特許 6274632 メチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6274632

(24)【登録日】2018年1月19日

(45)【発行日】2018年2月7日

(54)【発明の名称】メチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180129BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20180129BHJP

   C07D 235/14 20060101ALI20180129BHJP

   C07D 209/18 20060101ALI20180129BHJP

   C07D 215/12 20060101ALI20180129BHJP

   C07D 413/02 20060101ALI20180129BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20180129BHJP

   C07K 14/195 20060101ALN20180129BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20180129BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

   C07D235/14CSP

   C07D209/18

   C07D215/12

   C07D413/02

   !C07K19/00

   !C07K14/195

   !C07K14/47

【請求項の数】8

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2016-538163(P2016-538163)

(86)(22)【出願日】2015年2月18日

(86)【国際出願番号】JP2015054475

(87)【国際公開番号】WO2016017194

(87)【国際公開日】20160204

【審査請求日】2016年7月22日

(31)【優先権主張番号】特願2014-158061(P2014-158061)

(32)【優先日】2014年8月1日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年２月２１日 ｈｔｔｐ：／／ｃｓｊ．ｊｐ／ｎｅｎｋａｉ／９４ｈａｒｕ／ｐｒｏｇｒａｍ＿ｊｐ．ｈｔｍｌを通じて発表。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年３月１２日 「日本化学会第９４春季年会（２０１４）講演予稿集」に発表。平成２６年３月２８日 日本化学会第９４春季年会（２０１４）（場所：名古屋大学）において文書をもって発表。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年５月１２日 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍａｇｉｎｇ．ｊｐ／ｓｐｅｃｉａｌ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ？ｉｄ＝６２３８ を通じて発表。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年５月１５日 「第９回日本分子イメージング学会総会・学術集会の講演予稿集」に発表。平成２６年５月２２日および２３日 第９回日本分子イメージング学会総会・学術集会（場所：千里ライフサイエンスセンター）において文書をもって発表。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年５月３０日、平成２６年６月１１日 「日本ケミカルバイオロジー学会 第９回年会のプログラム」に発表。平成２６年６月１１日 「日本ケミカルバイオロジー学会 第９回年会の講演予稿集」に発表。平成２６年６月１２日および１３日 日本ケミカルバイオロジー学会 第９回年会（場所：大阪大学 豊中キャンパス 大阪大学会館１階アセンブリー・ホール ２階講堂）において文書をもって発表。

(73)【特許権者】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000040

【氏名又は名称】特許業務法人池内・佐藤アンドパートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】菊地 和也

(72)【発明者】

【氏名】堀 雄一郎

(72)【発明者】

【氏名】乙村 法道

【審査官】 松岡 徹

(56)【参考文献】

【文献】 Yuichiro HORI，Journal of the American Chemical Society，２０１３年，Vol.135，Pages 12360-12365

【文献】 Yoichiro HORI，Angew. Chem. Int. Ed.，２０１２年，Vol.51，Pages 5611-5614

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

Ｃ０７Ｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

メチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法であって、
標識対象であるメチル化ＤＮＡとプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化ＤＮＡを蛍光標識することを含み、
前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、
前記融合タンパク質は、ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、
前記化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物である、メチル化ＤＮＡの蛍光標識方法。

【化31】

前記式（Ｉ）中、
Ｚは、下記式（ｉ）であり、

【化32】

前記式（ｉ）中、
ｍ１は、４〜６の整数であり、
前記式（ｉ）中、Ｙは、下記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）であり、

【化33】

前記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）中、
ｎ５は、１〜３の整数であり、
Ｒ₁₁は、水素原子または塩素原子であり。
Ｒ₁₂は、−ＣＨ₃、または−（ＣＨ₂）₃ＳＣＯＣＨ₃であり、
Ｒ₁₃は、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓｅ−であり、
Ｘは、下記式（ｘｘｖｉ）であり、
ｎは、１〜６の整数であり、

【化34】

前記式（ｘｘｖｉ）中、
Ｒ₁〜Ｒ₅は、同一であっても異なっていてもよく、Ｒ₁〜Ｒ₅の１つ以上が、−ＮＯ₂、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ₃であり、残りが水素原子である。

【請求項2】

前記融合タンパク質における前記ＰＹＰまたはＰＹＰ変異体のアミノ酸配列が、
１）配列表の配列番号２〜７で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１番目から第２４番目、第１番目から第２５番目、第１番目から第２６番目、または、第１番目から第２７番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、及び
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記ＰＹＰまたはＰＹＰ変異体は、前記式（Ｉ）で表される化合物と反応して、式（Ｉ）で表される化合物から基Ｘが脱離した残基と結合するアミノ酸配列である、請求項１記載のメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法。

【請求項3】

前記融合タンパク質における前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質のアミノ酸配列が、
１）配列表の配列番号８または９で表されるアミノ酸配列、及び
２）上記１）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質は、メチル化ＤＮＡと結合するアミノ酸配列
である請求項１または２記載のメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法。

【請求項4】

前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法。

【請求項5】

式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む請求項１〜４のいずれかの方法に用いるための組成物。

【化35】

前記式（Ｉ）中、
Ｚは、下記式（ｉ）であり、

【化36】

前記式（ｉ）中、
ｍ１は、４〜６の整数であり、
前記式（ｉ）中、Ｙは、下記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）であり、

【化37】

前記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）中、
ｎ５は、１〜３の整数であり、
Ｒ₁₁は、水素原子または塩素原子であり。
Ｒ₁₂は、−ＣＨ₃、または−（ＣＨ₂）₃ＳＣＯＣＨ₃であり、
Ｒ₁₃は、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓｅ−であり、
Ｘは、下記式（ｘｘｖｉ）であり、
ｎは、１〜６の整数であり、

【化38】

前記式（ｘｘｖｉ）中、
ｍ３は、１または２の整数であり、
Ｒ₁〜Ｒ₅は、同一であっても異なっていてもよく、Ｒ₁〜Ｒ₅の１つ以上が、−ＮＯ₂、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ₃であり、残りが水素原子である。

【請求項6】

請求項５に記載の組成物と、プラスミドまたはベクターとを含むメチル化ＤＮＡの蛍光標識方法用キットであって、
前記プラスミドまたはベクターは、ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミドまたはベクターは、
１）配列表の配列番号１９〜２９で表される塩基配列、
２）配列表の配列番号１９〜２９で表される塩基配列において、第１番目から第７２番目、第１番目から第７５番目、第１番目から第７８番目、または、第１番目から第８１番目の塩基が欠失した塩基配列、及び
３）上記１）または２）の塩基配列のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質の前記ＰＹＰまたはＰＹＰ変異体は、前記式（Ｉ）で表される化合物と反応して、式（Ｉ）で表される化合物から基Ｘが脱離した残基と結合し、かつ、前記融合タンパク質の前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質は、メチル化ＤＮＡと結合する塩基配列であって、前記融合タンパク質の前記ＰＹＰまたはＰＹＰ変異体は、前記式（Ｉ）で表される化合物と反応して、式（Ｉ）で表される化合物から基Ｘが脱離した残基と結合、かつ、前記融合タンパク質の前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質は、メチル化ＤＮＡと結合する塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクターであるキット。

【化39】

前記式（Ｉ）中、
Ｚは、下記式（ｉ）であり、

【化40】

前記式（ｉ）中、
ｍ１は、４〜６の整数であり、
前記式（ｉ）中、Ｙは、下記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）であり、

【化41】

前記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）中、
ｎ５は、１〜３の整数であり、
Ｒ₁₁は、水素原子または塩素原子であり。
Ｒ₁₂は、−ＣＨ₃、または−（ＣＨ₂）₃ＳＣＯＣＨ₃であり、
Ｒ₁₃は、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓｅ−であり、
Ｘは、下記式（ｘｘｖｉ）であり、
ｎは、１〜６の整数であり、

【化42】

前記式（ｘｘｖｉ）中、
Ｒ₁〜Ｒ₅は、同一であっても異なっていてもよく、Ｒ₁〜Ｒ₅の１つ以上が、−ＮＯ₂、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ₃であり、残りが水素原子である。

【請求項7】

一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩。

【化43】

前記式（Ｉ）中、
Ｚは、下記式（ｉ）であり、

【化44】

前記式（ｉ）中、
ｍ１は、４〜６の整数であり、
前記式（ｉ）中、Ｙは、下記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）であり、

【化45】

前記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）中、
ｎ５は、１〜３の整数であり、
Ｒ₁₁は、水素原子または塩素原子であり。
Ｒ₁₂は、−ＣＨ₃、または−（ＣＨ₂）₃ＳＣＯＣＨ₃であり、
Ｒ₁₃は、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓｅ−であり、
Ｘは、下記式（ｘｘｖｉ）であり、
ｎは、１〜６の整数であり、

