特許 6238366 非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体およびその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6238366

(24)【登録日】2017年11月10日

(45)【発行日】2017年11月29日

(54)【発明の名称】非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体およびその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/74 20150101AFI20171120BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20171120BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20171120BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171120BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/74 BZNA

   A61K47/44

   A61P37/04

   A61P35/00

【請求項の数】8

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2014-533021(P2014-533021)

(86)(22)【出願日】2013年8月27日

(86)【国際出願番号】JP2013072885

(87)【国際公開番号】WO2014034669

(87)【国際公開日】20140306

【審査請求日】2016年7月26日

(31)【優先権主張番号】特願2012-188129(P2012-188129)

(32)【優先日】2012年8月28日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504171134

【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学

(73)【特許権者】

【識別番号】593192069

【氏名又は名称】日本ビーシージー製造株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100110766

【弁理士】

【氏名又は名称】佐川 慎悟

(74)【代理人】

【識別番号】100133260

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 基子

(74)【代理人】

【識別番号】100169340

【弁理士】

【氏名又は名称】川野 陽輔

(74)【代理人】

【識別番号】100195682

【弁理士】

【氏名又は名称】江部 陽子

(72)【発明者】

【氏名】原島 秀吉

(72)【発明者】

【氏名】中村 孝司

(72)【発明者】

【氏名】吹上 雅文

(72)【発明者】

【氏名】樋口 恵

(72)【発明者】

【氏名】赤座 英之

(72)【発明者】

【氏名】宮▲崎▼ 淳

(72)【発明者】

【氏名】中谷 彰洋

【審査官】 安藤 公祐

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／００３８１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００３−５２１５０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−０８０５６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６３−０３９８１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Homhuan A, et al.，New packaging method of mycobacterial cell wall using octaarginine-modified liposomes: enhanced upta，J Control Release，２００７年，120，60-9

【文献】 BJU int.，２００９年，103(5)，686-93

【文献】 Cellular Immunology，１９９１年，137，81-7

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／７４

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３７／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

構成脂質として、２〜２０個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を、構成脂質総量に対して０％超５％以下のモル比で含み、かつミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌およびロドコッカス属細菌からなる群から選択される１または２以上の細菌の細胞壁骨画分（ＣＷＳ；ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ）を内封する脂質膜構造体。

【請求項2】

細菌が牛型結核菌（ＢＣＧ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｏｖｉｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）である、請求項１に記載の脂質膜構造体。

【請求項3】

請求項１または請求項２に記載の脂質膜構造体を含有する免疫賦活剤。

【請求項4】

請求項１または請求項２に記載の脂質膜構造体を含有する癌の治療剤および／または進行抑制剤。

【請求項5】

癌が膀胱癌である、請求項４に記載の癌の治療剤および／または進行抑制剤。

【請求項6】

細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体を製造する方法であって、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する前記方法；
（ｉ）構成脂質として、２〜２０個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を、構成脂質総量に対してモル比で０％超５％以下含み、かつ、細菌菌体成分を内封しない脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液を調製する工程、
（ｉｉ）細菌菌体成分が分散した非極性溶媒溶液を調製する工程、
（ｉｉｉ）前記細菌菌体成分を内封しない脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液と前記細菌菌体成分が分散した非極性溶媒溶液とを混合して水中油型エマルションを調製する工程、
（ｉｖ）前記水中油型エマルションから非極性溶媒を減圧留去する工程。

【請求項7】

細菌菌体成分がミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌およびロドコッカス属細菌からなる群から選択される１または２以上の細胞壁画分（ＣＷ；ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ）または細胞壁骨画分（ＣＷＳ；ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ）である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

ミコバクテリウム属細菌が牛型結核菌（ＢＣＧ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｏｖｉｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）である、請求項７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体およびその製造方法に関し、より詳細には、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有する脂質膜構造体であって、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含み、かつ非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する前記脂質膜構造体、および濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、かつ非極性溶媒に分散性を有する目的物質を内封する脂質膜構造体を製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞へ薬剤などの目的物質を送達する為に、様々な担体が開発されている。特に、目的物質が牛型結核菌（ＢＣＧ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｏｖｉｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）の細胞壁骨画分（ＣＷＳ；ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ）などの細菌菌体成分である場合、強力な免疫賦活作用が期待されるが、これら細菌菌体成分は水に不溶であることから生体に適用可能な形態に製剤化することが困難であり、また、分子量が大きく負帯電性であることから細胞との相互作用が低いという問題があった。そこで、細菌菌体成分の担体として、界面活性剤を含むものや脂質膜構造体などが提案されており、例えば、細菌菌体成分、油状物質、界面活性剤および安定化剤を含む癌免疫療法用製剤（特許文献１）が開示されているほか、本発明者らにより、脂質膜に細菌菌体成分を含むリポソーム（特許文献２）が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】国際公開ＷＯ２０００／０３７２４号パンフレット

【特許文献2】国際公開ＷＯ２００７／１３２７９０号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、特許文献１に記載の癌免疫療法用製剤は、当該文献の記載からは細菌菌体成分を内封しているか否かが不明であり、仮に内封していると解釈した場合でも、少なくとも２μｍを超える粒子径を有しているため、サイズが大きく濾過滅菌処理をすることは困難である。また、特許文献２に記載のリポソームは、細菌菌体成分を含んでいる脂質膜を有している、すなわち脂質膜と一体化して含んでいるものの、内封する脂質膜構造体ではない。また、特許文献１および２には、水中油型エマルション製剤の製造についての記載はあるものの、当該製造方法は空の脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液を調製する工程を有しておらず、その結果、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、かつ非極性溶媒に分散性を有する目的物質を内封する脂質膜構造体は製造されていない。

【0005】

本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有していて、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含み、かつ非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体、および、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、かつ非極性溶媒に分散性を有する目的物質を内封する脂質膜構造体を製造する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、鋭意研究の結果、目的物質を内封しない脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液と目的物質が分散した非極性溶媒溶液とを混合して水中油型エマルションを調製した後、非極性溶媒を減圧留去することにより、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、かつ非極性溶媒に分散性を有する目的物質を内封する脂質膜構造体を製造することができること、およびこれにより製造した、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有していて、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含み、かつ非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体が、膀胱癌の治療や進行抑制、および細胞性免疫の賦活をすることができることを見出し、下記の各発明を完成した。

【0007】

（１）濾過滅菌処理が可能な粒子径を有する脂質膜構造体であって、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含み、かつ非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する前記脂質膜構造体。

【0008】

（２）細菌菌体成分がミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌およびロドコッカス属細菌からなる群から選択される１または２以上の細胞壁画分（ＣＷ；ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ）または細胞壁骨画分（ＣＷＳ；ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ）である、（１）に記載の脂質膜構造体。

【0009】

（３）ミコバクテリウム属細菌が牛型結核菌（ＢＣＧ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｏｖｉｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）である、（２）に記載の脂質膜構造体。

【0010】

（４）濾過滅菌処理が可能な粒子径を有する脂質膜構造体が１８０ｎｍ以下の粒子径を有する脂質膜構造体である、（１）から（３）のいずれかに記載の脂質膜構造体。

【0011】

（５）（１）から（４）のいずれかに記載の脂質膜構造体を含有する医薬組成物。

【0012】

（６）医薬組成物が膀胱癌の治療剤および／または進行抑制剤である、（５）に記載の医薬組成物。

【0013】

（７）濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、かつ非極性溶媒に分散性を有する目的物質を内封する脂質膜構造体を製造する方法であって、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する前記方法；（ｉ）目的物質を内封しない脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液を調製する工程、（ｉｉ）目的物質が分散した非極性溶媒溶液を調製する工程、（ｉｉｉ）前記目的物質を内封しない脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液と前記目的物質が分散した非極性溶媒溶液とを混合して水中油型エマルションを調製する工程、（ｉｖ）前記水中油型エマルションから非極性溶媒を減圧留去する工程。

【0014】

（８）目的物質を内封しない脂質膜構造体が、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含み、かつ目的物質を内封しない脂質膜構造体である、（７）に記載の方法。

【0015】

（９）目的物質が細菌菌体成分である、（７）または（８）に記載の方法。

【0016】

（１０）細菌菌体成分がミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌およびロドコッカス属細菌からなる群から選択される１または２以上の細胞壁画分（ＣＷ；ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ）または細胞壁骨画分（ＣＷＳ；ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ）である、（９）に記載の方法。

【0017】

（１１）ミコバクテリウム属細菌が牛型結核菌（ＢＣＧ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｏｖｉｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）である、（１０）に記載の方法。

【0018】

（１２）濾過滅菌処理が可能な粒子径が１８０ｎｍ以下の粒子径である、（７）から（１１）のいずれかに記載の方法。

【発明の効果】

【0019】

本発明に係る脂質膜構造体およびその製造方法によれば、細菌菌体成分を内封する一方で、水溶液に分散して容易に製剤化が可能であり、かつ、細胞に効率的に取り込まれる脂質膜構造体を得ることができる他、極性溶媒中で直径１μｍ程度の大きな立体構造を有する牛型結核菌の細胞壁骨画分（ＢＣＧ−ＣＷＳ）を、粒子径１００ｎｍ程度のコンパクトな粒子状に折りたたんで内封する脂質膜構造体を得ること、あるいは濾過滅菌処理が可能な粒子径を有する脂質膜構造体が得られることから、医薬品として利用するに際し、その全製造工程における無菌化が必要なく、濾過滅菌処理をして医薬品としての脂質膜構造体を安価に製造することができる。また、本発明に係る脂質膜構造体は、溶媒の含有量が顕著に小さく、もっぱら細菌菌体成分などの目的物質を内封することから、効率よく目的物質を送達することができる脂質膜構造体を得ることができるうえ、癌細胞に効率よく取り込まれ、癌の治療や進行抑制をすること、特に、生体における膀胱内投与により膀胱癌の治療や進行抑制をすることができること、あるいは免疫細胞に作用して、細胞性免疫を賦活することができる。さらに、本発明に係る脂質膜構造体の製造方法によれば、製造に用いた目的物質の大部分を脂質膜構造体に内封させられることから、脂質膜構造体に目的物質を効率よく内封させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】本発明に係る脂質膜構造体の製造方法を模式的に示す図である。

