特許 6275646 ＭＡＩＴ様細胞およびその作製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6275646

(24)【登録日】2018年1月19日

(45)【発行日】2018年2月7日

(54)【発明の名称】ＭＡＩＴ様細胞およびその作製方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20180129BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180129BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20180129BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20180129BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20180129BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10

   C12N15/00 AZNA

   A61K35/12

   A61P31/04

   A61P31/10

【請求項の数】18

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2014-544630(P2014-544630)

(86)(22)【出願日】2013年10月30日

(86)【国際出願番号】JP2013080359

(87)【国際公開番号】WO2014069672

(87)【国際公開日】20140508

【審査請求日】2016年6月24日

(31)【優先権主張番号】特願2012-239195(P2012-239195)

(32)【優先日】2012年10月30日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】307010166

【氏名又は名称】第一三共株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100126985

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 充利

(72)【発明者】

【氏名】若尾 宏

(72)【発明者】

【氏名】藤田 博美

(72)【発明者】

【氏名】小清水 右一

(72)【発明者】

【氏名】吉清 和則

【審査官】 濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０３８５７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０２７０９４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１３４５２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０６３８１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Le BOURHIS, L., et al.，Antimicrobial activity of mucosal-associated invariant T cells，Nat. Immunol.，２０１０年 ８月，11(8)，pp.701-708

【文献】 Le BOURHIS, L., et al.，Mucosal-associated invariant T cells: unconventional development and function，Trends in Immunology，２０１１年 ５月，32(5)，pp.212-218

【文献】 三宅幸子，MAIT細胞と自己免疫疾患，最新医学，２０１１年１２月１０日，66(12)，pp.2736-2740

【文献】 DUSSEAUX, M., et al.，Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17 -secreting T cells，Blood，２０１１年 １月，117(4)，pp.1250-1259

【文献】 NISHIMURA, K., et al.，Development of Defective and Persistent Sendai Virus Vector; A UNIQUE GENE DELIVERY/EXPRESSION SYSTE，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，２０１１年 ２月１１日，286(6)，pp.4760-4771

【文献】 所和美ら，薬効薬理試験の試験計画書 −信頼性の観点から−，Jpn. Pharmacol. Ther.（薬理と治療），２００３年，31(3)，pp.196-200

【文献】 山本恵司，安全性薬理試験，日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.），２００７年，130，pp.299-303

【文献】 Harold Ayetey，Therapeutic Possibilities of Induced Pluripotent Stem Cells，Translational Stem Cell Research，Human Press，２０１１年，Chapter 8，p. 77-90

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＭＡＩＴ細胞に初期化因子を導入してＭＡＩＴ細胞に特異的な態様に再構成されたＴＣＲα鎖遺伝子を保持する人工多能性幹細胞を得ること、次いで、
この人工多能性幹細胞を分化誘導してＭＡＩＴ様細胞を得ること、
を含む、ＭＡＩＴ様細胞の作製方法。

【請求項2】

ＭＡＩＴ細胞に初期化因子を導入してＭＡＩＴ細胞特異的な態様に再構成されたＴＣＲα鎖遺伝子を保持する人工多能性幹細胞を得ることを含む、人工多能性幹細胞の作製方法。

【請求項3】

ウイルスベクターを用いて初期化因子を導入する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ウイルスベクターが、センダイウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

センダイウイルスベクターが、複数の初期化因子を同一のベクター内に搭載したものである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

請求項２乃至５のいずれかに記載の方法によって得られる人工多能性幹細胞。

【請求項7】

ＭＡＩＴ細胞に特異的な態様に再構成されたＴＣＲα鎖遺伝子を保持する人工多能性幹細胞。

【請求項8】

ＴＣＲα鎖遺伝子として、ＭＡＩＴ細胞に特異的な態様に再構成された、単一のＴＣＲα鎖遺伝子のみを保持する、請求項７に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項9】

ＭＡＩＴ細胞に特異的な態様に再構成されたＴＣＲα鎖遺伝子が、ヒトの場合Ｖα７．２−Ｊ α３３、マウスの場合Ｖα１９−Ｊ α３３である、請求項７又は８記載の人工多能性幹細胞。

【請求項10】

請求項２乃至５のいずれかの方法によって得られる、請求項７乃至９のいずれかに記載の人工多能性幹細胞。

【請求項11】

請求項６乃至１０のいずれかに記載の人工多能性幹細胞を分化誘導してＭＡＩＴ様細胞を得ることを含む、ＭＡＩＴ様細胞の作製方法。

【請求項12】

前記人工多能性幹細胞をフィーダー細胞とともに共培養してＭＡＩＴ様細胞を得る、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

請求項６乃至１０のいずれかに記載の人工多能性幹細胞を分化誘導することによって得られるＭＡＩＴ様細胞。

【請求項14】

請求項１１又は１２に記載の方法によって得られるＭＡＩＴ様細胞。

【請求項15】

ＣＤ４５ＲＡの発現が陽性である、請求項１３に記載のＭＡＩＴ様細胞。

【請求項16】

請求項１３乃至１５の何れかに記載のＭＡＩＴ様細胞と被験物質を接触させる工程を含む、被験物質のＭＡＩＴ細胞の機能を調整する活性の評価方法。

【請求項17】

請求項１３乃至１５の何れかに記載のＭＡＩＴ様細胞を含有する、細胞療法剤。

【請求項18】

細菌感染又は真菌感染に対する抵抗力を向上させるために投与される、請求項１７の細胞療法剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＭＡＩＴ細胞から人工多能性幹細胞を作製する方法、および、ＭＡＩＴ細胞由来の人工多能性幹細胞に関する。また、本発明は、人工多能性幹細胞からＭＡＩＴ様細胞を作製する方法、および、それによって得られたＭＡＩＴ様細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

ＭＡＩＴ細胞（Ｍｕｃｏｓａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｔ ｃｅｌｌｓ）は、各種サイトカインを産生して種々の免疫反応を制御し、自然免疫と獲得免疫の「橋渡し役」を担う細胞として知られる自然免疫Ｔリンパ球の一種である。ＭＡＩＴ細胞はヒトにおいて豊富に存在し、例えば肝臓中のＴ細胞では２０−５０％、腸管粘膜固有層リンパ球（ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ＬＰＬ）や末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）の１−１０％を占める一方、マウスでは稀有な細胞である（Ｄｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｌｅ Ｂｏｕｒｈｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0003】

ＭＡＩＴ細胞のもう一つの特徴として、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）の単一性が挙げられる。Ｔ細胞に特異的に発現するＴＣＲは主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）分子に結合したペプチド断片を抗原として認識する。ＴＣＲは細胞表面に発現する２つのポリペプチド鎖、α鎖とβ鎖で構成されているが、両鎖ともＮ末端の抗原結合領域に可変（ｖａｒｉａｂｌｅ：Ｖ）領域と呼ばれるＴＣＲ分子ごとにアミノ酸配列の異なる部位を有しており、このＶ領域の多様性が免疫反応におけるＴ細胞の抗原特異性を決定している。ＴＣＲのＶ領域は、免疫グロブリンと同様に多数の亜型からなるＶ（Ｖａｒｉａｂｌｅ）、Ｄ（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｊ（Ｊｏｉｎｉｎｇ）遺伝子断片からなり、α鎖はＶとＪの１断片ずつが、β鎖はＶ、Ｄ、Ｊの１断片ずつがＤＮＡ組み換えにより結合し、当該領域をコードする遺伝子を形成している。

【0004】

一方、Ｔ細胞の中でもそのＴＣＲが多様性を呈しない単一である細胞として、ナチュラルキラーＴ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ：ＮＫＴ細胞）とＭＡＩＴ細胞の２種類が知られている。ヒトの場合、ＭＡＩＴ細胞のＴＣＲα鎖はＶα７．２−Ｊα３３の組み合せのみであり、ＮＫＴ細胞の場合、その組み合わせはＶα２４−Ｊα１８である（Ｌｅ Ｂｏｕｒｈｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。また、マウスの場合、ＭＡＩＴ細胞のＴＣＲα鎖はＶα１９−Ｊα３３の組み合せのみであり、ＮＫＴ細胞の場合、その組み合わせはＶα１４−Ｊα１８となっている。両細胞のＴＣＲは結合できる抗原提示分子（拘束性）も異なっており、ＭＡＩＴ細胞のＴＣＲは、一般的なＴ細胞における抗原提示分子であるＭＨＣに類似した、多様性の無いＭＲ１（ＭＨＣ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）を認識・結合するが、ＮＫＴの場合、ＭＨＣ類似のＣＤ１ｄ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−１ｄ）を抗原提示分子とする。ＭＡＩＴ細胞特異的なＴＣＲとＭＲ１は進化的に良く保存されており、広範な種における機能的重要性が示唆される（Ｌｅ Ｂｏｕｒｈｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0005】

