第１逆止弁４は、第１貯留槽１の第１〜第３区画２７ａ〜２７ｃ内の底壁１４上に、導入口３８（３８ａ〜３８ｃ）を開閉できるように設置される。
図１および図２に示すように、第１逆止弁４は、連絡用流路３２（３２ａ〜３２ｃ）から第１貯留槽１への液体培地Ｍ１の流れを許容し、かつ第１貯留槽１から連絡用流路３２（３２ａ〜３２ｃ）への液体培地Ｍ１の流れを阻止する。

【0030】

図１および図８に示すように、第２逆止弁５は、底壁１４に、それぞれ導入口３７（３７ａ〜３７ｃ）を閉止可能に設置されている。
具体的には、第２逆止弁５は、第２貯留槽２の第１〜第３区画２８ａ〜２８ｃ内の底壁１４上に、導入口３７（３７ａ〜３７ｃ）を開閉できるように設置される。
図１および図２に示すように、第２逆止弁５は、導出用流路３４（３４ａ〜３４ｃ）から第２貯留槽２への液体培地Ｍ１の流れを許容し、第２貯留槽２から導出用流路３４（３４ａ〜３４ｃ）への液体培地Ｍ１の流れを阻止する。
なお、第１および第２逆止弁４、５は、底壁１４に設けてもよいが、マイクロチップ３に設けてもよい。

【0031】

図３および図４に示すように、ホルダ７は、槽本体１２を支持する基体部４１と、基体部４１に支持された槽本体１２に向けて蓋部１３を押圧する一対の押圧バー４２（押圧部材）とを有する。
図４に示すように、基体部４１は、略矩形（詳しくは略長方形）の薄板状の底板部４３と、底板部４３の上面に高さ方向に突出して形成された厚肉部４４とを有する。

【0032】

厚肉部４４は、底板部４３の１つの側縁部４３ａに形成された側縁凸部４４ａと、底板部４３の２つの端縁部４３ｂ、４３ｂに形成された端縁凸部４４ｂ、４４ｂとを有する。
側縁凸部４４ａおよび端縁凸部４４ｂ、４４ｂは、それぞれ底板部４３の側縁部４３ａおよび端縁部４３ｂ、４３ｂに沿って形成されている。
端縁凸部４４ｂ、４４ｂの両端面には、それぞれ押圧バー４２の端部が挿入される挿入穴４４ｃが形成されている。
厚肉部４４によって囲まれた内部空間は、槽本体１２の下部およびマイクロチップ３の一部を収容する収容凹部４５となっている。
基体部４１は、金属や樹脂で構成することができる。

【0033】

図３および図４に示すように、押圧バー４２は、例えば金属などで構成されており、中央部には、蓋部１３を押圧するための凸状曲げ部４５が形成されている。凸状曲げ部４５は、端縁凸部４４ｂに近づく方向に凸状に曲げられて形成されている。
押圧バー４２は、両端部を厚肉部４４の挿入穴４４ｃに挿入した状態で、この挿入部分を支点として、端縁凸部４４ｂに沿う中心軸の軸周り方向に回動可能となっている。
図３に示すように、押圧バー４２は、凸状曲げ部４５を蓋部１３の切欠き２１内に配置し、段部２３に係止させることができる。これによって、蓋部１３を槽本体１２に対して押圧し、貯留槽１１を確実に密封状態とすることができる。

【0034】

図１に示すように、加圧ポンプ６は、第１および第２の送気経路４６ａ、４６ｂにより第１貯留槽１および第２貯留槽２に接続され、貯留槽１、２に気体（例えば空気）を供給して貯留槽１、２内を加圧できる。
送気経路４６ａ、４６ｂは、例えば貯留槽１１の蓋部１３の気体供給孔２６ａ、２６ｂの一端２６ａ１、２６ｂ１に接続することができる。

【0035】

［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０を用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
本発明において培養する細胞は、特に限定されず、例えばヒトを含む動物由来の細胞、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を目的に応じて使用できるが、特に好適な細胞の例として、血管内皮細胞がある。

【0036】

培養に用いられる液体培地としては、特に限定されないが、血管内皮細胞を培養する場合は血管内皮細胞専用の培地がより好ましい。市販されている血管内皮細胞用の培地としては、Endothelial cell basal medium (HuMedia-EG2) （商品名）（クラボウ社製）、 EGM-2 BulletKit（商品名）（Lonza社製）等が挙げられる。

【0037】

（予備工程）
培養用流路３１に細胞を接着させるために細胞間基質(ＥＣＭ)が必要である場合は、この予備工程を実施することが好ましい。
図１に示すように、第１貯留槽１に、細胞間基質(ＥＣＭ)を含有する液（ＥＣＭ含有液）を充てんし、加圧ポンプ６からの気体供給により第１貯留槽１を加圧することによって、ＥＣＭ含有液を導入用流路３３から培養用流路３１に導入し、所定時間放置する。
第１貯留槽１に気体を送り込み、この気体を培養用流路３１に送入することによって、ＥＣＭ含有液を培養用流路３１から除去し、導出用流路３４を通して第２貯留槽２に導入し、排出する。
次いで、同様の手法により、ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）で貯留槽１、２および流路３１〜３４を洗浄する。
なお、細胞間基質(ＥＣＭ)がなくても培養用流路３１への十分な細胞の接着強度が得られる場合には、この予備工程はなくてもよい。