【図2】ＢＣＧ−ＣＷＳを含むＨＢＳ、エタノールおよびペンタンの外観を示す図である。

【図3】ＢＣＧ−ＣＷＳおよびＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを含むＨＢＳの外観を示す図である。

【図4】ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームの調製方法の一態様を示す模式図である。

【図5】ＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソーム（従来型）の調製方法を示す模式図である。

【図6】０〜５％の含有量でＲ８と結合した脂質を構成脂質として含み、かつＢＣＧ−ＣＷＳを内封するリポソームにおける、粒子径、ＰＤＩ、ゼータ電位およびＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率を示す図である。

【図7】ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームおよびＢＣＧ−ＣＷＳを内封していないリポソームの透過型電子顕微鏡による観察画像である。

【図8】大径空リポソーム、小径空リポソームおよびＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームにおける、脂質１ｎｍｏｌあたりの内液由来蛍光強度（ＲＦＩ／ｎｍｏｌ）を示す図である。

【図9】ＮＢＤで標識したＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームおよびＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを取り込ませたＭＢＴ−２細胞における、リポソーム（緑色）および酸性コンパートメント（赤色）の位置を示す図である。図中、緑色と赤色との重複を示す黄色の蛍光が観察された主な箇所を矢印で示す。

【図10】ＮＢＤで標識したＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを取り込ませたＭＢＴ−２細胞群（サンプル群）およびリポソームを取り込ませていないＭＢＴ−２細胞群（コントロール群）における、各群全体の蛍光強度（左図）および各細胞の蛍光強度と細胞数との関係（右図）を示す図である。

【図11】ＭＢＴ−２細胞のみを移植したマウス（Ａ群）、およびＭＢＴ−２細胞を移植するとともに各種のリポソームを投与したマウス（Ｂ〜Ｆ群）における、腫瘍体積を示す図である。

【図12】ＭＢＴ−２細胞を移植するとともにＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームおよび空リポソームを投与したマウスの生存数を示す図である。

【図13】上図の棒グラフ中、ａはＭＢＴ−２細胞と空リポソームとを混合して皮下注射したマウスａ、ｂはＭＢＴ−２細胞とＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームとを混合して皮下注射したマウスｂ、ｃはＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを取り込ませたＭＢＴ−２細胞を皮下注射したマウスｃ、ｄはＭＢＴ−２細胞とＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームとを互いに離れた部位に皮下注射したマウスｄにおける、腫瘍組織の総面積、生存腫瘍組織の面積、壊死腫瘍組織の面積および壊死細胞の割合（％）を示す図である。また、下左図は、ヘマトキシリン・エオシン染色したマウスａ〜ｄの腫瘍組織切片を示す写真図であり、下右図は左図に示すヘマトキシリン・エオシン染色像における生存腫瘍組織および壊死腫瘍組織を示す図である。

【図14】上図は、マウスａ〜ｄの腫瘍組織における各種白血球の数および割合を示す図である。また、下図は、ギムザ染色したマウスａ〜ｄの腫瘍組織切片を示す写真図である。

【図15】何も投与しない膀胱癌モデルラット（Ｇ群）、および各種リポソームを膀胱内投与した膀胱癌モデルラット（Ｈ〜Ｊ群）における、膀胱の切片を示す図である。

【図16】何も投与しない膀胱癌モデルラット（Ｇ群）、および各種リポソームを膀胱内投与した膀胱癌モデルラット（Ｈ〜Ｌ群）における、膀胱重量、膀胱基底膜１０ｃｍあたりの上皮性病変（腫瘍）数および腫瘍体積を示す図である。

【図17】何も添加しないナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞（基準群）、ならびにＢＣＧ−ＣＷ（ポジティブコントロール群）、空リポソーム（ネガティブコントロール群）およびＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム（試験群）を添加したナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞における、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生と細胞数との関係を示す図である。

【図18】ＢＣＧ−ＣＷ（ポジティブコントロール群）、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム（試験群）および空リポソーム（ネガティブコントロール群）を添加したナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞における、ＩＦＮ−γ産生細胞およびＩＬ−４産生細胞への変化率（％）を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明に係る非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体およびその製造方法について詳細に説明する。本発明に係る脂質膜構造体は、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有していて、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含み、かつ非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する。

【0022】

「濾過滅菌処理」とは、酵母や細菌などの微生物を濾過して取り除く操作をいう。脂質膜構造体の濾過滅菌処理は、例えば、一般に市販されている孔径０．２、０．２２、０．４５、５．０μｍなどの濾過滅菌用メンブレンフィルターを通過させることにより行うことができる。本発明における「濾過滅菌処理が可能な粒子径」としては、好ましくは１５０ｎｍ以上２００ｎｍ未満の粒子径を挙げることができ、より好ましくは１５５ｎｍ以上１９５ｎｍ以下，さらに好ましくは１９０、１８７、１８５、１８３、１８１、１８０、１７９、１７８、１７７、１７６、１７５、１７４、１７３、１７２、１７１、１７０、１６９、１６８、１６７、１６６、１６５、１６４、１６３、１６２、１６１、１６０ｎｍの粒子径を挙げることができる。

【0023】

本発明に係る脂質膜構造体の好ましい形態は、脂質一重層あるいは脂質二重層からなる脂質膜を有する閉鎖小胞である。ここで、本発明に係る脂質膜構造体は、非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分などの目的物質を内封していることから、最も内側の脂質膜は、脂質分子が疎水性基を内腔側（目的物質）に向けて並んでなる、脂質一重層の脂質膜を形成している場合がある。

【0024】

本発明に係る脂質膜構造体が有する脂質膜の枚数は、１であってもよく２以上であってもよい。脂質膜構造体として、具体的には、例えば、脂質二重層からなる脂質膜を複数有する多重膜リポソーム（ＭＬＶ）の他、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）などの脂質二重層からなる脂質膜を１のみ有する一枚膜リポソームを挙げることができる。

【0025】

本発明に係る脂質膜構造体を構成する脂質（以下「構成脂質」という。）の種類は特に限定されず、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、長鎖脂肪族アルコールあるいはグリセリン脂肪酸エステルなどを挙げることができ、これらのうちのいずれであってもよい。また、カチオン性脂質、ｐＨ依存性カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質のいずれであってもよい。

【0026】

リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、卵黄フォスファチジルコリン（ＥＰＣ）など）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロールなど）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、またはこれらの水素添加物、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンなど）などを挙げることができ、これらのうちの１種または２種以上を用いることができる。

【0027】

糖脂質としては、スフィンゴミエリン、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリドなどのグリセロ糖脂質、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

【0028】

ステロールとしては、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。これらのステロールは、一般には脂質二重層を物理的または化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために用いることができる。

【0029】

長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０〜２０の脂肪酸またはそのアルコールを使用することができる。そのような長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸（ＳＴＲ）、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、アラキジン酸、マルガリン酸、ツベルクロステアリン酸などの飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エレオステアリン酸などの不飽和脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコールなどを挙げることができ、具体的には、１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＭＧ）、１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＳＧ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

【0030】

グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

【0031】

カチオン性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＣ−６−１４）などのジエタノールアミン塩酸塩、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ（ＣＨＥ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−オレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモールコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、ＤＯＳＰＡ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

【0032】

ｐＨ依存性カチオン性脂質としては、１−ｍｅｔｈｙｌ−４，４−ｂｉｓ［（９Ｚ，１２Ｚ）−ｏｃｔａｄｅｃａ−９，１２−ｄｉｅｎ−１−ｙｌｏｘｙ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＹＳＫ０５）、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＤＡＰ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる

【0033】

また、中性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、ジミリストイルグリセロール（Ｃ１４）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。また、アニオン性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジルエチレングリコールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。

【0034】

本発明に係る複数個のアルギニン残基からなるペプチド（以下「本発明に係るペプチド」という。）のアルギニンの個数は、複数個であれば特に限定されず、例えば、数個、十数個、数十個などを挙げることができ、より具体的には、２〜２０個、好ましくは３〜１８個、より好ましくは４〜１６個、さらに好ましくは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個を挙げることができる。本発明に係るペプチドは、その配列を基にして、当業者によって適宜選択可能な方法を用いて合成することができる。そのような方法としては、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成するペプチド合成法の他、本発明に係るペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、作製したベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地にて培養し、得られた培養物から採取する方法や、本発明に係るペプチドをコードするＤＮＡを無細胞タンパク質合成系で発現させて得る方法などを挙げることができる。なお、いずれの合成法も、当業者により広く知られている一般的な方法の他、あらゆる方法を利用することができる。

【0035】

本発明における「複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質」は、本発明に係るペプチドのＮ末端側に結合した脂質でもよく、Ｃ末端側に結合した脂質でもよい。また、本発明において、本発明に係るペプチドと脂質とは直接結合していてもよく、プロリンやイソロイシン、ロイシン、バリンなどのアミノ酸やポリプロリンなどのペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーなど、何らかのリンカーを介して結合していてもよい。