ＭＡＩＴ細胞は上記ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＴＣＲα鎖を発現するとともに、特異的な表面抗原マーカー分子として、Ｃ型レクチンであるＣＤ１６１（別名、ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＮＫＲＰ１）およびインターロイキン（ＩＬ）−１８受容体α鎖（ＩＬ−１８Ｒα）を発現する（Ｃｏｓｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｌｅ Ｂｏｕｒｈｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。即ち、ＭＡＩＴ細胞は、ＣＤ３等の一般的なＴ細胞マーカーとともに、ＭＡＩＴ特異的ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＴＣＲα鎖、ＣＤ１６１、ＩＬ−１８Ｒαを発現する細胞として規定することができる。また、ＭＡＩＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ⁻、ＣＤ４５ＲＯ^＋、ＣＤ９５^ｈｉｇｈ、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗといったエフェクター／メモリー型Ｔ細胞の形質を呈するとともに、ケモカイン受容体の発現がＣＣＲ９^ｉｎｔ、ＣＣＲ７⁻、ＣＣＲ５^ｈｉｇｈ、ＣＸＣＲ６^ｈｉｇｈ、ＣＣＲ６^ｈｉｇｈであることから、腸管や肝臓等へのホーミング指向性が示唆される（Ｄｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0006】

また、ＭＡＩＴ細胞はインターフェロン（ＩＦＮ）γやＩＬ−１７、ＩＬ−２といったサイトカインやグランザイムＢを産生するとともに、ほとんど増殖性を示さず、多剤耐性輸送体であるＡＢＣＢ１を発現して多剤耐性を示すことが報告されている（Ｄｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。これらの特性より、ＭＡＩＴ細胞は腸内細菌が産生する異物に対して抵抗性を有し、及び／又は、生体内の感染防御システムに関与することが示唆された。事実、ＭＡＩＴ細胞は結核菌等の細菌や真菌に感染した細胞と反応する特殊なＴ細胞であることが報告されるとともに、結核等の細菌感染患者ではＭＡＩＴ細胞の減少が見られること、また、マウスを用いたモデル実験により、ＭＡＩＴ細胞はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓやＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの感染を防御することが示された（Ｌｅ Ｂｏｕｒｈｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｄｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。以上の結果から、ＭＡＩＴ細胞は細菌感染に対する自然免疫リンパ球としての機能が推測されている。

【0007】

その他、ＭＡＩＴ細胞は多発性硬化症をはじめとする自己免疫疾患や炎症性疾患、癌の発症・進展との関連性が示唆されている。ＣＤ８^＋／ＣＤ１６１^ｈｉｇｈＴ細胞は肝臓や関節等の炎症部位に集積し、多発性硬化症の発症要因と目されているＴ細胞群であるが、ヒトＰＢＭＣ中ではＣＤ８^＋／ＣＤ１６１^ｈｉｇｈＴ細胞の９０％がＭＡＩＴ細胞特異的ＴＣＲα鎖であるＶα７．２^＋であることが示されている（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。さらに、多発性硬化症患者ではその病変部に、より多くのＭＡＩＴ細胞が集積していることが報告されている（Ｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＭＡＩＴ細胞の集積は、腎癌や脳腫瘍（Ｐｅｔｅｒｆａｌｖｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（Ｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）でも報告されている。また、潰瘍性大腸炎やクローン病に代表される炎症性腸疾患に関し、薬剤で惹起した炎症性組織傷害に対して移入したＭＡＩＴ細胞が保護的に作用することが報告されている（Ｘｉａｏ Ｒｕｉｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0008】

この様にＭＡＩＴ細胞は種々の疾患や病態への関与が示唆されるが、免疫制御機構、特に自然免疫における作用やその詳細なメカニズム、そこに寄与する因子や分子、さらには病態発症・進展における意義等については、検討・解析が十分に進んでいないのが現状である。その大きな理由の１つとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ並びにｉｎ ｖｉｖｏ試験に供し得る細胞ソースの問題が挙げられる。

【0009】

上述の通り、実験用動物として頻用されるマウスではＭＡＩＴ細胞は非常に稀有な細胞集団であり、当該動物を用いた機能解析は困難である。一方、ヒトにはＭＡＩＴ細胞がマウスと比較すれば豊富に存在するものの、ＭＡＩＴ細胞を末梢血等のヒト生体試料から大量に調製するには限界がある。また、この様な方法では、得られるＭＡＩＴ細胞の数や性質が大きく変動する可能性も高く、当該細胞を用いた試験の安定性・再現性に難がある。さらに、ＭＡＩＴ細胞は通常、細胞増殖能をほとんど有していない状態にあり、しかも、その増殖を誘導する因子や刺激が同定されていないため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で増幅させることができない（Ｄｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。そのため、ＭＡＩＴ細胞を用いた研究を広範に進めるための１つの解決策としては、例えば、ＭＡＩＴ細胞と機能が類似したモデル細胞の利用が考えられるが、その様な特性を有する細胞株はほとんど知られていないのが現状である。

【0010】

また、ＭＡＩＴ細胞の将来的な活用法の１つとして、各種感染症や自己免疫疾患、癌の罹患患者に、ＭＡＩＴ細胞又は人為的に修飾したＭＡＩＴ細胞を移入し治療する、いわゆる細胞移植療法に用いる細胞ソースとしての利用が考えられる。しかしながら、当該治療法を実現させるためには、やはり安定した品質を有した、大量のＭＡＩＴ細胞を調製する方法の確立が必須である。

【0011】

近年、種々の細胞を生体外で調製する方法として、多能性幹細胞を起源細胞として用い、当該細胞を分化誘導して目的の細胞を作出することが広範に試みられている。多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）とは、試験管内培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的又は長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞と定義される。多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）や胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ）、出生直後の精巣から単離される生殖細胞系列幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、さらには線維芽細胞等の体細胞から特殊な遺伝子操作により作製される人工（誘導）多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；以下、ｉＰＳ細胞と称する）等が挙げられる（Ｌｅｎｇｎｅｒ，２０１０；Ｐｆａｎｎｋｕｃｈｅ ｅｔ ａｌ，２０１０；Ｏｋｉｔａ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，２０１１）。

【0012】

多能性幹細胞から血球系細胞やリンパ球系細胞を作製する事例は数多く報告されており、Ｔ細胞を選択的に作出する方法も公知である。即ち、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を未分化状態で維持した後、造血細胞維持能を有するストローマ細胞（例えばＯＰ９細胞）の上に播種して造血幹細胞及び造血前駆細胞への分化を誘導し、それを回収した後、引き続き、Ｎｏｔｃｈリガンドであるｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−１（ＤＬＬ１）を強制発現させたＯＰ９細胞（ＯＰ９／ＤＬＬ１）上でＴ細胞としての特性を有する細胞を作出することが可能である（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ Ｆ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。また、マウスＮＫＴ細胞から作製したｉＰＳ細胞を、このＯＰ９共培養系を用いることにより、ＮＫＴ細胞としての特性を有する細胞を作製する方法も報告されている（ＷＯ２００８／０３８５７９；Ｗａｋａｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，２００８；ＷＯ２０１０／０２７０９４；Ｗａｔａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】ＷＯ２００８／０３８５７９

【特許文献2】ＷＯ２０１０／０２７０９４

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ｄｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１７，１２５０−１２５９（２０１１）

【非特許文献2】Ｌｅ Ｂｏｕｒｈｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，２１２−２１８（２０１１）

【非特許文献3】Ｃｏｓｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５，１９０３−１９１６，（２００８）

【非特許文献4】Ｌｅ Ｂｏｕｒｈｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１，７０１−７０８（２０１０）

【非特許文献5】Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．８，ｅ１０００４０７（２０１０）

【非特許文献6】Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１９，４２２−４３３（２０１１）

【非特許文献7】Ｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，２２３−２３０（２００４）

【非特許文献8】Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，５２９−５３５（２０１１）

【非特許文献9】Ｐｅｔｅｒｆａｌｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０，１５１７−１５２５（２００８）

【非特許文献10】Ｘｉａｏ Ｒｕｉｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１５，７６２−７６７（２０１２）

【非特許文献11】Ｌｅｎｇｎｅｒ ＣＪ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１９２，３８−４４（２０１０）

【非特許文献12】Ｐｆａｎｎｋｕｃｈｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６，１０５−２４（２０１０）

【非特許文献13】Ｏｋｉｔａ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３６６，２１９８−２２０７（２０１１）

【非特許文献14】Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，４１０−４１７（２００４）

【非特許文献15】Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２，６８７９−６８８８（２０１１）

【非特許文献16】Ｗａｋａｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２２，２２２３−２２３１（２００８）

【非特許文献17】Ｗａｔａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０，２６１０−８（２０１０）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

Ｔ細胞の中でもそのＴＣＲが多様性を呈しない単一（ｉｎｖａｒｉａｎｔ）な細胞として、ＮＫＴ細胞とＭＡＩＴ細胞の２種類が知られている。ＮＫＴ細胞は、細菌や癌に対して個体を防御するのに重要な役割を果たすとともに自己免疫疾患においてその病態に関与することが、主にマウスを用いた検討により知られている。一方、ＭＡＩＴ細胞は、ヒトの末梢血や腸管、肝臓に多く存在し、粘膜免疫において重要な役割を果たすと考えられているものの、その詳細については解明されていないことも多い。

