特許 6259207 エラスチン産生促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6259207

(24)【登録日】2017年12月15日

(45)【発行日】2018年1月10日

(54)【発明の名称】エラスチン産生促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20171227BHJP

   A61K 38/01 20060101ALI20171227BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20171227BHJP

   A23L 33/18 20160101ALI20171227BHJP

   A23L 2/52 20060101ALI20171227BHJP

   A23L 2/66 20060101ALI20171227BHJP

   A61P 17/00 20060101ALN20171227BHJP

   A61K 8/64 20060101ALN20171227BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALN20171227BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALN20171227BHJP

   A61P 19/02 20060101ALN20171227BHJP

   A61P 29/00 20060101ALN20171227BHJP

   A23L 2/38 20060101ALN20171227BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/17

   A61K38/01

   A61P43/00 105

   A23L33/18

   A23L2/00 F

   A23L2/00 J

   !A61P17/00

   !A61K8/64

   !A61Q19/08

   !A61Q19/00

   !A61P19/02

   !A61P29/00 101

   !A23L2/38 P

【請求項の数】6

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2013-126286(P2013-126286)

(22)【出願日】2013年6月17日

(65)【公開番号】特開2015-860(P2015-860A)

(43)【公開日】2015年1月5日

【審査請求日】2016年5月16日

(73)【特許権者】

【識別番号】711002926

【氏名又は名称】雪印メグミルク株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】高野 義彦

(72)【発明者】

【氏名】加藤 晴彦

(72)【発明者】

【氏名】上野 宏

(72)【発明者】

【氏名】小林 敏也

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０８０９１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５１６０４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５４１０６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１４４７５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００３−５３３２０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−０００８６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−００００３８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

ＷＰＩ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物を有効成分とするエラスチン産生促進剤。

【請求項2】

前記リポカリン２分解物が、分子量３００以上、８０００以下であることを特徴とする請求項１に記載のエラスチン産生促進剤。

【請求項3】

前記リポカリン２分解物が、リポカリン２をタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする請求項２記載のエラスチン産生促進剤。

【請求項4】

前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする請求項３記載のエラスチン産生促進剤。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれかに記載のエラスチン産生促進剤を配合したエラスチン産生促進用サプリメント。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれかに記載のエラスチン産生促進剤を配合したエラスチン産生促進用飲食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下、関節機能低下等を防止するのに有用なエラスチン産生促進剤、エラスチン産生促進用飲サプリメント、食品及びエラスチン産生促進用化粧料に関する。さらに詳しくは、本発明は、リポカリンファミリータンパク質あるいはそのリポカリンファミリータンパク質を分解して得られるリポカリンファミリータンパク質分解物を有効成分とするエラスチン産生促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、皮膚のメカニズムに関して、多くの研究が進められている。
皮膚の乾燥感や肌荒れの原因としてマクロ的には、加齢による新陳代謝の減衰によるものがある。その他、太陽光（紫外線）、乾燥、酸化等の作用が皮膚の乾燥肌や肌荒れの原因に、複雑に関与していることが確認されてきた。これらの因子による作用によって、真皮の最も主要なマトリックス成分であるコラーゲン繊維が顕著に減少していることが明らかとなってきた。コラーゲン繊維によって保たれていた皮膚のハリや弾力性といった張力保持機構が、コラーゲン繊維が減少する事により破壊され、皮膚はシワやたるみを増した状態になる。また、コラーゲンは水分を保持する機能を有しており、皮膚をしっとりとした状態に保つことにも役立っている。外的因子により、コラーゲンが破壊されると、肌は乾燥し、荒れた状態になる。エラスチンは、そのコラーゲン線維を支える役割を持ち、弾性線維とも呼ばれている。エラスチンは真皮の構成としては約２％に過ぎないが、エラスチンの形成を制御することが、皮膚の弾力性やたるみ等の改善につながる。以上のことから、真皮層の主要な成分の一つであるエラスチンの生合成を促進させることによって、皮膚のシワやたるみを防止できると思われる。そこで、エラスチン産生促進剤が望まれていた。
エラスチン産生促進剤としては京水菜、京壬生菜、伏見とうがらし、万願寺とうがらし及び九条ねぎ、オウバク、オタネニンジン、アルテア、ヨクイニン及びユリ等植物からの抽出物が開示されている。（特許文献１，２）
一方、関節軟骨中や靭帯中のエラスチンは、関節機能の円滑な作動に役立っている。変形性関節症(ＯＡ)の場合、関節周囲の血行が悪くなり酸素の供給が低下することで、軟骨細胞によるコラーゲンやプロテオグリカンなどの産生を低下させ、死滅した軟骨細胞が滑膜を刺激、炎症を起こし、関節に痛みを生じさせることとなる。さらに、炎症時のサイトカインの放出が、軟骨細胞死を誘導し、痛みの症状を激化させる。
ＯＡの対症療法としては、痛み止めや抗炎症製剤の投与、高分子ヒアルロン酸(ヒアルロン酸ナトリウム)の関節腔内への注入等があげられる。近年では、対症療法以外の方法として、軟骨細胞の分化促進または軟骨細胞の肥大化の抑制、軟骨細胞によるコラーゲン、プロテオグリカンの転写、合成促進などのアプローチが取られ始めているが、エラスチンの合成促進などの研究はあまり見られない。
以上のことから、エラスチン産生の促進は、肌荒れ等の皮膚疾患、関節リウマチや外傷性関節症、骨関節炎、変形性関節症といった関節疾患の予防、治療に有効である。したがって、日常の生活の中で手軽に摂取できるエラスチン産生促進剤を含有するサプリメント、クリームあるいは飲食品が望まれていた。
リポカリン２（ＬＣＮ２）及びβラクトグロブリンは、８本のβ−バレル構造を有するリポカリンファミリーに属するタンパク質である。
リポカリン２（ＬＣＮ２）は、ヒト好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）)とも呼ばれ、９２ｋＤａのヒト好中球タイプIVコラゲナーゼに結合するタンパク質として同定されている。肝臓から分泌されるリポカリン２は、ジデロフォア-Fe³⁺と選択的に結合することで、バクテリアの鉄利用を阻害し増殖を阻害するといった抗菌作用を持つ。また、血漿、血中のリポカリン２が炎症や感染のマーカーとして、尿中のリポカリン２が乳がんなどの悪性腫瘍のマーカーとして利用できるとの報告がある。リポカリン２は、牛乳中にも含まれることが知られているが、成熟乳に比べて初乳中に多く含まれるとの報告がある。しかしながら牛乳中のリポカリン２の機能についての報告はない。
βラクトグロブリンは牛乳中の主要な乳清タンパク質である。有用生理活性物質であるレチノール等の疎水性物質の結合能を有しており、優れた機能特性（乳化性、ゲル化性、起泡性）を有する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１２-１６２４８７

