特許 6238252 ＰＴＰＲＺ活性阻害剤、それを用いた治療剤、薬剤輸送システム及び治療システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6238252

(24)【登録日】2017年11月10日

(45)【発行日】2017年11月29日

(54)【発明の名称】ＰＴＰＲＺ活性阻害剤、それを用いた治療剤、薬剤輸送システム及び治療システム

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/655 20060101AFI20171120BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20171120BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171120BHJP

   A61K 9/127 20060101ALN20171120BHJP

   A61K 47/02 20060101ALN20171120BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/655

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   !A61K9/127

   !A61K47/02

【請求項の数】11

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2016-2902(P2016-2902)

(22)【出願日】2016年1月8日

(65)【公開番号】特開2017-122074(P2017-122074A)

(43)【公開日】2017年7月13日

【審査請求日】2017年1月12日

(73)【特許権者】

【識別番号】504261077

【氏名又は名称】大学共同利用機関法人自然科学研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】100182073

【弁理士】

【氏名又は名称】萩 規男

(72)【発明者】

【氏名】藤川 顕寛

(72)【発明者】

【氏名】久保山 和哉

(72)【発明者】

【氏名】野田 昌晴

【審査官】 澤田 浩平

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００４／０７６６４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Biochemistry，２００３年，42，p.6674-6687

【文献】 Lav Ist Anat Istol Patol Univ Stadi Peruqia，１９７８年，38(3)，p.87

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ９／００−９／７２，

Ａ６１Ｋ３１／３３−３１／８０，

Ａ６１Ｋ４７／００−４７／６９，

Ａ６１Ｐ１／００−４３／００

ＣＡｐｌｕｓ （ＳＴＮ），

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ），

ＭＥＤＬＩＮＥ （ＳＴＮ），

ＥＭＢＡＳＥ （ＳＴＮ），

ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む、ＰＴＰＲＺ活性阻害剤。

【化1】

（式（１）中、Ｒ¹およびＲ³は、各々独立して、水素原子または酸性基を示し、Ｒ²は、水素原子または水酸基を示し、Ａは置換基を有するもしくは有さないフェニル基（ベンゼン環）または、置換基を有するもしくは有さないナフチル基（ナフタレン環）を示す。）

【請求項2】

前記一般式（１）中、Ａは下記式（２）

【化2】

（式（２）中、Ｒ^４は水素原子または酸性基を示す。）、または下記式（３）

【化3】

（式（３）中、Ｒ^４は前記式（２）のＲ^４と同じ。）である、請求項１に記載のＰＴＰＲＺ活性阻害剤。

【請求項3】

請求項１又は請求項２記載のＰＴＰＲＺ活性阻害剤を含む、神経膠腫治療剤。

【請求項4】

請求項１又は請求項２記載のＰＴＰＲＺ活性阻害剤を含む、ヒトＰＴＰＲＺの過剰発現に起因する疾病の予防・治療剤であって、前記疾病が、脳腫瘍または膠芽腫から選択される、予防治療剤。

【請求項5】

前記式（１）中、Ｒ¹、Ｒ³およびＲ⁴は、各々独立して、水素原子または硫酸基を示す、請求項１又は請求項２記載のＰＴＰＲＺ活性阻害剤。

【請求項6】

前記式（１）中、Ｒ¹、Ｒ³およびＲ⁴は、各々独立して、水素原子または硫酸基を示す、請求項３記載の神経膠腫治療剤。

【請求項7】

前記式（１）中、Ｒ¹、Ｒ³およびＲ⁴は、各々独立して、水素原子または硫酸基を示す、請求項３記載の予防治療剤。

【請求項8】

前記式（１）中、Ｒ¹、Ｒ³およびＲ⁴はいずれも硫酸基を示し、かつＲ²は水酸基を示す、請求項１又は請求項２記載のＰＴＰＲＺ活性阻害剤。

【請求項9】

前記式（１）中、Ｒ¹、Ｒ³およびＲ⁴はいずれも硫酸基を示し、かつＲ²は水酸基を示す、請求項３記載の神経膠腫治療剤。

【請求項10】

前記式（１）中、Ｒ¹、Ｒ³およびＲ⁴はいずれも硫酸基を示し、かつＲ²は水酸基を示す、請求項３記載の予防治療剤。

【請求項11】

患者の腫瘍疾患部位において、母材が投与された後、経時変化における腫瘍の増殖を阻止できる、神経膠腫を治療するための薬剤輸送システムまたは治療システムであって、
１）請求項１〜１０のいずれかに記載の一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む剤とリポソームとの複合体、および
２）投与用の溶媒
を含む母材を含み、
前記母材は、前記投与の後、前記経時変化にわたり、前記疾患部位に前記剤を放出するようになっている薬剤輸送システムまたは治療システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＰＴＰＲＺ活性阻害剤、それを用いた治療剤、薬剤輸送システム及び治療システムに関する。
神経膠腫（グリオーマ）は、その中でも膠芽腫（グリオブラストーマ）には有効な治療法がなく、確定診断後の平均余命は１年程度である。本発明は、ＰＴＰＲＺの活性を阻害することが、グリオーマの治療に有効であることを示すものである。

【0002】

受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ・ゼータ（ＰＴＰＲＺ）は、細胞膜上に発現する受容体分子である。その細胞内にはタンパク質チロシン残基に付与されたリン酸化修飾を除去するタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）活性ドメインを有している。これまでにＰＴＰＲＺの存在がグリオーマの悪性化に関与していることは示されていたが、ＰＴＰＲＺの細胞内ホスファターゼ活性がグリオーマの悪性化に寄与するのかという大事な点についてはわかっていなかった。また、これまで、ＰＴＰＲＺのＰＴＰドメインに結合して、その働きを選択的に妨げる公知の物質はなく、そのホスファターゼを薬理学的に阻害することでグリオーマに対して制ガン効果が得られるのかもわかっていなかった。

【0003】

本発明者らは、ＰＴＰＲＺのＰＴＰドメインを含む細胞内領域のタンパク質をラット膠芽腫由来の細胞株（Ｃ６グリオブラストーマ細胞）に強制発現させることでＰＴＰ活性がガン細胞の悪性表現型に関与することを実証した。
本発明者らは、Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ３-ｈｙｄｒｏｘｙ-４-［（４-ｓｕｌｆｏｎａｔｏ-１-ｎａｐｈｔｈｙｌ）ｄｉａｚｅｎｙｌ］-２，７-ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ（別名アマランス、赤色２号、以下ＡＲ２７）が、ＰＴＰＲＺに作用して、その酵素活性を阻害することを初めて見出した。

【0004】

本発明者らは、ＡＲ２７のＰＴＰ分子に対する阻害効果が、ＰＴＰＲＺと同じファミリー分子であるＰＴＰＲＧに対して強く、一方、他のＰＴＰファミリー分子（ＰＴＰＲＡ、ＰＴＰＲＭ、ＰＴＰＲＳ、ＰＴＰＲＢ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ６）に対する阻害効果は弱いことを突き止め、ＡＲ２７が特定のＰＴＰファミリー分子、すなわち、ＰＴＰＲＺとＰＴＰＲＧに対して高い選択的阻害活性を有することを見出した。

【0005】

本発明者らは、ＡＲ２７の選択的阻害活性に必要とされる分子構造の特徴、そして、ＡＲ２７の阻害効果に関わるＰＴＰＲＺのＰＴＰドメイン内のアミノ酸残基を同定し、ＡＲ２７によるＰＴＰＲＺの阻害メカニズムに関しての理解を進めた。
本発明者らは、そのままでは細胞膜を通過せず、細胞内に存在するＰＴＰＲＺのＰＴＰドメインに対して阻害効果を発揮しないＡＲ２７を、リポソームと混合することで効果的に生きた細胞内に取り込ませ、細胞内のＰＴＰＲＺの酵素活性を抑制する手法（ＡＲ２７／リポソーム複合体）を発明した。

【0006】

本発明者らは、ＡＲ２７／リポソーム複合体を用いることで、シャーレ内の培養条件下においてＣ６グリオブラストーマ細胞株の細胞増殖能と細胞移動能（ガンの悪性化の指標となる）を抑制すること、さらに、Ｃ６グリオブラストーマ細胞株のラット脳内への同種同所移植実験における腫瘍形成に対しても抑制効果が得られることを実証した。
以上の成果をまとめることで、ＰＴＰＲＺの細胞内ドメインに対する選択的機能阻害が神経膠腫治療のために有望であることを初めて示し、本発明が完成した。

【背景技術】

【0007】

神経膠腫（グリオーマ）は、最も一般的な原発性脳腫瘍である（非特許文献１参照）。世界保健機関（ＷＨＯ）の認定するグレードＩの神経膠腫は、外科的切除で治療可能であり、より高いグレードへの進行はほとんどなく、予後は良い。グレードＩＩまたはＩＩＩの神経膠腫は浸潤性があり、より高いグレードへと進行し、予後不良である。膠芽腫（グリオブラストーマ）は最も悪性度の高いグレードＩＶの神経膠腫である。グリオブラストーマは、固形腫瘍の中でも最悪であり、腫瘍細胞は盛んに増殖し、周囲の正常組織へも広く浸潤する。膠芽腫に対する効果的な治療法はいまだ確立されておらず、致死的な疾病と認識されている。膠芽腫と診断されてからの生存期間の中央値は１２ヵ月から１４ヵ月である（非特許文献２参照）。

【0008】

タンパク質チロシンリン酸化は後生動物において多くの細胞機能を制御し、その変調は神経膠腫を含む様々なガンの原因に関係する（非特許文献３、非特許文献４参照）。細胞タンパク質上のチロシン残基のリン酸化は、次の２つの酵素群によって動的に制御される。一つは、リン酸基を付加する触媒作用をもつタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）であり、もう一つは基質タンパク質からリン酸を除去するタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）である。もともとガン遺伝子として発見された経緯のあるＰＴＫファミリーに属する分子については、現在、最も主要な制ガン剤の標的分子になっている。

【0009】

グリオーマにおいても、遺伝子変異によって恒常的にキナーゼが活性化しているケースは多く認められている。ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮細胞増殖因子受容体チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ）の発癌性変異体）は、グリオブラストーマで高頻度に生じている変異である。このＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体では、自己リン酸化能が高まっており、恒常的にＥＧＦＲシグナルが活性化してしまっているため、グリオブラストーマの悪性化に寄与しているとみなされている（非特許文献５、非特許文献６参照）。肺がんにおけるゲフィチニブ（ｇｅｆｉｎｉｔｉｂ）のようなＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の有意な治療効果（非特許文献７参照）から、これらのキナーゼ阻害剤がグリオマブラストーマに対しても有効ではないかとの期待感をもたらしたが、それに反して、グリオブラストーマの標準的な治療にＥＧＦＲ標的阻害薬を付与した治療を実施しても、その生存率が有意に改善する治療効果は認められていない（非特許文献８参照）。

【0010】

一方ＰＴＰという分子種については、ＰＴＫとは逆の酵素反応を担うことから、当初、腫瘍の形成を抑制する働きを担うものと想定された。そのためＰＴＰ阻害剤が、ガン治療薬として応用できる可能性は容易に予見できるものではなかった。しかし最近の研究では、ＰＴＰファミリーに属する分子の中に、少数乍ら腫瘍形成に対して促進的に働く可能性が示唆されている（非特許文献４、非特許文献９参照）。

【0011】

グリオーマに関しては、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）の一つであるＰＴＰＲＺ（ＰＴＰζまたはＲＰＴＰβとも呼ばれる）の発現レベルの上昇が報告されていた（非特許文献１０、非特許文献１１参照）。他の腫瘍に関しても、神経芽細胞腫、皮膚黒色腫、胃がん（非特許文献１２参照）や小細胞肺がん（非特許文献１３参照）におけるＰＴＰＲＺの発現上昇が報告されている。ＰＴＰＲＺはヒト、ラット、マウスのゲノム上に単一遺伝子としてコードされており、ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって３つのアイソフォームが発現している。すなわち、２つの受容体型のＰＴＰＲＺ−ＡとＰＴＰＲＺ−Ｂ、および分泌型のＰＴＰＲＺ−Ｓである（非特許文献１４、非特許文献１５参照）。グリオブラストーマでは、３つのアイソフォームのうち、ＰＴＰＲＺ−Ｂが著しく発現上昇していると報告されている（非特許文献１６参照）。正常な脳組織では、これら３つのアイソフォームの全てが発現しており、その細胞外領域にはコンドロイチン硫酸糖鎖と呼ばれる特殊な糖鎖構造によって高度に修飾されている（非特許文献１５、非特許文献１７参照）。一方、中枢神経組織以外では、胃粘膜組織など末梢組織の一部で、非プロテオグリカンのＰＴＰＲＺがわずかながら発現していることが示されている（非特許文献１８参照）。

