特許 6236660 植物の生育促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6236660

(24)【登録日】2017年11月10日

(45)【発行日】2017年11月29日

(54)【発明の名称】植物の生育促進剤

(51)【国際特許分類】

   A01G 7/00 20060101AFI20171120BHJP

   A01C 1/00 20060101ALI20171120BHJP

   C12N 1/00 20060101ALN20171120BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20171120BHJP

【ＦＩ】

   A01G7/00 605Z

   A01C1/00 A

   !C12N1/00 P

   !C12N1/20 A

【請求項の数】4

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2013-146402(P2013-146402)

(22)【出願日】2013年7月12日

(65)【公開番号】特開2015-15933(P2015-15933A)

(43)【公開日】2015年1月29日

【審査請求日】2016年3月2日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （１）平成２５年１月２８日 東北大学大学院生命科学研究科及び国立大学法人東北大学の「平成２４年度東北大学大学院生命科学研究科 博士・修士最終試験要旨集、Ｍ３０８頁」に発表 （２）平成２５年２月１２日 東北大学大学院生命科学研究科博士課程前期２年の課程最終試験にて口頭発表

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２４年度農林水産省委託プロ「農業環境における物質循環促進のための微生物による処理技術の開発」（気候変動プロ）産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01604

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01607

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01608

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01610

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01605

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01612

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01606

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01615

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01609

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01611

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01616

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01613

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01614

(73)【特許権者】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(73)【特許権者】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504300088

【氏名又は名称】国立大学法人帯広畜産大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(74)【代理人】

【識別番号】100078662

【弁理士】

【氏名又は名称】津国 肇

(74)【代理人】

【識別番号】100135873

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 圭子

(74)【代理人】

【識別番号】100116528

【弁理士】

【氏名又は名称】三宅 俊男

(74)【代理人】

【識別番号】100141357

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 音哉

(72)【発明者】

【氏名】岡崎 和之

(72)【発明者】

【氏名】池田 成志

(72)【発明者】

【氏名】高橋 宙之

(72)【発明者】

【氏名】田口 和憲

(72)【発明者】

【氏名】黒田 洋輔

(72)【発明者】

【氏名】関口 博之

(72)【発明者】

【氏名】南澤 究

(72)【発明者】

【氏名】鶴丸 博人

(72)【発明者】

【氏名】橋本 萌

(72)【発明者】

【氏名】大和田 琢二

【審査官】 竹中 靖典

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１０−２７６５７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２０１８００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−１９４９５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−２１８７１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０７−０２５７１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２８１１９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１４５０７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０８−２０５６７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０９０６２８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／００９６４１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０９−２９９０７６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ０１Ｇ ７／００

Ａ０１Ｃ １／００ − １／０８

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ １／２０

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポラロモナス属に属するＨＲＲＫ１０３（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０７）、バリオボラックス属に属するＨＲＲＫ１７０（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０８）、ノボスフィンゴビウム属に属するＨＲＲＫ１９３（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１０）、又はＨＲＲＫ０１０（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０５）、ノカルディオイデス属に属するＨＲＲＰ１１０（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１２）、デボシア属に属するＮｏ．１８４（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０６）、メソリゾビウム属に属するＨＲＴＰ０２７（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１５）又はＨＲＲＫ１９０（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０９）、スフィンゴモナス属に属するＨＲＲＰ０８９（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１１）、フィロバクテリウム属に属するＨＲＴＰ１９２（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１６）、バチルス属に属するＨＲＴＫ１５６（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１３）、リゾビウム属に属するＨＲＲＫ００５（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０４）、又はストレプトマイセス属に属するＨＲＴＫ１９２（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１４）に属する微生物を含む、植物の生育促進剤。

【請求項2】

植物が、ヒユ科に属する、請求項１に記載の植物の生育促進剤。

【請求項3】

植物が、テンサイ及び／又はホウレンソウである、請求項２に記載の植物の生育促進剤。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物の生育促進剤を種子又は植物の根部と接触させることを含む、植物の栽培方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物の生育促進根圏細菌（ＰＧＰＲ：Plant Growth Promotion Rhizobacterium）を含む植物の生育促進剤及びそれを用いる植物の栽培方法に関する。

【背景技術】

【0002】

砂糖の原料作物であるテンサイは北海道内で６０，０００ｈａの作付面積を有する畑輪作を維持する上で欠くことができない作物である。テンサイ栽培においては、砂糖の国内消費量低下や輸入糖との価格競争などから、生産コストの低下が強く求められている。また、２０１０年以降、テンサイの収量は低下し、作付面積の減少により産糖量は大きく減少しており、収量性の向上と安定化が求められている。