【化46】

前記式（ｘｘｖｉ）中、
ｍ３は、１または２の整数であり、
Ｒ₁〜Ｒ₅は、同一であっても異なっていてもよく、Ｒ₁〜Ｒ₅の１つ以上が、−ＮＯ₂、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ₃であり、残りが水素原子である。

【請求項8】

メチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法であって、
標識対象であるメチル化ＤＮＡとプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化ＤＮＡを蛍光標識することを含み、
前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、
前記融合タンパク質は、ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、
前記化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物である、
メチル化ＤＮＡの蛍光標識方法。

【化47】

前記式（Ｉ）中、
Ｚは、下記式（ｉ）であり、

【化48】

前記式（ｉ）中、
ｍ１は、４〜６の整数であり、
前記式（ｉ）、Ｙは、下記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）であり、

【化49】

前記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）中、
ｎ５は、１〜３の整数であり、
Ｒ₁₁は、水素原子または塩素原子であり。
Ｒ₁₂は、−ＣＨ₃、または−（ＣＨ₂）₃ＳＣＯＣＨ₃であり、
Ｒ₁₃は、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓｅ−であり、
Ｘは、下記式（ｘｘｖｉ）であり、
ｎは、１〜６の整数であり、

【化50】

前記式（ｘｘｖｉ）中、
Ｒ₁〜Ｒ₅は、同一であっても異なっていてもよく、Ｒ₁〜Ｒ₅の１つ以上が、−ＮＯ₂、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ₃であり、残りが水素原子である。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＤＮＡのシトシンのメチル化は、遺伝子発現を制御する重要な化学修飾反応である。この化学修飾は、発生、分化、老化、免疫反応の多岐に渡る生命現象に関わることが知られている。ＤＮＡメチル化の異常は、癌や生活習慣病、中枢神経疾患とも深い関わりがあることが知られており、ＤＮＡメチル化を触媒する酵素の阻害剤は、癌の治療薬となることが分かり、大きな脚光を浴びている。現在、ＤＮＡのメチル化を生細胞で検出する技術は、蛍光蛋白質や合成蛍光プローブによりラベル化したタグ蛋白質を用いた技術に限られている（例えば特許文献１）。

【0003】

例えば、メチル化ＤＮＡに結合するＭｅｔｈｙｌＣｐＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ （ＭＢＤ）に蛍光蛋白質や合成蛍光プローブでラベル化したタグ蛋白質を融合させ、その融合タンパク質の局在を観測する手法が知られている（非特許文献１）。

【0004】

【化1】

【0005】

前記スキーム中、「ＧＦＰ」は、緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescent Protein）を意味する。

【0006】

一方、この手法では、メチル化ＤＮＡに結合していない融合タンパク質からも蛍光が観測されるため、観測される蛍光の分布がメチル化ＤＮＡの分布と本当に一致しているか判別できない。このため、遊離の状態では蛍光を発せず、かつ、メチル化ＤＮＡに結合すると蛍光を発する分子の開発が必要とされていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２０１０−６８７７５号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】S.Kobayakawaら、Genes Cells, ２００７年、１２巻、ｐ．４４７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

そこで、本発明は、メチル化ＤＮＡに特異的に結合し、かつ、高い蛍光強度を発する、メチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、メチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法であって、
標識対象であるメチル化ＤＮＡとプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化ＤＮＡを蛍光標識することを含み、
前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、
前記融合タンパク質は、ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、
前記化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物である。

【0011】

【化2】

【0012】

前記式（Ｉ）中、
Ｚは、下記式（ｉ）〜（ｘ）から選択され、

【0013】

【化3】

【0014】

【化4】

【0015】

前記式（ｉ）〜（ｖ）中、
ｍ１は、４〜６の整数であり、
前記式（ｖｉ）〜（ｘ）中、
ｍ２は、１または２の整数であり、
前記式（ｉ）〜（ｘ）中、Ｙは、下記式（ｘｘｘｉ）〜（ｘｘｘｖｉｉｉ）から選択され、

【0016】

【化5】

【0017】

前記式（ｘｘｘｖｉ）中、
ｎ４は、０または１の整数であり、
前記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）中、
ｎ５は、１〜３の整数であり、
Ｒ₁₁は、水素原子または塩素原子であり。
Ｒ₁₂は、−ＣＨ₃、または−（ＣＨ₂）₃ＳＣＯＣＨ₃であり、
Ｒ₁₃は、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓｅ−であり、

Ｘは、下記式（ｘｘｉ）〜（ｘｘｖｉｉｉ）から選択され、
ｎは、１〜６の整数であり、

【0018】

【化6】

【0019】

前記式（ｘｘｉ）〜（ｘｘｖｉｉｉ）中、
ｍ３は、１または２の整数であり、
Ｒ₁〜Ｒ₅は、同一であっても異なっていてもよく、Ｒ₁〜Ｒ₅の１つ以上が、−ＮＯ₂、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ₃であり、残りが水素原子である。

【0020】

また本発明は、メチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法であって、
標識対象であるメチル化ＤＮＡとプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化ＤＮＡを蛍光標識することを含み、
前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、
前記融合タンパク質は、ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、
前記化合物は、ＤＮＡ結合色素部分を含み、前記ＤＮＡ結合色素部分は、前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質部分がメチル化ＤＮＡと結合した場合前記ＤＮＡ結合色素部分がメチル化ＤＮＡと結合することにより蛍光を発する化合物である、
メチル化ＤＮＡの蛍光標識方法である。

【発明の効果】

【0021】

本発明のメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法は、目的とするメチル化ＤＮＡを標識した場合にのみ、強い蛍光を示す。そのため、メチル化ＤＮＡを標識していないプローブを除去しなくとも、蛍光のバックグラウンドを最小限に抑えることができる。従って、精度の高い蛍光観察を行うことが可能である。また、未反応のプローブを除去する必要がないので、生体内での生体分子を観察する際に適する。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、ＹＯＣＮＢ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１とメチル化ＤＮＡの反応後の蛍光画像を示す。

【図2】図２は、ＹＯＣＮＢ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１とメチル化ＤＮＡの反応後の蛍光画像を示す。

【図3】図３は、化合物ＹＯＣＮＢの蛍光強度を示す。

【図4】図４は、ＹＯＣＮＢ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１またはＹＯＣＮＢ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１を含むプローブによる蛍光強度変化を示す。

【図5】図５は、ＹＯＣＮＢを添加した細胞の蛍光像を示す。

【図6】図６は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖ２−ＨＡ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（１−１１２）を導入した細胞の蛍光像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）は、紅色光合成細菌Ectothiorhodospira halophila（Halorhodospira halophila）から単離された光受容タンパク質である。この紅色光合成細菌は真正細菌であるため、ＰＹＰを細胞内で用いた際、ＰＹＰ由来の内在性タンパク質が蛍光標識に悪影響を与える可能性は低い。また、このＰＹＰは、１２５のアミノ酸残基（配列表の配列番号１）により構成されており、比較的小さな（１４ｋＤａ）タンパク質である。このＰＹＰの６９番目のシステイン残基に発色団であるｐ−クマル酸がチオエステル結合を介して結合する。ＰＹＰにはｐ−クマル酸以外、様々な類似体が結合することが知られている（例えば、以下のスキームに示す化合物。例えばCordgunkeら、Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1998, 95, pp7396-7401、Koonら、The Journal of Biological Chemistry, 1996, 271, pp. 31949-31956を参照）。

【0024】

【化7】

【0025】

本発明の標識方法においては、標識対象であるメチル化ＤＮＡと本発明のプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化ＤＮＡを蛍光標識することを含む。本発明者らは、前記プローブとして、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られたプローブを開発した。前記融合タンパク質は、前記ＰＹＰまたはＰＹＰ由来のタンパク質と、ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質とを含む融合タンパク質である。

【0026】

【化8】

【0027】

前記化合物は、ＤＮＡ結合色素部分と、ＰＹＰ結合部分と、脱離基部分を含む。化合物は式（Ｉ）で表され、式中、Ｚで表される部分が、ＤＮＡ結合色素部分、Ｘで表される部分が、脱離基部分、残りの部分がＰＹＰ結合部分である。前記ＤＮＡ結合色素部分は、ＤＮＡと結合すると、蛍光を発するが、ＤＮＡ結合色素単独では、ＤＮＡ結合能力が低い。前記プローブに含まれているＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質部分がメチル化ＤＮＡと結合した場合、前記プローブに含まれている前記ＤＮＡ結合色素部分は、メチル化ＤＮＡに近接することができる。そうすると、前記ＤＮＡ結合色素部分は、メチル化ＤＮＡと結合し、蛍光を発するのである。従って、前記プローブがメチル化ＤＮＡに結合していない場合、前記ＤＮＡ結合色素部分は、蛍光を発しない。そのため、前記プローブは、メチル化ＤＮＡに結合しない場合は蛍光を発せず、一方、メチル化ＤＮＡに結合した場合には、蛍光を発するという効果を奏することができる。