【0012】

ＰＴＰＲＺがグリオーマの治療標的となり得る可能性については、ＰＴＰＲＺの細胞外領域に対する特異抗体にタンパク質毒素サポリンを結合させた抗ＰＴＰＲＺートキシン複合体が、ヒトＵ８７グリオーマ細胞株のマウス異種移植モデルにおいて腫瘍形成を遅らせることが示されている（非特許文献１９参照）。また、ＰＴＰＲＺの発現がノックダウンされたグリオーマ細胞株では、細胞培養条件下での細胞増殖や細胞移動が低下すること、実験動物への異種移植モデルにおいてグリオーマ細胞株の腫瘍形成能がＰＴＰＲＺのノックダウンによって低下することが示されている（非特許文献２０参照）。

【0013】

また、ＰＴＰＲＺの細胞内ホスファタターゼ活性によって脱リン酸化される生理的な基質タンパク質は、ニューロン、グリア、および胃粘膜細胞を含む多彩な細胞において、細胞移動能、細胞ー細胞間、細胞ー細胞外基質との接着に関係することがわかっている（非特許文献１５、非特許文献２１参照）。

【0014】

以上の先行知見は、ＰＴＰＲＺという分子がグリオーマの悪性化に関与することを示唆したが、ＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性自体が、ガンの悪性化に寄与することを示す知見はなく、さらに言えば、ＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性を選択的に阻害する公知の物質や化合物はなく、その可能性を検証することはできなかった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Louis D. N., et al, The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114, 97-109 (2007)

【非特許文献2】Stupp R., et al, European Organisation for Research and Treatment of Cancer Brain Tumour and Radiation Oncology Groups & National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. Lancet Oncol. 10, 459466 (2009)

【非特許文献3】Zhang J., et al, Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat. Rev. Cancer 9, 28-39 (2009)

【非特許文献4】Julien S. G., et al, Inside the human cancer tyrosine phosphatome. Nat. Rev. Cancer 11, 35-49 (2011)

【非特許文献5】Sugawa N., et al, Identical splicing of aberrant epidermal growth factor receptor transcripts from amplified rearranged genes in human glioblastomas. Proc. Natl Acad. Sci. USA 87, 8602-8606 (1990)

【非特許文献6】Nishikawa R., et al, A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 7727-7731 (1994)

【非特許文献7】Paez J. G., et al, EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 304, 1497-1500 (2004).

【非特許文献8】Mellinghoff I. K., et al, Will kinase inhibitors make it as glioblastoma drugs? Curr. Top. Microbiol. Immunol. 355, 135-169 (2012)

【非特許文献9】Navis A. C., et al, Protein tyrosine phosphatases in glioma biology. Acta Neuropathol. 119, 157-175 (2010)

【非特許文献10】Muller S., et al, A role for receptor tyrosine phosphatase ζ in glioma cell migration. Oncogene 22, 6661-6668 (2003)

【非特許文献11】Ulbricht U., et al, Expression and function of the receptor protein tyrosine phosphatase ζ and its ligand pleiotrophin in human astrocytomas. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1265-1275 (2003)

【非特許文献12】Wu C. W., et al, Protein tyrosine-phosphatase expression profiling in gastric cancer tissues. Cancer Lett. 242, 95-103 (2006)

【非特許文献13】Makinoshima H., et al, PTPRZ1 regulates calmodulin phosphorylation and tumor progression in small-cell lung carcinoma. BMC Cancer 12, 537 (2012)

【非特許文献14】Maeda N., et al, Multiple receptor-like protein tyrosine phosphatases in the form of chondroitin sulfate proteoglycan. FEBS Lett. 354, 67-70 (1994)

【非特許文献15】Chow J. P., et al, Metalloproteinase- and γ-secretase-mediated cleavage of protein-tyrosine phosphatase receptor type Z. J. Biol. Chem. 283, 30879-30889 (2008)

【非特許文献16】Canoll P. D., et al, Three forms of RPTP-beta are differentially expressed during gliogenesis in the developing rat brain and during glial cell differentiation in culture. J. Neurosci. Res. 44, 199-215 (1996)

【非特許文献17】Nishiwaki T., et al, Characterization and developmental regulation of proteoglycan-type protein tyrosine phosphatase ζ/RPTPβ isoforms. J. Biochem. 123, 458-467 (1998)

【非特許文献18】Fujikawa A., et al, Mice deficient in protein tyrosine phosphatase receptor type Z are resistant to gastric ulcer induction by VacA of Helicobacter pylori. Nat. Genet. 33, 375-381 (2003)

【非特許文献19】Foehr E. D., et al, Targeting of the receptor protein tyrosine phosphatase β with a monoclonal antibody delays tumor growth in a glioblastoma model. Cancer Res. 66, 2271-2278 (2006)

【非特許文献20】Ulbricht U., et al, RNA interference targeting protein tyrosine phosphatase ζ/receptor-type protein tyrosine phosphatase β suppresses glioblastoma growth in vitro and in vivo. J. Neurochem. 98, 1497-1506 (2006)

【非特許文献21】Fujikawa A., et al, Specific dephosphorylation at tyr-554 of git1 by PTPRZ promotes its association with paxillin and hic-5. PLoS ONE 10, e0119361 (2015)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、ＰＴＰＲＺ−ＡおよびＰＴＰＲＺ−Ｂといった受容体アイソフォームに由来する細胞内領域のＰＴＰドメインに結合することで、そのホスファターゼ活性を阻害もしくは機能不全にする化合物であり、またそのような化合物を用いた治療剤、及びガン細胞や腫瘍組織への効果的な薬物輸送と組み合わせた治療原理を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明者らは、従来の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性を抑制することが制癌治療のために効果的であることを見出した。ここで本発明者らは、最初の強力なＰＴＰＲＺ阻害剤として、合成化合物であるＴｒｉｓｏｄｉｕｍ ３-ｈｙｄｒｏｘｙ-４-［（４-ｓｕｌｆｏｎａｔｏ-１-ｎａｐｈｔｈｙｌ）ｄｉａｚｅｎｙｌ］-２，７-ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ（別名アマランス、赤色２号、ＡＲ２７）を同定した。本発明者らは、ＡＲ２７によるＰＴＰＲＺの阻害の分子的基礎を調べ、阻害活性に必要とされるＡＲ２７の官能基やＰＴＰＲＺのアミノ酸残基を特定した。ＡＲ２７自体は、そのままでは細胞膜を透過せず、そのため当然、そのままで抗がん剤的な作用は示さなかったが、本発明者らは、ＡＲ２７をリポソームと混合することで、ＡＲ２７を効果的に細胞内に取り込ませる方法を発明した。そして、このＡＲ２７／リポソーム複合体は、グリオブラストーマ細胞株の動物移植モデルにおける腫瘍成長を効果的に抑制できたことから、ＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性の薬理学的阻害によるグリオーマ治療システムの原理が実証され、ついに、本発明を完成させるに至った。以下、本発明を詳細に説明する。

【0018】

本発明は、下記一般式（１）

【0019】

【化1】

【0020】

（式（１）中、Ｒ¹およびＲ³は、各々独立して、水素原子または酸性基を示し、Ｒ²は、水素原子または水酸基を示し、Ａは置換基を有するもしくは有さないフェニル基（ベンゼン環）、または置換基を有するもしくは有さないナフチル基（ナフタレン環）を示す。）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む、ＰＴＰＲＺ活性阻害剤に係る発明であり、前記一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む神経膠腫治療剤、また前記ＰＴＰＲＺ活性阻害剤を含む、ヒトＰＴＰＲＺの過剰発現に起因する疾病の予防・治療剤であって、前記疾病が、脳腫瘍または神経膠腫から選択される予防治療剤も含む発明である。さらに本発明は、前記ＰＴＰＲＺ活性阻害剤の、ヒトＰＴＰＲＺを過剰発現する腫瘍への使用に係る。

【0021】

さらに本発明は、前記一般式（１）中、Ａは、下記式（２）

【0022】

【化2】

【0023】

（式（２）中、Ｒ⁴は水素原子または酸性基を示す。）、または下記式（３）

【0024】

【化3】

【0025】

（式（３）中、Ｒ⁴は前記式（２）のＲ⁴と同じ。）である、上記のＰＴＰＲＺ活性阻害剤、神経膠腫治療剤および予防治療剤に係る発明である。

【0026】

さらに本発明のＰＴＰＲＺ活性阻害剤、神経膠腫治療剤または予防治療剤においては、前記式（１）中、Ｒ¹、Ｒ³およびＲ⁴は、各々独立して、水素原子または硫酸基を示すことが好ましく、さらにＲ¹、Ｒ³およびＲ⁴はいずれも硫酸基を示し、かつＲ²は水酸基を示すことが好ましい。

【0027】

また本発明は、患者の腫瘍疾患部位において、母材が投与された後、経時変化における腫瘍の増殖を阻止できる、主に神経膠腫を治療するための薬剤輸送システムまたは治療システムであって、
１）前記一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む剤とリポソームとの複合体、および
２）投与用の溶媒
を含む母材を含み、
前記母材は、前記投与の後、前記経時変化にわたり、前記疾患部位に前記剤を放出するようになっている薬剤輸送システムまたは治療システムに係る発明である。

【0028】

また、患者の腫瘍疾患部位において、母材が投与された後、経時変化における腫瘍の増殖を阻止できる、主に神経膠腫の治療方法であって、
１）前記一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む剤とリポソームとの複合体、および
２）投与用の溶媒
を含む母材を含み、
前記母材は、前記投与の後、前記経時変化にわたり、前記疾患部位に前記剤を放出する方法を開示する。

【0029】

本明細書において「置換基を有する」もしくは「置換基を有さない」で定義される基、すなわちフェニル基またはナフチル基における置換基の数は、置換可能であれば特に制限はない。

【0030】

本明細書において「薬学的に許容されるその塩」としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の塩基付加塩や酸付加塩が挙げられる。さらに本発明においては、投与後に、生体中で（ｉｎ ｖｉｖｏ）何らかの化学的又は生理的プロセスによって薬物を放出する薬物前駆体である化合物、すなわち「プロドラッグ」をも包含しうる。

【0031】

後述するように、本発明における、一般式（１）で表されるアゾ化合物の構造は、ＰＴＰＲＺ活性を阻害すると同定された赤色２号（ＡＲ２７、アマランス（Ａｍａｒａｎｔｈ）として知られる、分子式；Ｃ₂₀Ｈ₁₁Ｎ₂Ｎａ₃Ｏ₁₀Ｓ₃、ＩＵＰＡＣ名称：（４Ｅ）−３−オキソ−４−［（４−スルホナト-１-ナフチル）ヒドラゾノ］ナフタレン−２，７−ジスルホン酸三ナトリウム（Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ（４Ｅ）-３-ｏｘｏ-４-［（４-ｓｕｌｆｏｎａｔｏ-１-ｎａｐｈｔｈｙｌ）ｈｙｄｒａｚｏｎｏ］ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ-２，７-ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、分子量６０４．４８、ＣＡＳ登録番号；９１５-６７-３）の構造に認められるように、アゾ基（−Ｎ＝Ｎ−）を有する有機化合物であり、当該アゾ基の両側には、芳香族系の基を有する構造を示す。

【0032】

一般式（１）の上部はナフタレン環を示すと共に、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³の位置に置換基を有することが好ましい。

【0033】

本発明は一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む、ＰＴＰＲＺ活性阻害剤である。

【0034】

一般式（１）中、Ｒ¹およびＲ³は、各々独立して、水素原子または酸性基を示すが、酸性基としては、硫酸基（−ＳＯ₃Ｘ、−ＯＳＯ₃Ｘであり、ＸはＮａ等の硫酸イオンとの対イオンをなす）やニトロ基（−ＮＯ₂）などのマイナス荷電した基が挙げられ、また無機系の基が好ましい。これらの酸性基はナトリウム、マグネシウムなどのアルカリ金属やアルカリ土類金属との塩を形成していてもよく、より好ましくは硫酸塩（スルホン酸塩、例えば−ＳＯ₃Ｎａ）を形成していることである。さらにＲ¹およびＲ³は共に酸性基を示すことが好ましい。

【0035】

上記一般式（１）中、Ｒ²は、水素原子または水酸基を示し、好ましくは水酸基である。

【0036】

上記一般式（１）中、Ａは、置換基を有するもしくは有さないフェニル基（ベンゼン環）、または置換基を有するもしくは有さないナフチル基（ナフタレン環）を示し、その具体的な構造例として、上記の式（２）のベンゼン環または式（３）のナフタレン環であることが好ましい。