【0038】

（細胞接着工程）
第１貯留槽１に細胞懸濁液を充てんし、加圧ポンプ６からの気体供給により第１貯留槽１に気体を送入することによって、細胞懸濁液を導入用流路３３から培養用流路３１に導入し、所定時間静置して細胞を培養用流路３１の内面に接着させる。

【0039】

（細胞培養工程）
（第１サブ工程）
図１に示すように、液体培地Ｍ１を第１貯留槽１に充てんする。
加圧ポンプ６を稼働させ、第１送気経路４６ａを通して第１貯留槽１に気体（例えば空気）を供給して第１貯留槽１内を加圧する。この際、第２貯留槽２は、気体供給孔２６ｂを通して大気に開放しておくことが好ましい。
第１貯留槽１内の圧力上昇によって、第１貯留槽１内の液体培地Ｍ１は、導出口３６、導入用流路３３を通って培養用流路３１に導入され、培養用流路３１内を流通する。液体培地Ｍ１は、導出用流路３４を通って第２貯留槽２に導入される。
導入口３８には第１逆止弁４が設けられているため、液体培地Ｍ１が第１貯留槽１から連絡用流路３２に流入することはない。

【0040】

（第２サブ工程）
加圧ポンプ６による第１貯留槽１への気体供給を停止するとともに、加圧ポンプ６によって、第２送気経路４６ｂを通して第２貯留槽２に気体を供給して第２貯留槽２内を加圧する。この際、第１貯留槽１は、気体供給孔２６ａを通して大気に開放しておくことが好ましい。
第２貯留槽２内の圧力上昇によって、第２貯留槽２内の液体培地Ｍ１は、導出口３９、連絡用流路３２を通って第１貯留槽１に導入される。
導入口３７には第２逆止弁５が設けられているため、液体培地Ｍ１が第２貯留槽２から導出用流路３４に流入することはない。
第２サブ工程では、液体培地Ｍ１が第１貯留槽１に導入されるため、十分量の液体培地Ｍ１が第１貯留槽１内に確保される。

【0041】

第１および第２サブ工程を繰り返すことによって、液体培地Ｍ１を培養用流路３１に循環させることができる。このため、剪断力が加えられる環境下で細胞の培養を行うことができる。
細胞に与えられる剪断応力（ずり応力）は、例えば１〜１００ｄｙｎ／ｃｍ^２となる。

【0042】

第１サブ工程と第２サブ工程との間には、貯留槽１、２の両方を大気に開放する第３のサブ工程を設けてもよい。これによって、各流路の寸法が設計値から外れている場合でも、貯留槽１、２の液体培地Ｍ１の貯留量の偏りを是正できる。

【0043】

細胞培養装置１０では、構造が簡単であるため、コストを抑制するとともに、操作を容易にすることができる。よって、容易な操作で細胞に剪断力を加えつつ培養を行うことができる。
また、液体培地Ｍ１を第１貯留槽１と培養用流路３１と第２貯留槽２との間で循環使用するため、液体培地Ｍ１の使用量を削減でき、かつ無菌的操作も容易になる。このため、複数の試験を並列的に行うのが容易となり、創薬スクリーニング等において効率の高い試験が可能である。

【0044】

細胞培養装置１０では、マイクロチップ３に流路３１〜３４がそれぞれ複数（図示例では３つ）形成されているため、複数の試験を並列的に行うことができる。また、第１貯留槽１および第２貯留槽２は共通であるため、装置構成は簡略である。

【0045】

上述の実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
例えば、図８等に示す細胞培養装置１０のマイクロチップ３では、培養用流路３１、連絡用流路３２、導入用流路３３、および導出用流路３４は、それぞれ３つ形成されているが、各流路の数は３に限らず、１または２でもよいし、４以上であってもよい。

【産業上の利用可能性】

【0046】

本発明は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。特に、医薬品の開発、細胞生物学の基礎研究に有用である。

【符号の説明】

【0047】

１・・・第１貯留槽、２・・・第２貯留槽、３・・・マイクロチップ（流路デバイス）、４・・・第１逆止弁、５・・・第２逆止弁、６・・・加圧ポンプ（加圧手段）、７・・・ホルダ（蓋部押圧部）、１０・・・細胞培養装置、１２・・・槽本体、１３・・・蓋部、１９ａ・・・第１開口、１９ｂ・・・第２開口、３１、３１ａ〜３１ｃ・・・培養用流路、３２、３２ａ〜３２ｃ・・・連絡用流路、３３、３３ａ〜３３ｃ・・・導入用流路、３４、３４ａ〜３４ｃ・・・導出用流路、４２・・・押圧バー（押圧部材）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】