【0028】

ＰＹＰのアミノ酸配列としては、例えば、Halorhodospira halophila由来のＰＹＰのアミノ酸配列、すなわち、配列表の配列番号１０で表されるアミノ酸配列が挙げられる。ＰＹＰのアミノ酸配列としては、他の由来を有するものでもよく、ＮＣＢＩＧｅｎｅ／Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｍＲＮＡ）／Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｓｅに記載のアミノ酸配列を利用してもよい。ＰＹＰをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、Halorhodospira halophila由来のＰＹＰの塩基配列、すなわち、配列表の配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。ＰＹＰの塩基配列としては、他の由来を有するものでもよく、ＮＣＢＩＧｅｎｅ／Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｍＲＮＡ）／Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｓｅに記載の塩基配列を利用してもよい。

【0029】

ＰＹＰ変異体のアミノ酸配列としては、ＰＹＰのアミノ酸配列のうち、酸性アミノ酸のいずれか１〜５個をアルギニンに置き換えたものが挙げられる。ＰＹＰ変異体のアミノ酸配列としては、例えば、Halorhodospira halophila由来のＰＹＰのアミノ酸配列、すなわち、配列表の配列番号１０で表されるアミノ酸配列の酸性アミノ酸のいずれか１〜３個をアルギニンに置き換えた、例えば、配列表の配列番号１１〜１６で表されるアミノ酸配列が挙げられる。具体的には、配列表の配列番号１０で表されるアミノ酸配列の酸性アミノ酸の第５３番目のＡｓｐ（配列番号１１）、第６５番目のＡｓｐ（配列番号１２）、第７１番目のＡｓｐ（配列番号１３）、第７４番目のＧｌｕ（配列番号１４）、または第９７番目のＡｓｐ（配列番号１５）をＡｒｇに変異させたＰＹＰ変異体のアミノ酸配列、第７１番目のＡｓｐ、第７４番目のＧｌｕ、及び第９７番目のＡｓｐをＡｒｇに変異させたＰＹＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１６）が挙げられる。ＰＹＰ変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、ＰＹＰのアミノ酸配列のうち、酸性アミノ酸のいずれか１〜５個をアルギニンに置き換えたものの塩基配列が挙げられる。ＰＹＰ変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列表の配列番号２〜７で表される塩基配列が挙げられる。

【0030】

ＭＢＤのアミノ酸配列としては、例えば、Homo Sapiens由来のＭＢＤ１に含まれるアミノ酸配列、すなわち、配列表の配列番号１７および１８で表されるアミノ酸配列が挙げられ、ＭＢＤをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、Homo Sapiens由来のＭＢＤ１に含まれる塩基配列、すなわち、配列表の配列番号８および９で表される塩基配列が挙げられる。具体的には、配列番号８で表される塩基配列は、メチル化ＤＮＡに結合するドメイン（ＭＢＤ）の塩基配列であり、配列番号９で表される塩基配列は、ＭＢＤドメインに加え、核移行シグナル配列の部分を含む塩基配列である。

【0031】

ＰＹＰもしくはＰＹＰ変異体およびＭＢＤもしくはＭＢＤ由来タンパク質については、前記と異なる他の由来を有するものでもよく、ＮＣＢＩＧｅｎｅ／Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｍＲＮＡ）／Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｓｅに記載のアミノ酸配列を利用してもよい。例えば、ＭＢＤについては、以下のアクセッション番号が挙げられる。

【0032】

【表1】

【0033】

融合タンパク質は、前記のように、ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とを含む。ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とは、リンカーで結合されてもよい。このリンカーとしては、グリシン、セリン等のアミノ酸０〜３０個から構成されたペプチドが挙げられる。

【0034】

融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得るには、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用い、通常の方法に従い、そのようなプラスミド若しくはベクターを調製することができる。本発明において、ベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入するためのポリヌクレオチドをいい、プラスミドを含むものをいう。なお、ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。融合タンパク質を発現可能とする配列は、当業者であれば、導入する細胞の種類に応じて適宜選択しうる。プラスミド及びベクターは、融合タンパク質の発現を調節する配列（例えば、発現誘導プロモーターや制御配列）を含んでもよい。

【0035】

細胞内で融合タンパク質を発現させるには、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを用いて、通常の方法に従って行うことができる。

【0036】

発現した融合タンパク質を単離するには、通常の方法に従って行うことができる。

【0037】

本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物は、前記のように、
Ｚは、前記式（ｉ）〜（ｘ）から選択され、
前記式（ｉ）〜（ｖ）中、
ｍ１は、４〜６の整数であり、
前記式（ｖｉ）〜（ｘ）中、
ｍ２は、１または２の整数であり、
前記式（ｉ）〜（ｘ）中、Ｙは、前記式（ｘｘｘｉ）〜（ｘｘｘｖｉｉｉ）から選択され、
前記式（ｘｘｘｖｉ）中、
ｎ４は、０または１の整数であり、
前記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）中、
ｎ５は、１〜３の整数であり、
Ｒ₁₁は、水素原子または塩素原子であり。
Ｒ₁₂は、−ＣＨ₃、または−（ＣＨ₂）₃ＳＣＯＣＨ₃であり、
Ｒ₁₃は、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓｅ−であり、
Ｘは、前記式（ｘｘｉ）〜（ｘｘｖｉｉｉ）から選択され、
ｎは、１〜６の整数であり、
前記式（ｘｘｉ）〜（ｘｘｖｉｉｉ）中、
ｍ３は、１または２の整数であり、
Ｒ₁〜Ｒ₅は、同一であっても異なっていてもよく、Ｒ₁〜Ｒ₅の１つ以上が、−ＮＯ₂、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ₃であり、残りが水素原子である。

【0038】

式（Ｉ）の化合物の塩は、酸または塩基との塩であってもよい。そのような塩としては、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミンとの塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸との塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸との塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。

【0039】

式（Ｉ）の化合物は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。

【0040】

本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。

【0041】

本発明の蛍光標識する方法において用いられる、融合タンパク質を得ることは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することを含んでもよい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＰＹＰまたはＰＹＰ変異体をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。

【0042】

本発明のタンパク質を蛍光標識する方法において、前記融合タンパク質と、式（Ｉ）の化合物とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する細胞内や生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてin vitroで行ってもよい。標識をin vitroで行う場合、例えば、緩衝液中（ｐＨ６．８〜８．５）で２０〜３７℃の温度で行ってもよい。

【0043】

本発明のメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法において、融合タンパク質におけるＰＹＰまたはＰＹＰ変異体のアミノ酸配列は、
１）配列表の配列番号２〜７で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１番目から第２４番目、第１番目から第２５番目、第１番目から第２６番目、または、第１番目から第２７番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記ＰＹＰまたはＰＹＰ変異体は、前記式（Ｉ）で表される化合物と反応して、式（Ｉ）で表される化合物から基Ｘが脱離した残基と結合するアミノ酸配列、及び、
４）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記ＰＹＰまたはＰＹＰ変異体は、前記式（Ｉ）で表される化合物と反応して、式（Ｉ）で表される化合物から基Ｘが脱離した残基と結合するアミノ酸配列であるのが好ましい。

【0044】

本発明のメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法において、前記融合タンパク質における前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質のアミノ酸配列は、
１）配列表の配列番号８または９で表されるアミノ酸配列、
２）上記１）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質は、メチル化ＤＮＡと結合するアミノ酸配列、及び、
３）上記１）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質の前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質は、メチル化ＤＮＡと結合するアミノ酸配列であるのが好ましい。

【0045】

本発明のメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法においては、前記融合タンパク質を得ること、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含むのが好ましい。

【0046】

また、本発明は、式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む前記本発明の方法に用いるための組成物である。

【0047】

また、本発明は、式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩と、前記プローブとを含む前記本発明の方法に用いるための組成物である。前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、前記融合タンパク質は、ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、前記化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物である。

【0048】

また、本発明は、前記組成物と、プラスミドまたはベクターとを含むメチル化ＤＮＡの蛍光標識方法用キットである。
前記プラスミドまたはベクターは、ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターである。

【0049】

前記キットにおいて、
好ましくは、前記プラスミドまたはベクターは、
ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とを、リンカー（グリシン、セリン等のアミノ酸０〜３０個から構成されたペプチド）で結合された融合タンパク質であり、
前記プラスミドまたはベクターは、
１）配列表の配列番号１９〜２９で表される塩基配列、
２）配列表の配列番号１９〜２９で表される塩基配列において、第１番目から第７２番目、第１番目から第７５番目、第１番目から第７８番目、または、第１番目から第８１番目の塩基が欠失した塩基配列、
３）上記１）または２）の塩基配列のいずれかの塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質の前記ＰＹＰまたはＰＹＰ変異体は、前記式（Ｉ）で表される化合物と反応して、式（Ｉ）で表される化合物から基Ｘが脱離した残基と結合し、かつ、前記融合タンパク質の前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質は、メチル化ＤＮＡと結合する塩基配列、及び、
４）上記１）または２）の塩基配列のいずれかの塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質の前記ＰＹＰまたはＰＹＰ変異体は、前記式（Ｉ）で表される化合物と反応して、式（Ｉ）で表される化合物から基Ｘが脱離した残基と結合、かつ、前記融合タンパク質の前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質は、メチル化ＤＮＡと結合する塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクターである。