【0037】

Ａが置換基を有する場合、一般式（２）または一般式（３）において、Ｒ⁴は酸性基を示し、酸性基としてはＲ¹およびＲ³と同様に、硫酸基（−ＳＯ₃Ｘ、−ＯＳＯ₃Ｘ）や酸化窒素基（−ＮＯ）などのマイナスに荷電する基が挙げられ、また無機系の基が好ましい。これらの酸性基はナトリウム、マグネシウムなどのアルカリ金属やアルカリ土類金属との塩を形成していてもよく、より好ましくは硫酸塩（−ＳＯ₃Ｎａ）を形成していることである。さらにＲ¹、Ｒ³およびＲ⁴のいずれも酸性基を示すことが好ましい。

【0038】

本発明のＰＴＰＲＺ活性阻害剤については、以下の実施態様において詳しく説明する。
本発明は、上記のＰＴＰＲＺ活性阻害剤を含む神経膠腫治療剤、および、ＰＴＰＲＺ活性阻害剤を含む、ＰＴＰＲＺの過剰発現に起因する疾病の予防・治療剤であって、前記疾病が、脳腫瘍または神経膠腫、ＰＴＰＲＺを過剰発現する腫瘍から選択される、予防治療剤については、以下の実施態様において詳しく説明する。

【0039】

本発明の薬剤輸送システムまたは治療システムは、患者の腫瘍疾患部位において、１）上記一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む剤とリポソームとの複合体、および２）投与用の溶媒を含む母材が投与された後、経時変化における腫瘍の増殖を阻止できる、主に神経膠腫を治療するためのシステムであり、前記母材は、前記投与の後、前記経時変化にわたり、前記疾患部位に前記剤を放出するようになっているものである。

【0040】

本発明に係る神経膠腫の治療方法においては、患者の腫瘍疾患部位において、１）上記一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む剤とリポソームとの複合体、および２）投与用の溶媒を含む母材が投与された後、経時変化における腫瘍の増殖を阻止できる、主に神経膠腫の治療方法に係り、前記母材は、前記投与の後、前記経時変化にわたり、前記疾患部位に前記剤を放出するようになっているものである。

【0041】

以上の本発明の薬剤輸送システム、治療システムまたは治療方法において使用されるリポソームは、患者の体内において輸送又は患者に投与するために、上記一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩と混和し、既存又は公知の方法により作成されればよい。これはＡＲ２７の構造から分かるように、負に荷電するアリールスルホン酸は細胞膜を通過しにくく、そのため細胞内への取り込みにとって不都合となることがある。本発明者らは陽イオン性のリポソーム試薬を用いることでＡＲ２７／リポソーム複合体の荷電状態が変わり、ＡＲ２７が生きた細胞内に効率的に輸送されることを見出したものである。従って、本発明において用いられるリポソームは、一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む剤とリポソームとの複合体の細胞取り込みが容易となる状態となっておればよい。例えば後述するように、リポフェクタミン２０００試薬などを用いることで複合体を作成できる。

【0042】

以上の本発明の薬剤輸送システム、治療システムまたは治療方法において使用される投与用の溶媒は、上記の一般式（１）で表されるアゾ化合物または薬学的に許容されるその塩を含む剤とリポソームとの複合体を調製するために用いられ、例えば０．９％のＮａＣｌ水溶液を投与用の溶媒として用いるとよい。

【発明の効果】

【0043】

本発明は次の効果を奏する。
（ｉ）ＰＴＰＲＺ活性の阻害剤、それを用いた治療剤、薬剤輸送システム及び治療システムを提供することができる。
（ｉｉ）これまでＰＴＰＲＺの活性を選択的に阻害する化合物は知られていなかったが、食用色素として用いられるアマランス（別名赤色2号、本明細ではＡＲ２７と呼称）にＰＴＰＲＺ阻害活性があることを見出した。さらにＡＲ２７をリポソームと混合することで効率的に腫瘍細胞に取り込ませる手法を開発し、これによってグリオーマの細胞増殖や細胞浸潤を効果的に抑制することが可能になった。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1A】ＰＴＰＲＺノックダウンによるＣ６グリオブラストーマ細胞の悪性度に関与する図であり、ウエスタンブロット解析によるＰＴＰＲＺタンパク質の発現量の評価結果である。

【図1B】ＰＴＰＲＺノックダウンによるＣ６グリオブラストーマ細胞の悪性度が低下したことを示す図であり、ボイデンチャンバー法による細胞移動能の評価結果とその定量評価結果である。

【図1C】ＰＴＰＲＺノックダウンによるＣ６グリオブラストーマ細胞の悪性度に関与する図であり、ウエスタンブロット解析よるＰＴＰＲＺタンパク質の発現量の評価結果である。

【図1D】ＰＴＰＲＺノックダウンによるＣ６グリオブラストーマ細胞の悪性度が低下したことを示す図であり、Ｃ６細胞及びＣ６細胞由来のＰＴＰＲＺの安定的ノックダウン細胞株の細胞増殖の評価結果である。

【図1E】ＰＴＰＲＺノックダウンによるＣ６グリオブラストーマ細胞の悪性度が低下したことを示す図であり、ボイデンチャンバー法による細胞移動能の評価結果とその定量評価結果である。

【図1F】ＰＴＰＲＺノックダウンによるＣ６グリオブラストーマ細胞の悪性度が低下したことを示す図であり、Ｃ６細胞及びＰＴＰＲＺのノックダウンＣ６細胞株の腫瘍形成を、ガン細胞の同種同所移植モデルを用いた腫瘍形成能の評価結果である。

【図2A】ＰＴＰＲＺノックダウンによるＰＴＰＲＺの基質分子のチロシンリン酸化の上昇に関する図であり、ウエスタンブロット解析による細胞全タンパク質のチロシンリン酸化状態とｐａｘｉｌｌｉｎのタンパク質の発現量の評価結果である。

【図2B】ＰＴＰＲＺノックダウンによるＰＴＰＲＺの基質分子のチロシンリン酸化の上昇を示す図であり、ウエスタンブロット解析による免疫沈降物中のｐａｘｉｌｌｉｎのチロシンリン酸化レベルの評価結果とその定量評価である。

【図3A】Ｃ６細胞へのＰＴＰＲＺの細胞内フラグメントの過剰発現による悪性度の亢進に関する図であり、ウエスタンブロット解析によるＰＴＰＲＺの細胞内フラグメントの発現量の評価結果を示すものである。

【図3B】Ｃ６細胞へのＰＴＰＲＺの細胞内フラグメントの過剰発現による悪性度の亢進を示す図であり、ボイデンチャンバー法による細胞移動能の評価結果とその定量評価結果である。ＰＴＰ活性を欠いたＣＳ変異体では亢進しないことを示す。

【図4A】ＡＲ２７によるＰＴＰＲＺの阻害に関する図であり、ＡＲ２７の化学構造である。

【図4B】ＡＲ２７によるＰＴＰＲＺの阻害を示す図であり、インビトロの阻害評価系よるＩＣ₅₀の算出結果である。

【図5A】ＡＲ２７及び類似化合物によるＰＴＰＲＺの阻害に関する図であり、ＡＲ２７及びその類似化合物の化学構造である。

【図5B】ＡＲ２７及び類似化合物によるＰＴＰＲＺの阻害を示す図であり、インビトロの阻害評価系よる評価結果である。

【図6A】ＡＲ２７の阻害に関わるＰＴＰＲＺ中のアミノ酸残基の特定に関する図であり、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色による阻害アッセイに用いたＰＴＰＲＺ変異体酵素のタンパク質標品の評価結果である。

【図6B】ＡＲ２７の阻害に関わるＰＴＰＲＺ中のアミノ酸残基の特定を示す図であり、インビトロにおける酵素活性（比活性）の評価結果である。

【図6C】ＡＲ２７の阻害に関わるＰＴＰＲＺ中のアミノ酸残基の特定を示す図であり、インビトロにおける阻害感受性の評価結果である。

【図7A】リポソームを用いたＡＲ２７の細胞内導入法の開発を示す図であり、細胞内に直接導入することでＡＲ２７由来の蛍光を検出した結果である。

【図7B】リポソームを用いたＡＲ２７の細胞内導入法の開発を示す図であり、ＡＲ２７の細胞内取り込み量の測定結果である。

【図7C】リポソームを用いたＡＲ２７の細胞内導入法の開発を示す図であり、ＡＲ２７及びリポソーム処理したＣ６細胞の蛍光顕微鏡による観察結果である。

【図7D】リポソームを用いたＡＲ２７の細胞内導入法の開発を示す図であり、ＡＲ２７／リポソーム複合体のＣ６細胞のＰＴＰＲＺの活性に対する阻害効果の評価結果である。

【図8A】ＡＲ２７／リポソーム複合体によるＣ６細胞の細胞運動の抑制を示す図であり、ボイデンチャンバー法によるＣ６及びＲＺ-ＫＤ＃２の細胞移動に対するＡＲ２７／リポソーム複合体の効果とその定量評価結果である。

【図8B】ＡＲ２７／リポソーム複合体によるＣ６細胞の細胞増殖能の抑制を示す図であり、Ｃ６及びＲＺ-ＫＤ＃２の細胞増殖に対するＡＲ２７／リポソーム複合体の効果の定量評価の結果である。

【図9】Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ２／リポソーム複合体がＣ６細胞の細胞増殖能に及ぼす影響を示す図であり、ＡＲ２７類化合物でＰＴＰＲＺの阻害活性が著しく弱いｃｏｍｐｏｕｎｄ ２／リポソーム複合体を用いたコントロール実験の評価結果である。

【図10】ＡＲ２７／リポソーム複合体によるＣ６細胞の腫瘍形成の抑制を示す図であり、ＡＲ２７／リポソーム複合体投与群の腫瘍サイズを示す顕微鏡観察像と定量評価結果である。

【発明を実施するための形態】

【0045】

＜はじめに＞
蛋白質のチロシンリン酸化によるシグナリングは、細胞増殖、細胞接着・移動、細胞ー細胞間コミュニケーションといった様々な細胞機能の制御に関わっており、チロシン残基にリン酸基を付加するプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ファミリーと、その逆反応を担うプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーによって制御されている。元々、細胞のトランスフォーメーション（形質転換）因子として発見されたＰＴＫファミリーは、抗ガン剤の主要な創薬標的分子であり、既にｉｍａｔｉｎｉｂ、ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂなどの低分子のＰＴＫ活性阻害化合物がガン治療薬として上市されている（Nat Rev Cancer 11, 35-49, 2011）。一方、ＰＴＫファミリー分子に約１０年遅れて発見されたＰＴＰファミリー分子は、研究初期には基質特異性に欠けているとされ、あるＰＴＰ分子を阻害するとＰＴＫファミリー分子及びその基質分子が非特異的に活性化し、発ガンなどの副作用が生じると懸念された。しかしながら、これまでにＰＴＰファミリー分子のほとんどについてその遺伝子ノックアウトマウスが作出され、作出された３１分子のノックアウトマウス系統のうち２１系統は見かけ上正常に発育することから（本発明者らによる文献調査）、ＰＴＰ阻害剤の副作用リスクは小さいと考えられた。

【0046】

１９９９年、インスリンシグナルを抑制するＰＴＰファミリー分子の一つ、ＰＴＰ１Ｂのノックアウトマウスが作出され、このノックアウトマウスが見かけ上は正常に生育し、かつ高脂肪食による肥満が誘導されないことが判明し（Science 283, 1544-1548, 2000）、糖尿病に対する新薬開発を目的としてＰＴＰ１Ｂの選択的阻害剤の探索が行われるようになった。ＰＴＰ１Ｂ以外にも、ＳＨＰ-２の機能獲得（ｇａｉｎ-ｏｆ-ｆｕｎｃｔｉｏｎ）変異が小児白血病リンパ腫の原因であること、造血細胞に発現するＰＴＰ-ｌｙｐの機能獲得変異が自己免疫疾患（Ｉ型糖尿病、バセドウ病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス）と関わることから、創薬標的としての可能性が示されている（Nat Rev Mol Cell Biol 7, 833-846, 2006）。しかしながら現時点で、ＰＴＰファミリー分子を標的とする市販薬は未だ登場しておらず、ＰＴＰファミリー分子のホスファターゼ活性を阻害する化合物が、がん治療薬として有効であるという予見は、当該専門分野の研究者でも容易になされるものではない。