【0036】

また、本発明に係るペプチドと脂質との結合様式としては、例えば、水素結合、イオン結合、疎水結合、ファンデルワールス結合などの非共有結合や、ジスルフィド結合、ペプチド結合などの共有結合を挙げることができる。また、「複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質」における脂質は、上述した、本発明に係る脂質膜構造体の構成脂質として用いられるものを挙げることができる。なお、後述する実施例においては「ペプチドと結合した脂質」として、８個のアルギニン残基からなるペプチド（配列番号１）と結合したステアリン酸（ステアリル化オクタアルギニン；ＳＴＲ−Ｒ８）を用いている。

【0037】

本発明に係る脂質膜構造体の脂質膜には、「複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質」を複数種類含んでいてもよい。例えば、ＳＴＲ−Ｒ８と８個のアルギニン残基からなるペプチドと結合したパルミチン酸、１０個のアルギニン残基からなるペプチドと結合したリン脂質と７個のアルギニン残基からなるペプチドと結合したステロール、１０個のアルギニン残基からなるペプチドと結合したステアリン酸と８個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した糖脂質など、任意に選択することができる。また、「複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質」の含有量は、アルギニン残基の個数やペプチドと結合した脂質の種類、他の構成脂質の種類、細菌菌体成分の種類などに応じて適宜設定することができる。

【0038】

また、本発明に係る脂質膜構造体の脂質膜には、構成脂質の他に、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの正荷電を付与する荷電物質、ジセチルホスフェートなどの負電荷を付与する荷電物質、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質などの膜タンパク質などを含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。

【0039】

「非極性溶媒」とは、極性が無い溶媒や極性が比較的小さい溶媒をいう。本発明における非極性溶媒としては、水などの極性溶媒より沸点が小さいものが好ましく、細菌菌体成分が分散して、当該非極性溶媒中で比較的小さな粒子を形成するものがより好ましい。本発明における非極性溶媒として、具体的には、例えば、ペンタンやジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル（イソプロピルエーテル）、ヘキサン、テトラクロロメタン、トルエン、ベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサン、酢酸ブチルあるいはこれらと酢酸エステルやアセトン、メタノールとの混合物などを挙げることができ、これらのうち、１または２以上を用いることができるが、ペンタンやジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルが好ましい。

【0040】

本発明における「細菌菌体成分」は、非極性溶媒に分散性を有する限り特に限定されない。ここで、本発明において、「非極性溶媒に分散性を有する」とは、非極性溶媒中に比較的均一に拡散しうることをいう。本発明における細菌菌体成分としては、例えば、ミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌等の細胞壁画分（ＣＷ；ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ）または細胞壁骨格画分（ＣＷＳ；ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ）を挙げることができる。

【0041】

ミコバクテリウム属細菌の細胞壁（ＣＷ）は、ミコール酸（脂肪酸）、アラビノガラクタン（多糖）及びペプチドグリカンからなる高分子を含んでおり、この高分子により細胞壁の基本構造が構成されている。この基本構造は「細胞壁骨格（ＣＷＳ）」と呼ばれる。ミコバクテリウム属細菌と分類上関連するノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌等も、ミコバクテリウム属細菌と同様の細胞壁骨格（ＣＷＳ）を有する。

【0042】

ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌としては、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉｉ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧなどの結核菌群を、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）細菌としては、例えば、Ｎ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｎ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｎ．ｒｕｂｒａなどを、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌としては、例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃ．ｕｌｃｅｒａｎｓなどを挙げることができる。本発明に係る「細菌菌体成分」としては、これらの細菌のうち、ＢＣＧの細胞壁画分（ＢＣＧ−ＣＷ）又は細胞壁骨格画分（ＢＣＧ−ＣＷＳ）であることが好ましい。

【0043】

細胞壁画分（ＣＷ）は、細胞壁骨格（ＣＷＳ）を主成分とする限り、その組成、調製方法等は特に限定されるものではなく、例えば、上述した特許文献２に記載の方法により調製することができる。細胞壁骨格画分（ＣＷＳ）は、細胞壁画分（ＣＷ）から細胞壁骨格（ＣＷＳ）を精製して得られる画分であり、細胞壁骨格画分（ＣＷＳ）もまた、上述した特許文献２に記載の方法により調製することができる。

【0044】

ミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌などの細胞壁画分（ＣＷ）または細胞壁骨格画分（ＣＷＳ）は、抗癌作用や免疫賦活作用（アジュバンド活性、免疫活性化作用）を有する。細胞壁骨格（ＣＷＳ）のうち、ペプチドグリカン部分及びミコール酸部分が抗癌作用や免疫賦活作用に関して重要である。細胞壁画分（ＣＷ）に含まれる細胞壁骨格（ＣＷＳ）以外の成分（例えば、リポマンナン、トレハロースミコレート）も抗癌作用や免疫賦活作用に寄与している。

【0045】

次に、本発明は、本発明に係る脂質膜構造体を含有する医薬組成物を提供する。なお、本発明に係る脂質膜構造体を含有する医薬組成物において、上述した非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。本発明に係る脂質膜構造体を含有する医薬組成物は、細菌菌体成分の作用に応じた医薬用途に使用することができる。例えば、細菌菌体成分が抗癌作用や免疫賦活作用を有する場合、本発明の脂質膜構造体を含有する医薬組成物を、膀胱癌や咽頭癌、胃癌、肺癌、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、子宮癌、前立腺癌などの癌の治療剤や進行抑制剤、あるいは免疫賦活剤（アジュバンド）として使用することができる。

【0046】

医薬組成物の剤形としては、例えば、脂質膜構造体の分散液またはその乾燥物（例えば、凍結乾燥物、噴霧乾燥物等）を挙げることができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤などの添加剤を添加して使用してもよい。

【0047】

医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれにおいても使用することができる。医薬組成物をｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、経口投与のほか、膀胱内、静脈、腹腔内、皮下、経鼻などの非経口投与を挙げることができる。投与量及び投与回数は、投与対象の年齢や性別、症状、細菌菌体成分の種類や量などに応じて適宜設定することができる。

【0048】

最後に、本発明は、非極性溶媒に分散性を有する目的物質を内封する脂質膜構造体の製造方法を提供する。本発明に係る脂質膜構造体の製造方法を図１に模式的に示す。本発明に係る脂質膜構造体の製造方法は、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、かつ非極性溶媒に分散性を有する目的物質を内封する脂質膜構造体を製造する方法であって、
（ｉ）目的物質を内封しない脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液を調製する工程、
（ｉｉ）目的物質が分散した非極性溶媒溶液を調製する工程、
（ｉｉｉ）前記目的物質を内封しない脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液と前記目的物質が分散した非極性溶媒溶液とを混合して水中油型エマルションを調製する工程、
（ｉｖ）前記水中油型エマルションから非極性溶媒を減圧留去する工程。
以上（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する。なお、本発明に係る非極性溶媒に分散性を有する目的物質を内封する脂質膜構造体の製造方法において、上述した非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体または本発明に係る脂質膜構造体を含有する医薬組成物と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。

【0049】

本発明における「目的物質」は、非極性溶媒に分散性を有するものである限り特に限定されない。本発明における「目的物質」としては、例えば、薬剤、核酸、ペプチド、タンパク質、糖またはこれらの複合体などの種々の生理活性物質を挙げることができるが、細菌菌体成分であることが好ましい。

【0050】

（ｉ）の工程において、目的物質を内封しない脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液を調製する方法は特に限定されず、定法に従い行うことができる。そのような方法としては、例えば、極性溶媒を用いて、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法などの公知の方法により、目的物質を内封しない脂質膜構造体を調製する方法を挙げることができる。また、脂質膜構造体を定法に従い調製した後、これを回収して所望の極性溶媒に加えることにより調製してもよく、透析などにより脂質膜構造体の外液を所望の極性溶媒に交換することにより調製してもよい。なお、「目的物質を内封しない脂質膜構造体」の脂質膜の枚数は、１であってもよく２以上であってもよい。また、「目的物質を内封しない脂質膜構造体」の構成脂質としては、上述の脂質を挙げることができる。

【0051】

ここで、「極性溶媒」とは、極性が比較的大きい溶媒をいう。本発明における極性溶媒は、（ｉｉｉ）の工程の水中油型エマルションを構成する非極性溶媒より沸点が大きいものが、減圧留去により非極性溶媒を容易に留去させることができるため、好ましい。本発明における極性溶媒として、具体的には、水やエタノール、酢酸、アセトニトリル、アセトンなどを挙げることができ、これらのうち１または２以上を用いることができる。

【0052】

（ｉｉ）の工程において、目的物質が分散した非極性溶媒を調製する方法としては、例えば、目的物質を非極性溶媒に加えて攪拌する方法を挙げることができる。ここで、非極性溶媒は、（ｉｉｉ）の工程の水中油型エマルションから減圧留去することができるもの、すなわち、水中油型エマルションを構成する極性溶媒より沸点が小さいものが好ましく、具体的には、上述した本発明に係る脂質膜構造体における「非極性溶媒」を挙げることができる。

【0053】

（ｉｉｉ）の工程において、目的物質を内封しない脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液と目的物質が分散した非極性溶媒溶液とを混合して水中油型エマルションを調製する方法は定法に従い行うことができる。そのような方法としては、例えば、ボルテックスミキサーを用いて攪拌する方法やソニケーターを用いて超音波処理する方法を挙げることができ、極性溶媒や非極性溶媒の種類や量に応じて適宜選択して行うことができる。

【0054】

（ｉｖ）の工程において、水中油型エマルションから非極性溶媒を減圧留去する方法としては、例えば、水中油型エマルションをエバポレーターに供する方法を挙げることができる。この場合、エバポレーターの水浴温度や回転速度、エバポレーターに供する時間などは、極性溶媒や非極性溶媒の種類や量などに応じて適宜設定することができる。