【0050】

本発明のメチル化ＤＮＡの蛍光標識方法用キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。

【0051】

本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
式（Ｉ）の化合物は、Ｚが、前記式（ｉ）で表されるのが好ましい。

【0052】

また、本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、式（Ｉ）の化合物は、Ｚが、前記式（ｉ）で表され、Ｙが、式（ｘｘｘｖｉｉｉ）で表されるのが好ましい。

【0053】

また、本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、式（ｘｘｖｉ）で表されるのが好ましい。

【0054】

また、本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、式（ｘｘｖｉ）で表され、Ｚが、前記式（ｉ）で表されるのが好ましい。

【0055】

また、本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、式（ｘｘｖｉ）で表され、Ｚが、前記式（ｉ）で表され、Ｙが、式（ｘｘｘｖｉｉｉ）で表されるのが好ましい。

【0056】

また、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩である。

【0057】

【化9】

【0058】

前記式（Ｉ）中、
Ｚは、下記式（ｉ）〜（ｘ）から選択され、

【0059】

【化10】

【0060】

【化11】

【0061】

前記式（ｉ）〜（ｖ）中、
ｍ１は、４〜６の整数であり、
前記式（ｖｉ）〜（ｘ）中、
ｍ２は、１または２の整数であり、
前記式（ｉ）〜（ｘ）中、Ｙは、下記式（ｘｘｘｉ）〜（ｘｘｘｖｉｉｉ）から選択され、

【0062】

【化12】

【0063】

前記式（ｘｘｘｖｉ）中、
ｎ４は、０または１の整数であり、
前記式（ｘｘｘｖｉｉｉ）中、
ｎ５は、１〜３の整数であり、
Ｒ₁₁は、水素原子または塩素原子であり。
Ｒ₁₂は、−ＣＨ₃、または−（ＣＨ₂）₃ＳＣＯＣＨ₃であり、
Ｒ₁₃は、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｓｅ−であり、

Ｘは、下記式（ｘｘｉ）〜（ｘｘｖｉｉｉ）から選択され、
ｎは、１〜６の整数であり、

【0064】

【化13】

【0065】

前記式（ｘｘｉ）〜（ｘｘｖｉｉｉ）中、
ｍ３は、１または２の整数であり、
Ｒ₁〜Ｒ₅は、同一であっても異なっていてもよく、Ｒ₁〜Ｒ₅の１つ以上が、−ＮＯ₂、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ₂−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ₃であり、残りが水素原子である。

【0066】

式（Ｉ）の化合物は、Ｚが、前記式（ｉ）で表されるのが好ましい。

【0067】

また、式（Ｉ）の化合物は、Ｚが、前記式（ｉ）で表され、Ｙが、式（ｘｘｘｖｉｉｉ）で表されるのが好ましい。

【0068】

また、式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、式（ｘｘｖｉ）で表されるのが好ましい。

【0069】

また、式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、式（ｘｘｖｉ）で表され、Ｚが、前記式（ｉ）で表されるのが好ましい。

【0070】

また、式（Ｉ）の化合物は、Ｘが、式（ｘｘｖｉ）で表され、Ｚが、前記式（ｉ）で表され、Ｙが、式（ｘｘｘｖｉｉｉ）で表されるのが好ましい。

【0071】

また、式（Ｉ）の化合物としては、以下の式で表わされる化合物ＹＯＣＮＢがより好ましい。これらの好ましい式（Ｉ）の化合物は、本発明におけるメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法、組成物等においても好ましく用いられる。

【0072】

【化14】

【0073】

式（Ｉ）の化合物は、例えば、下記スキームに従い、製造することができる。なお、出発原料である式（ＩＩＩ）の化合物、式（ＩＶ）の化合物および式（Ｖ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、購入してもよい。

【0074】

【化15】

【0075】

前記式（ＩＶ）中、Ｈａｌはハロゲン原子を意味する。

【0076】

また、本発明は、メチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法であって、
標識対象であるメチル化ＤＮＡとプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記メチル化ＤＮＡを蛍光標識することを含み、
前記プローブは、融合タンパク質と化合物とを反応させて得られ、
前記融合タンパク質は、ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ変異体と、ＭＢＤ（Methyl CpG-binding domain）またはＭＢＤ由来タンパク質とを含む融合タンパク質であり、
前記化合物は、ＤＮＡ結合色素部分を含み、前記ＤＮＡ結合色素部分は、前記ＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質部分がメチル化ＤＮＡと結合した場合前記ＤＮＡ結合色素部分がメチル化ＤＮＡと結合することにより蛍光を発する化合物である、
メチル化ＤＮＡの蛍光標識方法である。

【0077】

前記本発明の方法において、前記ＤＮＡ結合色素部分は、ＤＮＡと結合すると、蛍光を発するが、ＤＮＡ結合色素単独では、ＤＮＡ結合能力が低い。前記プローブに含まれているＭＢＤまたはＭＢＤ由来タンパク質部分がメチル化ＤＮＡと結合した場合、前記プローブに含まれている前記ＤＮＡ結合色素部分は、メチル化ＤＮＡに近接することができる。そうすると、前記ＤＮＡ結合色素部分は、メチル化ＤＮＡと結合し、蛍光を発するのである。従って、前記プローブがメチル化ＤＮＡに結合していない場合、前記ＤＮＡ結合色素部分は、蛍光を発しない。そのため、前記プローブは、メチル化ＤＮＡに結合しない場合は蛍光を発せず、一方、メチル化ＤＮＡに結合した場合には、蛍光を発するという効果を奏することができる。

【0078】

また、ＤＮＡメチル化酵素の阻害剤は、抗癌薬として注目されている。一方、阻害剤のＤＮＡメチル化阻害活性を生細胞においてハイスループットスクリーニングすることは、従来、適した技術がなかったため困難であった。本発明のメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法を用いれば、ＤＮＡメチル化阻害が起こると、プローブの蛍光が減少することが考えられる。このため、本発明のメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法により、生細胞レベルで蛍光強度の増減を検出するだけで容易にＤＮＡメチル化阻害活性を調べることができる。これは、分子生物学研究において有用なだけではなく、製薬企業での創薬プロセスにおいても有用である。

【0079】

従って、本発明は、ＤＮＡメチル化阻害剤を見出すためのスクリーニング方法であり、前記スクリーニング方法は、スクリーニングされるべき化合物とＤＮＡとを反応させた反応液に、本発明のプローブを反応させ、得られるＤＮＡのメチル化の程度を判断することにより、前記スクリーニングされるべき化合物のＤＮＡメチル化阻害活性を評価する工程を含む。

【0080】

また、本発明は、本発明のプローブを用いたＤＮＡのメチル化検出方法である。前記検出方法は、本発明のプローブと被検体であるＤＮＡとを反応させ、ＤＮＡのメチル化程度を判断することにより、前記被検体であるＤＮＡのメチル化を検出する工程を含む。

【0081】

［実施例］
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＮＢＳ：Ｎ−ブロモスクシンイミド
ＡＩＢＮ：アゾビスブチロニトリル
ＴｓＣｌ：トルエンスルホニルクロライド
Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＨＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート
ＤＭＡＰ：Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン
ＰｙＢＯＰ：ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー

【0082】

［化合物および機器］
化合物は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ−アルドリッチジャパン株式会社から購入して、さらなる精製を行わずに用いた。

【0083】

ＮＭＲスペクトルは、¹Ｈ−ＮＭＲ用には４００ＭＨｚで、¹³Ｃ−ＮＭＲ用には１００．４ＭＨｚで、テトラメチルシランを内部標準として用い、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＡＬ４００装置（日本電子株式会社）で測定した。質量スペクトル（ＥＩ）は、ＣＢＰ１−Ｍ２５−０２５カラムを備えたＳｈｉｍａｚｕ ＧＣＭＳ−ＱＰ２０００（株式会社島津製作所）で電子衝撃モード（７０ｅＶ）で操作して測定した。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）は、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＤＸ３０３（日本電子株式会社）測定した。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ−Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ（日本ウォーターズ株式会社）で測定した。蛍光スペクトルは、Ｎａｎｏｌｏｇ（ホリバ・ジョバン・イボン社）を用いて測定した。スリット幅は励起および放射の両方について３．０ｎｍであった。光電子増倍管電圧は７００Ｖであった。蛍光測定前にサンプルはＤＭＳＯ（生化学用グレード、和光純薬工業株式会社）に溶解させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、ＢＷ−３００（富士シリシア化学株式会社）を用いて行った。蛍光イメージングは、ＡＥ−６９３５Ｂ ＶＩＳＩＲＡＹＳ−Ｂを用いて視覚化した。