【特許文献2】特開２０１２-５６９３３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

特許文献１，２に開示されている発明では、植物由来の原材料を用いる為、エラスチン産生促成剤の原料の栽培が特定の地域に限られていたり、季節による供給の変動が大きいなど安定供給が出来ないという課題がある。そこで、日常の生活の中で手軽に摂取できる、エラスチン産生促進剤を提供すること、及びそのような物質を配合したエラスチン産生促進用サプリメント、飲食品及びエラスチン産生促進用化粧料を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、これらの課題を解決するために、エラスチン産生促進作用を示す物質について、鋭意、探索を進めたところ、リポカリンファミリータンパク質あるいはそのリポカリンファミリータンパク質を分解して得られるリポカリンファミリータンパク質分解物が、皮膚のエラスチン産生量を増加させることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の態様を含むものである。
（１）リポカリンファミリータンパク質及び／又はリポカリンファミリータンパク質分解物を有効成分とするエラスチン産生促進剤。
（２）上記リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物が、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物である、（１）記載のエラスチン産生促進剤。
（３）上記リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物が、βラクトグロブリン及び／又はβラクトグロブリン分解物である、（１）記載のエラスチン産生促進剤。
（４）前記リポカリン２分解物が、分子量３００以上、８０００以下であることを特徴とする（２）に記載のエラスチン産生促進剤。
（５）前記リポカリン２分解物が、リポカリン２をタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする（２）記載のエラスチン産生促進剤。
（６）前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする（５）記載のエラスチン産生促進剤。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のエラスチン産生促進剤を有効成分とするスキンケア剤。
（８）前記スキンケアが、肌荒れの予防及び／又は改善であることを特徴とする（７）記載のスキンケア剤。
（９）（１）〜（６）のいずれかに記載のエラスチン産生促進剤を配合したサプリメント。
（１０）（１）〜（６）のいずれかに記載のエラスチン産生促進剤を配合した飲食品。
（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載のエラスチン産生促進剤を配合した化粧料。
（１２）（１）〜（６）のいずれかに記載のエラスチン産生促進剤を経口摂取又は塗布することによる肌質の改善方法。
（１３）（１）〜（６）のいずれかに記載のエラスチン産生促進剤を１日あたり１０．０μｇ以上経口摂取するか、又は０．０５〜０．５重量％配合した組成物を塗布することによる肌質の改善方法。