【0055】

本発明に係る脂質膜構造体および本発明に係る脂質膜構造体の製造方法により製造された脂質膜構造体は、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン酸緩衝液，酢酸緩衝液などの適当な水性溶媒に分散させて使用することができる。分散液には、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤などの添加剤を適宜添加してもよい。また、脂質膜構造体は、前記の分散液を乾燥させた状態で保存することができる。さらに、脂質膜構造体は、経口投与することができる他、膀胱内、静脈、腹腔内、皮下、経鼻などへの非経口投与も可能である。

【0056】

以下、本発明に係る非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体およびその製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

【実施例】

【0057】

＜実施例１＞リポソームの調製
（１）ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム
［１−１］空リポソームを含むＨＢＳの調製
８個のアルギニン残基からなるペプチド（配列番号１；以下「Ｒ８」という。）と結合したステアリン酸（ＳＴＲ−Ｒ８；クラボウ社）を用意した。Ｒ８はリポソームに一定の細胞内移行能を付与することが知られているペプチドであり（国際公開ＷＯ２００５／０３２５９３号パンフレット；小暮健太郎、薬学雑誌、第１２７巻、第１０号、第１６８５−１６９１頁、２００７年）、ＳＴＲ−Ｒ８はＲ８のＮ末にステアリン酸（ＳＴＲ）が結合した構造を有する。続いて、卵黄フォスファチジルコリン（ＥＰＣ）、コレステール（Ｃｈｏｌ）およびＳＴＲ−Ｒ８を用いて、水和法によりリポソームを調製した。具体的には、これらの脂質を、モル比がＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＳＴＲ−Ｒ８＝７０：３０：２の割合でクロロホルムに溶解して、これを脂質クロロホルム溶液（総脂質濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）とした。脂質クロロホルム溶液をナスフラスコに入れて、エバポレーターを用いて減圧乾燥させることにより脂質フィルムを得た。ｐＨが７．４である５ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ ５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．９ｗ／ｖ％；以下「ＨＢＳ」という。）を脂質フィルムに添加して水和させ、撹拌または超音波処理をすることによりリポソームを調製し、これを空リポソームとした。空リポソームは、目的物質を内封せず、その内腔はＨＢＳで満たされている。続いて、空リポソームをミニエクストルーダー（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ社）を用いて孔径４００ｎｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ社）に通過させて濾過処理することにより、孔径４００ｎｍ以下の空リポソームを含むＨＢＳを調製した。

【0058】

［１−２］ＢＣＧ−ＣＷＳが分散した非極性溶媒溶液の調製
既報（特許文献２）に記載の方法に従い、牛型結核菌の細胞壁骨画分（ＢＣＧ−ＣＷＳ）を得た。続いて、予備実験として、各３００μＬのＨＢＳ、エタノールおよびペンタンそれぞれにＢＣＧ−ＣＷＳ１ｍｇを入れて攪拌し、外観を確認した。その結果を図２に示す。図２に示すように、ＨＢＳ中では、ＢＣＧ−ＣＷＳは凝集し、視認できる程大きい粒子を形成した。これに対し、エタノールおよびペンタン中では、ＢＣＧ−ＣＷＳは凝集せずに分散した状態となった。すなわち、ＢＣＧ−ＣＷＳは、有機溶媒中では、凝集せずに分散することが確認された。

【0059】

そこで、次に、極性溶媒および非極性溶媒それぞれ３００μＬにＢＣＧ−ＣＷＳ１ｍｇを入れて攪拌して分散させ、これらの溶媒中におけるＢＣＧ−ＣＷＳの粒子径および粒度分布指数（Ｐｈａｓｅ Ｄｏｐｐｌｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒ；ＰＤＩ）をＺＥＴＡＳＩＺＥＲ Ｎａｎｏ ＺＥＮ３６００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて測定した。極性溶媒としてエタノール、２−プロパノールおよびｔｅｒｔ−ブチルアルコールを、非極性溶媒としてペンタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびヘキサンを用いた。その結果を表１に示す。表１に示すように、粒子径およびＰＤＩのいずれも、エタノール、２−プロパノールおよびｔｅｒｔ−ブチルアルコールと比較して、ペンタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびヘキサンでは、顕著に小さい値であった。すなわち、非極性溶媒中のＢＣＧ−ＣＷＳは、極性溶媒中のＢＣＧ−ＣＷＳと比較して、粒子径が小さく、粒子径のバラツキも小さいことが確認された。この結果から、非極性溶媒中に分散させた細菌菌体成分は、小さな粒子径を有し、比較的均一な粒子径を有することが示された。そこで、ＢＣＧ−ＣＷＳ１ｍｇをペンタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびヘキサンそれぞれ３００μＬに入れて分散させ、これらをＢＣＧ非極性溶媒溶液として、以下の実験に用いることとした。

【0060】

【表1】

【0061】

［１−３］水中油型エマルションの調製および非極性溶媒の減圧留去
本実施例１（１）［１−２］のＢＣＧ非極性溶媒溶液３００μＬに、本実施例１（１）［１−１］の空リポソームを含むＨＢＳを７００μＬずつ添加し、プローブ型ソニケーターを用いて超音波処理を行うことにより混合して、水中油型エマルション（Ｏ／Ｗエマルション）を調製した。続いて、Ｏ／Ｗエマルションをナスフラスコに移し、エバポレーターを用いてエバポレーションを行い、ペンタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびヘキサンを減圧留去することによりリポソームを調製して、これをＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームとした。続いて、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームをミニエクストルーダー（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ社）を用いて孔径２００ｎｍのポリカーボネート製メンブレンフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ社）に通過させて濾過処理した。ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを含むＨＢＳの外観を、ＢＣＧ−ＣＷＳを含むＨＢＳと比較して図３に示す。上述した様に、ＢＣＧ−ＣＷＳはＨＢＳ中で凝集して視認できる程大きい粒子を形成するのに対して、図３に示すように、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームはＨＢＳ中で分散した状態であることが確認された。本実施例１（１）［１−１］〜［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームの調製方法を図４に模式的に示す。

【0062】

（２）比較用リポソーム
本実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に記載の方法によりリポソームを調製し、これを比較用リポソームとした。ただし、ＢＣＧ非極性溶媒溶液に代えて、モル比がＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＳＴＲ−Ｒ８＝７０：３０：２かつ総脂質濃度２３．３ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＥＰＣ、ＣｈｏｌおよびＳＴＲ−Ｒ８を含み、かつ１ｍｇ／３００μＬとなるようにＢＣＧ−ＣＷＳを含むペンタンを用い、空リポソームを含むＨＢＳに代えてＨＢＳを用いて行った。

【0063】

（３）Ｒ８の量を変化させたリポソーム
本実施例１（１）［１−１］に記載の方法において、脂質クロロホルム溶液における脂質の割合をＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＳＴＲ−Ｒ８＝７０：３０：２に代えて、ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＳＴＲ−Ｒ８＝７０：３０：０、１、２、３、４および５としてリポソームを調製した。すなわち、Ｒ８と結合した脂質を構成脂質として含む量が、他の構成脂質総量に対して０、１、２、３、４および５％である空リポソームを調製し、これらをＲ８／０〜５％空リポソームとした。次に、本実施例１（１）［１−２］〜［１−３］に記載の方法において、非極性溶媒としてペンタンを、空リポソームに代えてＲ８／０〜５％空リポソームを、それぞれ用いてリポソームを調製し、これらをＲ８／０〜５％リポソームとした。

【0064】

（４）ＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソーム
既報（国際公開ＷＯ２００７／１３２７９０号パンフレット）に記載の方法に従い、ＢＣＧ−ＣＷＳを含む脂質膜を有するリポソームを調製し、これをＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームとした。具体的には、まず、ＥＰＣおよびＣｈｏｌをモル比がＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝７：３の割合でクロロホルムに溶解してＥＰＣ／Ｃｈｏｌ溶液（総脂質濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を得た。また、ＳＴＲ−Ｒ８を１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう水に溶解してＳＴＲ−Ｒ８水溶液を得た。また、ＢＣＧ−ＣＷＳ１ｍｇをクロロホルム：エタノール＝２：１（ｖ：ｖ）のクロロホルム／エタノールに懸濁してＢＣＧ−ＣＷＳ懸濁液を得た。続いて、ＢＣＧ−ＣＷＳ懸濁液全量（ＢＣＧ−ＣＷＳ量１ｍｇ）に、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ溶液およびＳＴＲ−Ｒ８水溶液を１００：２（ｖ：ｖ）の割合で混合して、ＢＣＧ混合脂質液を得た。ＢＣＧ混合脂質液をエバポレーターに供して減圧乾燥させることにより脂質フィルムを調製した。脂質フィルムに７００μＬのＨＢＳを添加して水和させた後、ガラスビーズを加えて、６５℃で２０分間、減圧せずにロータリーエバポレーターを回転させることにより攪拌してＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームを調製した。続いて、孔径１，０００ｎｍおよび４００ｎｍのメンブレンフィルターに通過させて濾過処理した。本実施例１（４）のＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームの調製方法を図５に模式的に示す。

【0065】

＜実施例２＞リポソームの性状
（１）粒子径、ＰＤＩ、ゼータ電位およびＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率
［１−１］測定方法
リポソームの粒子径、ＰＤＩおよびゼータ電位は、ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ Ｎａｎｏ ＺＥＮ３６００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、動的光散乱法により粒子径およびＰＤＩを、電気泳動法によりゼータ電位をそれぞれ測定した。