【0003】

北海道のテンサイ栽培では４５日程度育苗した苗を圃場に移植する移植栽培が９割を占める。この移植栽培で安定多収を実現するには、早期に健苗を育苗し、圃場に移植することが重要である。

【0004】

植物の根圏または根内には多くの微生物が生息しており、その中にはＰＧＰＲと呼ばれ、植物に生育促進効果をもたらす有用細菌が存在することが知らており、トマトやトウモロコシなど、多くの作物でＰＧＰＲを利用した生育促進技術が報告されている（特許文献１〜５）。

【0005】

しかしながら、テンサイを含むヒユ科は、菌根共生をしない植物として知られている。テンサイの病原菌を抑える拮抗微生物の研究は多々あるものの、この予測を支持するように、テンサイ生育促進微生物の研究は、ほとんど報告されていない（非特許文献１〜３）。

【0006】

そこで、テンサイから生育促進効果を有するＰＧＰＲを分離し、育苗中のテンサイ等の作物の苗に接種することで健苗を育成する技術の開発が待たれていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開平６−３１１８２６号公報

【特許文献2】特開２０１２−１３５３００号公報

【特許文献3】特開２００２−２３３２４６号公報

【特許文献4】特開平９−２９９０７６号公報

【特許文献5】特開平１０−７４８３号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Suslow and Schroth, 1982. Phytopathology 72:199-206.

【非特許文献2】Cakmakci et al., 1999. J. Plant Nutr. Soil Sci. 162:437-442

【非特許文献3】Shi et al., 2011. Symbiosis 54:159-166

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、植物の生育促進根圏細菌を含む植物の生育促進剤及びそれを用いる植物の栽培方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、テンサイ根圏に生育促進効果を有するＰＧＰＲが生息していると考え、テンサイ共生細菌を網羅的に分離した。分離源の部位は栄養吸収を行っている細根とした。分離源のサンプリング時期は、テンサイの生育が旺盛な時期である７月中旬とした。その結果、無接種に比べて乾物量が増加し、生育促進効果が認められた１３菌株を見出し、本発明を完成させた。

【0011】

したがって、本発明は、以下のとおりである。
［１］ポラロモナス属、バリオボラックス属、ノボスフィンゴビウム属、ノカルディオイデス属、デボシア属、メソリゾビウム属、スフィンゴモナス属、フィロバクテリウム属、バチルス属、リゾビウム属又はストレプトマイセス属に属する微生物を含む、植物の生育促進剤、
［２］植物が、ヒユ科に属する、［１］に記載の植物の生育促進剤、
［３］植物が、テンサイ及び／又はホウレンソウである、［２］に記載の植物の生育促進剤、
［４］ポラロモナス属に属する微生物が、ＨＲＲＫ１０３であり、バリオボラックス属に属する微生物が、ＨＲＲＫ１７０株であり、ノボスフィンゴビウム属に属する微生物が、ＨＲＲＫ１９３株及びＨＲＲＫ０１０株であり、ノカルディオイデス属に属する微生物が、ＨＲＲＰ１１０株であり、デボシア属に属する微生物が、Ｎｏ．１８４株であり、メソリゾビウム属に属する微生物が、ＨＲＴＰ０２７株及びＨＲＲＫ１９０であり、スフィンゴモナス属に属する微生物が、ＨＲＲＰ０８９株であり、フィロバクテリウム属に属する微生物が、ＨＲＴＰ１９２株であり、バチルス属に属する微生物が、ＨＲＴＫ１５６株であり、リゾビウム属に属する微生物が、ＨＲＲＫ００５株であるか又はストレプトマイセス属に属する微生物が、ＨＲＴＫ１９２株である、［１］〜［３］のいずれかに記載の植物の生育促進剤。

【発明の効果】

【0012】

本発明の植物の生育促進剤をテンサイ等の作物の種子または幼苗に接種することで、植物体の大きい健苗を育苗することができる。この技術により、移植後の活着や初期生育が向上し、収量性の向上と安定化を図ることができる。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明で得られた１３菌株については、下記の受託番号のもと独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに２０１３年６月２５日付けで寄託されている。
菌株名 種名 受託番号
ＨＲＲＫ１０３ ポラロモナス属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０７
（Polaromonas sp.）
ＨＲＲＫ１７０ バリオボラックス属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０８
（Variovorax sp.）
ＨＲＲＫ１９３ ノボスフィンゴビウム属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１０
（Novosphingobium sp.）
ＨＲＲＰ１１０ ノカルディオイデス属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１２
（Nocardioides sp.）
Ｎｏ．１８４ デボシア属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０６
（Devosia sp.）
ＨＲＴＰ０２７ メソリゾビウム属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１５
（Mesorhizobium sp.）
ＨＲＲＰ０８９ スフィンゴモナス属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１１
（Sphingomonas sp.）
ＨＲＴＰ１９２ フィロバクテリウム属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１６
（Phyllobacterium sp.）
ＨＲＴＫ１５６ バチルス属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１３
（Bacillus sp.）
ＨＲＲＫ０１０ ノボスフィンゴビウム属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０５
（Novosphingobium sp.）
ＨＲＲＫ００５ リゾビウム属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０４
（Rhizobium sp.）
ＨＲＲＫ１９０ メソリゾビウム属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６０９
（Mesorhizobium sp.）
ＨＲＴＫ１９２ ストレプトマイセス属 ＮＩＴＥ Ｐ−０１６１４
（Streptomyces sp.）