【発明の効果】

【0006】

本発明により、リポカリンファミリータンパク質及び／またはリポカリンファミリータンパク質分解物を有効成分とすることでエラスチン産促進剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】はリポカリン２によるエラスチン産生促進効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明のエラスチン産生促進剤の特徴は、リポカリン２及び／またはリポカリン２をタンパク質分解酵素で分解して得られるリポカリン２分解物を有効成分とすることにある。本発明のリポカリン２はどのような由来のものであっても使用可能である。たとえば、ヒト及びウシ由来のリポカリン２はすでにその遺伝子配列が明らかになっており、遺伝子組換えによる生産が可能であるが、本発明では、遺伝子工学的手法により生産されたリポカリン２も使用可能であり、細胞培養の培養液から回収した細胞由来のものも使用可能である。また、リポカリン２はウシ初乳中に含有されており、乳から回収したものであっても良く、生乳や粉乳、脱脂乳、還元乳等から、加熱処理、加塩処理、エタノール処理、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマト処理、限外濾過処理等によって取得することも可能である。

【0009】

リポカリン２分解物は、リポカリン２をトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で分子量が８，０００以下となるように限定分解したペプチド混合物を使用することが可能である。但し、分子量の下限は３００以上であることが好ましい。

【0010】

本発明のエラスチン産生促進剤は、経口投与あるいは塗布することにより、エラスチン産生促進効果を発揮する。本発明のエラスチン産生促進剤を経口投与するに際しては、有効成分であるリポカリン２あるいはリポカリン２分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。本発明において、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、例えば、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法によって製剤化することが可能である。この種の製剤には、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用してもよい。より具体的には、結合剤としては、例えば、澱粉、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられ、崩壊剤としては、例えば、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶性セルロース等が挙げられる。また、界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等、流動性促進剤としては無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
さらには、これらのリポカリン２やリポカリン２分解物をそのままあるいは製剤化した後、これを栄養剤や飲食品等に配合することも可能である。なお、リポカリン２あるいはリポカリン２分解物は、比較的熱に対して安定であるので、リポカリン２あるいはリポカリン２分解物を含む原料を通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。

【0011】

本発明のエラスチン産生促進剤を塗布するに際しては、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末等が挙げられる。例えば、本発明のエラスチン産生促進剤をワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸、ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、ロウ、樹脂、水及び、要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料に混合することによって、エラスチン産生促進用化粧料や医薬品を製造することができる。

【0012】

本発明のエラスチン産生促進剤の経口投与による有効量は、その製剤形態、投与方法、使用目的、及びこれを適用される患者の年齢、体重、病状により適宜規定され一定でないが、ラットを用いた動物実験の結果、リポカリン２及び／またはリポカリン２分解物は、ラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ以上摂取させることでエラスチン産生促進作用を示すことが明らかとなった。したがって、外挿法によると、通常、成人一人当たり一日１０μｇ以上のリポカリン２及び／またはリポカリン２分解物を摂取すればエラスチン産生促進効果が期待できるため、この必要量を確保できるよう飲食品に配合するか、あるいは、医薬として投与すれば良い。なお、投与は必要に応じて一日数回に分けて行うことも可能である。

【0013】

本発明のエラスチン産生促進剤の塗布による有効量は、剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは、０．００１〜２重量％となるように、リポカリン２及び／またはリポカリン２分解物を配合すれば良い。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものは、さらに配合量を増やすことができる。

【実施例1】

【0014】

以下、実施例および試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。実施例および試験例における「％」は断らない限り「重量％」を意味するものとする。
以下に、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、これらは単に本発明の実施態様を例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

【0015】

Ｓセファロース ３,０００ｇ を充填したカラムを脱イオン水で充分洗浄し、脱脂乳１０,０００Ｌを通液して、脱イオン水で充分洗浄した後、０．１〜１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。その後、リポカリン２を含む溶出画分を再度フェニルＳセファロース疎水性カラムクロマトグラフィーで分画した。さらに、この画分をＨＰＬＣシステムにてＣ４およびＣ８逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーで順次処理し、リポカリン２４００ｍｇ（画分Ａ）を得た。なお、このようにして得られたリポカリン２は、そのままエラスチン産生促進剤として使用可能である。