【0066】

また、リポソームのＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率は次の様に測定した。まず、エタノールにＢＣＧ−ＣＷＳを０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬとなるよう懸濁して、これらを検量用サンプルとした。また、リポソームを含むＨＢＳを測定用サンプルとした。また、１．１％（ｖ／ｖ）フクシン溶液（ナカライテスク社）に水およびフェノールを加えて、フェノールの終濃度が５％（ｗ／ｖ）かつフクシンの終濃度が０．５５％（ｖ／ｖ）となるよう調整し、これをフクシン／フェノール液とした。次に、マイクロチューブに、１００％エタノールを１ｍＬずつ入れた。ここに、さらに、１ｍＬの１００％エタノール（ネガティブコントロール）、１ｍＬの検量用サンプルおよび１００〜１５０μＬの測定用サンプルをそれぞれ入れた。これらのマイクロチューブを２分間ボルテックスすることにより、ＢＣＧ−ＣＷＳを析出させた。析出したＢＣＧ−ＣＷＳのペレットを目視により確認した後、１５℃、６０００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離を行って、上清を除去してペレットを回収した。続いて、１００％エタノールを１ｍＬずつ添加して同条件下で遠心分離を行い、上清を除去してペレットを回収した。ペレットを１０分間風乾させた後、ヘキサン４００μＬを添加してボルテックスまたは超音波処理することによりＢＣＧ−ＣＷＳをヘキサン中に分散させた。続いて、フクシン／フェノール液２００μＬを添加して３〜４分間転倒混和することにより、ＢＣＧ−ＣＷＳをフクシンにより染色した。ここで、ＢＣＧ−ＣＷＳの主成分であるミコール酸は、フクシンと反応して赤色を呈することが知られている。続いて、上層のヘキサン層を２５０μＬ回収し、９６穴プレートに移し、５３０ｎｍにおける吸光度を測定した。ネガティブコントロールおよび検量用サンプルの測定結果に基づき、ＢＣＧ−ＣＷＳ濃度の検量線を作成した。作成した検量線に測定用サンプルの測定結果を当てはめることにより、測定用サンプルにおけるＢＣＧ−ＣＷＳ濃度を求めた。このＢＣＧ−ＣＷＳ濃度から、リポソーム全量におけるＢＣＧ−ＣＷＳ量を算出し、次式１を用いて、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率を求めた。
式１；ＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率（％）＝１００×（リポソーム全量におけるＢＣＧ−ＣＷＳ量／リポソーム調製時に用いたＢＣＧ−ＣＷＳ量）。
すなわち、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率は、リポソームを調製する際に用いたＢＣＧ−ＣＷＳのうち、実際にリポソームに内封またはその脂質膜に含有されたＢＣＧ−ＣＷＳの割合を示す値である。

【0067】

［１−２］ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームとＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームとの比較
実施例１（１）のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームおよび実施例１（４）のＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームについて、本実施例２（１）［１−１］に記載の方法により粒子径、ＰＤＩ、ゼータ電位およびＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率を測定した。その結果を表２に示す。表２に示すように、ＰＤＩおよびゼータ電位は、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームと、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームとで、同等であった。これに対し、粒子径は、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームでは、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームと比較して顕著に小さかった。また、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームの粒子径は、ペンタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびヘキサンのいずれを用いて調製した場合も１８０ｎｍ以下であった。この結果から、実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に示す方法により調製した脂質膜構造体は、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有することが示された。また、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率は、ペンタンやジイソプロピルエーテルを用いて調製したＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームの方が、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームと比較して顕著に大きかった。この結果から、実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に示す方法により、脂質膜構造体に目的物質を効率的に内封させることができることが明らかになった。

【0068】

【表2】

【0069】

以下の本実施例２（１）［１−３］および（２）〜（５）、ならびに実施例３〜５においては、実施例１（１）［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームとして、ペンタンを用いて調製したものを用いた。

【0070】

［１−３］ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームと比較用リポソームとの比較
実施例１（２）の比較用リポソームについて、本実施例２（１）［１−１］に記載の方法により粒子径、ＰＤＩ、ゼータ電位およびＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率を測定した。その結果を実施例１（１）のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームと比較して表３に示す。表３に示すように、粒子径、ＰＤＩおよびゼータ電位は、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームと比較用リポソームとで、同等であった。一方、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率は、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームの方が、比較用リポソームと比較して顕著に大きかった。すなわち、リポソームにＢＣＧ−ＣＷＳを効率的に内封させるためには、空リポソームを含むＨＢＳとＢＣＧ非極性溶媒溶液とを混合する必要があることが明らかになった。この結果から、脂質膜構造体に目的物質を効率的に内封させるためには、目的物質を内封しない脂質膜構造体を含む極性溶媒溶液と目的物質が分散した非極性溶媒溶液とを混合して水中油型エマルションを調製する必要があることが示された。

【0071】

【表3】

【0072】

［１−４］Ｒ８の量を変化させたリポソームにおける比較
実施例１（３）のＲ８／０〜５％リポソームについて、本実施例２（１）［１−１］に記載の方法により粒子径、ＰＤＩ、ゼータ電位およびＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率を測定した。その結果を図６に示す。図６に示すように、粒子径は、Ｒ８／０〜５％リポソームのいずれもほぼ同等であったが、Ｒ８／２％リポソームが特に小さかった。これらの結果から、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質の含有量が、他の構成脂質総量に対して１％以上３％未満である場合に、脂質膜構造体の粒子径が特に小さくなることが示された。

【0073】

次に、ＰＤＩは、Ｒ８／０〜５％リポソームのいずれもほぼ同等であったが、Ｒ８／０％リポソームが特に小さかった。これは、後述するようにＲ８／０％リポソームがＢＣＧ−ＣＷＳを内封しないことによると考えられた。次に、ゼータ電位は、Ｒ８／０％リポソームでは負の値（アニオン性）であったのに対して、Ｒ８／１〜５％リポソームではいずれも正の値（カチオン性）であった。これは、Ｒ８／０％リポソームが、カチオン性物質であるＳＴＲ−Ｒ８を有さないことによると考えられた。

【0074】

最後に、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封／含有率は、Ｒ８／０％リポソームでは検出限界以下（Ｎｏｔ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ；Ｎ．Ｄ．）であったのに対して、Ｒ８／１〜５％リポソームではいずれも平均値で１５％以上であった。すなわち、目的物質を内封しない脂質膜構造体がＲ８と結合した脂質を構成脂質として有さない場合、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体の調製は困難であったが、一定の濃度でＲ８と結合した脂質を構成脂質として有する場合は、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体を調製することができた。これらの結果から、アルギニン残基からなるペプチドについては、アルギニンの残基数が変化した場合でも、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質の含有量を変化させて、当該ペプチドを修飾することにより、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体を調製することができることが示された。

【0075】

（２）電子顕微鏡観察
実施例１（１）のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを含むＨＢＳを用意した。これを、２％（ｖ／ｖ）タングステン酸水溶液と混合した後、カーボン蒸着した４００メッシュのグリッドに滴下した。過剰な水分を除去して風乾させた後、透過型電子顕微鏡ＪＥＭ−１２００ＥＸ（日本電子社）を用いて、加速電圧８０ｋＶで観察し、ＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を用いて写真撮影した。なお、ＢＣＧ−ＣＷＳは、透過型電子顕微鏡による観察では、不規則な紐状またはシート状（コントラストがほとんど無く、一様な面状）の構造体として観察される（Ｙ．Ｕｅｎｉｓｈｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第７７巻、第１３９〜１４４頁、２００９年）。これは、ＢＣＧ−ＣＷＳが、溶媒中で長く伸びた構造や折りたたまれた構造などの不均一な構造をとるためと考えられる。一方、リポソームは均一な小胞構造であるため、同心円状の構造体として観察されると考えられる。

【0076】

写真撮影した結果を図７に示す。図７左図に示すように、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームでは、同心円状構造体（リポソームと考えられる）の内側に不規則な紐状構造体およびシート状構造体（ＢＣＧ−ＣＷＳと考えられる）が観察された。また、不規則な紐状構造体およびシート状構造体は、折りたたまれたコンパクトな粒子状であり、その周囲に、溶媒（ペンタンあるいはＨＢＳ）の存在を示す間隙はほとんど見られなかった。すなわち、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームは、ＢＣＧ−ＣＷＳを内封しており、かつ溶媒をほとんど内封していないことが明らかになった。また、図７右図に示すように、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを含むＨＢＳ中においては、ＢＣＧ−ＣＷＳを内封していないリポソームも観察された。ＢＣＧ−ＣＷＳを内封していないリポソームでは、同心円状構造体の中心部まで脂質膜が密に詰まっており、内腔はほとんど存在しない様子が観察された。すなわち、実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に示す方法において、Ｏ／Ｗエマルションから非極性溶媒を減圧留去すると、リポソームの内腔に存在する非極性溶媒はほぼ完全に留去されて、溶媒をほとんど内封しないリポソームが得られることが明らかになった。

【0077】

これらの結果から、実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に示す方法により、非極性溶媒に分散性を有する目的物質を内封する脂質膜構造体を得ることができること、および当該脂質膜構造体が内封する溶媒の量はきわめて小さいことが示された。

【0078】

（３）リポソームが含有する極性溶媒の量；リポソームが含有する極性溶媒に由来する蛍光強度の検討
実施例１（１）［１−１］に記載の方法により空リポソームを、実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に記載の方法によりＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを、それぞれ調製した。ただし、ＨＢＳに代えて０．１ｍｍｏｌ／Ｌのカルセインを含むＨＢＳを用いることにより、リポソームの内外に存在するＨＢＳを蛍光染色した。また、空リポソームの濾過処理においてメンブレンフィルターは孔径４００ｎｍおよび孔径２００ｎｍのものを用い、前者を通過させた空リポソームを大径空リポソーム、後者を通過させた空リポソームを小径空リポソームとした。調製したリポソームの粒子径をＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて測定したところ、大径空リポソームは２４８ｎｍ、小径空リポソームは１６０ｎｍ、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームは１６１ｎｍであった。