【実施例1】

【0084】

化合物ＹＯＣＮＢの製造
下記化合物ＹＯＣＮＢを下記スキームに従い製造した。

【0085】

【化16】

【0086】

【化17】

【0087】

（ｉ）１−ブロモ−４−（メトキシメトキシ）−２−メチルベンゼン（１）の製造

【0088】

【化18】

【0089】

フレームドライ、アルゴン置換した５００ｍＬ三口フラスコに、４−ブロモ−３−メチルフェノール（３．０１ｇ、１６．１ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（１８０ｍＬ）、ジメトキシメタン（５．０ｍＬ、５６．５ｍｍｏｌ）、およびＰ₂Ｏ₅（７．３１ｇ、５１．５ｍｍｏｌ）を加えて、得られた混合物を室温で３時間撹拌した。撹拌後、前記混合物へＮａ₂ＣＯ₃を加えてろ過後、ろ液から溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（１）を２．８０ｇ（１２．１ｍｍｏｌ、収率７５％）得た。

【0090】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ2.36 (s, 3H, c), 3.45 (s, 3H, a), 5.13 (s, 2H, b), 6.75 (dd, 1H, J_ef = 8.4 Hz, J_de = 2.8 Hz, e), 6.93 (d, 1H, J_de = 2.8 Hz, d), 7.39 (d, J_ef =8.8 Hz, f)

【0091】

（ｉｉ）１−ブロモ−２−（ブロモメチル）−４−（メトキシメトキシ）ベンゼン（２）の製造

【0092】

【化19】

【0093】

フレームドライ、アルゴン置換した３００ｍＬ三口フラスコに化合物（１）（２．８０ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（２．８１ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（１．００ｇ、６．１０ｍｍｏｌ）およびＣＣｌ₄（１５０ｍＬ）を加えて、得られた混合物を９５℃で５時間還流した。還流終了後、前記混合物をろ過し、ろ液から溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（２）を２．３１ｇ（７．４４ｍｍｏｌ、収率６１％）得た。

【0094】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ3.47 (s, 3H, f), 4.55 (s, 2H, a), 5.16 (s, 2H, e), 6.88 (dd, 1H, Jbc = 3.2 Hz, J_cd =2.8 Hz, b), 7.15 (d, 1H, J_bc =2.8Hz, b), 7.45 (d, 1H, J_cd = 8.8 Hz, d)

【0095】

（ｉｉｉ）１４−ヒドロキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデシル ４−メチルベンゼンスルホネート（３）の製造

【0096】

【化20】

【0097】

１００ ｍＬナスフラスコにペンタエチレングリコール（４．８２５１ｇ、２０．２５ｍｍｏｌ）、およびテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）を加えて、そこへ２ＮのＮａＯＨ水溶液を８ｍＬ（ｐＨ＝１２）滴下した後、得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。その後、前記混合物へ、ＴｓＣｌ（８７２．１０ｍｇ、４．５７４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）溶液を滴下漏斗で４０分かけて滴下した。反応終了後、前記混合物へ水（１００ｍＬ）およびジクロロメタン（１００ｍＬ）を加えて、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で３回抽出した。得られた有機相を合わせて、水(１００mL)で２回、ついで飽和ＮａＣｌ水溶液（１００ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えて、ろ過をした後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（３）を１．５１０ｇ（３．８４８ｍｍｏｌ、収率８４％）得た。

【0098】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ2.45 (s, 3H, a), 3.59-3.82 (m, 18H, e, f, g, h, i, j, k, l, m), 4.16 (t, 2H, d), 7.34 (d, 2H, J_bc = 8.0 Hz, b), 7.80 (d, 2H, J_bc = 8.4 Hz, c)
MS (ESI+) [M+H]+計算値 393.16、測定値 393.02

【0099】

（ｉｖ）１４−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデカン−１−オール（４）の製造

【0100】

【化21】

【0101】

フレームドライ、アルゴン置換した１００ｍＬ三口フラスコに化合物（３）（１．５１０２ｇ、３．８４８ｍｍｏｌ）、ＮａＮ₃（１．２３５ｇ、１９．０２ｍｍｏｌ）、および脱水ＤＭＦ（２５ｍＬ）を加えて６０℃で４時間撹拌した。溶媒を留去した後、酢酸エチル（４０ｍＬ）および水（４０ｍＬ）を加えて、酢酸エチル（４０ｍＬ）で２０回抽出し、飽和ＮａＣｌ水溶液（４０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えてろ過をした後、溶媒を留去した。シリカゲルクロマトグラフィーにより精製を行い、化合物（４）を７１３．７ｍｇ（２．７１２ｍｍｏｌ、収率７０％）得た。

【0102】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ3.40 (t, 2H, J = 5.2 Hz, a), 3.60-3.77 (m, 18H, b, c, d, e, f, g, h, i)
MS (ESI+)[M+Na]+計算値286.14、測定値 286.07

【0103】

（ｖ）ｔｅｒｔ−ブチル （１４−ヒドロキシ−３，６，９，１２−テトラオキサテトラデシル）カルバメート（５）の製造

【0104】

【化22】

【0105】

５０ｍＬ二口フラスコに酢酸エチル（１５ｍＬ）に溶かした化合物（４）（３１５．８９ｍｇ、１．２００ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）₂Ｏ（４１８．７８ｍｇ、１．９１９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２００μＬ、１．４４０ｍｍｏｌ）、およびＰｄ／Ｃ（３８．２９ｍｇ）を加えて、得られた混合物を室温で２９時間撹拌した。前記混合物をろ過後、ろ液から溶媒を留去した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（５）を３７５．０ｍｇ（１．１１２ｍｍｏｌ、収率９３％）得た。

【0106】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ1.45 (s, 9H, a), 3.32 (m, 2H, b), 3.53 (t, 2H, J_jk = 5.2 Hz, k), 3.61-3.73 (m, 16H, c, d, e, f, g, h, i, j)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃)δ 28.2, 40.2, 61.3, 70.0, 70.2, 70.3, 78.9, 156.0
HRMS (Fab+)[M+H]+計算値 338.2173、測定値 338.2178

【0107】

（ｖｉ）ｔｅｒｔ−ブチル−（１−（２−ブロモ−５−（メトキシメトキシ）フェニル）−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサヘキサデカン−１６−イル）カルバメート（６）の製造

【0108】

【化23】

【0109】

フレームドライ、アルゴン置換した５０ｍＬの三口フラスコにＮａＨ（１９０．６９ｍｇ、４．７６７ｍｍｏｌ）、および脱水ＤＭＦ（１８ｍＬ）を加えて、得られた混合物を０℃で２時間撹拌した。その後、前記混合物へ化合物（５）（３７３．２ｍｇ、１．１０７ｍｍｏｌ）および化合物（２）（３４４．４３ｍｇ、１．１１１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（５．５ｍＬ）溶液を加えて０℃で２時間撹拌した。前記混合物から溶媒を留去した後、得られた残渣へ水（５０ｍＬ）およびジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えて、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で３回抽出した。得られた有機相を合わせて、水（５０ｍＬ）で１回、次いで飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えて、ろ過をした後、溶媒を留去した。得られた残渣をカラムクラフトグラフィーにより精製し、標題の化合物（６）を２７４．３５ｍｇ（０．４８５ｍｍｏｌ、収率４４％）得た。

【0110】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ 1.44 (s, 9H, r), 3.32 (t, 2H, p), 3.46 (s, 3H, a), 3.52-3.75 (m, 18H, g, h, i, j, k, l, m, n, o), 4.58 (s, 2H, f), 5.19 (s, 2H, b), 6.84 (dd, 1H, J_cd = 2.8 Hz, J_de = 8.4 Hz, d), 7.20 (d, 1H, J_cd = 2.8 Hz, c), 7.40 (d, 1H, J_de = 8.4Hz, e)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃)δ28.3, 40.2, 60.0, 70.1, 70.5, 70.6, 72.3, 94.3, 113.9, 116.6, 116.8, 133.0, 138.7, 156.0, 156.6
HRMS (Fab+)[M+H]+計算値 566.1959、測定値 566.1966

【0111】

（ｖｉｉ）（Ｅ）−メチル−３−（２−（２０，２０−ジメチル−１８−オキソ−２，５，８，１１，１４，１９−ヘキサオキサ−１７−アザヘニコシル）−４−（メトキシメトキシ）フェニル）アクリレート（７）の製造