【0016】

従来、ＮＫＴ細胞の免疫制御能に着目して、ＮＫＴ細胞を創薬開発に結びつけるべく主にマウスを用いて機能解析が進められてきたが、マウスでの解析結果がヒトの解析結果と一致しないことがしばしば観察される。ＮＫＴ細胞はマウスには比較的豊富に存在しているが、ヒトでは非常に希少であり、これまで、ヒトＮＫＴ細胞を標的にした創薬が試みられてきたが多くは失敗に終わっている。

【0017】

これに対して、ＭＡＩＴ細胞はマウスでは非常に希少である一方、ヒトにおいては豊富に存在することが知られている。そして、ＮＫＴ細胞とＭＡＩＴ細胞は類似した特異的な形質を呈することから、ヒトＭＡＩＴ細胞はマウスＮＫＴ細胞と同様の機能、つまり、マウスＮＫＴ細胞に相当するヒトの機能細胞がＭＡＩＴ細胞であるとの説も提唱されている。したがって、ＭＡＩＴ細胞の機能解析を進め、それを創薬開発に活かすことは極めて重要である。

【0018】

しかしながら、ＭＡＩＴ細胞は、これまで知られている如何なるＴ細胞増殖刺激にも反応しないため、機能解析に必要な大量のＭＡＩＴ細胞を調製することが困難であった。特に、実験用動物として頻用されるマウスではＭＡＩＴ細胞は非常に希有な細胞集団であり、マウスのＭＡＩＴ細胞を用いて研究開発を進めるには限界がある。また、ヒトではＭＡＩＴ細胞が豊富に存在するものの、ＭＡＩＴ細胞の増殖が困難であるため、ヒト生体からの採取に依存した方法では大量のＭＡＩＴ細胞を調製するには限界がある。このように、ＭＡＩＴ細胞の取得は生体からの採取・精製によるほかなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化誘導・増幅法や形質類似細胞（モデル細胞）に関する技術も存在していない。

【0019】

そこで、本発明は、ＭＡＩＴ細胞と同様の機能を有するＭＡＩＴ様細胞を樹立し、それを作製する技術を確立することを一つの目的とする。また、本発明は、ＭＡＩＴ細胞から人工多能性幹細胞を作製する方法、および、ＭＡＩＴ細胞由来の人工多能性幹細胞を提供することもその課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0020】

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行ったところ、ＭＡＩＴ細胞を初期化してＭＡＩＴ細胞由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を作製することに成功し、さらに、ＭＡＩＴ細胞由来の人工多能性幹細胞を分化誘導してＭＡＩＴ様細胞を得ることに成功した。

【0021】

本発明は、これに限定されるものではないが、以下の発明を包含する。
（１）ＭＡＩＴ細胞に初期化因子を導入してＭＡＩＴ細胞特異的な態様に再構成されたＴＣＲα鎖遺伝子を保持する人工多能性幹細胞を得ること、次いで、この人工多能性幹細胞を分化誘導してＭＡＩＴ様細胞を得ること、を含む、ＭＡＩＴ様細胞の作製方法。
（２）ＭＡＩＴ細胞に初期化因子を導入してＭＡＩＴ細胞特異的な態様に再構成されたＴＣＲα鎖遺伝子を保持する人工多能性幹細胞を得ることを含む、人工多能性幹細胞の作製方法。
（３）ウイルスベクターを用いて初期化因子を導入する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ウイルスベクターが、センダイウイルスベクターである、（３）に記載の方法。
（５）センダイウイルスベクターが、複数の初期化因子を同一のベクター内に搭載したものである、（４）に記載の方法。
（６）（２）〜（５）のいずれかに記載の方法によって得られる人工多能性幹細胞。
（７）ＭＡＩＴ細胞に特異的な態様に再構成されたＴＣＲα鎖遺伝子を保持する人工多能性幹細胞。
（８）ＴＣＲα鎖遺伝子として、ＭＡＩＴ細胞に特異的な態様に再構成された、単一のＴＣＲα鎖遺伝子のみを保持する、（７）に記載の人工多能性幹細胞。
（９）ＭＡＩＴ細胞に特異的な態様に再構成されたＴＣＲα鎖遺伝子が、ヒトの場合Ｖα７．２−Ｊ α３３、マウスの場合Ｖα１９−Ｊ α３３である、（７）又は（８）に記載の人工多能性幹細胞。
（１０） （２）〜（５）のいずれかの方法によって得られる、（７）〜（９）のいずれかに記載の多能性幹細胞。
（１１） （６）〜（１０）のいずれかに記載の人工多能性幹細胞を分化誘導してＭＡＩＴ様細胞を得ることを含む、ＭＡＩＴ様細胞の作製方法。
（１２） 前記人工多能性幹細胞をフィーダー細胞とともに共培養してＭＡＩＴ様細胞を得る、（１１）に記載の方法。
（１３） （６）〜（１０）のいずれかに記載の人工多能性幹細胞を分化誘導することによって得られるＭＡＩＴ様細胞。
（１４） （１１）又は（１２）に記載の方法によって得られるＭＡＩＴ様細胞。
（１５） ＣＤ４５ＲＡの発現が陽性である、（１３）に記載のＭＡＩＴ様細胞。
（１６） （１３）乃至（１５）の何れかに記載のＭＡＩＴ様細胞と被験物質を接触させる工程を含む、被験物質のＭＡＩＴ細胞の機能を調整する活性の評価方法。
（１７） （１３）乃至（１５）の何れかに記載のＭＡＩＴ様細胞を含有する、細胞療法剤。
（１８） 細菌感染又は真菌感染に対する抵抗力を向上させるために投与される、（１７）の細胞療法剤。

【発明の効果】

【0022】

本発明によれば、ＭＡＩＴ細胞から人工多能性幹細胞を作製することができる。また、本発明によれば、人工多能性幹細胞からＭＡＩＴ様細胞を作製することができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１上段は、ＭＡＩＴ細胞におけるＴＣＲα鎖の遺伝子再構成様式を示した図である。生殖細胞系列ゲノム（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）においては同一染色体上の離れた場所に位置しているＶα７．２およびＪα３３領域をコードする遺伝子配列が、ＭＡＩＴ細胞では再構成されて１つの連続した遺伝子をコードする（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）。矢印は実施例１記載の配列番号１と２のプライマーの設置位置を図示したもの。また、図１下段は、ヒト臍帯血細胞から調製したＭＡＩＴ細胞から樹立したｉＰＳ細胞様の５株におけるＶα７．２およびＪα３３領域の再構成を調べたものである。各細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、実施例１記載の配列番号１と２のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｃＩで消化して２％アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。１：ＭＡＩＴ細胞から作製したｉＰＳ細胞様の細胞（１−３Ｄ株）由来のＰＣＲ産物（ＳａｃＩ未消化）、２：１−３Ｄ株由来ＰＣＲ産物をＳａｃＩで消化したもの、Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー、３−６：ＭＡＩＴ細胞から作製したｉＰＳ細胞様の細胞株由来ＰＣＲ産物をＳａｃＩで消化したもの。

【図2A】図２Ａは、ヒト臍帯血細胞から調製したＭＡＩＴ細胞から樹立したｉＰＳ細胞の写真である。

【図2B】図２Ｂは、ヒトＭＡＩＴ細胞から樹立したｉＰＳ細胞（ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞：１−３Ｄ株）における各種ＥＳ／ｉＰＳ細胞特異的マーカーの発現を示す染色像である。上段は、特異的抗体を用いて免疫染色したもの、下段はＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）による核染色像である。

【図3】図３は、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞における特異的な遺伝子発現を示す電気泳動写真である。１：ヒトｉＰＳ細胞（Ｂ７株）、２：ヒトＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞（１−３Ｄ株）、３：ヒトＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞（２−５Ｄ株）、ヒトＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞（４−６Ｄ株）、ヒトＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞（Ａ１１株）、ヒトＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞（Ａ１３株）、ヒトＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞（Ａ４６株）、ヒトＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞（Ｃ４Ｂ株）、ヒトＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞（Ｃ５Ｂ株）、ヒトＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞（Ｃ７Ｉ株）。

【図4】図４は、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞から作製した奇形腫の組織像である。ａ：全体像（倍率：×４０）、ｂ：メラニン陽性細胞（図中の黒色の細胞）を含む神経管様構造（倍率：×２００）、ｃ：ケラチン陽性の上皮細胞から構成されている腸管様構造（倍率：×２００）、ｄ：デスミン陽性を呈する筋組織様構造（倍率：×２００）。

【図5】図５は、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞から分化誘導した細胞における各種ＭＡＩＴ細胞マーカーの発現を示す図である。数字（ｄａｙｓ）はＴ細胞系列細胞への分化を誘導してからの日数。上段は、抗ＴＣＲ Ｖα７．２抗体（３Ｃ１０）と抗ＴＣＲαβ抗体（ＩＰ２６）に対する反応性を示しており、図内の実線で囲んだ部分が共陽性画分（３Ｃ１０^＋／ＴＣＲαβ^＋細胞）であり、全体に占める割合を数値（％）で示した。下段は、この共陽性画分について抗ＩＬ−１８ Ｒα抗体（Ｈ４４）と抗ＣＤ１６１抗体（ＤＸ１２）に対する反応性を示す。