【0014】

本発明に用いられる上記微生物の培養は、従来公知の任意の培地を用いることができる。また、液体培地以外に寒天入りの斜面培地及び平板培地等の固体培地を用いることもできる。これらの培地を用いることによって、菌株を増殖させて、所望の菌体量を得ることができる。

【0015】

培地の炭素源としては、上記菌株が同化しうるあらゆるものを使用することができるが、グルコース、ガラクトース、ラクトース、アラビノース、マンノース、麦芽エキス澱粉加水分解物などの糖を例示することができる。

【0016】

窒素源としても同様に、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどの、該菌株が利用することができる各種の合成又は天然物が利用可能である。

【0017】

微生物培養の常法に従って、食塩、リン酸塩などの無機塩類、カルシウム、マグネシウム、鉄などの金属の塩類、ビタミン、アミノ酸などの微量栄養源も必要に応じて添加することができる。

【0018】

培養は、振盪培養、静置培養、通気培養などの好気的条件下で行なうことができる。培養温度は、２０〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃、培養期間は１〜５日、好ましくは３〜４日である。

【0019】

本発明において、「植物の生育促進」とは、植物の種子の発芽を促進させることおよび／または植物の生育を促進させることをいう。また、「根部」とは、植物を栽培した場合に土壌中または水耕液中にあって水分や栄養分の吸収を行なう部分をいう。

【0020】

本発明の微生物は、微生物を植物の種子または根部に接触させるかまたはそれらの近傍に存在させることで、その種子の発芽を促進しおよび／またはその植物の生育を促進する性質を有する。

【0021】

したがって、本発明は、植物の種子または根部に接触させるかまたはそれらの近傍に存在させることで植物の発芽を促進しおよび／または植物の生育を促進する性質を有する微生物を含む植物の栽培促進剤を提供する。また、本発明は、この栽培促進剤を用いる植物の栽培促進方法を提供する。

【実施例1】

【0022】

（1）テンサイ共生細菌の分離
北海道河西郡芽室町の北海道農業研究センター内の三要素栽培試験圃場において、テンサイ品種「アマホマレ」を移植栽培した。生育が旺盛な７月中旬に、通常施肥区（以下、ＮＰＫ区）、窒素無施肥区（以下、ＰＫ区）、窒素およびリン酸無施肥区（以下、Ｋ区）の３試験区から各３個体を採取し、よく洗浄した後、葉身、葉柄、根、細根の各部位に分割して使用時まで−３０℃で凍結保存した。
テンサイ共生細菌の分離はＰＫ区及びＫ区から採取した細根を分離源とし、分離培地には、シクロヘキシミド５０ｐｐｍを添加した、Ｒ２Ａ寒天培地（ベクトン・ディッキンソン株式会社）又はＴＳＡ寒天培地（ベクトン・ディッキンソン株式会社のTryptic soy brothに１.５％濃度で寒天を加えた培地）の２種類を用いた（以下、培養法）。細根を乳鉢で摩砕した後、１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）で適当な濃度に薄め、分離培地に塗布した後、２４℃で１週間培養した。培養後に形成されたコロニーを網羅的に釣菌し、各々２００菌株、計８００菌株を分離した。分離した８００菌株のうち６６５菌株については１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を解析し、属名を決定した。一方、ＮＰＫ区、ＰＫ区及びＫ区から採取した根及び細根から抽出したＤＮＡを用いて、培養することなく直接、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を解析し、テンサイの根及び細根に共生している細菌叢を解析した（以下、非培養法）。

【0023】

培養法及び非培養法で得られた１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列結果を基に群集構造解析を行った結果、テンサイの共生細菌相は種レベルで３８５個のＯＴＵ（operational taxonomic units）に分類された。異なるＯＴＵに属する共生細菌は系統的に異なっており、植物への共生機構も異なっていると考えられる。３８５個のＯＴＵについて、培養法あるいは非培養法に基づいた多様性解析において分離頻度が高く、安定して検出された菌群、過去の論文から有用効果が期待できるものとして、４５個のＯＴＵを選抜した。これらのＯＴＵに属する菌株について、以下の方法によりテンサイ幼苗への接種試験を行い、生育促進効果を評価した。