【0047】

本発明の創薬標的であるＰＴＰＲＺは、８つのサブファミリーに分類される受容体型ＰＴＰ（ＲＰＴＰ）のうちＲ５ＲＰＴＰサブファミリーに属している。このＲ５ＲＰＴＰサブファミリーにはＰＴＰＲＺとＰＴＰＲＧの２つの分子が存在する。中枢神経系に特異的に発現している。脳腫瘍の一つである神経膠腫（グリオーマ）の中で、最も悪性度が高い膠芽腫（グリオブラストーマ）では、とくにＰＴＰＲＺの発現が異常に増大していることが複数グループから報告されている（Nat Rev Cancer Res 66, 2271-2278, 2011）。ヌードマウスの脳内にヒトグリオブラストーマＵ２５１-ＭＧ細胞株を同所移植したモデル実験では、ＰＴＰＲＺのｓｉＲＮＡの導入によって脳腫瘍サイズが縮小することや、ヒトグリオーマＵ８７細胞株を移植したヌードマウスの腫瘍サイズの増大がＰＴＰＲＺの細胞外領域に対するイムノトキシンによって抑制されることが示されている（Cancer Res 66, 2271-2278, 2006）。これら先行知見は、神経膠腫の悪性化にＰＴＰＲＺの存在が関与していることを強く示唆しているが、その分子メカニズム、特にＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性が悪性化に寄与するのか否かは判っておらず、またＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性を選択的に阻害する化合物も知られていない。現在、神経膠腫に対する有効な治療法はなく、その新薬開発およびその開発に必須となる新規な分子標的を見出すことは重要であった。

【0048】

＜ラットＣ６グリオブラストーマの悪性表現型におけるＰＴＰＲＺの細胞内ホスファターゼ活性の関与＞
高度の浸潤性表現型を有するラットＣ６グリオブラストーマ細胞株は、グリオブラストーマの実験的モデルとして広く使われている（Science 161, 370-371, 1968; Cell Tissue Res. 310, 257-270, 2002）。Ｃ６細胞は、短いレセプター・アイソフォームＰＴＰＲＺ−Ｂを主に発現する（非特許文献１６参照）。

【0049】

また本発明者らもＣ６グリオブラストーマ細胞株にＰＴＰＲＺ−Ｂ受容体のタンパク質（分子サイズ２５０ ｋＤａ）を確認したが、このＰＴＰＲＺ−Ｂ以外にも、リガンド分子との相互作用に関わる細胞外領域を完全に欠失した細胞内領域タンパク質断片（Ｚ-ＩＣＦ， ７５ｋＤａ）がＣ６細胞株の細胞内に蓄積していることを見出した（図１Ｃ参照）。また、このＺ-ＩＣＦは、メタロプロテアーゼとγセクレターゼと介するタンパク質分解の結果生じることを確認した（非特許文献１３参照）。これらＺ-ＩＣＦは細胞内にあるため、細胞外領域に作用するような抗体や化合物などに対して非感受性であることは自明である。本発明者らは、ＰＴＰＲＺ（Ｚ-ＩＣＲ）の細胞内領域全体を過剰発現させることにより、大量のＺ-ＩＣＦがＣ６細胞の腫瘍形成性の特性に寄与しているかどうかを試験するため、Ｃ６細胞中で緑色蛍光タンパク質と融合させた。細胞の概ね半分が蛍光発光を示す条件下で、外因性Ｚ-ＩＣＲの全体的な発現は、内在性Ｚ-ＩＣＦと比較して数倍以上であった（図３Ａ参照）。ボイデンチャンバー分析により、Ｚ-ＩＣＲ過剰発現がＥＧＦによって誘発された細胞移動を著しく促進することを示したが、ホスファターゼが不活性のＩＣＲ変異体であるＺ-ＩＣＲ（ＣＳ）では、細胞移動の促進活性が認められなかった（図３Ａ、Ｂ参照）。このことは、神経膠芽腫の悪性化におけるＺ-ＩＣＦのホスファターゼ活性の因果的役割を示している。

【0050】

一方、他の神経膠芽腫細胞株で報告されるように、ＰＴＰＲＺのｓｉＲＮＡノックダウンにより、Ｃ６神経膠芽腫細胞の移動能が低下した（図１Ａ、Ｂ参照、および非特許文献１０及び１９参照）。Ｃ６細胞中のＰＴＰＲＺの安定したノックダウンによっても細胞移動と増殖が低下し、その影響はＰＴＰＲＺ発現の減少と相関していた（図１Ｃ、Ｄ、Ｅ参照）。生体内（インビボ、ｉｎ ｖｉｖｏ）でＰＴＰＲＺノックダウンの抗腫瘍効果を決定するために、本発明者らは、同系のＷｉｓｔｅｒ・ラットの脳に、親株（ｐａｒｅｎｔ）のＣ６細胞、もしくはＰＴＰＲＺをノックダウンされたＣ６細胞（ＲＺ-ＫＤ＃１及びＲＺ-ＫＤ＃２）を接種し、それらの腫瘍サイズをヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）染色によって評価した。腫瘍細胞接種後の７日目に実施した組織評価の結果は、ＰＴＰＲＺノックダウンされた細胞が形成した腫瘍巣は、Ｃ６細胞株のそれよりも有意に小さいと判明した（図１Ｆ参照）。

【0051】

本発明者らは以前、パキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎ）をＰＴＰＲＺの基質タンパク質と特定し、パキシリンの配列において１１８番目チロシン残基（Ｔｙｒ１１８）のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏ-Ｔｙｒ１１８）がＰＴＰＲＺによって選択的に脱リン酸化されることを突き止めた（J. Biol. Chem. 286, 37137-37146, 2011）。パキシリンは主要な接着タンパク質であり（Physiol. Rev. 84, 1315-1339, 2004）、パキシリンのＴｙｒ３１とＴｙｒ１１８のリン酸化はラット腹水肝癌細胞の細胞移動活性を制御している（Int. J. Cancer 97, 330-335, 2002）。ＰＴＰＲＺがノックダウンされたＣ６細胞から免疫沈降させたパキシリンのＴｙｒ１１８のリン酸化レベルは、親株のＣ６細胞のそれよりも有意に高く（図２Ｂ参照）、このことは、Ｃ６グリオブラストーマ細胞において、ＰＴＰＲＺによる基質タンパク質のリン酸化の調節が実際に行われていることを示している。またここでは、ＰＴＰＲＺのノックダウンによって細胞タンパク質の全体的なチロシンリン酸化パターンや、パキシリンのタンパク質発現自体が変化しないことが確認された（図２Ａ参照）。

【0052】

ＰＴＰＲＺの酵素活性ドメインの触媒サイトに直接作用する特異的抑制剤は存在していなかったが、これらの結果をもとにして、本発明者は、ＰＴＰＲＺに対して薬理学的に抑制する化合物を開発できれば、これを用いて、神経膠腫で最悪のグレードの膠芽腫の治療を実施できる可能性を初めて示すことができた。
＜Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＡＲ２７の阻害効果＞
本発明者らは、２，７−ナフタレンスルホン酸、３−ヒドロキシ−４−［（４−スルホ−１−ナフタレニル）アゾ］−トリソジウム塩（３ナトリウム塩））（以下ＡＲ２７と呼ぶ）が、試験管内において、ヒト由来のＰＴＰＲＺの酵素ドメインを含む細胞内全領域のタンパク質（以降、Ｚ-ＩＣＲと呼ぶ）が触媒する加水分解に対して阻害することを明らかにした。その阻害活性は、ＩＣ₅₀ ＝ ０．４ μＭであった。ＡＲ２７は、ＰＴＰＲＺと同じＲ５ＲＰＴＰサブファミリーに属するＰＴＰＲＧも強く阻害したが、他のＰＴＰ酵素に対する阻害ＩＣ₅₀値と比べて低く、ＡＲ２７がＰＴＰＲＺとＰＴＰＲＧに対して選択的阻害活性を有することが初めて見出された（図４）。

【0053】

＜ＡＲ２７によるＰＴＰＲＺ阻害の構造的基礎＞
ＡＲ２７は、アゾ染料である赤色２号（別名、アマランス）と同じ構造を有している（図４Ａ参照）。赤色２号と構造的に類似物は、食品添加物や化粧品などに広く使われており、一般に入手可能である。しかし、これら構造的類似化合物（以下ｃｏｍｐｏｕｎｄ ２からｃｏｍｐｏｕｎｄ １０と呼ぶ）は、ＡＲ２７と比較すれば、ＰＴＰＲＺに対する阻害活性は著しく低く（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ２からｃｏｍｐｏｕｎｄ ６）もしくは、全く無視しうる程度（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ７からｃｏｍｐｏｕｎｄ １０）であった（図５参照）。

【0054】

このＡＲ２７類似化合物の阻害評価の結果は、ＡＲ２７によるＰＴＰＲＺの活性阻害の作用機序に必要な構造に関して有用な情報を提供した。すなわち、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ２からｃｏｍｐｏｕｎｄ ４において阻害活性が弱まったことは、ＡＲ２７のジ・スルホネート・ナフタレン構造（図表示ではＡＲ２７の上側の半分の構造に相当）の２位に配座しているスルホネート基が阻害活性に極めて重要であることを示している。

【0055】

ｃｏｍｐｏｕｎｄ ５におけるＡＲ２７のナフタレン構造（図表示では、ＡＲ２７の下側半分の構造）の４位に配座しているスルホネートの除去、またｃｏｍｐｏｕｎｄ ６においてニトロナフタレン構造への置換によっても、阻害活性を大きく低下した。さらにまた、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ７とｃｏｍｐｏｕｎｄ ８におけるようにＡＲ２７の上側構造のみ、またはｃｏｍｐｏｕｎｄ ９とｃｏｍｐｏｕｎｄ １０のようにＡＲ２７の下側半分の構造だけにすると阻害活性は消失した。これらのことは、ＡＲ２７の２位のスルホネート以外にも、その化学構造全体が阻害活性に寄与することを示している。

【0056】

さらにＡＲ２７の阻害活性に関与するＰＴＰＲＺの細胞内ＰＴＰドメイン内のアミノ酸残基を特定するために、本発明者らは、部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ-ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を実施した。ここでは、５つの候補アミノ酸残基に関して総計６つの変異体酵素を作成した。これら変異体の酵素活性は、野生型のそれに比べて減少していたため（図６Ａ，Ｂ参照）、変異型と野生型酵素で同じ活性になるよう希釈調整した酵素溶液を用いて阻害剤に対する感受性の評価を実施した（図６Ｃ参照）。

【0057】

ヒト由来のＰＴＰＲＺの１７５８番目のアスパラギン残基（Ａｓｎ１７５８）については、ＡＲ２７によって阻害されないＣＤ４５やＰＴＰ１Ｂといった他のＰＴＰ分子で相当する位置に存在するアスパラギン酸残基（Ａｓｐ）に置換した。その変異型酵素（Ｎ１７５８Ｄ）は、非特異的なＰＴＰ阻害剤であるバナジン酸の阻害感受性は変化することなしに、ＡＲ２７とその類似化合物であるｃｏｍｐｏｕｎｄ ５による阻害効果に対して明確に抵抗性を示した。一方、Ｎ１７５８Ｄ変異体酵素は、ＡＲ２７のジ・スルホネート・ナフタレン構造において２位に配座しているスルホネート基を欠いたｃｏｍｐｏｕｎｄ ３やｃｏｍｐｏｕｎｄ ４に対する感受性は野生型酵素と同程度であった。この結果は、ＡＲ２７の２位のスルホネート基とＡｓｎ１７５８の側鎖中のアミノ基との間に特異的な相互作用を示唆した。

【0058】

ＰＴＰの基質認識に関わる領域に存在する１７５６番目のチロシン残基（Ｔｙｒ）をフェニルアラニン残基に置換した（Ｙ１７５６Ｆ）は、ＡＲ２７だけでなくｃｏｍｐｏｕｎｄ ３、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ５についても感受性が低下した。このことは、Ｔｙｒ１７５６がＡＲ２７及び類似化合物の阻害活性の発現に重要であることを示している。ここで検討した他の変異体型酵素に関しては、ＡＲ２７及び類似化合物に対する感受性は影響はしないことが判明した。

【0059】

以上の結果からは、ＰＴＰＲＺのＰＴＰドメイン内に存在する１７５８番目のアスパラギン残基は、ＡＲ２７の２位に配座しているスルホネート基と相互作用し、選択的阻害活性に対して必須的な役割を担っていると判断される。そして、Ｔｙｒ１７５６に関してであるが、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ７からｃｏｍｐｏｕｎｄ １０が全くＰＴＰＲＺを阻害しないことからは、ＡＲ２７の構造で二つのナフタレン環を繋ぐアゾ結合が阻害活性に関わると推測可能である。このアゾ結合は、ＡＲ２７及びｃｏｍｐｏｕｎｄ ３、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ５に共通する構造であり、Ｔｙｒ１７５６をフェニルアラニン残基に置換することで阻害活性が低下したことからは、Ｔｙｒ１７５６の水酸基がアゾ結合と相互作用し、阻害活性に関わっているものと推測される。