【図6】図６は、ｉＭＡＩＴ細胞における各種表面抗原マーカーの発現様式を示す図である。

【図7】図７は、ｉＭＡＩＴ細胞の各種サイトカイン産生能を示す図である。Ｎｏｎｅ：刺激なし、ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ：ＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ刺激あり。

【図8】図８は、マウス体内に移植したｉＭＡＩＴ細胞の各種臓器における存在を示す図であり、各種臓器から回収したリンパ球について３Ｃ１０^＋／ＴＣＲαβ^＋細胞を調べた。図内の実線で囲んだ部分が３Ｃ１０^＋／ＴＣＲαβ^＋細胞、すなわちｉＭＡＩＴ細胞であり、全体に占める割合を数値（％）で示した。ＢＭ：骨髄、Ｌｉｖ：肝臓、Ｓｐｌ：脾臓、ＩＥ：腸管上皮、ＬＰ：腸管粘膜固有層。

【図9】図９は、ｉＭＡＩＴ細胞の感染防御作用を確認した結果である。ｉＭＡＩＴ細胞を移植したマウスにＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ菌を接種し、２週間後の肝臓（Ｌｉｖｅｒ）および脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）における菌のコロニー形成能（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を測定した。

【発明を実施するための形態】

【0024】

一つの態様において本発明はＭＡＩＴ細胞様の形質を有する細胞（以下、ＭＡＩＴ様細胞）の作製方法であり、発現ベクターなどを用いて初期化因子をＭＡＩＴ細胞に導入してＭＡＩＴ細胞由来の人工多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞）を得た後、このｉＰＳ細胞を分化誘導することによってＭＡＩＴ様細胞を得ることができる。

【0025】

ＭＡＩＴ細胞を初期化してｉＰＳ細胞を得ることも本発明の１つの態様である。好ましい態様において、ウイルスベクター、中でもセンダイウイルスベクターを用いて初期化因子をＭＡＩＴ細胞に導入することによってＭＡＩＴ細胞由来のｉＰＳ細胞を得ることができる。当該ｉＰＳ細胞は、ＴＣＲα鎖遺伝子がＭＡＩＴ細胞に特有な配列の、単一なＶα−Ｊαに再構成されており、かつ自己増殖能および分化多能性を有し、ＥＳ細胞と類似の遺伝子発現様式を呈する、一般的なｉＰＳ細胞の特徴的な性質を備えた細胞（ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞）である。

【0026】

本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞内に初期化因子（核初期化因子）を導入・発現させることにより、人為的に分化多能性および自己複製能を獲得した細胞であって、ＥＳ細胞と類似した形質を有する細胞をいう。「分化多能性」（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）とは、適当な条件下において全ての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞と定義されるが、本発明の実施においては、必ずしも全ての系譜の細胞への分化能を有している必要はなく、ＭＡＩＴ細胞ならびにその幹・前駆細胞への分化能を有し、その他１つ以上の細胞系列に分化し得る能力を有していれば良い。ＥＳ細胞と類似の形質とは、ＥＳ細胞に特異的な表面マーカー分子の存在やテラトーマ形成能等のＥＳ細胞に特異的な細胞生物学的性質やＥＳ細胞特異的な遺伝子の発現、又は対象細胞における多数の遺伝子群の発現様式の類似性の高さ等で規定することができる。

【0027】

本発明においてＭＡＩＴ細胞とは、ＴＣＲα鎖遺伝子が特有かつ均一なＶα−Ｊα（マウスではＶα１９−Ｊα３３、ヒトの場合はＶα７．２−Ｊα３３）に再構成されているＴ細胞であり、より好ましくは、ＣＤ１６１やＩＬ−１８Ｒαを発現する細胞としても規定することができる。また、ＭＡＩＴ細胞はそのＴＣＲα鎖が、多様性の無いＭＲ１によって拘束されることも、その特徴とできる。さらに、本発明においてＭＡＩＴ細胞の特定は、ＭＡＩＴ細胞に特異的な遺伝子の発現や、ＭＡＩＴ細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって行うことができる。

【0028】

本発明において使用するＭＡＩＴ細胞は、特に由来の制限はなく、例えば、ヒト、マウス、サルなどの哺乳動物由来のＭＡＩＴ細胞を好適に使用することができる。また、生体内のＭＡＩＴ細胞は増殖能をほぼ欠失しており、ＭＡＩＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖する技術も確立されていないため、ＭＡＩＴ細胞は生体内から採取する必要があるが、採取する部位については特に制限はなく、例えば、臍帯血、末梢血、肝臓、胸腺、脾臓、骨髄、腸管（粘膜固有層、パイエル板）などに由来するＭＡＩＴ細胞を好適に使用することができ、末梢血又は臍帯血由来のＭＡＩＴ細胞を本発明において特に好適に使用し得る。

【0029】

本発明においてＭＡＩＴ細胞を初期化してｉＰＳ細胞を作製する場合、初期化因子（核初期化因子）としては、公知のものを特に制限せずに使用することができ、タンパク性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。例えば、山中因子として知られるＯｃｔ３／４遺伝子産物（核酸配列：配列番号９）、Ｋｌｆ４（核酸配列：配列番号１０）をはじめとするＫｌｆファミリー遺伝子産物、ｃ−Ｍｙｃ（核酸配列：配列番号１１）をはじめとするＭｙｃファミリー遺伝子産物、Ｓｏｘ２（核酸配列：配列番号１２）をはじめとするＳｏｘファミリー遺伝子産物、の４因子を用いることができ、また、Ｏｃｔ３／４遺伝子産物、Ｋｌｆファミリー遺伝子産物、Ｓｏｘファミリー遺伝子産物の３因子を導入した後に塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの存在下で培養してｉＰＳ細胞を得ることが知られている（国際公開ＷＯ２００７／６９６６６参照）。なお、ファミリー遺伝子としては、８０％以上あるいは９０％以上の同一性を有するものを好適に使用することができる。

【0030】

また、上記因子の一部を低分子化合物等の薬剤で代用できることも報告されており、例えば、Ｏｃｔ３／４とＳｏｘ２の２つの遺伝子を導入した細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるバルプロ酸で処理することにより、ｉＰＳ細胞を作製できる（Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，１２６９−１２７５（２００８））。さらには上記因子の代わりにｍｉｃｒｏＲＮＡｓを用いる方法（Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ８，６３３−６３８（２０１１））も公知である。

【0031】

初期化因子をＭＡＩＴ細胞に導入するための方法としては、上記の因子をタンパク質として導入する方法もあるが、それらをコードする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ）の形態で用いることがむしろ好ましい。当該核酸（好ましくはｃＤＮＡ）は、宿主となるＭＡＩＴ細胞で機能し得るプラスミドベクターやウイルスベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。

【0032】

発現ベクターとしては、ＭＡＩＴ細胞において初期化因子遺伝子の効率的な転写および発現が可能であり、その後の初期化（ｉＰＳ細胞化）を誘導できるものであれば良いが、当該発明において好適な例としてはセンダイウイルスベクター（ＳｅＶ）が挙げられる。センダイウイルスは、一本鎖の非分節型マイナス鎖ＲＮＡをゲノムとして有するウイルスであり、細胞生物学の分野で幅広く利用されてきたものである。センダイウイルスベクターは、多くの哺乳動物の細胞や組織に遺伝子を導入することができ、ベクターゲノムがＲＮＡの状態で細胞質に留まるため宿主染色体に影響を与えずに済むというメリットがある。センダイウイルスベクターを構築するためのキット製品は市販されており、当業者であれば適宜入手することが可能である。

【0033】

一般に、ウイルスベクターを用いて遺伝子を効率的に培養系に導入する方法として、アデノウイルスの他にレトロウイルスを用いる方法も広く知られている。本発明者らが検討したところ、ＭＡＩＴ細胞を用いる本発明においてはセンダイウイルスベクターを用いることによって、極めて効率的にＭＡＩＴ細胞を初期化してｉＰＳ細胞を得ることができ、さらにゲノム改変を生じないため安全性の点でも優れたｉＰＳ細胞を得ることができた。