【0079】

カルセインは塩化コバルト存在下では錯体を形成して消光することが知られている。このことに基づき、まず、リポソームの外液に塩化コバルトを添加して、外液におけるカルセインの蛍光を消失させた。続いて、蛍光光度計を用いて励起波長４６０ｎｍおよび蛍光波長５５０ｎｍで蛍光強度（相対蛍光強度；ＲＦＩ）を測定し、これを蛍光強度Ａとした。蛍光強度Ａは、主としてリポソームが含有するＨＢＳ（リポソームの内腔および脂質二重層の間隙に存在するＨＢＳ）に由来する蛍光量を示す。次に、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いてリポソームの脂質膜を破壊することにより、リポソームが含有するＨＢＳにおけるカルセインの蛍光も消失させた後、同様に蛍光強度を測定し、これを蛍光強度Ｂとした。蛍光強度Ｂは、リポソームの内外のカルセインが消光した後の、バックグラウンドの蛍光量を示す。また、リン脂質定量キット（和光純薬社）を用いてリポソームが含まれていた溶液の総脂質量（ｎｍｏｌ）を測定した。測定結果に基づき、次式２により、真にリポソームが含有するＨＢＳに由来する蛍光強度（含有ＨＢＳ由来蛍光強度）を算出した。
式２；含有ＨＢＳ由来蛍光強度（ＲＦＩ）＝蛍光強度Ａ−蛍光強度Ｂ。
次に、含有ＨＢＳ由来蛍光強度の値を総脂質量で除することにより、脂質１ｎｍｏｌあたりの含有ＨＢＳ由来蛍光強度（ＲＦＩ／ｎｍｏｌ）を求めた。以上の本実施例２（３）の実験を４回行い、ＲＦＩ／ｎｍｏｌについて、平均値および標準偏差を求めた。また、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームのＲＦＩ／ｎｍｏｌについて、大径空リポソームおよび小径空リポソームに対して有意差検定（反復測定２元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法）を行った。その結果を図８に示す。

【0080】

図８に示すように、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームのＲＦＩ／ｎｍｏｌは、大径空リポソームおよび小径空リポソームと比較して、有意に小さかった。また、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームのＲＦＩ／ｎｍｏｌは、標準偏差の範囲を勘案しても３５００より小さかった。すなわち、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームが含有するＨＢＳの量は、より大きな粒子径を有する空リポソームはもとより、ほぼ同じ粒子径を有する空リポソームと比較しても、顕著に少ないことが明らかになった。これらの結果から、実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に示す方法により調製した脂質膜構造体が含有する極性溶媒の量は、顕著に小さいことが示された。また、当該脂質膜構造体が含有する極性溶媒が、終濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌのカルセインを含み、ｐＨが７．４である１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＢＳである場合において、当該脂質膜構造体が含有する極性溶媒に由来するカルセインの蛍光強度は、励起波長４６０ｎｍおよび蛍光波長５５０ｎｍで測定した場合に、当該脂質膜構造体の構成脂質１ｎｍｏｌあたり３５００未満となることが示された。

【0081】

（４）リポソームが含有する極性溶媒の量；蛍光強度の低下による検討
リポソームがＴｒｉｔｏｎＸ−１００により破壊されると、リポソームが含有する極性溶媒によりリポソームの外液が希釈されてカルセインの濃度が低下するため、蛍光強度が低下する。このことに基づき、リポソームが含有する極性溶媒の量を測定した。具体的には、実施例１（１）［１−１］に記載の方法により空リポソームを、実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に記載の方法によりＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを、それぞれ調製した。リポソームを含むＨＢＳ１０μＬに、９７０μＬのＨＢＳおよび２０μＬの０．１ｍｍｏｌ／Ｌカルセイン溶液を添加した。これを、５００μＬずつ２等分して、一方に終濃度０．１％（ｖ／ｖ）となるよう１０％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を５μＬ添加し、これをＢ液とした。残りの一方にはＨＢＳを５μＬ添加し、これをＡ液とした。Ａ液およびＢ液のうちおよそ３００μＬを１００ｋＤａのマイクロコン（ミリポア社）に添加し、５０００ｒｐｍ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行うことにより限外ろ過を行った。限外ろ過を行っていないサンプルと限外ろ過を行ったサンプルとから、それぞれ１００μＬ分取し、蛍光強度を測定した。

【0082】

その結果、蛍光強度はＡ液よりもＢ液の方が小さかった。Ａ液とＢ液とを比較した蛍光強度の低下の程度は、空リポソームと比較してＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームの方が小さかった。これらの結果から、実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に示す方法により調製した脂質膜構造体が含有する極性溶媒の量は、顕著に小さいことが示された。

【0083】

（５）リポソームが含有する極性溶媒の量；重量測定による検討
実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に記載の方法によりＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを調製した。続いて、凍結乾燥を行い、凍結乾燥物を得た。凍結乾燥物の重量を測定した後、１ｍＬのＤＤＷを添加して再懸濁し、これを再懸濁リポソームとした。続いて、４３０００ｒｐｍ、４℃の条件下で３０分間超遠心分離を行うことにより、再懸濁リポソームと外水層とを分離した後、再懸濁リポソームの湿重量を測定した。また、リン脂質定量キット（和光純薬社）を用いて脂質濃度を測定し、測定結果に基づいて再懸濁リポソームの湿重量の補正を行った。続いて、次式３により、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームが含有する水溶液の重量を測定した。
式３；補正後の再懸濁リポソーム湿重量−凍結乾燥物重量。

【0084】

＜実施例３＞細胞への取込み
（１）リポソームの調製
実施例１（１）［１−１］〜［１−３］に記載の方法によりＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを調製し、実施例１（４）に記載の方法によりＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームを調製した。ただし、脂質クロロホルム溶液およびＢＣＧ混合脂質液に、Ｎｉｔｒｏ−２−１，３−Ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ（ＮＢＤ）が結合したＤＯＰＥ（ＮＢＤ標識ＤＯＰＥ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社）を他の構成脂質総量に対して、モル比１％となるようそれぞれ添加することにより、リポソームの表面をＮＢＤで標識した。

【0085】

（２）蛍光観察
マウス膀胱癌細胞株である、ＭＢＴ−２細胞（理化学研究所）を２×１０^５個の濃度でプレートに播き、１０％仔牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地）を用いて、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２雰囲気下で１日間培養した。培地を除去してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍＬを用いて細胞を洗浄した。続いて、本実施例３（１）のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームおよびＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームを、それぞれ総脂質濃度７５μｍｏｌ／Ｌで含むＲＰＭＩ１６４０培地を１ｍＬずつ加えた。これを同条件下で１時間インキュベートすることにより、ＭＢＴ−２細胞にリポソームを取り込ませた。培地を除去して、２０Ｕ／ｍＬのヘパリンを含むＰＢＳ１ｍＬを用いて洗浄することを２回繰り返した後、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地１ｍＬを用いて１回洗浄した。続いて、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地１ｍＬを加えて、同条件下で４５分間インキュベートした。次に、１００μｍｏｌ／ＬのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ５μＬを添加してさらに１５分間インキュベートすることにより、ＭＢＴ−２細胞の酸性コンパートメントを染色した。その後、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地１ｍＬを用いて洗浄することを２回繰り返した後、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地１ｍＬを加えて、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いてＮＢＤ（緑色）およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（赤色）の蛍光を観察した。その結果を図９に示す。

【0086】

図９に示すように、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームおよびＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームいずれを取り込ませた場合も、ＭＢＴ−２細胞の内部に、緑色の蛍光および緑色と赤色との重複を示す黄色の蛍光が観察された。黄色の蛍光が観察された箇所の数は、ＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソームを取り込ませた場合と比較してＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを取り込ませた場合の方が多かった。すなわち、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームはＭＢＴ−２細胞に効率的に取り込まれることが明らかになった。

【0087】

（３）ＦＡＣＳによる測定
ＭＢＴ−２細胞に、本実施例３（２）に記載の方法により、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを取り込ませた後、細胞を洗浄した。ただし、リポソームを加えた後のインキュベート時間は２時間に代えて１時間とした。続いて、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地１ｍＬを加えて、同条件下で１時間インキュベートし、これをサンプル群とした。また、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを取り込ませていない、同数のＭＢＴ−２細胞をコントロール群とした。サンプル群およびコントロール群の細胞におけるＮＢＤの蛍光強度および細胞数を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；日本ＢＤ社）を用いて測定した。また、サンプル群全体の蛍光強度については、コントロール群全体の蛍光強度に対して有意差検定（独立ｔ検定）を行った。各群全体の蛍光強度を図１０左図に、各細胞の蛍光強度と細胞数との関係を図１０右図にそれぞれ示す。

【0088】

図１０左図に示すように、サンプル群全体の蛍光強度は、コントロール群全体の蛍光強度と比較して、有意に大きかった。また、図１０右図に示すように、サンプル群では、コントロール群と比較して、蛍光強度の大きい細胞が多数検出された。サンプル群の細胞のうち、コントロール群の細胞と比較して蛍光強度が大きい細胞の数を百分率に換算したところ、９６．５±２．２％であった。すなわち、サンプル群のうち、大多数の細胞がＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを取り込んだことが明らかになった。

【0089】

以上の本実施例３（１）および（２）の結果から、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体は、癌細胞に効率的に取り込まれることが明らかになった。