【実施例2】

【0016】

実施例１で得られた画分Ａ２５ｍｇを、水１００ｍｌに懸濁し、最終濃度が１％となるようにパンクレアチンを加え、３７℃で５分から６時間、酵素処理を行った。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥して、リポカリン２分解物２４ｍｇ（画分Ｂ、Ｃ、Ｄ）を得た。なお、このようにして得られたリポカリン２分解物の平均分子量は、Ｂが約８，０００、Ｃが約５００、Ｄが約３００であった。また、実施例１で得られた画分Ａ２５ｍｇを、水１００ｍｌに懸濁し、最終濃度が０．０１％となるようにペプシンを添加し、ｐＨを２〜３に調整した後、３７℃で１２時間酵素処理を行い、さらにｐＨを８に調整した後、最終濃度が０．０１％となるようにトリプシンを添加し、３７℃で１２時間酵素処理を行った。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥し、リポカリン２分解物２４ｍｇ（画分Ｅ）を得た。画分Ｂ、Ｃ、Ｄは、そのままエラスチン産生促進剤として使用可能である。

【0017】

［試験例１］
実施例１で得られた試料Ａ及び実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｅについて、ラットを用いた動物実験によりエラスチン産生促進作用を調べた。７週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラットを、生理食塩水投与群（対照群）、実施例１で得られた試料Ａをラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ投与する群（Ａ−１群）、実施例１で得られた試料Ａをラット体重１ｋｇ当たり１００μｇ投与する群（Ａ−２群）、実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｅをラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ投与する群（Ｂ−１〜Ｅ−１群）、実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｅをラット体重１ｋｇ当たり１００μｇ投与する群（Ｂ−２〜Ｅ−２群）の１１試験群（ｎ＝６）に分け、それぞれを毎日１回ゾンデで経口投与して１０週間飼育した。皮膚のエラスチン量については、試験前日に剃毛したラットを屠殺後速やかに回収した皮膚組織（各３００ｍｇ）を測定に供した。皮膚組織に適量の０．８５％生理食塩水を加え、ホモジナイザーにて組織をホモジナイズした。皮膚組織からの抽出液を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗エラスチン抗体(ａｂｃａｍ社)を用いてウェスタンブロッティングを行い、エラスチン量を定量した。その結果を表１に示す。

【0018】

【表1】

【0019】

この結果、１０週間後の可溶性画分中エラスチン量は、対照群に比べ、すべての試験群で有意に高い値を示した。このことから、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物には、エラスチン産生促進作用があることが明らかとなり、エラスチン産生促進剤として有用であることが示された。また、このエラスチン産生促進作用はリポカリン２及び／又はリポカリン２分解物をラット体重１ｋｇ当たり少なくとも１０．０μｇ投与した場合に認められることが明らかとなった。

【0020】

［試験例２］
実施例１で得られた試料Ａ及び実施例２で得られた試料Ｂ、Ｃ、Ｄについて、正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ（ＮＢ））を用いた実験によりエラスチン産生促進作用を調べた。ＮＨＤＦ（ＮＢ）細胞を１２穴プレートに０．６×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に播種し、ＭＥＤＩＵＭ１０６培地(ＧＩＢＣＯ社製)にて３７℃、５％ＣＯ^２環境下にて２日間培養した後、無血清ＭＥＤＩＵＭ１０６培地に置換し、さらに２４時間培養した。そして、実施例１で得られた試料Ａ及び実施例２で得られた試料Ｂ、Ｃ、Ｄを、各ウエルに０．１容量％となるように無血清ＭＥＤＩＵＭ１０６培地にて調整後、細胞に添加（ｎ＝３）し、２４時間培養した。培養後の細胞をＰＢＳにて洗浄し、トリプシン処理にて細胞を剥がした後、回収した。細胞中のエラスチン産生量を、比色定量キット（ｂｉｏｃｏｌｏｒ，フナコシ）にて測定した。なお、対照として、リポカリン２又はリポカリン２分解物を添加しないで同様の試験を行った。その結果を表２に示す。

【0021】

【表2】

【0022】

表２の結果、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物を添加した群は、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物を添加していない群（対照）に比べていずれも有エラスチン産生促進量が有意に多かった。このことから、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物には、皮膚線維芽細胞に働きかけ、エラスチン産生を促進する作用があることが明らかとなり、エラスチン産生促進剤として有用であることが示された。