【0112】

【化24】

【0113】

マイクロウェーブ用シリンジに化合物（６）（１０４．１２ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）、アクリル酸メチル（２９．３７ｍｇ、０．３４１ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（７．３１ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）、フッ化カリウム（３６．８７ｍｇ、０．６３５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１５．２１ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１４０μＬ、５．４３ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１０ｍＬ）を加え、得られた混合物をマイクロウェーブ（１５０Ｗ、１７０℃）で３時間撹拌した。反応終了後、前記混合物をろ過し、ろ液から溶媒を留去した。得られた残渣に酢酸エチル（２５ｍＬ）および水（２５ｍＬ）を加え、生じた溶液を酢酸エチル（２５ｍＬ）で３回抽出した。得られた有機相を合わせて、水（５０ｍＬ）で２回、次いで飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えてろ過をした後、溶媒を留去した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（７）を１９．５２ｍｇ（０．０３４２ｍｍｏｌ、収率１９％）得た。

【0114】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ 1.44 (s, 9H, u), 3.31 (m, 2H, s), 3.47 (s, 3H, a), 3.51-3.70 (m, 18H, j, k, l, m, n, o, p, q, r), 3.80 (s, 3H, h), 4.66 (s, 2H, i), 5.20 (s, 2H, b), 6.29 (d, 1H, J_fg = 15.6 Hz, g), 6.98 (dd, 1H, J_cd = 2.8 Hz, J_de = 8.6 Hz, d), 7.10 (d, 1H, J_cd = 2.8 Hz, c), 7.55 (d, 1H, J_de = 8.4Hz, e), 7.92 (d, 1H, J_fg = 15.6 Hz, f)
¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃)δ28.4, 40.3, 51.6, 56.1, 69.9, 70.2, 70.5, 70.8, 79.1, 94.1, 115.6, 116.7, 117.5, 126.8, 128.2, 139.1, 141.2, 156.0, 158.6, 167.5
HRMS (Fab+) [M+H]+計算値 572.3065、測定値 572.3065
[M+Na]+計算値 594.2885、測定値 594.2885

【0115】

（ｖｉｉｉ）（Ｅ）−Ｓ−（４−（２−（（４−ニトロベンジル）アミノ）−２−オキソエチル）フェニル）−３−（２−（２０，２０−ジメチル−１８−オキソ−２，５，８，１１，１４，１９−ヘキサオキサ−１７−アザヘニコシル）−４−（メトキシメトキシ）フェニル）プロプ−２−エンチオエート（８）の製造

【0116】

【化25】

【0117】

化合物（７）（不純物を含む）（６７．９６ｍｇ）をＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解させ、そこへ、２ＮのＮａＯＨ水溶液をｐＨが１２になるまで加えた。得られた混合物を室温で９時間撹拌した。その後、前記混合物へ酢酸エチル（１０ｍＬ）加え、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液（１０ｍＬ）で３回抽出した。抽出後の水層に２Ｎの塩酸をｐＨが２になるまで滴下し、この溶液を酢酸エチル（３０ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＣｌ水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えてろ過をした後、溶媒を留去し、無色のオイルを２２．３８ｍｇ得た。フレームドライ、アルゴン置換した２０ｍＬ三口フラスコに前記オイル（２２．３８ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２０．１１ｍｇ、０．０５５３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（６．２２ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を加えて、得られた混合物を室温で８０分撹拌した。その後、前記混合物へ２−（４−メルカプトフェニル）−Ｎ−（４−ニトロベンジル）アセトアミド（１８．２７ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間撹拌した。前記混合物へ酢酸エチル（２０ｍＬ）および１０％クエン酸（２０ｍＬ）を加えて、酢酸エチル（２０ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機層を１０％クエン酸（２０ｍＬ）で３回、次いで飽和ＮａＣｌ水溶液（２０ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えてろ過をした後、溶媒を留去した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（８）を１８．９５ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ、収率５６％）得た。

【0118】

¹H NMR (400 MHz, ACETN-d₆)δ 1.40 (s, 9H, y), 3.19-3.22 (m, 2H, x), 3.46-3.69 (m, 23H, a, j, o, p, q, r, s, t, u, v, w), 4.56 (d, 2H, J=6.0 Hz, k), 4.72 (s, 2H, n), 5.29 (s, 2H, b), 6.84 (d, J_fg=15.6 Hz, g), 7.06 (dd, 1H,J_cd=2.4 Hz, J_de=8.4 Hz, d), 7.18 (d, J_cd=2.8 Hz, c), 7.46 (d, 4H, h, i), 7.54 (d, J_lm=8.8 Hz, l), 7.84 (d, J_de=8.8 Hz, e), 8.02 (d, J_fg=15.6 Hz, f), 8.19 (d, J_lm=8.8 Hz, m)
¹³C NMR (100 MHz, ACETN- d6)δ 28.6, 41.0, 43.1, 43.3, 56.2, 70.6, 70.7, 70.8, 71.2, 71.3, 71.5, 78.5, 94.8, 116.5, 117.9, 124.1, 124.2, 127.1, 129.0, 129.5, 130.9, 135.5, 138.5, 139.1, 141.5, 147.9, 148.5, 156.6, 160.0, 170.9, 187.6
HRMS (Fab+) [M+Na]+計算値 864.3348、測定値 864.3370

【0119】

（ｉｘ）２−（メチルチオ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（９）の製造

【0120】

【化27】

【0121】

１００ｍＬ二口フラスコに２−メルカプトベンズオキサゾール（２．０４７ｇ、１３．５４ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（４．２１ｍＬ、６７．６３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．１８９ｇ、８．６０３ｍｍｏｌ）およびアセトン（３０ｍＬ）を加えて、得られた混合物を７０℃で４時間還流した。その後、前記混合物をろ過し、ろ液から溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（９）を１．７０７ｇ（１０．３４ｍｍｏｌ、収率７８％）得た。

【0122】

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)δ2.77 (s, 3H, e), 7.31-7.34 (m, 2H, a, d), 7.63-7.66 (m, 2H, b, c)
HRMS (EI+)m/z :[M]+計算値 165.025、測定値 165.025

【0123】

（ｘ）３−メチル−２−（メチルチオ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−３−イウム（１０）の製造

【0124】

【化28】

【0125】

フレームドライ、アルゴン置換した５０ｍＬ三口フラスコに化合物（９）（５０７．９８ｍｇ、３．０８ｍｍｏｌ）、トリメチルオキソニウムテトラフルオロホウ酸塩（５４５．３２ｍｇ、３．６９ｍｍｏｌ）、および無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）を加えて、得られた混合物を室温で２４時間撹拌し、トリメチルオキソニウムテトラフルオロホウ酸塩（１３３．９５ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）をさらに前記混合物へ加え、さらに８時間撹拌した。前記混合物へエーテル（５０ｍＬ）を加えると白い沈殿が生じ、前記混合物をろ取して前記沈殿物を集めた。前記沈殿物をエーテル（５０ｍＬ）で３回洗浄を行い、標題の化合物（１０）を４６９．６２ｍｇ（１．７５９ｍｍｏｌ、収率５７％）得た。

【0126】

¹H NMR (400 MHz, D₂O)δ 2.87 (s, 3H, f), 3.77 (s, 3H, e), 7.50-7.53 (m, 2H, a, b), 7.61 (m, 1H, c), 7.68 (m, 1H, d)
MS (ESI+)[M]+計算値 180.05、測定値 180.37

【0127】

（ｘｉ）（Ｚ）−１−（４−カロボキシブチル）−４−（（３−メチルベンゾ［ｄ］オキサゾール−２（３Ｈ）−イリデン）メチル）キノリン−１−イウム（１１）の製造

【0128】

【化29】

【0129】

フレームドライ、アルゴン置換した５０ｍＬ三口フラスコに化合物１０（５０．７５ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）、１−（５−カルボキシペンチル）−４−メチルキノリン−１−イウム（５３．０２ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）および、無水トリエチルアミン（６０μＬ、０．７８ｍｍｏｌ）を加えると、得られた溶液がオレンジ色になった。この状態で得られた混合物を室温で３．５時間撹拌した。前記混合物へメタノールを加え、生じた固体を溶解させ、その後、混合物から溶媒を留去した。得られた残渣にアセトニトリル（１０ｍＬ）を加えて溶かし、そこへエーテル（３０ｍＬ）を加えて、得られた混合物を常温で一晩放置した。その後、混合物をろ過をして標題の化合物（１１）を３２．５１ｍｇ（０．０８４ｍｍｏｌ，収率４４％）得た。

【0130】

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD)δ 1.47 (m, 2H, o), 1.68 (m, 2H, p), 1.97(m, 2H, n), 2.31(t, 2H, J_pq=7.2 Hz, q), 3.84(s, 3H, e), 4.58(t, 2H, J_mn=7.4 Hz, m), 6.20(s, 1H, f), 7.40(m, 1H, a), 7.49(m, 2H, b, c), 7.64-7.74(m, 2H, d, l), 7.98(m, 1H, h), 8.06(m, 2H, g, i), 8.32(d, 1H, J_ij=7.2 Hz, j), 8.64(d, 1H, J_lk=8.0 Hz, k)
¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆)δ24.0, 25.4, 28.5, 30.4, 33.7, 38.9, 53.7, 73.8, 109.0, 110.6, 110.8, 117.9, 123.4, 124.2, 125.9, 126.1, 126.4, 131.3, 133.3, 137.1, 143.6, 146.0, 149.9, 161.4, 174.4
HRMS(Fab+) [M]+計算値389.1870、測定値 389.1870