【0090】

＜実施例４＞抗癌作用
（１）移植癌細胞における効果
［１−１］腫瘍体積
８週齢の雌のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（日本エスエルシー社）を、４〜６匹ずつ、Ａ〜Ｆの６群に分けた。ＭＢＴ−２細胞を、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地を用いて３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２雰囲気下で培養した後、培地を除去して３．５×１０^６個ずつＰＢＳに懸濁して、細胞懸濁液とした。細胞懸濁液と下記のリポソームとをマイクロチューブに入れて混合し、移植液を得た。２６Ｇ針とツベルクリンシリンジとを用いて、各群のマウスの右腹皮下に移植液を皮下注射することにより、ＭＢＴ−２細胞を移植した。その後、各群のマウスを２５日間飼育した。飼育は、標準的な温度および湿度ならびに明期および暗期のいずれも１２時間の条件下で行い、食餌および飲料水は自由摂取させた。移植後１４、１９、２１および２５日目に各群から１〜数匹ずつ任意に選択し、ノギスを用いて移植部位における腫瘍の長径および短径を測定した。ここで、腫瘍は、盛り上がった細胞塊として目視で容易に判別可能である。続いて、長径および短径の測定結果を基に、次式４を用いて腫瘍体積を算出した。
式４；腫瘍体積（ｍｍ^３）＝０．５２×長径×（短径）^２。
また、移植後２５日目のＣ群〜Ｆ群の腫瘍体積について、Ａ群およびＢ群に対して有意差検定（反復測定２元配置分散分析、Ｄｕｎｎｅｔｔ法）を行った。その結果を図１１に示す。

【0091】

『細胞懸濁液と混合したリポソーム』
Ａ群（５匹）；（細胞懸濁液のみ）
Ｂ群（５匹）；実施例１（１）［１−１］の空リポソーム（脂質量２．５６ｍｇ）
Ｃ群（５匹）；実施例１（１）［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム（ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．３ｍｇ、脂質量２．５６ｍｇ）
Ｄ群（４匹）；実施例１（１）［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム（ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．１ｍｇ、脂質量０．８５ｍｇ）
Ｅ群（６匹）；実施例１（４）のＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソーム（ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．３ｍｇ、脂質量２．５６ｍｇ）
Ｆ群（４匹）；実施例１（４）のＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソーム（ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．１ｍｇ、脂質量０．８５ｍｇ）

【0092】

図１１に示すように、移植後２５日目の腫瘍体積は、Ａ群およびＢ群と比較して、Ｄ群およびＦ群では小さい傾向であり、Ｃ群およびＥ群では有意に小さかった。すなわち、ＭＢＴ−２細胞を移植するとともにＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを投与した場合は、移植したＭＢＴ−２細胞の生着や成長が抑制されることが明らかになった。

【0093】

［１−２］生存率
８週齢の雌のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（日本エスエルシー社）を、１０匹ずつ２群に分け、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム投与群および空リポソーム投与群とした。各群のマウスに本実施例４（１）［１−１］に記載の方法によりＭＢＴ−２細胞を移植して、およそ６０日間飼育し、生存マウスの数を数えた。ただし、移植液において、細胞懸濁液と混合したリポソームは下記の通りとした。また、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム投与群の生存マウスの数について、空リポソーム投与群に対して有意差検定（ログランク検定）を行った。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム投与群の生存マウスの数は、空リポソーム投与群と比較して、有意に大きかった。すなわち、ＭＢＴ−２細胞を移植するとともにＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを投与すると、生存率が上昇することが明らかになった。

【0094】

『細胞懸濁液と混合したリポソーム』
ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム投与群；実施例１（１）［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム（ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．３ｍｇ、脂質量２．５６ｍｇ）
空リポソーム投与群；実施例１（１）［１−１］の空リポソーム（脂質量２．５６ｍｇ）

【0095】

［１−３］腫瘍組織面積および白血球数
１．０×１０^６個の細胞につき、実施例１（１）［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム（ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．１ｍｇ、脂質量０．８５ｍｇ）を添加したＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地を用いて、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２雰囲気下で、ＭＢＴ−２細胞を１時間培養した。その後、２０Ｕ／ｍＬのヘパリンを含むＰＢＳを用いて細胞を洗浄することにより、細胞に取り込まれていないリポソームを除去した。この処理により、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを取り込ませたＭＢＴ−２細胞を得て、これをｌｉｐｏ取り込み細胞とした。

【0096】

８週齢の雌のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（日本エスエルシー社）４匹を用意し、マウスａ〜ｄとした。下記のとおり、各マウスにＭＢＴ−２細胞またはｌｉｐｏ取り込み細胞１．０×１０^６個を移植するとともにリポソームを投与し、１０日間飼育した。ＭＢＴ−２細胞の培養および移植、リポソームの投与ならびにマウスの培養は本実施例４（１）［１−１］に記載の方法と同様に行った。その後、各マウスの腫瘍組織を採取し、定法に従いパラフィンに包埋した後、約３μｍ厚さの切片を作成し、ヘマトキシリン・エオシン染色およびギムザ染色を行った。ヘマトキシリン・エオシン染色した切片の画像を画像解析ソフトＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｖｅｒ．１．４４ｐ（Ｗａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を用いて解析して腫瘍組織の総面積、生存腫瘍組織の面積、壊死腫瘍組織の面積および壊死細胞の割合（％）を測定した。また、強拡大視野（Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｆｉｅｌｄ；ＨＰＦ）での観察により、腫瘍組織における各種白血球の数を測定した。

【0097】

マウスａ；ＭＢＴ−２細胞と実施例１（１）［１−１］の空リポソーム（脂質量０．８５ｍｇ）を混合した移植液を皮下注射。
マウスｂ；ＭＢＴ−２細胞と実施例１（１）［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム（ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．１ｍｇ、脂質量０．８５ｍｇ）を混合した移植液を皮下注射。
マウスｃ；ｌｉｐｏ取り込み細胞を含む細胞懸濁液を皮下注射。
マウスｄ；ＭＢＴ−２細胞を含む細胞懸濁液と実施例１（１）［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム（ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．１ｍｇ、脂質量０．８５ｍｇ）を含むＰＢＳを、互いに離れた部位に皮下注射。

【0098】

腫瘍組織の総面積、生存腫瘍組織の面積、壊死腫瘍組織の面積および壊死細胞の割合（％）を測定した結果を図１３に示す。図１３に示すように、マウスｂ〜ｄでは、マウスａと比較して、腫瘍組織の総面積および生存腫瘍組織の面積が顕著に小さく、壊死腫瘍組織の面積が小さいもののほぼ同等レベルであり、かつ、壊死細胞の割合が大きかった。すなわち、ＭＢＴ−２細胞を移植するとともにＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを投与した場合は、移植したＭＢＴ−２細胞に由来する腫瘍組織の増大が抑制されるとともに、腫瘍組織における細胞の壊死が維持ないし促進されることが明らかになった。

【0099】

また、マウスｂおよびマウスｃでは、マウスｄと比較しても、腫瘍組織の総面積および生存腫瘍組織の面積が小さく、かつ、壊死細胞の割合が顕著に大きかった。すなわち、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームとＭＢＴ−２細胞とを混合して移植した場合、あるいは、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを取り込ませたＭＢＴ−２細胞を移植した場合は、腫瘍組織の増大の抑制効果や腫瘍組織における細胞の壊死の維持ないし促進効果が大きくなることが明らかになった。

【0100】

次に、腫瘍組織における各種白血球の数および割合を測定した結果を図１４に示す。なお、図１４下の写真図において、色が濃く丸い核を持つ細胞がリンパ球である。図１４に示すように、マウスｂ〜ｄでは、マウスａと比較して、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球、マスト細胞および総白血球の数が多かった。また、各種白血球の増加の割合は、マウスｂ〜ｄでは、マウスａと比較して、リンパ球が特に大きかった。すなわち、ＭＢＴ−２細胞を移植するとともにＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを投与した場合は、移植したＭＢＴ−２細胞に由来する腫瘍組織への免疫細胞の浸潤、特にリンパ球の浸潤が促進されることが明らかになった。

【0101】

また、マウスｂおよびマウスｃでは、マウスｄと比較しても、腫瘍組織におけるリンパ球、好中球、好酸球、マスト細胞および総白血球の数が多く、リンパ球の増加の割合が大きかった。すなわち、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームとＭＢＴ−２細胞とを混合して移植した場合、あるいは、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを取り込ませたＭＢＴ−２細胞を移植した場合は、腫瘍組織への免疫細胞の浸潤効果が大きくなることが明らかになった。

【0102】

（２）膀胱癌モデルラットにおける効果
６週齢の雄のＦ３４４／ＤｕＣｒｌＣｒｌｊラット（日本チャールズリバー社）５４匹を用意した。これらのラットを、発癌物質であるＮ−ｂｕｔｙｌ−Ｎ−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅを０．０５％含む飲料水および発癌促進物質であるアスコルビン酸ナトリウムを５％含む飼料を自由摂取させながら８週間飼育することにより膀胱癌を誘発して、膀胱癌モデルラットを作製した。膀胱癌モデルラットを９匹ずつＧ〜Ｌの６群に分け、下記のリポソームを含むリン酸緩衝液を、１週間ごとに計８回、膀胱内に投与しながら飼育した。膀胱内投与は、エーテルによる軽麻酔下でラットを仰臥位にし、圧迫により排尿させた後、２４Ｇ×３／４インチの留置針を装着した外套カテーテルを外尿道口より挿入し、これを用いて投与することにより行った。また、リポソーム投与中の飼育期間は、通常の食餌および飲料水を自由摂取させ、標準的な温度および湿度ならびに明期および暗期のいずれも１２時間の条件下で飼育した。