【0034】

また、複数の初期化因子を導入するには、その１つもしくは複数の遺伝子を個別のベクターに挿入したものを作製し、これら複数種のベクターを同時に処理することが一般的であるが、複数の初期化遺伝子を１つのベクターに搭載し、全ての遺伝子を発現し得るベクターを用いることがより好ましい。ここで、「複数の初期化因子」とは、上述した、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子４因子から選択される少なくとも２つ以上の因子であり、好ましくはＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の３因子であり、さらに好ましくは、４因子の全てである。この様な複数の初期化遺伝子を同時に発現し得るセンダイウイルスベクターは公知であり、例えば、センダイウイルスベクターに初期化因子を、転写開始位置から、ｃ−Ｍｙｃ→Ｋｌｆ４ → Ｏｃｔ３／４→ Ｓｏｘ２の配置で搭載したＳｅＶｄｐ（ＭＫＯＳ）３０２Ｌ（配列番号１３）やＫｌｆ４→ Ｏｃｔ３／４→Ｓｏｘ２→ ｃ−Ｍｙｃの配置で搭載したＳｅＶｄｐ（ＫＯＳＭ）（配列番号１４）などは、きわめて高い効率で線維芽細胞等からｉＰＳ細胞を誘導・樹立できることが報告されている（ＷＯ２０１０／１３４５２６；Ｎｉｓｈｉｍｉｕｒａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６，４７６０−４７７１（２０１１）、ＷＯ２０１２／００６３８１７）。また、これらのベクターに関する知見に基づき、初期化因子の配置、挿入位置、その他の付加配列に関して、任意に設計したセンダイウィルスベクターを構築し、本発明に用いることができる。例えば、実施例１に用いたＳｅＶｄｐ（ＫＯＳＭ）３０２Ｌは、初期化因子をＳｅＶｄｐ（ＫＯＳＭ）と同様に、Ｋｌｆ４ → Ｏｃｔ３／４ → Ｓｏｘ２→ｃ−Ｍｙｃの配置で搭載し、挿入位置、その他の付加配列に関して、ＳｅＶｄｐ（ＫＯＳＭ）およびＳｅＶｄｐ（ＭＫＯＳ）３０２Ｌの特徴を採用したセンダイウイルスベクターである。

【0035】

このように、センダイウイルスベクター等を用いて初期化因子をＭＡＩＴ細胞に導入することによってＭＡＩＴ細胞由来のｉＰＳ細胞を得ることができるが、このようなＭＡＩＴ細胞由来のｉＰＳ細胞自体も本発明の１つの態様である。ＭＡＩＴ細胞を初期化して得られたｉＰＳ細胞（ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞）は、ＭＡＩＴ細胞に特異的なＴＣＲα鎖遺伝子及び／又はその産物を発現している（以下、当該特性を「ＭＡＩＴ細胞に特異的なＴＣＲα鎖を有している」と称する）点で、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞など従来から存在していた多能性幹細胞とは異なる。ＭＡＩＴ細胞に特異的なＴＣＲα鎖遺伝子を有している多能性幹細胞は、後述するように、Ｔ細胞への分化を誘導し得る条件下におくことによってＭＡＩＴ細胞と類似の特性を有するＭＡＩＴ様細胞を選択的に得ることができ、極めて有用である。

【0036】

ＭＡＩＴ細胞を初期化して得られるＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞は、引き続き、公知の方法による細胞回収、分離、精製法などによって高純度かつ多量に回収することができる。

【0037】

また１つの態様において、本発明は、ＭＡＩＴ細胞に特異的なＴＣＲα鎖遺伝子を有するｉＰＳ細胞である。このようなｉＰＳ細胞は、上述したように、センダイウイルスベクター等の発現ベクターを用いて初期化因子をＭＡＩＴ細胞に導入することによって得ることができるが、このように体細胞であるＭＡＩＴ細胞を初期化する方法以外にも、ＭＡＩＴ細胞に特異的なＴＣＲ遺伝子をＥＳ細胞や一般的な、通常法で作製されたｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞に導入することによって得ることも考えられる。その場合、多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞のみならず、哺乳動物の成体臓器や組織の細胞、骨髄細胞、血液細胞、さらには胚や胎児の細胞等に由来する、ＥＳ細胞に類似した形質を有するすべての多能性幹細胞を使用することができる。この場合、ＥＳ細胞と類似の形質は、ＥＳ細胞に特異的な表面マーカー分子の存在やテラトーマ形成能等のＥＳ細胞に特異的な細胞生物学的性質やＥＳ細胞特異的な遺伝子の発現、又は対象細胞における多数の遺伝子群の発現様式の類似性の高さ等で規定することができる。

【0038】

一つの態様において本発明はＭＡＩＴ様細胞の作製方法であり、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞などの、ＭＡＩＴ細胞に特異的なＴＣＲα鎖遺伝子を有するｉＰＳ細胞を分化誘導してＭＡＩＴ様細胞を得ることができる。このようにして得られた分化細胞は、ＭＡＩＴ細胞と同様の特性を有しており、本発明においてＭＡＩＴ様細胞という。特に、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞を分化誘導して得られたＭＡＩＴ様細胞を、本発明においてｉＭＡＩＴ細胞という（学術的には、「ｒｅＭＡＩＴ細胞」とも呼ばれる）。

【0039】

本発明において、ＭＡＩＴ細胞に特異的なＴＣＲα鎖遺伝子を有するｉＰＳ細胞を分化誘導してＭＡＩＴ様細胞を得る場合、ｉＰＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞からＴ細胞を分化誘導する公知の方法を制限なく使用することができる。ＮＫＴ細胞に関しては、核移植によりＮＫＴ細胞の核移植により得られたＥＳ細胞を作製し、当該細胞を分化誘導してＮＫＴ様細胞を得たこと、さらには、レトロウイルスベクターを用いてマウスＮＫＴ細胞を初期化してｉＰＳ細胞を作製し、そのｉＰＳ細胞を分化誘導してＮＫＴ様細胞を得たことがこれまでに報告されている。

【0040】

本発明において分化誘導によってＭＡＩＴ様細胞を得る際の培養法としては、ＭＡＩＴ様細胞が得られるような方法であれば、いずれも用いることができ、例えば、フィーダー細胞との共培養法、浮遊培養法、懸滴（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ）培養法、旋回培養法、軟寒天培養法、マイクロキャリア培養法などを挙げることができる。本発明の好ましい態様において、ｉＰＳ細胞を分化誘導してＭＡＩＴ様細胞を得る場合、共培養によることが好ましく、具体的には、ＯＰ９細胞などのストローマ細胞をフィーダー細胞として共培養し、さらに、ＮｏｔｃｈリガンドであるＤＬＬ１を強制発現させたＯＰ９細胞（ＯＰ９／ＤＬＬ１）と共培養すること、または最初からＯＰ９／ＤＬＬ１細胞と共培養することによって、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞から効率的にＭＡＩＴ様細胞を得ることができる。

【0041】

このようにして得られたＭＡＩＴ様細胞は、引き続き、公知の方法による細胞回収、分離、精製を行うことができる。本発明により得られたＭＡＩＴ様細胞は、生体内のＭＡＩＴ細胞とほぼ同等の形態学的、生理学的及び／又は免疫学的特徴を示す細胞である。生理学的及び／又は免疫学的特徴は、特にこれを限定しないが、ＭＡＩＴ様細胞の同定は、ＭＡＩＴ細胞に特異的な１つ又はそれ以上のマーカーの発現を確認することによって行うことができる。マーカーの発現は、特にその手法は問わないが、抗体を用いた免疫染色法や逆転写酵素介在性ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーション解析といった公知の細胞組織生物学的手法ならびに分子生物学的方法により確認することができる。ＭＡＩＴ様細胞を精製する方法は、公知となっている細胞の分離精製法であればいずれも用いることができるが、その具体的例として、フローサイトメーターや磁気ビーズ、パンニング法等の抗原−抗体反応に準じた方法や、ショ糖、パーコール等の担体を用いた密度勾配遠心による細胞分画法を挙げることができる（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３；「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。

【0042】

具体的には、ＭＡＩＴ様細胞は、ＭＡＩＴ細胞と同様に、抗ＴＣＲ Ｖα７．２抗体（３Ｃ１０）、抗ＣＤ１６１抗体、抗ＩＬ−１８Ｒα抗体などに対して陽性（３Ｃ１０^＋／ＣＤ１６１^＋／ＩＬ−１８Ｒα^＋）であった。その一方で、生体内のＭＡＩＴ細胞はＣＣＲ７の発現が陰性であるのに対して、抗原未感作の（作製直後の）ＭＡＩＴ様細胞は弱いながらもＣＣＲ７の発現が確認され、生体内ＭＡＩＴ細胞とＭＡＩＴ様細胞との間に差異があることが確認された。また、例えば末梢血由来のＭＡＩＴ細胞では、エフェクターメモリー型Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ４５ＲＯの発現が陽性であり、ナイーブ型Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ４５ＲＡの発現が陰性かごく一部の細胞でのみ陽性であるのに対し、抗原未感作の（作製直後の）ＭＡＩＴ様細胞では、ＣＤ４５ＲＯの陽性細胞はほとんど認められず、ＣＤ４５ＲＡの発現が強く認められた。このように、ＭＡＩＴ様細胞は、生体内ＭＡＩＴ細胞とほぼ同様の形質を呈するものの、一部異なる形質を有していることが分かった。

【0043】

また、本発明によって樹立されたＭＡＩＴ様細胞は、生体内ＭＡＩＴ細胞とほぼ同様の細胞表面抗原、遺伝子発現、サイトカイン産生能を備えており、マウスへ移入することにより、腸管や肝臓などの組織に局在し、増殖することが確認された。また、ＭＡＩＴ様細胞は、ＭＡＩＴ細胞と同様の抗菌／感染抵抗性を有することが確認された。すなわち、本発明によって樹立されたＭＡＩＴ様細胞は、生体内ＭＡＩＴ細胞と同様の機能や特性を備えていることが確認された。