【0060】

＜リポソームを用いたＡＲ２７の細胞内導入と、それによるグリオブラストーマの増殖及び移動能の抑制＞
ＡＲ２７は、３つのスルホネート基を有しており、負に強く荷電しているため、そのままでは細胞膜を通過せず、生きた細胞内に取り込まれないため、細胞内に存在するＰＴＰＲＺの酵素ドメインに作用することはできない。本発明者らは陽イオン性のリポソーム試薬を用いて、ＡＲ２７は生きた細胞に導入できることを見出し、さらにこのリポソームを用いたＡＲ２７の細胞内への導入には至適の混合比が存在することを明らかにした（図７Ｃ、および図７Ａ，Ｂ参照）。最適化された混合比で調整されたＡＲ２７／リポソーム複合体によって、シャーレ内で培養されたＣ６グリオブラストーマを処理すると、ＰＴＰＲＺの基質タンパク質であるパキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎ）のチロシンリン酸化は、無処理細胞に比べて有意に上昇した（図７Ｄ参照）。一方、ＡＲ２７単独もしくは、リポソーム単独で処理されたＣ６細胞ではパキシリンのリン酸化は変化しない。これらのことは、細胞内取り込まれたＡＲ２７がＰＴＰＲＺの活性を阻害した結果を反映していると考えられる。さらにＡＲ２７／リポソーム複合体を用いた処理において、細胞全タンパク質の抽出物のチロシンリン酸化パターン（及び抽出物中のパキシリン量）に変化は認められなかった（図７Ｄ参照）。この結果は、ＡＲ２７／リポソーム複合体が、細胞内で選択的にＰＴＰＲＺに作用していることを示すものと判断された。

【0061】

グリオーマの治療という観点から、ＰＴＰＲＺの薬理学的阻害の有効性を評価するために、本発明者らは、Ｃ６グリオブラストーマ細胞株に対するＡＲ２７／リポソーム複合体の効果を検討した。シャーレ内で培養されたＣ６細胞の増殖速度は、ＡＲ２７／リポソーム複合体の存在下では用量依存的に低下することが判明した。一方、ＰＴＰＲＺタンパク質の発現をノックダウンしたＣ６細胞株にＡＲ２７／リポソーム複合体を作用させても、その細胞増殖は変化しなかった（図８Ｂ参照）。このことは、ＡＲ２７／リポソーム複合体による細胞増殖の抑制効果が、ＰＴＰＲＺの活性阻害によるものであることを示している。また細胞増殖と同様に、細胞移動能についてもＡＲ２７／リポソーム複合体は、ＰＴＰＲＺ依存的に抑制することが判明した（図８Ａ参照）。

【0062】

一方、ＰＴＰＲＺに対する阻害活性が著しく低いｃｏｍｐｏｕｎｄ ２は、ＡＲ２７と同様にリポソームと混合してもＣ６細胞の増殖に有意な影響を与えなかった（図９参照）。

【0063】

＜ＡＲ２７／リポソーム複合体を用いたグリオブラストーマの腫瘍形成の抑制＞
最後に、本発明者らは、ＡＲ２７／リポソーム複合体が、Ｗｉｓｔｅｒラット頭蓋内へのＣ６グリオブラストーマの同種同所移植モデルにおける腫瘍形成を抑制するかについて評価を実施した。その結果、溶媒投与群やｃｏｍｐｏｕｎｄ ２／リポソーム複合体投与群に比べて、ＡＲ２７／リポソーム複合体の投与群の腫瘍サイズは、有意に小さいことが判明し（図１０参照）、ＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性の薬理学的阻害は、神経膠腫（グリオーマ）や膠芽腫（グリオブラストーマ）、そしてＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性が悪性化に寄与している腫瘍に対して新規な治療の種類になると結論された。

【0064】

＜小括＞
本発明では、まずＰＴＰＲＺの触媒活性が細胞移動、増殖とラットＣ６グリオブラストーマ細胞の悪性表現型に関与することを示した。次に、ＡＲ２７がＰＴＰＲＺに対する強力な阻害剤であることと、選択的阻害の構造的基礎を示した。そして、ＡＲ２７／リポソーム複合体によってＣ６グリオブラストーマ細胞株の細胞移動能、細胞増殖能、腫瘍形成が有意に抑制されることを実証した。

【0065】

＜補足説明＞
グリオーマの悪性化へ対するＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性の関与には、これまで大きな疑問が残されていた。ヘパリン結合性成長因子（プレイオトロフィンまたはミッドカイン）は、ＰＴＰＲＺの細胞外領域に結合することでＰＴＰＲＺ受容体の２量体化（もしくはオリゴマー化）を誘導し、その結果、細胞内のホスファターゼ活性が抑制されることが明らかになっている（J. Biol. Chem. 274, 12474-12479, 1999; Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 6593-6598, 2001; FEBS Lett. 580, 4051-4056, 2006）。しかしながら、プレイオトロフィンやミッドカインは、神経膠腫を含む多くの腫瘍において発現増加が認められており、しかもそれらの発現増加は腫瘍の悪性化に寄与すると報告されている（J. Biol. Chem. 280, 26953-2664, 2005）。これらの先行知見は、腫瘍細胞に発現するＰＴＰＲＺは、リガンド分子と結合し、細胞内ホスファターゼ活性は不活性状態にあることを示唆しており、すなわち、ＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性を阻害することは、ガンの悪性化につながるとの予見を与えるものであった。

【0066】

本発明者らは以前、ＰＴＰＲＺ受容体型アイソフォームがマトリックス・メタロプロテアーゼなどによって細胞表面で細胞外ドメインの切断を受けることを見出し、膜係留断片はγセクレターゼによってさらに消化され、細胞質断片（Ｚ-ＩＣＦ）が、細胞質と核に放出されることを見出している（非特許文献１３参照）。メタロプロテアーゼ活性がガン細胞の腫瘍の成長と侵入において重要な役割を果たすことはよく知られている（FEBS J. 278, 16-27, 2011）。この点について、本発明者らは、Ｃ６グリオブラストーマ細胞には、ＰＴＰＲＺ-Ｂの全長タンパク質だけでなく、細胞内断片Ｚ-ＩＣＦが著しく蓄積していることを見出した。ＰＴＰ活性を有するＰＴＰＲＺの細胞内タンパク質断片を過剰発現させることで、ガン悪性度を示す有力な指標の一つである細胞移動が高まり、一方、ＰＴＰ活性を欠失させた変異型の細胞内断片を発現させても細胞移動能は変化しないことを初めて明らかにした。

【0067】

プレイオトロフィンやミッドカインのようにＰＴＰＲＺの細胞外領域に結合してＰＴＰＲＺ受容体の働きを抑制するようなリガンド分子では、細胞内のＺ-ＩＣＦの活性が抑制されないことは自明である。すなわち、ガン細胞などに多く存在する細胞内のＺ-ＩＣＦのホスファターゼ活性を阻害するためには、細胞内のホスファターゼ活性に直接作用するＡＲ２７のような化合物が必須であることは明らかである。このことを鑑みれば、「ＰＴＰＲＺのホスファターゼ活性の阻害剤がグリオーマの治療薬になる可能性」は、本発明によって初めて実証されたことであると判断される。

【実施例】

【0068】

以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
以下の実施例において、用いた薬品に関する説明、及び用いた手法を以下に示す。
化学品（用いた材料）
ＡＲ２７の高純度化学品；２、７−ナフタレンスルホン酸、３-ヒドロキシ-４-［（４-スルホ-１-ナフタレニル）アゾ］−、三Ｎａ塩（２，７-Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ， ３-ｈｙｄｒｏｘｙ-４-［（４-ｓｕｌｆｏ-１-ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ） ａｚｏ］-， ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）は、シグマ（ＳＩＧＭＡ）社からから購入した（カタログ番号８７６１２）。

【0069】

ニューコクシン（ｎｅｗ ｃｏｃｃｉｎｅ，本明細ではｃｏｍｐｏｕｎｄ ２と呼ぶ）は、和光純薬工業（Ｗａｋｏ ｐｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）社から購入した（カタログ番号１１４７-０６５４２）。
赤色１３号（ａｃｉｄ ｒｅｄ １３、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ３、カタログ番号Ａ１２４３）、赤色８８号（ａｃｉｄ ｒｅｄ ８８、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４、カタログ番号Ｆ００８７）、ボルドーレッド（ｂｏｒｄｅａｕｘ ｒｅｄ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ５、カタログ番号Ｂ０７７９）、β−ナフトールバイオレット（β-ｎａｐｈｔｈｏｌ ｖｉｏｌｅｔ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ６
、カタログ番号Ｎ００３７）、二ナトリウム １−ニトロソ−２−ナフトール−３，６−ジスルホネート一水和物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ １-ｎｉｔｒｏｓｏ-２-ｎａｐｈｔｈｏｌ-３， ６-ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ７、カタログ番号Ｎ０２６８）、二ナトリウム ３−ヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ３-ｈｙｄｒｏｘｙ-２， ７-ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ８、Ｎ００２９）、４−アミノ−１−ナフタレンスルホン酸（４-ａｍｉｎｏ-１-ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ９、カタログ番号Ａ０３４４）、ナトリウム−１−ナフタレンスルホン酸塩（ｓｏｄｉｕｍ １-ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ １０、カタログ番号Ｎ００１５）は、東京化成工業（Ｔｏｋｙｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ）社から購入した。

【0070】

Ａ 発現プラスミド及び組み換え酵素
ヒト由来のＰＴＰＲＺ（ジーンバンクアクセッションナンバー（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．）Ｍ９３４２６）、ヒト由来のＰＴＰＲＡ（Ｍ３４６６８）、ヒト由来のＰＴＰＲＭ（Ｘ５８２８８）、ヒト由来のＰＴＰＲＧ（ＮＭ＿００２８４１）、ヒト由来のＰＴＰＲＳ（ＮＭ＿００２８５０）、ヒト由来のＰＴＰＮ１（ＮＭ＿００２８２７）及び、ヒト由来のＰＴＰＮ６（ＮＭ＿００２８３１）をコードするｃＤＮＡは、ヒト全ＲＮＡを鋳型とした逆転写ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）によって取得した。

【0071】

これらの取得したｃＤＮＡを鋳型とし、それぞれのＰＴＰドメインを含む領域をコードする部分、すなわち、ＰＴＰＲＺの細胞内全領域に相当するアミノ酸残基１６９８番目から２３１５番目まで、ＰＴＰＲＡの細胞内全領域に相当する２１８番目から８０７番目、ＰＴＰＲＭの細胞内全領域に相当する７６５番目から１４５２番目まで、ＰＴＰＲＧの細胞内全領域に相当する７９０番目から１４４５番目、ＰＴＰＲＳの細胞内全領域に相当する１３０４番目から１９４８番目、ＰＴＰＮ１のＰＴＰドメインに相当する１番目から３２１番目及び、ＰＴＰＮ６のＰＴＰドメインに相当する２２０番目から５２３番目をＰＣＲ法によって増幅し、そのｃＤＮＡ断片を取得した。ＰＴＰＲＢに関しては、マウス由来の細胞内領域をコードするｃＤＮＡ(J. Biol. Chem. 288, 23421-23431, 2013)を用いた。

【0072】

それらのｃＤＮＡは、大腸菌発現ベクターｐＧＥＸ-６Ｐ（ジーイーヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製）に挿入し、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現、これらをグルタチオンアフィニティー精製法によって精製し、組み換えＰＴＰ酵素標品として取得した。
ＰＴＰＲＺ酵素ドメインの点変異体の作成は、市販のクイックチェンジマルチサイト−ディレクテド突然変異生成キット（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ-ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用いて実施した。

【0073】

ＥＧＦＰ融合ＰＴＰＲＺ−ＩＣＲ（野生型またはそのＰＴＰ不活性ＣＳ変異体）タンパク質を発現するｐＥＧＦＰ−ＰＴＰＲＺＩＣＲ（ＷＴ）もしくはｐＥＧＦＰ−ＰＴＰＲＺＩＣＲ（ＣＳ）は、その対応するｃＤＮＡを公知のプラスミドより増幅（J. Biol. Chem. 286, 37137-37146, 2011）し、ｐＥＹＦＰ-Ｃ１ベクター（クローンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）製）へ挿入して作成した。

【0074】

マウス・ラットＰＴＰＲＺ ｓｈＲＮＡプラスミド（ＴＲＣ番号：ＴＲＣＮ０００００８１０６９）、ラットＰＴＰＲＺ ｓｉＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ ＩＤ：ＳＡＳＩ＿Ｒｎ０１＿０００５３２８１）、およびその混合された（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｉＲＮＡは、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）社から購入できる。