【0023】

［試験例３］
市販のヒトリポカリン２リコンビナントタンパク質（ＮＧＡＬ）（ＰＲＯＳＰＥＣ社）、及び正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ（ＮＢ））を用いた細胞実験により、ＮＧＡＬがエラスチンのｍＲＮＡ発現へ及ぼす影響について、リアルタイムＰＣＲ法を用いて検討した。
具体的には、ＮＨＤＦ（ＮＢ）細胞を２４穴プレートに０．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に播種し、ＭＥＤＩＵＭ１０６培地(ＧＩＢＣＯ社製)にて３７℃、５％ＣＯ^２環境下にて３日間培養した。３日間の培養期間のうち、ＮＧＡＬを１０ｎＭになるようにＭＥＤＩＵＭ１０６培地に溶解したものを、それぞれ２時間、４時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間細胞に添加・保持した後、以下の手順でｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収しｃＤＮＡを合成した。
培養した細胞液にＲＮＡ抽出剤であるＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン社製)を０．５ｍｌ添加し５分間静置した後、ピペッティングにて可溶化させた細胞液を１．５ｍｌ容のチューブに回収した。細胞液に０．１ｍｌのクロロホルムを添加し、十分に攪拌した後、二層に分離した上層(水層)を新たな１．５ｍｌ容のチューブに回収した。回収液に０．２５ｍｌの２−プロピルアルコールを添加し、１０分間静置後、１５,０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心分離機にかけ、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿物を得た。得られた沈殿物を、７０％エタノールにて洗浄した後、ＤＥＰＣ水に溶解しＲＮＡ液とした。１μg分のＲＮＡからＴａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｔａｋａｒａ ＳＹＢＲ Ｐｒｉｍｅ Ｅｘ ＴａｑII）を使用したリアルタイムＰＣＲを行った。反応条件は、９５℃、３０秒の初期変性後、９５℃、５秒の変性、５７℃、１５秒のアニーリング、７２℃、２０秒の伸張であり、合計４０サイクル反応させた。プライマーは表３に記載のＥＬＮ用プライマーを使用した。結果を図２に示す。

【0024】

【表3】

【0025】

図１により、ＮＧＡＬによるＥＬＮのｍＲＮＡ発現は、２〜２４時間のいずれも有意に亢進した。

【実施例3】

【0026】

表４に示す配合のエラスチン産生促進用飲料を常法により製造した。製造した飲料の風
味は良好で、沈殿等の問題もなかった。

【0027】

【表4】

【実施例4】

【0028】

表５に示す配合のドウを常法により作製し、成形した後、焙焼してエラスチン産生促進
用ビスケットを製造した。

【0029】

【表5】

【実施例5】

【0030】

表６に示す配合のエラスチン産生促進剤を常法により製造した。

【0031】

【表6】

【実施例6】

【0032】

表７に示す配合の化粧水を常法により製造した。

【0033】

【表7】

【実施例7】

【0034】

表８に示す配合のクリームを常法により製造した。

【0035】

【表8】

【0036】

［試験例４］
実施例６で得られた化粧水及び実施例７で得られたクリームを用いて、実使用テストを行った。比較品としては、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物を除いた以外は実施例６及び７と同じ配合のものを用いた。顔面のたるみや小ジワが認められる乾燥肌を有する成人女性２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ａ、Ｂ群）に、また、手に肌荒れが認められる女性２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ｃ、Ｄ群）に分け、Ａ群の顔面には本発明品の化粧水２ｇを、Ｂ群の顔面には比較品の化粧水２ｇを、Ｃ群の手指には本発明品のクリーム２ｇを、Ｄ群の手指には比較品のクリーム２ｇを、それぞれ１日２回通常の使用状態と同様に１０日間塗布した。結果を表８に示す。

【0037】

【表9】

【0038】

表９の結果より、本発明品の化粧水は、比較品の化粧水に比べて、乾燥感の改善、肌荒
れ等の改善が顕著であり、エラスチン産生促進効果に優れていることが実証された。また、本発明品のクリームについても、比較品のクリームに比べて、乾燥感の改善、肌荒れに顕著な改善がみられ、肌荒れ等の自然増悪抑制効果を有することが明らかとなった。
［試験例５］
変形性関節炎による軽度の痛みを有する患者２０名を対象に、実施例３に示す飲料を１日１回１００ｇ飲用し、１年間の臨床試験を行った。関節の疼痛および機能の評価を、疼痛に対するビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）、及び、関節炎の関節における疼痛、機能、および硬直に関するＷｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ（ＷＯＭＡＣ）指標にて変形性関節症の評価を行った。結果を表１０に示す。

【0039】

【表10】

【0040】

表１０の結果より、ＶＡＳおよびＷＭＡＣの両指標とも、摂取開始時の値と比較し、摂取6ヶ月後から有意に改善されている事がわかる。従って、本発明品の被験食は、比較品の被験食に比べて、関節の疼痛および機能の改善が顕著であり、エラスチン産生促進効果に優れていることが実証された。

【産業上の利用可能性】

【0041】

本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下、関節機能低下等を防止するのに有用なエラスチン産生促進剤、エラスチン産生促進用サプリメント、飲食品及びエラスチン産生促進用化粧料に関する。

【図1】