【0044】

１つの態様において、本発明はＭＡＩＴ様細胞である。本発明のＭＡＩＴ様細胞は、ＭＡＩＴ細胞の機能解析を進める上で貴重な研究ツールとして使用することができる。また、本発明のＭＡＩＴ様細胞は、ＭＡＩＴ細胞の発生や分化誘導、再生、生存、増殖などを促進する新規因子または物質や薬剤を同定するためのスクリーニングに用いることができる。

【0045】

本発明のＭＡＩＴ様細胞は、薬物などの各種生理活性物質や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価および活性評価に有用である。例えば、ＭＡＩＴ細胞の機能調節に関する物質や薬剤、さらにはＭＡＩＴ細胞に対して毒性や傷害性を有する物質や薬剤のスクリーニングに利用することができる。特に現状では、ＭＡＩＴ細胞の機能解析を進めるために十分なＭＡＩＴ細胞を準備することが困難であり、ＭＡＩＴ細胞の特性が十分に解明されていないところ、本発明により調製されたＭＡＩＴ様細胞は、上述したようなスクリーニングを実施するための有用な細胞ソースとなる。また、ヒト癌や多発性硬化症巣に集積するＴｃ１７細胞（ＩＬ−１７産生能を有するＣＤ８^＋細胞）の大部分がＭＡＩＴ細胞であるとの報告もあり、ＭＡＩＴ細胞の機能を解明し創薬開発を行うことが有用である。

【0046】

さらなる態様では、本発明により調製したＭＡＩＴ様細胞を含むアッセイキットは、上記スクリーニングのために有用である。また、ＭＡＩＴ細胞の機能解析に用いるモノクローナル抗体の作製、ＭＡＩＴ細胞の増殖、活性化、成熟化を制御するアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングについても、本発明のＭＡＩＴ様細胞を用いて実施することができる。

【0047】

スクリーニングに供する被験物質としては、特に制限されないが、例えば、低分子化合物、高分子化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、ペプチド、遺伝子、ウイルス、細胞、細胞培養液、微生物培養液などが挙げられる。

【0048】

別の態様では、本発明により調製したＭＡＩＴ様細胞を使用してこれをｅｘ ｖｉｖｏで自己免疫疾患、がん、感染等の免疫異常示す患者末梢血より調製したリンパ球（単球、樹状細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞等）と共培養に付すことにより、ＭＡＩＴ様細胞あるいは患者リンパ球表面抗原プロフィールの変化あるいは／ならびに転写因子、サイトカイン／ケモカイン等の産生能変化を指標としてその病態、薬剤効果、あるいは予後の予測等の診断に応用することも可能である。

【0049】

さらに、本発明のＭＡＩＴ様細胞は、それ自体を細胞移植して細胞移植療法に使用、又は、ＭＡＩＴ様細胞を実質的な有効成分として含む細胞療法剤として投与、することができる。ＭＡＩＴ細胞は細菌感染及び真菌感染に対する抵抗性を亢進させるため、例えば、本発明のＭＡＩＴ様細胞を細胞移植または投与することによって細菌感染又は真菌感染に対する抵抗性を向上させることができる。また、ＭＡＩＴ細胞は、自己免疫疾患や癌などに関与する可能性が報告されており、例えば、本発明のＭＡＩＴ様細胞を細胞移植することによってヒト自己免疫疾患や癌を治療できる可能性がある。すなわち、１つの態様において本発明は、ＭＡＩＴ様細胞の細胞移植療法における使用、細胞移植療法用のＭＡＩＴ様細胞、ＭＡＩＴ様細胞を細胞移植することを含む療法、ＭＡＩＴ様細胞を実質的な有効成分として含む細胞療法剤などに関する。このような細胞移植療法又は細胞投与療法の対象患者は、細菌感染に対する抵抗力を向上させる必要がある患者、臓器移植治療もしくは血液幹細胞など種々の細胞移植治療を受けた患者、自己免疫疾患患者、癌患者などであるが、好ましくは、患者が保有する血液中のＭＡＩＴ細胞が標準よりも少ない及び／又はＭＡＩＴ細胞の活性が低下している、患者である。

【0050】

本発明の実施において、分子生物学や組換えＤＮＡ技術等の遺伝子工学の方法及び一般的な細胞生物学の方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な書籍を参照し得る。このような書籍としては、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第３版、２００１）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」シリーズ゛（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＆ Ｓｔｒｉｌｉｎｇ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００３）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｍａｓｔｅｒｓ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、第３版、２０００）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．＆ Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）などが挙げられ、これらは参照により本明細書に組み入れられる。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＳｉｇｍａ社やＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などの市販業者から入手可能である。

【0051】

また、ｉＰＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞の作製、継代、保存法や細胞生物学実験の一般的方法について、実施者は、当該分野の標準的な書籍を参照し得る。これらの例として、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）が挙げられ、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において参照される細胞培養、発生・細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社やＳｉｇｍａ社等の市販業者から入手可能である。

【実施例】

【0052】

以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。

【0053】

実施例１：ヒト由来ＭＡＩＴ細胞からのｉＰＳ細胞の樹立
ヒト臍帯血よりフィコールを用いて単核球細胞を調製した。この単核球細胞に、ＭＡＩＴ細胞のＴＣＲ（Ｖα７．２）を特異的に認識するモノクローナル抗体３Ｃ１０（仏・キュリー研のＯｌｉｖｉｅｒ Ｌａｎｔｚ博士の恵与、又はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社）をビオチン標識したものを混和させ、アビジン磁気ビーズを利用したＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて３Ｃ１０抗体に反応性を有する細胞をポジティブ選択することにより、ＭＡＩＴ細胞を濃縮した。この操作を、異なる３名のドナー由来の臍帯血を用いて行った結果、ＦＡＣＳ解析により３Ｃ１０陽性細胞として規定されるＭＡＩＴ細胞は、それぞれ９６％、８８％、７８％の純度であった。

【0054】

この様にして精製した２０万個の３Ｃ１０陽性細胞に、ヒトｉＰＳ細胞作製用ベクターであるＳｅＶｄｐ（ＫＯＳＭ）３０２Ｌ（産業総合研究所の中西真人博士からの恵与）を室温で２時間感染させた（ＭＯＩ＝２．５）。当該ベクターは、ヒト由来の４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃをコードする核酸）を同一ベクター内に搭載しているセンダイウイルスベクターであり、効率的なｉＰＳ細胞作製能を有する（ＷＯ２０１０／１３４５２６）。ウイルスベクターを含む溶液を遠心操作により除去し、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＭ非必須アミノ酸液、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン、及び０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ社）に４ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ：ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、Ｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を添加したＥＳ／ｉＰＳ細胞専用培地に懸濁して、マイトマイシンＣで処理したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上へ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２濃度下で共培養を行った。１２日後、ＥＳ／ｉＰＳ様の形態を呈するコロニーを回収し、２４ウェルプレートに播種したＭＥＦの上に蒔き直した。ＥＳ／ｉＰＳ細胞専用培地で培養した後、成長したコロニーを形態的に判断し、ＥＳ／ｉＰＳ細胞様の形態をとるコロニーを選抜した。

【0055】

この様にして得られたｉＰＳ細胞がヒトＭＡＩＴ細胞由来であることを確認するため、ゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｔ細胞抗原受容体α鎖（ＴＣＲα）遺伝子座がＭＡＩＴ細胞特異的な遺伝子再構成を起こしているかどうかを調べた。ここで、図１に示すように、ＭＡＩＴ細胞に特異的なＴＣＲα鎖遺伝子を有する細胞では、ＴＣＲα領域をコードする遺伝子の一方がＶα７．２−Ｊα３３に再構成することが知られている。そこで、下記に示すプライマーを用いて、各ｉＰＳ細胞クローンのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない、再構成の有無を確認した。Ｖα７．２−Ｊα３３が遺伝子再構成しているＴＣＲα鎖を有している場合、下記プライマーを用いたゲノムＰＣＲにより２８２ｂｐのバンドが増幅され、当該ＰＣＲ産物は制限酵素ＳａｃＩで消化すると１９１＋９１ｂｐのＤＮＡ断片を生じる。一方、Ｖα７．２−Ｊα３３に再構成していない場合、２８２ｂｐのバンドは増幅されない。

【0056】

以上のようにして確認した結果、３名のドナー由来細胞から、独立した３回の実験を実施することにより、ヒトＭＡＩＴ細胞に由来するｉＰＳ細胞（ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞）を５０株以上樹立することができた。

【0057】

実施例２：ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞の特性解析
実施例１で個別に樹立・単離されたＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞株である１−３Ｄ、２−５Ｄ、４−６Ｄは、ＭＥＦフィーダー上で単層かつ扁平で明確な輪郭のコロニーを呈し、一般的なヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞ときわめて良く似た形態を示した（図２Ａ）。