【0075】

Ｂ ＩＣ₅₀の決定
酵素アッセイの溶媒は、１００ μｇ／ｍｌの牛血清アルブミン、５ ｍＭのＤＴＴ、０．０１％のＢｒｉｊ３５（登録商標）を含んだ１００ ｍＭの酢酸、５０ ｍＭのトリスと５０ ｍＭのビス・トリス（Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ）がアッセイ用緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。ＰＴＰ酵素のホスファターゼ活性に対する化合物の阻害効果は、ＤｉＦＭＵＰ（６，８-Ｄｉｆｌｕｏｒｏ-４-Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ライフテクノロジー社）などの人工基質を用いた。１００ μｌの酵素を含むアッセイ用緩衝液に評価検体となる阻害物質を加えて、室温にて２時間程度静置する。ここで用いる酵素量は、使用する評価機器に合わせて適当な速度なるように調整することが望ましい。酵素反応は、１００ μｌの４０ μＭ ＤｉＦＭＵＰを含むアッセイ用緩衝液を加えることで開始させる。ＤｉＦＭＵＰの加水分解の速度は、分光蛍光計（ＦＩ-４５００、日立社製）を使用し、蛍光強度（検出は４５５ ｎｍ、励起波長は３５８ ｎｍ）の増加としてモニターした。阻害活性（％）は、（１−阻害検体を添加した際の蛍光強度の増加速度／溶媒添加した際の蛍光強度の増加速度）×１００で算出した。ＩＣ₅₀は、５０％阻害を挟むに２点のデータから公知の計算手法によって算出した。

【0076】

ＰＴＰＲＺに対するＡＲ２７及び化学的類似体の阻害活性及びＰＴＰＲＺの変異体を用いた阻害活性の評価には、ホスホチロシン模倣のホスホクマリル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ-ｍｉｍｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｃｏｕｍａｒｙｌ）アミノ・プロピオン酸（ｐＣＡＰ）を結合したペプチド基質配列（特開2011-178697; J. Biol. Chem. 286, 37137-37146, 2011）を含むｐＣＡＰ-ＧＩＴ１_549-556はＰＴＰＲＺの基質として生理的な基質タンパク質のものに近くより適している。ｐＣＡＰ残基の加水分解は、分光蛍光計（ＦＩ-４５００、日立社製）により４６０ ｎｍの蛍光（３３４ ｎｍの励起波長）の増加として定量評価した。阻害効果は溶媒のコントロールとの相対値として示した。

【0077】

Ｃ ＡＲ２７／リポソーム複合体の調製
ＡＲ２７と混合するリポソーム及びリポソーム原料は、カチオン性のものが適当である。本発明では、インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、登録商標、（Ｃａｔ ｎｏ． １１６６８-０２７）を用いた。リポフェクタミン２０００溶液を適当な溶媒で２５倍に希釈した後、室温で５分間インキュベートした。このリポソーム溶液に対して、同じ溶媒で２ ｍＭに希釈したＡＲ２７を等容積で加え、３０分間インキュベートした。この反応液を１ ｍＭのＡＲ２７を含むＡＲ２７／リポソーム複合体とした。リポソーム試薬及び化合物の希釈に用いる溶媒は、培養細胞実験用の場合は、培地と同等の成分が望ましく、本発明では、Ｏｐｔｉ-ＭＥＭ（ｘ１）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｃａｔ ｎｏ． ５１９８５-０３４、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、登録商標））を使用した結果である。また脳室内投与実験では、脳室内に安全に投与できる溶媒が望ましく、本発明では、０．９％のＮａＣｌ（生理食塩水）をした。

【0078】

Ｄ 細胞培養と遺伝子導入法
ラットＣ６グリオブラストーマ細胞は、５％のＣＯ₂、３７℃の加湿インキュベーター中で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１００ Ｕ／ｍｌ ペニシリン−ストレプトマイシンを含む、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ、ｃａｔ ｎｏ． １１９９５-０６５、ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で培養、継代維持した。遺伝子導入には、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ａｍａｘａ社製）を用い、メーカ推奨のプログラムを用いて、２×１０⁶個の細胞あたり、プラスミドであれば１ μｇ程度、ｓｉＲＮＡであれば１００ ｐｍｏｌ程度でエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ）法によって実施した。遺伝子導入操作後の細胞は、２４〜３６時間の培養した後、移動移動能や細胞増殖試験のために使用できる。ＰＴＰＲＺの発現を安定的にノックダウンしたＣ６細胞系統は、ＰＴＰＲＺに対するｓｈＲＮＡプラスミドを導入後に、薬剤耐性マーカーであるピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）の存在下（５ μｇ／ｍｌ）で、限界希釈法によって選別し、取得した。

【0079】

Ｅ ＡＲ２７／リポソーム複合体の細胞内取り込み量の評価
ＡＲ２７やＡＲ２７／リポソーム複合体の細胞内への直接導入は、微量試薬注入装置（フェムトジェットＢ５２４７とインジェクトマンＮＩ２、エッペンドルフ社製）を用いて実施した。ＡＲ２７／リポソーム複合体は要事調製が望ましい。Ｃ６細胞（１ウエルあたり１．５×１０⁴セル程度）を、２４ウエルのプラスチック製の培養皿に播種し、１０％のＦＢＳを含む５００ μｌのＤＭＥＭで細胞培養した。翌日、ウエル内の培地を５００ μｌ のＯｐｔｉ-ＭＥＭに交換した後、同じ培地で適時希釈したＡＲ２７／リポソーム複合体を１００ μｌ添加し、それぞれのアッセイにおいて適切な時間インキュベーションした。

【0080】

細胞内に取り込まれたＡＲ２７の観察は、ＡＲ２７を直接注入した場合、その直後から、ＡＲ２７／リポソーム複合体の場合は、添加して３時間後、培地中に含まれるＡＲ２７／リポソーム複合体を新しいＯｐｔｉ-ＭＥＭ培地と交換してから実施した。蛍光顕微鏡（ＢＺ-８０００、キーエンス社製）を用い、励起波長、５６０／４０ ｎｍ、蛍光波長、６３０／６０ ｎｍのフィルターを用いて蛍光観察した。

【0081】

細胞内へ取り込まれたＡＲ２７の定量評価は以下のように実施した。５００ μｌのＣ６細胞懸濁液（1×１０⁶個の細胞がＯｐｔｉ-ＭＥＭ培地に懸濁された）に対して、Ｏｐｔｉ-ＭＥＭ培地で適時希釈されたＡＲ２７／リポソーム複合体を含む溶液を１００ μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。一般的なリン酸緩衝液で細胞を遠心洗浄した後、細胞中に取り込まれたＡＲ２７を１００ μｌのメタノールで抽出した。遠心分離後により不要物を取り除いた後、抽出されたＡＲ２７量を５２５ ｎｍの吸光度で測定した。吸光度計にはマイクロプレートリーダー（ＳＨ-９０００Ｌａｂ、コロナ電気会社製）を用いた。

【0082】

Ｅ ボイデンチャンバー分析（細胞移動能の評価）
ボイデンチャンバー分析は、８ μｍ孔サイズの膜（ケモタクシセル、クラボー（Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｃｅｌｌ、Ｋｕｒａｂｏ）社製）と２４ウエルのプラスチック製組織培養プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）でトランスウエル・インサート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓ）を使って常法に従い実施した。具体的には、検体となる細胞を１００ μｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＯｐｔｉ-ＭＥＭ培地中に懸濁し、ラミニン（１０ μｇ／ｍｌ）で被覆されたトランスウエル・インサートに、１ウエルあたり１．５×１０⁵細胞で播種した。下部チャンバーは、細胞遊誘引物質として上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地で満たした。細胞播種の３時間後、１０％の中性のホルマリンにより細胞を固定し、ＤＡＰＩ（４'、６-ジアミジノ-２-フェニルインドール）により細胞核を蛍光染色した。蛍光顕微鏡観察下の観察では、まず、トランスウエルに存在する全細胞数をＤＡＰＩの蛍光シグナルとしてカウントし、次に、ウエル上部に存在する細胞を綿棒を用いて除去し、ウエル下部の表面まで移動した細胞のみの細胞数を計測し、これを細胞移動能として評価した。

【0083】

ＡＲ２７／リポソーム複合体は、同じ培地で適切な濃度に希釈した後、検体細胞の懸濁液（１ ｍｌにつき６×１０⁵細胞）に対して、体積比で５分の１量を添加した。この細胞懸濁液を３７℃で１時間インキュベーションした後、トランスウエル・インサートに播種し、２時間後に細胞数の計測を実施した。

【0084】

Ｆ 細胞増殖能の評価
細胞増殖の評価は常法に従って実施した。具体的には、一般的な２４ウエルのプラスチック製細胞培養皿（１ウエルにつき１．５×１０⁵細胞）に検体細胞を播種し、１０％のＦＢＳを含む５００ μｌのＤＭＥＭで適当時間まで培養し、細胞数をカウントした。ＡＲ２７／リポソーム複合体の評価においては、検体細胞をウエルに播種して１時間後に、２％のＦＢＳを含む５００ μｌのＯｐｔｉ-ＭＥＭに培地交換し、この培地で希釈したＡＲ２７／リポソーム複合体を１００ μｌ添加し、指定時間まで培養した。培養皿上で生育した細胞は、トリプシン処理によって剥離・回収し、一般的な血球計盤を用いて顕微鏡下で計数した。

【0085】

Ｇ 免疫沈降とウエスタンブロット解析を用いた評価
免疫沈降とウエスタンブロット解析は常法に従い実施した。具体的には、細胞タンパク質の抽出には、２０ ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１％のＮＰ-４０、１５０ ｍＭのＮａＣｌ、１０ ｍＭのＮａＦ、１ ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム塩（ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ）、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡフリー（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ-ｆｒｅｅ）、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製）を溶解緩衝液として用いた。細胞抽出物中に混在する抗体成分は、プロテインＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）セファロース（ＧＥヘルスケア社製）を用いた吸着処理により除去した。この抽出物に対して、マウス抗パキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎ）抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）とプロテインＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）セファロースを加えた。プロテインＧセファロースに吸着・回収されたパキシリンの免疫複合体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離した後、電気的ブロッティング法を用いて重合ビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜上に転写した。ウエスタン解析のために、タンパク質が転写されたＰＶＤＦ膜は、ブロッキング溶液（１０ ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ ｍＭのＮａＣｌ中に４％の脱脂粉ミルクと０．１％のトリトンＸ-１００が含まれる）でブロッキングの前処理を行った。リン酸化されたタンパク質を検出する場合のブロッキング溶液には、１０ ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ ｍＭのＮａＣｌ中に１％のＢＳＡと０．１％のトリトンＸ-１００が含まれる溶液を用いた。その後、ＰＶＤＦ膜は、同じブロッキング溶液で希釈した特異抗体で一晩静置し、ＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用いて検出した。

【0086】

Ｈ Ｃ６グリオブラストーマ細胞の脳内同種移植、ＡＲ２７／リポソーム複合体の脳室内投与および、その組織学的な評価
この発明で行った動物実験は、大学共同利用機関法人自然科学研究機構動物実験規程に基づき設置された自然科学研究機構岡崎３機関動物実験委員会の承認を得て実施された。すべての手術はイソフルラン麻酔下で行われ、実験動物の苦しみを最小限にするよう細心の注意が払われて実施された。

【0087】

具体的には、イソフルラン麻酔下のＷｉｓｔｅｒラット（オス、３週齢）を脳定位固定装置に固定し、検体グリオブラストーマ細胞を一般的なリン酸バッファーに懸濁（５ μｌあたり ５×１０⁵細胞）し、ハミルトン注射器を用いて頭蓋表層から５ ｍｍの深さにある線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）の部位に移植した。脳定位手術では、検体化合物の脳室内（ＩＣＶ）投与のために、ステンレス・ガイド・カニューレ（ｓｔａｉｎｌｅｓｓ ｇｕｉｄｅ ｃａｎｎｕｌａ）（太さ２２ゲージ、長さ７．４ ｍｍ）を左側脳室内に挿入した。

【0088】

グリオブラストーマ細胞を移植した翌日から、ＡＲ２７／リポソーム複合体などの検体化合物を含む溶液をガイドカニューレを介して投与した。投与量は、５ μｌであり、およそ５分間かけて注入した。術後すべての動物は、予期せぬ苦しみが生じていないか、異常な行動などがないかを毎日観察した。移植手術から７日後に、常法に従って、ホルマリン灌流固定した動物から全脳を取り出し、パラフィン包埋脳の連続冠状切片（切片圧７ μｍ）を作成した。ヘマトキシリン染色した連続切片を顕微鏡撮影し、その腫瘍巣の領域を一般的な画像ソフト上で目視にて特定し、その領域の面積を算出した。腫瘍体積は、全切片の腫瘍面積に切片厚を乗じて換算した。