【0103】

『投与したリポソーム（〈〉中の記載は１回あたりの投与量を示す）』
Ｇ群；（何も投与しない）
Ｈ群；実施例１（１）［１−１］の空リポソーム〈脂質量（ＢＣＧ−ＣＷＳ量換算）０．１ｍｇ／１ｍＬ×ラット個体の体重（ｋｇ）〉
Ｉ群；実施例１（１）［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム〈ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．１ｍｇ／１ｍＬ×ラット個体の体重（ｋｇ）〉
Ｊ群；実施例１（１）［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソーム〈ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．０３ｍｇ／１ｍＬ×ラット個体の体重（ｋｇ）〉
Ｋ群；実施例１（４）のＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソーム〈ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．１ｍｇ／１ｍＬ×ラット個体の体重（ｋｇ）〉
Ｌ群；実施例１（４）のＢＣＧ−ＣＷＳ含有脂質膜リポソーム〈ＢＣＧ−ＣＷＳ量０．０３ｍｇ／１ｍＬ×ラット個体の体重（ｋｇ）〉

【0104】

最終投与から１週間飼育した後に解剖し、膀胱を摘出して１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬することにより固定した。固定後、膀胱を矢状断に分割し、電子天秤を用いて重量を測定した。ここで、膀胱重量は膀胱癌の進行に伴って大きくなると考えられる。その後、膀胱を４分割してパラフィンに包埋し、約３μｍ厚さの切片を作製してヘマトキシリンエオシン染色を行った。染色した切片を観察して上皮性病変（腫瘍）数を数えた。また、膀胱基底膜の長さを画像解析により測定し、測定結果に基づき、膀胱基底膜１０ｃｍあたりの上皮性病変（腫瘍）数を算出した。続いて、Ｉ群〜Ｌ群の膀胱重量および膀胱基底膜１０ｃｍあたりの上皮性病変（腫瘍）数について、Ｇ群およびＨ群それぞれに対して有意差検定（１元配置分散分析、Ｄｕｎｎｅｔｔ法）を行った。さらに、Ｇ群〜Ｊ群について本実施例４（１）［１−１］に記載の方法により腫瘍体積を測定し、膀胱を取り出して２つに割り、粘膜面のデジタル写真を撮影後、腫瘍病変の２値化画像を作成し、病変数と腫瘍体積を測定した。

【0105】

Ｇ群、Ｉ群およびＪ群の腫瘍体積について、Ｈ群に対して有意差検定（１元配置分散分析、Ｄｕｎｎｅｔｔ法）を行った。Ｇ群〜Ｊ群の膀胱の切片を図１５に、Ｇ群〜Ｌ群の膀胱重量および膀胱基底膜１０ｃｍあたりの上皮性病変（腫瘍）数ならびにＧ群〜Ｊ群の腫瘍体積の測定結果を図１６に、それぞれ示す。

【0106】

図１６左図に示すように、膀胱重量は、Ｇ群〜Ｌ群のうちＩ群およびＪ群が最も小さかった。また、Ｉ群〜Ｋ群は、Ｈ群に対して有意に小さかった。すなわち、膀胱癌モデルラットにＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを投与すると、膀胱重量が減少あるいは膀胱重量の増大が抑制されることが明らかになった。また、図１５に示すように、Ｉ群およびＪ群では、ＧおよびＨ群と比較して、膀胱における上皮性病変（腫瘍）の数が顕著に少なかった。また、図１６中央図に示すように、膀胱基底膜１０ｃｍあたりの上皮性病変（腫瘍）数は、Ｉ群〜Ｌ群のいずれも、Ｈ群に対して有意に少なかった。Ｊ群〜Ｌ群は、Ｇ群に対しても有意に少なかった。すなわち、膀胱癌モデルラットにＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを投与すると、上皮性病変（腫瘍）の数が減少あるいは上皮性病変（腫瘍）の数の増大が抑制されることが明らかになった。また、図１６右図に示すように、腫瘍体積は、Ｉ群およびＪ群では、Ｇ群およびＨ群と比較して小さかった。特に、Ｉ群ではＨ群と比較して有意に小さかった。すなわち、膀胱癌モデルラットにＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを投与すると、腫瘍体積が減少あるいは腫瘍体積の増大が抑制されることが明らかになった。

【0107】

以上の本実施例４（１）［１−１］〜（２）の結果から、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体は、癌の治療をすることや癌の進行を抑制することができることが示された。また、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体は、癌細胞に直接投与することにより、一層高い抗癌作用を発揮することが示された。

【0108】

＜実施例５＞免疫賦活作用
（１）ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞の単離
４名の健康な被験者から血液を採取し、Ｆｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐｊｏｈｎ社）を用いて末梢血単核球を単離した。続いて、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８／ＣＤ４５ＲＯ抗体を反応させることにより、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞をＦＩＴＣ標識した。次に、抗ＦＩＴＣマグネティックビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）およびＡｕｔｏ−ＭＡＣＳセルソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてＦＩＴＣ標識した細胞を単離し、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を得た。

【0109】

（２）リポソームの添加
本実施例５（１）のナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞の培地に、ＰＢＳに懸濁した牛型結核菌の細胞壁画分（ＢＣＧ−ＣＷ）、実施例１（１）［１−１］の空リポソームおよび実施例１（１）［１−３］のＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームを添加し、それぞれポジティブコントロール群、ネガティブコントロール群および試験群とした。添加量は、ＢＣＧ−ＣＷまたはＢＣＧ−ＣＷＳの量で、終濃度が１、３、１０および３０μｇ／ｍＬとした。また、何も添加しないナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を基準群とした。続いて、これらの細胞群を、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞の分化誘導用培地を用いて、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内で１週間培養した。この１週間の培養期間のうち、始めの２日間は２０μｇ／ｍＬのａｎｔｉ−ＣＤ３抗体を各培地に添加して培養し、残りの５日間はａｎｔｉ−ＣＤ３抗体を添加しない培地で培養した。Ｔｈ１細胞の分化誘導用培地としては、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ＆Ｃｏ社）、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２（Ｒ６Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）および５μｇ／ｍＬのａｎｔｉ−ＩＬ−４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含む１０％血清入ＲＰＭＩ１６４０培地を、Ｔｈ２細胞の分化誘導用培地としては、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ＆Ｃｏ社）、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）および５μｇ／ｍＬのａｎｔｉ−ＩＦＮ−γ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含む１０％血清入ＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ用いた。その後、抗ＩＦＮ−γ抗体および抗ＩＬ−４抗体を反応させ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を産生する細胞を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；日本ＢＤ社）により検出した。４名の被験者のうち、任意に選択した１名の結果を図１７に示す。

【0110】

図１７上図に示すように、Ｔｈ１細胞の分化誘導用培地を用いた場合（Ｔｈ１分化誘導環境）下では、ＩＦＮ−γを産生し、かつＩＬ−４を産生しない細胞（Ｔｈ１細胞）の数は、試験群では、添加量に関わらず、ネガティブコントロール群と比較して大きかった。特に、添加量が３０μｇ／ｍＬの場合、試験群のＴｈ１細胞数は、ネガティブコントロール群および基準群と比較して大きく、ポジティブコントロール群と比較して、同程度であった。すなわち、Ｔｈ１分化誘導環境下において、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームは、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を促進することが明らかになった。

【0111】

一方、図１７下図に示すように、Ｔｈ２細胞の分化誘導用培地を用いた場合（Ｔｈ２分化誘導環境）下では、ＩＦＮ−γを産生せず、かつＩＬ−４を産生する細胞（Ｔｈ２細胞）の数は、試験群では、添加量に関わらず、ネガティブコントロール群および基準群と比較して小さく、ポジティブコントロール群と比較して、同程度であった。また、試験群のＴｈ１細胞数は、添加量が３、１０および３０μｇ／ｍＬの場合、ネガティブコントロール群および基準群と比較して大きく、ポジティブコントロール群と比較して、同程度であった。すなわち、Ｔｈ２分化誘導環境下においても、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームは、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を促進して、Ｔｈ２細胞への分化を抑制することが明らかになった。

【0112】

次に、フローサイトメトリーでの測定結果に基づき、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞がＩＦＮ−γ産生細胞またはＩＬ−４産生細胞へ変化する率（変化率；％）を算出した。変化率は、基準群におけるＩＦＮ−γ産生細胞およびＩＬ−４産生細胞の割合を１００％としたときの、各群における各細胞の割合として算出した。続いて、変化率について、４名の被験者の結果の平均値および標準偏差を求めた。また、試験群の変化率について、ネガティブコントロール群に対して有意差検定（独立ｔ検定）を行った。その結果を図１８に示す。

【0113】

図１８に示すように、試験群におけるＩＦＮ−γ産生細胞への変化率は、Ｔｈ１分化誘導環境およびＴｈ２分化誘導環境のいずれにおいても、ネガティブコントロール群と比較して大きい傾向であった。特に、Ｔｈ２分化誘導環境下で添加量が３０μｇ／ｍＬの場合、試験群におけるＩＦＮ−γ産生細胞への変化率は、ネガティブコントロール群と比較して有意に大きかった。また、試験群におけるＴｈ２分化誘導環境下でのＩＬ−４産生細胞への変化率は、添加量が３、１０および３０μｇ／ｍＬの場合、ネガティブコントロール群と比較して有意に小さく、添加量が１μｇ／ｍＬの場合も、ネガティブコントロール群と比較して小さい傾向であった。すなわち、Ｔｈ１分化誘導環境およびＴｈ２分化誘導環境のいずれにおいても、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームは、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を促進することが明らかになった。また、Ｔｈ２分化誘導環境下において、ＢＣＧ−ＣＷＳ内封リポソームは、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化を抑制することが明らかになった。

【0114】

以上の本実施例５（２）の結果から、濾過滅菌処理が可能な粒子径を有し、複数個のアルギニン残基からなるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体は、免疫細胞に作用して、細胞性免疫を賦活することが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]