【0058】

また、この様に継代維持したＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞を用い、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞に特異的なマーカーの発現を調べた。固定したＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞に対し、１次抗体として抗アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体、抗Ｏｃｔ−３／４抗体、抗Ｎａｎｏｇ抗体（以上、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）、抗ＴＲＡ−１−６０抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、又は抗ＴＲＡ−１−８１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）と反応させた後、ローダミン標識２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて染色した。細胞核は４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ：４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）溶液（１μｇ／ｍＬ）で染色した。これらの抗体や色素による染色像を蛍光顕微鏡下にて観察した。その結果、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞はアルカリフォスファターゼ、ＳＳＥＡ４、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１の全てについて強陽性を示した（図２Ｂ）。

【0059】

同様にＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞のＲＮＡを調製し、未分化なヒトｉＰＳ細胞特異的な遺伝子であるＯｃｔ−３／４およびＮａｎｏｇの発現を確認した。ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞から調製した全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）を行ない、各種遺伝子断片の増幅を行なった。
Ｏｃｔ−３／４〔増幅サイズ：１４４ｂｐ〕

Ｎａｎｏｇ〔増幅サイズ：３９１ｂｐ〕

ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）〔増幅サイズ：３８２ｂｐ〕

【0060】

ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド（Ｍｅｒｃｋ社）で染色した後、ゲル撮影装置（ＡＴＴＯ社）を用いて検出した。その結果、個別に樹立・単離されたＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞株である１−３Ｄ、２−５Ｄ、４−６Ｄ、Ａ１１、Ａ１３、Ｃ４Ｂ、Ｃ５Ｂの各細胞株において、ヒトｉＰＳ細胞と同様にＯｃｔ−３／４ならびにＮａｎｏｇ遺伝子の強い発現が認められた（図３）。

【0061】

より網羅的にＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞株の遺伝子発現状況を検討するために、ＤＮＡマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）解析を行い、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞とヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞における遺伝子発現プロファイルの相関を調べた。その結果を表１に示す。表１から明らかなように、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞はヒトＥＳ細胞あるいはヒトｉＰＳ細胞ときわめて良く似た遺伝子発現パターン（全ての比較において相関係数が０．９５以上）を呈し、一方、作出の起源細胞となったヒト臍帯血由来ＭＡＩＴ細胞とは異なっていた。また、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞では、一般的なヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞と同様、Ｏｃｔ−３／４遺伝子やＮａｎｏｇ遺伝子プロモーター領域の脱メチル化や、高いテロメレース活性も確認でき、数十代以上、未分化形質を維持したまま継代培養することが可能である。

【0062】

以上の結果より、ＭＡＩＴ細胞から樹立したｉＰＳ細胞株（ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞株）が一般的なｉＰＳ細胞様の特性・機能を有していることが示される。

【0063】

【表1】

【0064】

なお、以下の実験には、上記と同様、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞として１−３Ｄ株、２−５Ｄ株、４−６Ｄ株等の複数の細胞株を用いたが、総じて細胞株の違いによる実験結果の相違はみられなかった。そのため、以下の実施例では、特に断りがない場合、１−３Ｄ株を用いた実施例データを示す。

【0065】

引き続き、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞の分化能を検討した。ＭＥＦ上で未分化な形質を保ちながら継代培養したＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞を細胞解離液（０．２５％ トリプシン、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶを含む）で処理して小塊にし、ｂＦＧＦを含まないＥＳ／ｉＰＳ細胞専用培地で懸濁した後、低接着性プレートに播種した。８日後に細胞凝集塊を回収し、それらをゼラチンで前処理した細胞接着性プレートに播種し、１６日後に固定した。固定した細胞は１次抗体として抗筋性アクチン抗体（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）や抗Ｓｏｘ−１７抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社）、抗ネスチン抗体（Ｓｉｇｍａ社）と反応させた後、上記の方法と同様に染色ならびに蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞を分化誘導したものから、本条件下において筋性アクチン陽性の中胚葉細胞やＳｏｘ−１７陽性の内胚葉性細胞、ネスチン陽性の外胚葉性細胞の出現が確認できた。

【0066】

また、８×１０^６〜１０×１０^６個のＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞をＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）の皮下に移植したところ、１０〜１４週後に奇形腫（ｔｅｒａｔｏｍａ）の形成が見られた。各腫瘍のパラフィン包埋標本から組織切片を作製し、１次抗体として抗汎サイトケラチン抗体（ＤＡＫＯ社）又は抗デスミン抗体（ＤＡＫＯ社）と反応させた後、ビオチン標識２次抗体（ＤＡＫＯ社）と反応させ、最後にジアミノベンチジンを用いた呈色反応を行った。ヘマトキシリン液で染色後、光学顕微鏡下にて観察を行ったところ、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞由来腫瘍内には、メラニン陽性細胞を含む神経管様構造やサイトケラチン陽性細胞で構成される腸管様構造、さらにはデスミン陽性の筋細胞様組織の存在が認められた（図４）。

【0067】

以上の結果より、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞は一般的なヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞と同様、未分化状態特異的なマーカー遺伝子ならびに蛋白を発現し、三胚葉への分化多能性を有した細胞であることが確認できた。

【0068】

実施例３：ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞からのＭＡＩＴ細胞作製
ＥＳ細胞等の幹細胞は、ＯＰ９細胞をフィーダー細胞とした共培養により、ＣＤ３４陽性の血球／リンパ球前駆細胞に分化誘導することができ、さらにＮｏｔｃｈリガンドであるＤＬＬ１を強制発現したＯＰ９細胞（ＯＰ９／ＤＬＬ１）と共培養することにより、Ｔ細胞系列の細胞に分化誘導させることができることが知られている（Ｓｃｈｍｉｔｔ ＴＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．５，４１０−４１７（２００４）；Ｗａｋａｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２２，２２２３−２２３１（２００８）；Ｗａｋａｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２００８／０３８５７９；Ｗａｔａｒａｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０，２６１０−２６１８（２０１０）；ＷＯ２０１０／０２７０９４；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２，６８７９−６８８８（２０１１））。

【0069】

本実施例では、当該方法に基き、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞からＭＡＩＴ細胞への分化誘導を試みた。

【0070】

ＯＰ９細胞及びＯＰ９／ＤＬＬ１細胞は、理化学研究所バイオリソースセンター（Ｒｉｋｅｎ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）より購入したものを使用した。まず、コンフルエントにして３〜７日後のＯＰ９細胞上に、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞のコロニーを１００個程度の小塊に分散したものを、１０ｃｍディッシュ辺り１×１０^６個播種し、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）および０．１ｍＭ １−ｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌを含むαＭＥＭ培地中で培養し、血球及びリンパ球系の幹・前駆細胞に分化誘導した。播種後１１〜１２日目にコロニー状に形成された細胞集塊をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄後、１ｍｇ／ｍＬのｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むαＭＥＭ培地および０．０１％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社）を加えてよく攪拌し、単一細胞に分散させた。この細胞集団をＣＤ３４ ＭｕｌｔｉＳｏｒｔ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いてＣＤ３４陽性細胞分画（純度９５％以上）を調製・回収した後、２０％ＦＢＳ、ヒトＳＣＦ（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）、ヒト・インターロイキン７（ＩＬ−７）、ヒトＦｌｔ３リガンド（ＦＬ）（全てＲｅｐｒｏｔｅｃｈ社、各５ｎｇ／ｍＬ）を含むαＭＥＭ培地（以下、ＭＡＩＴ細胞分化誘導培地）に懸濁し、事前に２４穴細胞培養プレートに播種し、コンフルエントにして３〜７日後のＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。ＭＡＩＴ細胞分化誘導培地を４日ごとに半量ずつ交換し、培養を１４〜３０日間継続した後、細胞をピペッティング操作によりフィーダー細胞から分離させ、回収した。

【0071】

この様にしてＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞から分化させた細胞の形質を、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ＦＣＭ）法で、抗ＴＣＲ Ｖα７．２抗体（３Ｃ１０）、抗ＴＣＲαβ抗体（ＩＰ２６；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗ＣＤ１６１抗体（ＤＸ１２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び抗ＩＬ−１８Ｒα抗体（Ｈ４４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）に対する反応性を指標に検討した。その結果を図５に示す。

【0072】

まず、上記の方法により調製したＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞に由来する分化細胞（ＯＰ９／ＤＬＬ１細胞に播種して３０日目）を、上記４種の抗体で染色したところ、そのほとんど全ての細胞がＴＣＲ Ｖα７．２^＋／ＴＣＲαβ^＋となった（以下、ＴＣＲ Ｖα７．２^＋を３Ｃ１０抗原陽性：３Ｃ１０^＋と記載する）。また、この共陽性画分の細胞は、同時にそのほとんど全てがＣＤ１６１^＋およびＩＬ−１８Ｒα^＋であり、ＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞からＭＡＩＴ様細胞を分化誘導できることが示された。

【0073】

このＭＡＩＴ様細胞は本方法により再現性良く、また高率で作製することができ、複数回の検討において３Ｃ１０^＋／ＴＣＲαβ^＋／ＣＤ１６１^＋／ＩＬ−１８Ｒα^＋で規定されるＭＡＩＴ様細胞は、常に全体の８５％以上を占めることが確認できた。