【0089】

以下、図面による結果により本発明を説明する。
例１
図１Ａ〜図１Ｆは、ＰＴＰＲＺノックダウンによってＣ６グリオブラストーマ細胞の悪性度が低下したことを示す図である。
図１Ａにおいては、ＰＴＰＲＺに対する特異的なｓｉＲＮＡ（ＳＡＳＩ＿Ｒｎ０１＿０００５３２８１、シグマ−アルドリッチ）及びコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ）をＣ６細胞に導入し、２４から３６時間培養した後、それらの細胞抽出物を、抗ＰＴＰＲＺ-Ｓ抗体（全てのＰＴＰＲＺアイソフォームの細胞外領域を認識する特異抗体、非特許文献１３参照）を用いてウエスタンブロット解析したもの（図１Ａの左側）と、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）によりタンパク質染色したもの（図１Ａの右側）である。図１Ａの左側及び右側の図の縦方向は分子サイズ（単位はｋＤａ）を示す。図１Ａの結果から、Ｃ６グリオブラストーマ細胞における主要な発現アイソフォームがＰＴＰＲＺ-Ｂであること、そしてＰＴＰＲＺに対するｓｉＲＮＡによってノックダウンされたことが分かる。

【0090】

実験方法は、前記Ｄの細胞培養と遺伝子導入法と、Ｇの免疫沈降とウエスタンブロット法を参照。

【0091】

例２
図１Ｂにおいては、例１（図１Ａ）に示したＰＴＰＲＺのｓｉＲＮＡでノックダウンしたＣ６細胞とコントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞の運動能をボイデンチャンバー法によって評価した結果（図１Ｂの左側）である。

【0092】

ＰＴＰＲＺのノックダウンによって細胞運動能は、ｓｃｒａｍｂｌｅコントロールに比して有意に低下した。すなわち、図１Ｂの右側に配置したグラフにおいて「＊」で示されるように、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定においてｐ ＜ ０．０５と有意差を示した。データは平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ５）である。
実験方法は、前記Ｅのボイデンチャンバー分析を参照。

【0093】

例３
図１Ｃにおいては、ｓｈＲＮＡ含有プラスミドを用いてＰＴＰＲＺを安定的にノックダウンしたＣ６細胞株を作成、取得したことを示す（図中、ＲＺ-ＫＤ＃１及び＃２として表示）。ＰＴＰＲＺが発現したものを抗ＲＰＴＰβ抗体（ＰＴＰＲＺの細胞内領域を認識する特異抗体、非特許文献１３参照）を用いたウエスタンブロットにより解析したもの（図１Ｃの左側）とクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色したもの（図１Ｃの右側）を示す。ＲＺ-ＫＤ＃２では、ＰＴＰＲＺ-Ｂタンパク質とその細胞内タンパク質断片であるＺ-ＩＣＦがほぼ消失していることが分かる。

【0094】

実験方法は、前記Ｇの免疫沈降とウエスタンブロット法を参照。

【0095】

例４
図１Ｄにおいては、例３（図１Ｃ）に示した親細胞株（ｐａｒｅｎｔ）のＣ６細胞及びＣ６細胞由来のＰＴＰＲＺの安定的ノックダウン細胞株（ＲＺ-ＫＤ＃１及びＲＺ-ＫＤ＃２）の細胞増殖能を評価した結果を示す。培養プレートに播種して１時間後の細胞数に違いはなく、ＰＴＰＲＺのノックダウンによって細胞接着性は変化していないことが分かる。一方、細胞播種して２５及び４９時間後の細胞数は、ＰＴＰＲＺのノックダウン細胞株で有意に低下した。すなわち、図１Ｄのグラフにおいて「＊」で示されるように、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定においてｐ ＜ ０．０５と有意差を示した。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ４）である。ＰＴＰＲＺの安定的ノックダウンによって細胞増殖が低下したことが分かる。

【0096】

実験方法は、前記Ｆの細胞増殖分析を参照。

【0097】

例５
図１Ｅにおいては、ボイデンチャンバー法による細胞運動能の評価の結果を示す。ＰＴＰＲＺの安定的ノックダウンによって細胞運動能は有意に低下したすなわち、図１Ｅのグラフにおいて「＊＊」で示されるように、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定においてｐ ＜ ０．０１と有意差を示した。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ５）である。

【0098】

実験方法は、前記Ｅのボイデンチャンバー分析を参照。

【0099】

例６
図１Ｆにおいては、Ｃ６細胞及びＰＴＰＲＺのノックダウンＣ６細胞株の腫瘍形成を、同種同所移植モデルを用いて評価した結果を示す。ラットの脳内移植して１週間後の脳組織（冠状断面）における腫瘍形成部位のヘマトキリン染色像を示す。下側のパネルは、上側パネルの四角で囲った区域の拡大図である。スケール・バーは１ ｍｍ。右側のグラフは、脳の連続切片から測定される個々の腫瘍容積をプロットしたものである（ｎ ＝ ６）。グラフ中の水平バーは、それぞれのグループの平均値である。図１Ｆのグラフにおいて「＊」で示されるように、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定においてｐ ＜ ０．０５と有意差を示した。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ５）である。このことからＰＴＰＲＺノックダウン細胞株の腫瘍サイズの成長は、親細胞株に比べて有意に抑制されることが分かる。

【0100】

実験方法は、前記ＨのＣ６グリオブラストーマ細胞の脳内同種移植、ＡＲ２７／リポソーム複合体の脳室内投与および、その組織学的な評価を参照。

【0101】

例７
図２Ａ〜図２Ｂは、ＰＴＰＲＺノックダウンによるＰＴＰＲＺの基質分子のチロシンリン酸化の上昇を示す図である。

【0102】

図２Ａにおいては、Ｃ６細胞（ｐａｒｅｎｔ）及びＲＺ-ＫＤ＃２細胞株における全細胞タンパク質のチロシンリン酸化状態とｐａｘｌｌｉｎ（ＰＴＰＲＺによって脱リン酸化される基質分子）の発現量をウエスタンブロットで解析した結果である。この結果より、全タンパク質のチロシンリン酸化とｐａｘｉｌｌｉｎの発現量に変化は認められないことが分かった。

【0103】

実験方法は、前記Ｇ 免疫沈降とウエスタンブロット法も参照）

【0104】

例８
図２Ｂにおいては、ｐａｘｉｌｌｉｎに対する特異抗体を用いて免疫沈降したｐａｘｉｌｌｉｎのチロシンリン酸化状態を評価した結果を示す。図２Ｂの右側のグラフにおいて「＊」で示されるように、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定においてｐ ＜ ０．０５と有意差を示した。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ３）である。このことからｐａｘｉｌｌｉｎ上のＰＴＰＲＺの脱リン酸化サイトのリン酸化は、ＲＺ-ＫＤ＃２ において有意に上昇したことが分かった。

【0105】

実験方法は、前記Ｇ 免疫沈降とウエスタンブロット法を参照。

【0106】

例９
図３Ａ〜図３Ｂは、ラットＣ６グリオブラストーマ細胞のＰＴＰＲＺの細胞内フラグメントの過剰発現によるＣ６細胞の悪性度の亢進を示す図である。
図３Ａにおいては、Ｃ６細胞にチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインを有するＰＴＰＲＺの細胞内全域フラグメント（Ｚ-ＩＣＲ）と蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）との融合タンパク質（ＥＧＦＰ-Ｚ-ＩＣＲ（ＷＴ））及び、ホスファターゼ活性に必須のシステイン残基をセリン残基に置換した変異体（ＥＧＦＰ-Ｚ-ＩＣＲ（ＣＳ））を発現する細胞の抽出物をＰＴＰＲＺの細胞内エピトープに対する抗ＲＰＴＰβを用いてウエスタンブロット解析した結果（左側図）、また分析に用いたタンパク質の総量をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって検証した結果（右側図）を示す。ＥＧＦＰ-Ｚ-ＩＣＲ（ＷＴ）及びＥＧＦＰ-Ｚ-ＩＣＲ（ＣＳ）に由来するタンパク質のバンドは、ＥＧＦＰ-ＰＴＰＲＺ-ＩＣＲｓと表示している。

【0107】

実験方法は、前記Ｄの細胞培養と遺伝子導入法と、前記Ｇ 免疫沈降とウエスタンブロット法を参照。

【0108】

例１０
図３Ｂにおいては、例９（図３Ａ）に示したＥＧＦＰ-Ｚ-ＩＣＲ（ＷＴ）、ＥＧＦＰ-Ｚ-ＩＣＲ（ＣＳ）それと、コントロールとしてＥＧＦＰを強制発現させたＣ６細胞の細胞運動性をボイデンチャンバー法によって評価した結果を示す（左側の図）。図３Ｂの右側のグラフは、ウエル下部に移動した細胞数を示す（前記Ｅ ボイデンチャンバー分析も参照）。「＊」で示されるように、Ｚ-ＩＣＲ（ＷＴ）は、ＥＧＦＰ対照細胞に比べてｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定においてｐ ＜ ０．０５と有意差を示した。このことからＰＴＰＲＺの細胞内フラグメントの発現によってＣ６細胞の運動能は有意に亢進することが分かった。また「＃＃」で示されるように、Ｚ-ＩＣＲ（ＷＴ）は、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定においてｐ ＜ ０．０１とＺ-ＩＣＲ（ＣＳ）に比べて有意な差を示した。すなわちホスファターゼ活性が運動能の亢進に必要であることが初めて分かった。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ５）である。

【0109】

実験方法は、前記Ｅのボイデンチャンバー分析を参照。

【0110】

例１１
図４Ａ〜図４Ｂは、ＰＴＰＲＺ及びそのほかのＰＴＰ分子に対するＡＲ２７の阻害作用を示す図である。
図４Ａにおいては、ＡＲ２７の化学構造を示す。

【0111】

例１２
図４Ｂにおいては、ＡＲ２７がＰＴＰＲＺ及びそのほかのＰＴＰ分子の細胞内チロシンホスファターゼ活性に与える影響のＩＣ₅₀を示す。ＰＴＰＺ（○）、ＰＴＰＮ１（●、ＰＴＰ１Ｂ、ＮＴ１サブファミリー）、ＰＴＰＮ６（×、ＳＨＰ１、ＮＴ２サブファミリー）、ＰＴＰＲＢ（▼、ＰＴＰβ、Ｒ３サブファミリー）、ＰＴＰＲＳ（■、ＰＴＰσ、Ｒ２Ａサブファミリー）、ＰＴＰＲＭ（▲、ＰＴＰμ、Ｒ２Ｂサブファミリー）、ＰＴＰＲＡ（◆、ＰＴＰα、Ｒ４サブファミリー）、ＰＴＰＲＧ（◇、ＰＴＰγ、Ｒ５サブファミリー）。ＰＴＰ酵素の基質特異性の影響を排除するため、低分子人工基質であるＤｉＦＭＵＰを最終濃度２０μＭでアッセイ用の基質して用いた。ＡＲ２７は、ＰＴＰＲＺおよびＰＴＰＲＧに対して選択的に強く阻害することを示すことが明らかになった。

【0112】

実験方法は、前記ＢのＩＣ₅₀の決定を参照。

【0113】

例１３
図５Ａ〜図５Ｂは、ＡＲ２７及びＡＲ２７の類似化合物によるＰＴＰＲＺの阻害を示す図である。
図５Ａにおいては、ＡＲ２７（ｃｏｍｐｏｕｎｄ １）及びその類似化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ２〜１０）の化学構造を示す。

【0114】

例１４
図５Ｂにおいては、ＰＴＰＲＺに最適化された基質ペプチドであるｐＣＡＰ-ＧＩＴ１_549-556を用いて化合物（各々１０μＭ）の阻害活性を評価した結果を示す。化合物番号は例１３に示した図５Ａ内に付された番号に対応している。図の縦軸は残存酵素活性を示し、ＤＭＳＯコントロールとの相対値として表記されている。図５Ｂの下側のグラフにおいて「＊＊」で示されるように、ＡＮＯＶＡとＳｃｈｅｆｆｅ'ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定においてｐ ＜ ０．０１と有意な差を示した。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ３）。このことからｃｏｍｐｏｕｎｄ ２からｃｏｍｐｏｕｎｄ ６の阻害活性は、ＡＲ２７に比べて低いものの有意な阻害活性は認められること、一方、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ７からｃｏｍｐｏｕｎｄ １０には全く阻害活性を持たないことが初めて明らかになった。

【0115】

実験方法は、前記ＢのＩＣ₅₀の決定を参照。

【0116】

例１５
図６Ａ〜図６Ｃは、ＡＲ２７の阻害に関わるＰＴＰＲＺ中のアミノ酸残基の特定を示す図である。図６Ａと例１６の図６Ｂでは、ＰＴＰＲＺの触媒活性に関する部位特異的変異誘発の効果を示す。