【0131】

（ｘｉｉ）化合物ＹＯＣＮＢの製造

【0132】

【化30】

【0133】

２０ｍＬナスフラスコに化合物（８）（５８．５１ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（５ｍＬ）およびトリエチルアミン（１ｍＬ）を加えて、得られた混合物を室温で１時間撹拌して溶媒を留去して、化合物（８）の脱保護体を得た。続いて、フレームドライ、アルゴン置換した５０ｍＬ三口フラスコにＰｙＢＯＰ（１０３．１８ｍｇ、０．１９８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３０．９５ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ）ならびに無水ＤＭＦ（６ｍＬ）に溶かした粗化合物（１１）（５３．５８ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（４２．１μＬ、０．３０２ｍｍｏｌ）を加えて、得られた混合物を室温で５時間撹拌した。その後、前記混合物へ、化合物（８）の脱保護体の無水ＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を加え、前記混合物をさらに室温で４時間撹拌した。前記混合物から溶媒を除去した後、得られた残渣をＨＰＬＣ（水／０．１％トリエチルアミン含有アセトニトリル）により精製し、化合物ＹＯＣＮＢを９．５８ｍｇ（０．００８１１ｍｍｏｌ、収率１１％）得た。

【0134】

¹H NMR (400 MHz, ACETN)δ 1.45 (m, 2H, o), 1.67 (m, 2H, n), 1.99 (m, 2H, p), 2.19 (m, 2H, q), 3.17 (m, 2H, s), 3.44-3.68 (m, 20H, s, t, u, v, w, x, y, z, 1, 10), 3.95 (s, 3H, e), 4.54 (d, 2H, J=6.4 Hz, 11), 4.59 (s, 2H, 2), 4.65 (t, 2H, m), 6.34 (s, 1H, f), 6.67 (d, 1H, J₆₇=15.6 Hz, 7), 6.83 (dd, 1H, J₃₄=2.4 Hz, J₄₅=8.8 Hz, 4), 6.95 (d, 1H, J₃₄=2.4 Hz, 3), 7.40-7.46 (m, 5H, d, 8, 9), 7.52 (d, 2H, J₁₂₁₃=9.2 Hz, 12), 7.60 (d, 1H, c), 7.64 (d, 1H, J₄₅=8.8 Hz, 5), 7.73 (d, 2H, a, b), 7.91 (d, 1H, J₆₇=15.6 Hz, 6), 8.00 (m, 1H, i), 8.11-8.20 (m, 4H, h, j, 13), 8.46 (d, J=6.8 Hz, g), 8.71 (d, 1H, J=9.2 Hz, l)
¹³C NMR (100 MHz, DMF-d₇)δ25.8 26.4, 26.5, 39.6, 42.9, 43.0, 54.9, 70.2, 70.3, 70.6, 70.8, 70.9, 71.0, 71.4, 74.6, 111.3, 111.5, 116.1, 117.3, 118.8, 122.4 124.1 124.6, 125.0, 126.7, 126.8, 127.2, 129.0, 129.8, 130.8, 132.4, 132.6, 134.1, 135.2, 136.6, 138.3, 138.7, 139.4, 141.6, 144.5, 147.5, 148.7, 151.3, 158.7, 159.6, 161.3, 168.5, 169.9, 175.8, 187.7
HRMS (MALDI+)[M]+計算値 1068.4423、測定値 1068.4462

【0135】

［Ｈｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１／Ｈｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１の遺伝子を持つ大腸菌の製造］
Ｈｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１に関しては、まず、ＭＢＤ1のＤＮＡ断片は、ｐＧＥＸ2Ｔ−ＭＢＤ1をテンプレートとして、プライマー（配列番号３２）およびプライマー（配列番号３３）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片と、ｐｃＤＮＡ3.1（＋）−ＨＡ−ＰＹＰ−ＮＬＳのそれぞれをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ライゲーションすることでｐｃＤＮＡ3.1（＋）−ＨＡ−ＰＹＰ−ＭＢＤ1−ＮＬＳを得た。シークエンス解析により、目的プラスミドの配列であることを確認した。

【0136】

ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ1のＤＮＡ断片はｐｃＤＮＡ3.1（＋）−ＨＡ−ＰＹＰ−ＭＢＤ1−ＮＬＳをテンプレートとして、プライマー（配列番号３４）およびプライマー（配列番号３５）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片と、ｐＱＥ−３２空ベクターのそれぞれをＳｐｈＩとＫｐｎＩで制限酵素処理し、ライゲーションすることでｐＱＥ３２−Ｈｉｓ−ＰＹＰ−ＭＢＤ１を得た。シークエンス解析により、目的プラスミドの配列であることを確認した。Ｈｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１のＤＮＡ断片はｐＱＥ３２−Ｈｉｓ−ＰＹＰ−ＭＢＤ１をテンプレートとして、プライマー（配列番号３６）およびプライマー（配列番号３７）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片と、ｐＥＴ２１ｂ（＋）空ベクターのそれぞれをＮｈｅＩとＸｈｏＩで制限酵素処理し、ライゲーションすることでｐＥＴ２１ｂ（＋）−Ｈｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１を得た。シークエンス解析により、目的プラスミドの配列（配列番号３０）であることを確認した。

【0137】

Ｈｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１に関しては、まず、ｐＭＡＬｐ５ｘ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１のＤＮＡ断片は、ｐＭＡＬｐ５ｘ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１をテンプレートとして、プライマー（配列番号３８）およびプライマー（配列番号３９）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片と、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＭＢＰ−ＰＹＰ３ＲのそれぞれをＮｄｅＩとＫｐｎＩで制限酵素処理し、ライゲーションすることでｐＭＡＬｐ５ｘ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１を得た。シークエンス解析により、目的プラスミドの配列であることを確認した。

【0138】

Ｈｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１のＤＮＡ断片は、ｐＭＡＬｐ５ｘ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１をテンプレートとして、プライマー（配列番号４０）およびプライマー（配列番号４１）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片と、ｐＥＴ２１ｂ（＋）−Ｈｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１のそれぞれをＮｈｅＩとＸｈｏＩで制限酵素処理し、ライゲーションすることでｐＥＴ２１ｂ（＋）−Ｈｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１を得た。シークエンス解析により、目的プラスミドの配列（配列番号３１）であることを確認した。

【0139】

［Ｈｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１の発現と精製］
１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを２０μＬ加えたＬＢ培地（２０ｍＬ）で、Ｈｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１の遺伝子をもつ大腸菌（配列番号３０）を３７℃で１６時間培養した。続いて、３７℃に温めたＬＢ培地（１Ｌ）に１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを１ｍＬ加え、培養していたＬＢ培地（２０ｍＬ）を加えて３７℃で３．５時間培養を行った。ここに１ＭのＩＰＴＧを３００μＬ加えて２０℃で１６時間培養した。この培養液を５０００ｒｐｍ、２０℃で１２分間遠心分離を行い、上清を取り除き、Ｂｉｎｄ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ １粒、ｐＨ８．０）を２０ｍＬ加え懸濁し、氷上で超音波により大腸菌を破砕した。その後、１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離を行い、上清をろ過し、ろ液をＮｉカラムに添加した。１時間撹拌後、２５ｍＬのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）をカラムに２回添加することで洗浄操作を行い、２５ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ （５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）をカラムに添加しＨｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１を溶出させ、精製を行った。

【0140】

得られたＨｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１をゲルろ過カラムクロマトグラフィーによって精製した。ゲルろ過用緩衝液としてＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を使用した。

【0141】

［Ｈｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１の発現と精製］
前記「Ｈｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１の発現と精製」において、Ｈｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１の遺伝子をもつ大腸菌の代わりにＨｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１の遺伝子をもつ大腸菌（配列番号３１）を用いた以外は、同様にして、Ｈｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１を得た。なお、ＰＹＰ３Ｒは、Ｃｙｓ３９の近傍に位置し、負電荷を持つアミノ酸残基Ｄ７１、Ｄ９７およびＥ７４を正電荷を持つアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）に変更したＰＹＰ変異体である。

【0142】

＜ゲルシフトアッセイ＞
化合物ＹＯＣＮＢ（終濃度５μＭ）、Ｈｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（終濃度５μＭ）を含む５０μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ＤＭＳＯ、ｐＨ７．４）を調製し、２５℃で２時間インキュベーションし、ラベル化反応させてＹＯＣＮＢ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（終濃度５μＭ）を得た。ＹＯＣＮＢ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（終濃度０、２５、５０、１００、２００、４００、８００ｎＭ）、二本鎖のＤＮＡ（ＤＮＡ配列（配列番号４２）とその相補鎖（配列番号４３）、ｍＣ：メチル化シトシン）（終濃度５０ｎＭ）、ＩＧＥＰＡＬ（終濃度０．０５％）、グリセロール（終濃度５％）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ＤＭＳＯ、ｐＨ７．４）を２０μＬ調製し、２５℃で３０分間インキュベーションした。