【0074】

以下、本方法によりＭＡＩＴ−ｉＰＳ細胞から分化誘導されたＭＡＩＴ様細胞をｉＭＡＩＴ細胞と称する。

【0075】

実施例４：ｉＭＡＩＴ細胞の特性解析
Ｌａｎｔｚらの一連の報告（Ｄｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１１）によると、生体内、特に末梢血に存在するＭＡＩＴ細胞は、ＴＣＲ Ｖα７．２、ＣＤ１６１、ＩＬ−１８Ｒα以外にＣＤ２６（ＤＰＰ−ＩＶ）やＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒα）、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４）といった細胞表面マーカーが陽性であることが知られている。そこで上述の方法に基づき、ｉＭＡＩＴ細胞における、これらマーカーに特異的な抗体に対する反応性を調べた。

【0076】

陽性対照として、ヒト末梢血単核球細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）より上記の方法と同様に３Ｃ１０^＋／ＴＣＲαβ^＋／ＣＤ１６１^＋画分細胞を調製し、当該細胞をヒト末梢血由来ＭＡＩＴ細胞（以下、ＰＢＭＣ−ＭＡＩＴ細胞）として用いた。

【0077】

【表2】

【0078】

表２に結果を示す。ＰＢＭＣ−ＭＡＩＴ細胞では、既報の通り、ＣＤ２６やＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ２４４の発現が認められた。ｉＭＡＩＴ細胞においても、発現に若干の強弱があるものの、これら全てのマーカーの発現を確認することができた（図６、表２）。

【0079】

また、ＰＢＭＣ−ＭＡＩＴ細胞はＣＣＲ５やＣＣＲ６といったケモカイン受容体を強く発現する一方、ＣＣＲ７の発現が陰性であることが知られている（Ｄｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。そこで、ＰＢＭＣ−ＭＡＩＴ細胞とｉＭＡＩＴ細胞における、これらケモカイン受容体の発現を上述の方法と同様に検討したところ、ｉＭＡＩＴ細胞では、ＰＢＭＣ−ＭＡＩＴ細胞と同様、ＣＣＲ５とＣＣＲ６の強い発現が認められた。一方、ＣＣＲ７は弱いながらも発現が確認され、ＰＢＭＣ−ＭＡＩＴ細胞とは異なる特性を呈した（表２）。

【0080】

さらに、ＰＢＭＣ−ＭＡＩＴ細胞は一般的にエフェクターメモリー型Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ４５ＲＯの発現が陽性であり、ナイーブ型Ｔ細胞（抗原刺激を受ける前のＴ細胞）のマーカーとして知られるＣＤ４５ＲＡの発現は陰性又はごく一部の細胞でのみ陽性であるが、ｉＭＡＩＴ細胞ではＣＤ４５ＲＡの発現が強く認められ、ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞はほとんど認められなかった（図６、表２）。

【0081】

以上の結果より、ｉＭＡＩＴ細胞はＰＢＭＣ−ＭＡＩＴ細胞とほぼ同様の形質を呈することが強く示された一方、ＣＤ４５ＲＡやＣＣＲ７の発現で規定されるナイーブ型Ｔ細胞としての特性を保持しており、ＰＢＭＣ−ＭＡＩＴとは一部異なる形質を有していることが明らかになった。

【0082】

実施例５：ｉＭＡＩＴ細胞のサイトカイン産生能確認
ＭＡＩＴ細胞の特徴として、ＣＤ３／ＴＣＲとＣＤ２８への共刺激シグナル（以下、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激）、又はホルボール１２−ミリスタート１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ：ＰＭＡ）とイオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）による刺激（以下、ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ刺激）によりインターフェロン（ＩＦＮ）γ等のサイトカインを産生することが知られている（Ｄｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。そこで、実施例２、３記載の方法に基づき作製したｉＭＡＩＴ細胞を、抗ＣＤ３抗体並びに抗ＣＤ２８抗体でコートされた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混和培養してＣＤ３／ＣＤ２８刺激を４８時間、行った。また、同様にｉＭＡＩＴ細胞培養系にＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ；和光純薬社）とＩｏｎｏｍｙｃｉｎ（１μＭ；和光純薬社）を添加してＰＭＡ／Ｉｏｎｏ刺激を４８時間行った。

【0083】

その後、培地上清を回収し、各種サイトカインの量をＢｉｏｐｌｅｘ Ｐｒｏ−Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２１−ｐｌｅｘ ＡｓｓａｙおよびＰｒｏ−Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２７−ｐｌｅｘ Ａｓｓａｙシステム（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて測定した。その結果、ｉＭＡＩＴ細胞は未刺激状態ではＩＦＮγを産生していなかったが、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激又はＰＭＡ／Ｉｏｎｏ刺激を与えたところ、著明に高いＩＦＮγの産生が認められた（図７）。また、その他のサイトカイン産生能も調べたところ、ｉＭＡＩＴ細胞は未刺激状態ではＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−αの産生がみられなかったが、ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ刺激により明らかな産生亢進効果が認められた。一方、ＩＬ−４やＩＬ−１０の産生はみられず、以上の結果はＰＢＭＣ−ＭＡＩＴ細胞とよく似た傾向を示していた。

【0084】

また、ＭＡＩＴ細胞は、細菌を貪食させたモノサイトと共培養することにより、インターフェロン（ＩＦＮ）γ等のサイトカインを産生することが知られている。そこで、同様の系を用いてｉＭＡＩＴ細胞のサイトカイン産生能を検討した。ヒト末梢血由来単核球細胞（１×１０^６個／ｍＬ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を細胞培養用９６穴プレートに１×１０^５個ずつ播種し、１時間放置した後、底面に付着性細胞として残る細胞（約１×１０^４個）をモノサイトとして使用した。無血清・無添加のＤＭＥＭ培地中の付着性細胞に対して大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；多重感染度ＭＯＩ＝１００）を３時間感染させた。その後、１０％ＦＢＳ及びペニシリン・ストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭで洗浄・置換し、そこに実施例３、４と同様の方法で調製したｉＭＡＩＴ細胞を２×１０^４個ずつ播種した。４８時間共培養を行った後、培地の上清を回収し、各種サイトカインの量を測定した。その結果、当該共培養系においても、ＩＦＮγやＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−αといったサイトカインの産生量増大が確認できた。

【0085】

実施例６：マウス体内におけるｉＭＡＩＴ細胞の定着と感染防御効果の検討
ｉＭＡＩＴ細胞が動物体内で、通常のＭＡＩＴ細胞と同様の挙動を取り得るかを確認するため、事前に３２０ｃＧｙの放射線照射を行った８〜１０週齢のＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社）に、実施例３で作製したｉＭＡＩＴ細胞（５×１０^４個／匹）を経静脈投与により注入移植した。６〜１０週後に安楽的に屠殺した後、骨髄や肝臓、脾臓、小腸上皮や粘膜固有層を摘出した。次に、当該臓器よりリンパ球を回収し、実施例３と同様のＦＣＭ法を用いて、リンパ球中のｉＭＡＩＴ細胞、即ち３Ｃ１０^＋／ＴＣＲαβ^＋細胞の存在を調べた。

【0086】

その結果、調べた全ての臓器においてｉＭＡＩＴ細胞の存在が確認され、特に小腸粘膜固有層に高率に集積していることが示された（図８）。また、小腸粘膜固有層で検出されたｉＭＡＩＴ細胞数が、移入した細胞数の少なくとも１００倍を超えている例が確認され、ｉＭＡＩＴ細胞がマウス体内環境下で増殖していることが示唆された。

【0087】

ＭＡＩＴ細胞は、結核菌等の細菌に感染した細胞と反応し、感染防御の機能を有することが知られている。ｉＭＡＩＴ細胞は、感染防御の際に重要な役割を担うＩＦＮγやＩＬ−１７、ＩＬ−２を産生するとともに（実施例５参照）、これらサイトカインと同様、細胞傷害性を誘起する上で中心的な役割を担うパーフォリンおよびグランザイムも産生している（データ示さず）。そこで、ｉＭＡＩＴ細胞が、実際に細菌感染に対する防御効果を示すか否かを検討した。

【0088】

ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ １ Ｓｕｇ／Ｊｉｃ）マウス（実験動物中央研究所）に、実施例３の方法に基づいて作製したｉＭＡＩＴ細胞（５×１０^４個／匹）を経静脈投与により注入移植した。その５週間後、非結核性抗酸菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）を１．０×１０^６ＣＦＵ／匹で接種した。その２週間後に安楽的に屠殺して肝臓と脾臓を摘出し、当該臓器内で生存するＭ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ菌の数（コロニー形成能）を調べた。

【0089】

結果を図９に示すが、ｉＭＡＩＴ細胞を移入しなかった群であるｉＭＡＩＴ（−）と比較して、ｉＭＡＩＴ細胞を移入した群であるｉＭＡＩＴ（＋）では肝臓における生菌（形成コロニー）数が有意に低減しており、脾臓においても同様の傾向が認められた。

【0090】

以上の実験結果は、動物体内において、ｉＭＡＩＴ細胞はＭＡＩＴ細胞と同等の機能や効果を呈することを明らかに示すものである。
［配列表］

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】