【0117】

図６Ａにおいては、ＰＴＰＲＺの酵素活性ドメインの各種変異体を作成し、そのタンパク質（精製されたＧＳＴ融合タンパク質（白矢頭で示す））の精製度（ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる）をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色で確認した結果を示す（アミノ酸残基の表示は一文字表記による）。
実験方法は、前記Ａの発現プラスミド及び組み換え酵素を参照。

【0118】

例１６
図６Ｂにおいては、それぞれのＰＴＰＲＺ変異体の同一タンパク量あたりの酵素活性（比活性）は、５ｎＭの酵素を２０μＭのｐＣＡＰ-ＧＩＴ１_549-556を基質として用いて評価した結果を示す。データは、野生型酵素との相対値として提示したものである。その結果、「＊」および「＊＊」で示されるように、ＡＮＯＶＡとＳｃｈｅｆｆｅ'ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定においてｐ ＜ ０．０５（＊）、ｐ ＜ ０．０１（＊＊）と有意な差を示した。データは、平均 ± 標準誤差 （ｎ ＝ ３〜５）。このことから、野生型に比べて、ほとんどの変異体で、酵素活性は有意に低下していたことが分かった。

【0119】

実験方法は、前記ＢのＩＣ₅₀の決定を参照。
例１７
図６Ｃにおいては、野生型と変異型酵素の酵素活性を同程度に調整した後、ＡＲ２７、その類似化合物（例１３の図５Ａに示したｃｏｍｐｏｕｎｄ ３からｃｏｍｐｏｕｎｄ ５）及び非特異的ＰＴＰ阻害剤として知られるバナジン酸（ｖａｎａｄａｔｅ）に対する阻害感受性を評価した結果を示す）。阻害分析は、ｐＣＡＰ-ＧＩＴ１_549-556を基質として阻害化合物（各々１０ μＭ）またはｖａｎａｄａｔｅ（２００ μＭ）の終濃度になるよう加えて実施した。残存酵素活性は、各々の酵素の溶媒コントロールとの相対値として表現した。その結果、「＊」および「＊＊」で示されるように、ＡＮＯＶＡとＳｃｈｅｆｆｅ'ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定においてｐ ＜ ０．０５（＊）、ｐ ＜ ０．０１（＊＊）と有意な差を示した。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ３）。

【0120】

具体的には次の通りであった。Ｎ１７５８Ｄ変異体は、ＡＲ２７およびｃｏｍｐｏｕｎｄ ５に対しては、野生型酵素に比べて有意に阻害抵抗性を示した。しかし、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ３及びｃｏｍｐｏｕｎｄ ４に対しては、野生型酵素と同程度に阻害された。また、非特異的なＰＴＰ阻害剤ｖａｎａｄａｔｅに対する阻害感受性は、むしろ亢進していた。このことは、ＡＲ２７のナフタレン-ジスルホン酸構造の２位のスルホン酸とＰＴＰＲＺの活性ドメインのＮ１７５８残基との間に相互作用が存在することを示している。

【0121】

次にＹ１７５６Ｆ変異体であるが、ＡＲ２７及びｃｏｍｐｏｕｎｄ ３からｃｏｍｐｏｕｎｄ ５の全てに対して抵抗性を示した。しかし、ｖａｎａｄａｔｅに対する阻害感受性に変化は認められなかった。このことは、ＡＲ２７及びその類似化合物に共通する、例えば、アゾ結合部位とこのチロシン残基の相互作用の存在を推測させた。
実験方法は、前記ＢのＩＣ₅₀の決定を参照。

【0122】

例１８
図７Ａ〜図７Ｄは、リポソームを用いたＡＲ２７の細胞内導入法の開発を示す図である。
図７Ａにおいては、マイクロインジェクション法を用いてＡＲ２７をＣ６細胞にインジェクションした。蛍光と明視野（ＢＦ）イメージは、矢頭によって示されるＡＲ２７の注射の前（ｂｅｆｏｒｅ）後（ａｆｔｅｒ）における同一視野の顕微鏡観察像を示す。細胞内のＡＲ２７は、蛍光励起によって赤い蛍光を示すことが分かった（矢頭）。

【0123】

実験方法は、前記ＥのＡＲ２７／リポソーム複合体の細胞内取り込み量の評価を参照。

【0124】

例１９
図７Ｂにおいては、ＡＲ２７／リポソーム複合体の最適化条件を検討した結果を示す。この結果から、１００μＭのＡＲ２７を含むＡＲ２７とリポソームの混合比までは直線的に細胞内取り込みは増加するが、それ以降は減少することが分かった（ＡＲ２７／リポソーム複合体、白丸○）。またリポソームと混合しないと、ＡＲ２７単独処理ではほとんど細胞内に取り込まれない（黒丸●）ことが分かった。

【0125】

実験方法は、前記ＥのＡＲ２７／リポソーム複合体の細胞内取り込み量の評価を参照。

【0126】

例２０
図７Ｃにおいては、ＡＲ２７及びリポソームで処理したＣ６細胞を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。通常のプラスチック培養皿の上で培養したＣ６細胞を、無処理、ＡＲ２７単独処理、リポソーム単独処理、ＡＲ２７／リポソーム複合体処理の条件下で３時間インキュベートし、通常培地へ交換することで細胞を洗浄した後、蛍光と位相コントラスト（ＰｈＣ）を撮影した。図７Ｃ中の最も右のパネルは、ＡＲ２７／リポソーム複合体で処理した細胞のみ赤色の蛍光が観察された。スケール・バーは２０μｍである。ＡＲ２７／リポソーム複合体でのみ、細胞内にＡＲ２７が取り込まれていることが明確に示された。

【0127】

実験方法は、前記ＥのＡＲ２７／リポソーム複合体の細胞内取り込み量の評価を参照。

【0128】

例２１
図７Ｄにおいては、Ｃ６細胞を用いてＰＴＰＲＺの基質分子ｐａｘｉｌｌｉｎのリン酸化に対する複合体の効果を評価した結果を示す。Ｃ６細胞懸濁液は、図に示された組合せのＡＲ２７とリポソームで３０分間インキュベートし、その後、ラミニンで被覆した培養シャーレに播種した。播種１５分後の細胞からタンパク抽出を行い、ＰＴＰＲＺの基質サイトであるＴｙｒ１１８のパキシリンのリン酸化を分析した（右側の上図）。右下のグラフは、その定量結果を示している。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ３）である。その結果、「＊＊」で示されるように、ＡＮＯＶＡとＳｃｈｅｆｆｅ'ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定においてｐ ＜ ０．０５（＊＊）と有意差を示した。この結果は、ＡＲ２７／リポソーム複合体処理した場合においてのみ、ｐａｘｉｌｌｉｎのチロシンリン酸化の有意な上昇を示している。一方、全細胞タンパク質のチロシンリン酸化のパターン（左上図）とｐａｘｌｌｉｎの発現量（左下図）に変化はしておらず、複合体の処理によってチロシンリン酸化シグナルが非特異的に損なわれた可能性が否定された。

【0129】

実験方法は、前記ＣのＡＲ２７／リポソーム複合体の調製と、前記Ｇの免疫沈降とウエスタンブロット法を参照。

【0130】

例２２
図８Ａ〜図８Ｂは、ＡＲ２７／リポソーム複合体によるＣ６細胞の細胞運動及び細胞増殖能の阻害作用を示す図である。

【0131】

図８Ａにおいては、ＡＲ２７／リポソーム複合体がＣ６及びＲＺ-ＫＤ＃２細胞株の細胞運動能に与える効果をボイデンチャンバー分析で評価した結果を示す（上側）。下側のグラフは定量解析の結果である。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ５）である。その結果、「＊＊」で示されるように、ＡＮＯＶＡとＳｃｈｅｆｆｅ'ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定においてｐ ＜ ０．０１と有意な差を示し、Ｃ６細胞では２０μＭのＡＲ２７／リポソーム複合体処理によって細胞運動能が有意に低下した。

【0132】

一方、ｐ ＜ ０．０５（＃）で示されるように、ＲＺ-ＫＤ＃２細胞株は、親細胞株に比べて運動能は低下していることが、例５に示した図１Ｅの結果と同様に再現した。しかしＲＺ-ＫＤ＃２の細胞運動性は、ＡＲ２７／リポソーム複合体によって抑制されなかった。このことから、ＡＲ２７／リポソーム複合体の細胞運動抑制作用はＰＴＰＲＺに依存的であることが明らかになった。

【0133】

実験方法は、前記ＣのＡＲ２７／リポソーム複合体の調製と、Ｅのボイデンチャンバー分析を参照。

【0134】

例２３
図８Ｂにおいては、ＡＲ２７／リポソーム複合体がＣ６及びＲＺ-ＫＤ＃２の細胞増殖に与える影響を評価した結果を示す。上側のグラフは、ＡＲ２７／リポソーム複合体を加えてから１時間後の細胞数の定量評価である。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ４）である。有意差はなく、ＡＲ２７／リポソーム複合体が細胞接着性に与えた影響はないと判断された。

【0135】

下側のグラフは、ＡＲ２７／リポソーム複合体を加えて２５時間後の細胞数の定量評価である。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ４）である。ＡＮＯＶＡとＳｃｈｅｆｆｅ'ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定においてｐ ＜ ０．０５（＊）、ｐ ＜ ０．０１（＊＊）、ｐ ＜ ０．０１（＃＃）と有意差を示し、１０ μＭ以上のＡＲ２７を含むリポソーム複合体によって低下することが明らかになった。また例４に示した図１Ｄの結果と同様に、ＲＺ-ＫＤ＃２は親株のＣ６細胞に比べて細胞増殖が低下しているが、ＡＲ２７／リポソーム複合体による増殖抑制は受けないことも明らかになった。すなわち、ＡＲ２７／リポソーム複合体の細胞増殖抑制はＰＴＰＲＺに依存的であることが明らかになった。

【0136】

実験方法は、前記ＣのＡＲ２７／リポソーム複合体の調製と、Ｆの細胞増殖能の評価を参照。

【0137】

例２４
図９は、ＡＲ２７類似化合物でＰＴＰＲＺに対する阻害活性が弱いｃｏｍｐｏｕｎｄ ２が、Ｃ６細胞の増殖に与える影響を評価した結果を示す図である。下側のグラフは、リポソーム複合体による処理の１時間後と２５時間後の細胞数をカウントし、24時間の細胞増殖を定量評価したものある。データは、平均 ± 標準誤差（ｎ ＝ ３）である。「＊＊」で示されるようにｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定においてｐ ＜ ０．０１（＊＊）と有意差を示し、ＡＲ２７／リポソーム複合体（40 μＭのＡＲ２７を含む）処理でのみ、リポソーム（ｖｅｈｉｃｌｅ）単独処理に比べて有意に低下した。一方、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ２／リポソーム複合体では、細胞増殖の抑制効果は検出されなかった。すなわち、ＡＲ２７／リポソーム複合体によるＣ６細胞の増殖抑制効果は、ＰＴＰＲＺの活性阻害に起因することが明らかになった。

【0138】

実験方法は、前記ＣのＡＲ２７／リポソーム複合体の調製と、Ｆの細胞増殖能の評価を参照。

【0139】

例２５
図１０は、ＡＲ２７／リポソーム複合体によるＣ６細胞の腫瘍形成の抑制を示す図である。
Ｃ６細胞をラットの脳内に移植し、移植手術の翌日から５ μｌのＡＲ２７／リポソーム複合体（０．９％のＮａＣｌ中で１ ｍＭ）、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ２／リポソーム複合体（０．９％のＮａＣｌ中で１ ｍＭ）もしくは５ μｌの溶媒（０．９％のＮａＣｌ）を毎日脳内に投与した。脳内移植の１週間後の脳組織（冠状断面）における腫瘍形成部位のヘマトキリン染色像を示す。下側のパネルは、上側パネルの四角で囲った区域の拡大図である。スケール・バーは１ ｍｍ。右側のグラフは、脳の連続切片から測定される個々の腫瘍容積をプロットしたものである（ｎ ＝ ５〜８）。グラフ中の水平バーは、それぞれのグループの平均値である。「＊」で示されるように、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定においてｐ ＜ ０．０５と有意差を示し、ＡＲ２７／リポソーム複合体の投与群の腫瘍サイズが生理食塩水投与群に比べて有意に抑制されることが分かった。一方、ｃｏｍｐｏｕｎｄ ２／リポソーム複合体投与群では、腫瘍サイズの抑制はほとんど認められず、ＰＴＰＲＺの活性阻害によって腫瘍形成が抑制されることが明らかになった。

【0140】

実験方法は、前記ＣのＡＲ２７／リポソーム複合体の調製と、ＨのＣ６グリオブラストーマ細胞の脳内同種移植、ＡＲ２７／リポソーム複合体の脳室内投与および、その組織学的な評価を参照。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】