【実施例2】

【0024】

（2）テンサイ幼苗への接種試験
試験にはテンサイ品種「リッカ」を供試した。種子は７０％エタノールに１分、次に次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素濃度１％、ｔｗｅｅｎ２０を０．０１％添加）に１５分、それぞれ浸漬した後、滅菌蒸留水で５回以上濯いで表面殺菌した。表面殺菌した種子を２５℃で２４時間、暗所に静置して発芽させた。発芽が確認された種子３粒を滅菌した育苗培土（商品名「ポットエース」、片倉チッカリン株式会社）８０ｍｌを充填したセル（セルサイズ：４１ｘ４１ｘ４３．５（Ｈ）ｍｍ、商品名「セルボックス２５穴」、明和株式会社）に置床し、その上に滅菌した育苗培土２０ｍｌを覆土して播種した。１処理区の反復は１２セルとした。寒天培地（Ｒ２Ａ寒天培地又はＴＳＡ寒天培地）上で２４℃・３〜４日間、暗所で静置培養した菌体を白金耳で掻き取り、滅菌蒸留水中に懸濁した。この懸濁液の６００ｎｍにおける吸光度(ＯＤ値)を計測し、ＯＤ値が０．１となるように滅菌蒸留水で希釈したものを接種源とした。接種は、播種直後に行い、１セルあたり１ｍｌの接種源を灌注して接種した。無接種区には滅菌蒸留水を灌注接種した。播種・接種後は、明期：２５℃・１６時間、暗期：２０℃・８時間に調節した人工気象室内で栽培し、播種１週間後に間引きを行い１株／セルとした。播種１ヵ月後、セルからテンサイを慎重に抜き取り、丁寧に水洗いして根に付着した土壌を落とした。地上部と根部に切断し、８０℃で３日間乾燥させた後、個体毎の乾物重を測定した。
テンサイ幼苗への接種試験の結果、無接種区と比較して乾物重が増加し、生育促進効果が認められた菌株として１３菌株を選抜した（表１）。

【実施例3】

【0025】

（3）ホウレンソウ幼苗への接種試験
テンサイへ幼苗への生育促進効果が認められた１３菌株のうち１０菌株について、テンサイと同じヒユ科に属するホウレンソウへの接種試験を実施した。試験にはホウレンソウ品種「おかめ（ネーキッド種子）」（タキイ種苗）を供試した。種子を１８℃で７２時間、暗所に静置して発芽させた。発芽が確認された種子４粒を滅菌したバーミキュライトまたは育苗培土（商品名「げんき君果菜２００」、コープケミカル株式会社）５０ｍｌを充填したセル（セルサイズ：４５ｘ４５ｘ５０（Ｈ）ｍｍ、商品名「プラグトレイ５０穴」、ランドマーク社）に置床し、その上に滅菌した育苗培土１０ｍｌを覆土して播種した。子葉展開後、健全な苗３株となるように間引きし、１処理区の反復は１２株（４セル）とした。寒天培地（Ｒ２Ａ寒天培地又はＴＳＡ寒天培地）上で２５℃・３〜４日間、暗所で静置培養した菌体を滅菌綿棒で集菌し、滅菌蒸留水中に懸濁した。この懸濁液の６００ｎｍにおける吸光度(ＯＤ値)を計測し、ＯＤ値が０．０２となるように滅菌蒸留水で希釈したものを接種源とした。接種は、播種直後に行い、１セルあたり５ｍｌの接種源を灌注して接種した。無接種区には滅菌蒸留水を灌注接種した。播種・接種後は、明期：２５℃・１６時間、暗期：２５℃・８時間に調節した人工気象室内で栽培し、栽培期間中は水耕栽培液を全てセルに等量ずつ与え、土壌が乾燥することのないよう維持した。播種２週間後、セルからホウレンソウを慎重に抜き取り、丁寧に水洗いして根に付着した土壌を落とした。地上部と根部に切断し、個体毎の生重量を測定した。
ホウレンソウへの接種試験を実施した結果、ポラロモナス属に属するＨＲＲＫ１０３株、バリオボラックス属に属するＨＲＲＫ１７０株、ノカルディオイデス属に属するＨＲＲＰ１１０株、デボシア属に属するＮｏ．１８４株及びメソリゾビウム属に属するＨＲＴＰ０２７株は顕著な生育促進効果を示し、ホウレンソウへの適用の可能性が明らかとなった（表２）。

【0026】

【表1】

【表2】

【産業上の利用可能性】

【0027】

本発明の植物の生育促進剤をテンサイ等の作物の種子または幼苗に接種することで、植物体の大きい健苗を育苗することができる。