【0143】

１２％アクリルアミドゲルを用意し、１８０Ｖ、３０分間プレランを行った後、サンプルを１０μＬ添加し、ＴＢ ｂｕｆｆｅｒ中、室温において１８０Ｖ、９０分間電気泳動を行った。その後、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉで３０分間染色を行い、蛍光バンドを検出した。得られた結果を図１に示す。

【0144】

Ｈｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１の代わりにＨｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１を用いて得られたＹＯＣＮＢ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１を用いた結果を図２に示す。

【0145】

図１に示すように、化合物ＹＯＣＮＢでラベル化して得られたＹＯＣＮＢ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１は、非メチル化ＤＮＡとは結合しないが、メチル化されたＤＮＡとは結合することが確認された。

【0146】

一方、図２に示すように、化合物ＹＯＣＮＢでラベル化して得られたＹＯＣＮＢ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１は、非メチル化ＤＮＡとは結合しないが、メチル化されたＤＮＡとは結合することが確認された。

【0147】

[化合物ＹＯＣＮＢの蛍光強度]
二本鎖のＤＮＡ(ＤＮＡ配列（配列番号４２）とその相補鎖（配列番号４３）、ｍＣ：メチル化シトシン)(終濃度５０ｎＭ)の存在下もしくは非存在下で、化合物ＹＯＣＮＢ(終濃度２００ｎＭ)を含む２００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液(２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５％ＤＭＳＯ，ｐＨ ７．４)を２５ ℃で３０分インキュベーションし、蛍光スペクトルを測定した。

【0148】

得られた結果を図３に示す。図３に示すように、化合物ＹＯＣＮＢとメチル化ＤＮＡとを混合しても、化合物ＹＯＣＮＢのみの場合と、蛍光強度は、ほぼ同一である。従って、式（Ｉ）で表される化合物を用いるのではなく、プローブを用いる本発明の方法により、メチル化ＤＮＡを蛍光標識することが可能であることが、確認された。

【0149】

［ＹＯＣＮＢ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１またはＹＯＣＮＢ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１を含むプローブによる蛍光強度変化］
化合物ＹＯＣＮＢ(終濃度 ５ μＭ), Ｈｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１あるいはＨｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１(終濃度 ５ μＭ)を含む３０ μＬのHEPES緩衝液(２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ，５％ ＤＭＳＯ，ｐＨ ７．４)を調製し、２５℃でＨｉｓ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１の場合は１０ 時間, Ｈｉｓ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１の場合は３時間インキュベーションし、ＹＯＣＮＢ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１あるいはＹＯＣＮＢ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１をそれぞれ調製した。

【0150】

その後、二本鎖のＤＮＡ(ＤＮＡ配列（配列番号４２）とその相補鎖（配列番号４３）、ｍＣ：メチル化シトシンあるいはシトシン) (終濃度 ５０ｎＭ)の存在下もしくは非存在下で、ＹＯＣＮＢ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１あるいはＹＯＣＮＢ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１(終濃度 ２００ ｎＭ), ２００ μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ５％ ＤＭＳＯ， ｐＨ ７．４）を調製し、２５℃で３０分インキュベーションし、蛍光スペクトルを測定した。

【0151】

得られた結果を図４に示す。図４に示すように、野生型ＰＹＰ由来のＹＯＣＮＢ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１より、変異型ＰＹＰ由来のＹＯＣＮＢ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１により、メチル化ＤＮＡをより強い蛍光で標識することが可能であることが確認された。

【0152】

この点は、野生型ＰＹＰのＰＩ値が４．７９であるのに対し、変異型ＰＹＰ（例えばＰＹＰ３Ｒ）のＰＩ値が６．７２であるため、負電荷に帯電しているＤＮＡへの結合能が、野生型ＰＹＰより変異型ＰＹＰのほうが高いため、と考えられる。

【0153】

［ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＨＡ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１（１−１１２）の作成］
ＭＢＤ１のＤＮＡ断片はｐＥＴ２１ｂ（＋）−Ｈｉｓ−ＰＹＰ−ＭＢＤ１をテンプレートとして、プライマ―（配列番号４４）およびプライマー（配列番号４５）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片とｐｃＤＮＡ３．１−ＨＡ−ＰＹＰをそれぞれＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで制限酵素処理してライゲーションすることによりプラスミドを得た。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的プラスミドのｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖ２−ＨＡ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１（１−１１２）をであることを確認した。

【0154】

［ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＨＡ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（１−１１２）の作成］
ＰＹＰ３ＲのＤＮＡ断片は、ｐＥＴ２１ｂ（＋）−Ｈｉｓ−ＰＹＰ３Ｒをテンプレートとして、プライマー（配列番号４６）およびプライマー（配列番号４７）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片とｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖ２−ＨＡ−ＰＹＰＷＴ−ＭＢＤ１（１−１１２）をそれぞれＨｉｎｄｈＩＩＩとＥｃｏＲＩで制限酵素処理してライゲーションすることによりプラスミドを得た。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的遺伝子（配列番号４８）を含むプラスミドのｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖ２−ＨＡ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（１−１１２）であることを確認した。

【0155】

［細胞の調整と遺伝子導入］
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（独立行政法人理化学研究所より購入）を１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）培地２ｍＬ中２４時間培養し、培地を除いた後に、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＭＥＭ培地を２ｍＬ加えた。この細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ライフテクノロージー社製）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＨＡ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（１−１１２）の遺伝子断片を含まない空ベクター）及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖ２−ＨＡ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（１−１１２）の遺伝子を導入し、３７℃で２４時間インキュベーションを行った。その後、培地を除いた後、得られた細胞をハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＨＢＳＳ）１ ｍＬで３回洗浄し、２μＭのＹＯＣＮＢおよび５００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒを含むＭＥＭ培地１ｍＬを加え、３７℃で６０分間インキュベーションした。更に、その細胞の培地に３００μＬ（１ｍｇ／１ｍＬ）のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を加えて、３７℃で１５分間インキュベーションを行い、ＨＢＳＳ（１ｍＬ）で３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地（１ｍＬ）を加えた。

【0156】

［蛍光イメージング実験］
上記の細胞の蛍光イメージングを共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０ｉ（オリンパス株式会社製）を用いて行った。ＹＯＣＮＢ由来の蛍光像を取得する際には、４７３ｎｍのレーザーを励起光として用い、４９０ｎｍ〜５９０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いた。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光像を取得する際には、４０５ｎｍのレーザーを励起光として用い、４２０ｎｍ〜４６０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いて観測を行った。

【0157】

得られた結果を図５に示す。図５は、ＹＯＣＮＢを添加した細胞の蛍光像を示す。上段画像は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（空ベクター）を導入した細胞の画像であり、下段画像は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖ２−ＨＡ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（１−１１２）を導入した細胞の画像である。図の左側の画像は蛍光像を示し、右側の画像は位相差像を示す。白枠の囲みは、核内から蛍光輝点が観測された領域を示している。

【0158】

空ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）を導入した細胞の核内から複数の蛍光の輝点は観測されなかったのに対し（図５中左上参照）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖ２−ＨＡ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（１−１１２）を導入した細胞の核内から複数の蛍光の輝点が観測された（図５中左下参照）。この結果から、ＹＯＣＮＢ単独では、核内のＤＮＡに結合し蛍光を発しないことが理解できる。一方、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＨＡ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（１−１１２）を導入した細胞では、ＹＯＣＮＢは細胞核内に発現している蛋白質ＨＡ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（１−１１２）を標識し、その蛋白質がメチル化ＤＮＡに結合し、その近傍のＤＮＡにＹＯＣＮＢの蛍光色素部位が結合し蛍光を発していると考えられる。

【0159】

図６は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｖ２−ＨＡ−ＰＹＰ３Ｒ−ＭＢＤ１（１−１１２）を導入した細胞の蛍光像であり、ＹＯＣＮＢ由来の蛍光像とＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光像を示している。左から、（ａ）ＹＯＣＮＢの蛍光像、（ｂ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光像、（ｃ）ＹＯＣＮＢとＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光の重ね合わせ画像、および（ｄ）位相差像を示す。

【0160】

図６（ｂ）に示すように、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光は、核内から複数の輝点として観測された。その蛍光の分布は、ＹＯＣＮＢ由来の蛍光（図６（ａ）参照）と一致した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２はメチル化ＤＮＡの豊富なヘテロクロマチンと呼ばれる遺伝子領域を蛍光染色することが知られていることから、ＹＯＣＮＢ由来の蛍光がメチル化ＤＮＡ領域から観測されていると考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0161】

本発明のメチル化ＤＮＡを蛍光標識する方法は、ＤＮＡメチル化阻害剤のハイスループットスクリーニング等に適用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]