特許 6290076 ＤＯＴＡＰ塩化物の安定な結晶改質物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6290076

(24)【登録日】2018年2月16日

(45)【発行日】2018年3月7日

(54)【発明の名称】ＤＯＴＡＰ塩化物の安定な結晶改質物

(51)【国際特許分類】

   C07C 219/08 20060101AFI20180226BHJP

   A61K 8/14 20060101ALI20180226BHJP

   A61K 8/41 20060101ALI20180226BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20180226BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20180226BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20180226BHJP

   A61Q 17/04 20060101ALI20180226BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20180226BHJP

   C07C 213/10 20060101ALI20180226BHJP

【ＦＩ】

   C07C219/08CSP

   A61K8/14

   A61K8/41

   A61K9/127

   A61K9/50

   A61K47/18

   A61Q17/04

   A61Q19/00

   C07C213/10

【請求項の数】19

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2014-511756(P2014-511756)

(86)(22)【出願日】2012年5月2日

(65)【公表番号】特表2014-520085(P2014-520085A)

(43)【公表日】2014年8月21日

(86)【国際出願番号】EP2012001882

(87)【国際公開番号】WO2012159704

(87)【国際公開日】20121129

【審査請求日】2015年5月1日

【審判番号】不服2016-18061(P2016-18061/J1)

【審判請求日】2016年12月2日

(31)【優先権主張番号】61/488,428

(32)【優先日】2011年5月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591032596

【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】プラッチャー、 ミカエル ヴィルヘルム

(72)【発明者】

【氏名】ヘディンガー、 アルフレド

【合議体】

【審判長】 守安 智

【審判官】 冨永 保

【審判官】 榎本 佳予子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５２１７５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平５−５０８６２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／０４９５４９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C07D,A61K

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶であって、
（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶は、以下の特徴のうちの１つを有し：
Ｘ線粉末回折パターンのピーク位置として測定される、１２．８°、１９．５°、１９．８°、２０．２°及び２１．６°の値を含む２θ値（波長λ＝１．５４０６０ÅのＣｕ−Ｋα放射線を使用して測定される２θ、±０．１°）；又は
Ｘ線粉末回折パターンのピーク位置として測定される、６．５°、１２．８°、１９．５°、１９．８°、２０．２°、２０．７°、２１．６°及び２５．３°の値を含む２θ値（波長λ＝１．５４０６０ÅのＣｕ−Ｋα放射線を使用して測定される２θ、±０．１°）；
前記（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶中の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の含有量は、９９質量％以上である
ことを特徴とする、（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶。

【請求項2】

（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶であって、
（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶は、以下の特徴のうちの１つを有し：
Ｘ線粉末回折パターンのピーク位置として測定される、１２．８°、１９．５°、１９．８°、２０．３°及び２１．６°の値を含む２θ値（波長λ＝１．５４０６０ÅのＣｕ−Ｋα放射線を使用して測定される２θ、±０．１°）；又は
Ｘ線粉末回折パターンのピーク位置として測定される、６．６°、１２．８°、１９．５°、１９．８°、２０．３°、２０．８°、２１．６°及び２５．３°の値を含む２θ値（波長λ＝１．５４０６０ÅのＣｕ−Ｋα放射線を使用して測定される２θ、±０．１°）；
前記（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶中の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の含有量は、９９質量％以上である
ことを特徴とする、結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶。

【請求項3】

２５℃、相対湿度６０％で３６ヶ月間、保存した時に、質量基準及びＨＰＬＣにより測定した面積％基準にて、９９％より高い安定性を有する
ことを特徴とする、請求項１に記載の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶。

【請求項4】

２５℃、相対湿度６０％で３６ヶ月間、保存した時に、質量基準及びＨＰＬＣにより測定した面積％基準にて、９９％より高い安定性を有する
ことを特徴とする、請求項２に記載の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶。

【請求項5】

ＨＰＬＣによって測定される面積％基準にて、少なくとも９９％の化学的純度を有する
ことを特徴とする、請求項１または３に記載の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶。

【請求項6】

ＨＰＬＣによって測定される面積％基準にて、少なくとも９９％の化学的純度を有する
ことを特徴とする、請求項２または４に記載の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶。

【請求項7】

前記（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶は、鏡像異性的に純粋な（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶であり；
１６０℃よりも高い融点及び１３０Ｊ／ｇを超える融解エンタルピーを有する
ことを特徴とする、請求項１、３、５のいずれか一項に記載の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶。

【請求項8】

前記（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶は、鏡像異性的に純粋な（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶であり；
１６０℃よりも高い融点及び１３０Ｊ／ｇを超える融解エンタルピーを有する
ことを特徴とする、請求項２、４、６のいずれか一項に記載の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶。

【請求項9】

請求項１、３、５、７のいずれか一項に記載の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項10】

請求項２、４、６、８のいずれか一項に記載の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項11】

さらに、ペプチド、ヌクレオチド、抗原、細胞増殖抑制剤、リポソーム、リポプレックス、ナノ粒子又はマイクロエマルションの１種又はそれ以上、またはそれらの混合物を含む
ことを特徴とする、請求項９または１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

請求項１、３、５、７のいずれか一項に記載の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶を製造する方法であって、
該方法は、
アセトンと２−プロパノールの混合物中の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の調製された溶液を、毎分０．００１℃〜０．１℃の速度で５〜２００時間、−１２℃までゆっくりと冷却することで、アセトンと２−プロパノールの混合物中から（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を結晶化する工程、
その際、前記調製された溶液の温度は、２５℃〜３５℃の範囲に選択され、
前記調製された溶液は、１部の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物：４部の溶媒〜１部の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物：１００部の溶媒までの濃度の範囲で、アセトンと２−プロパノールの混合物中溶解された（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を含んでいる；
得られた結晶質（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を、アセトンと２−プロパノールの混合物中に溶解して調製された溶液を、毎分０．００１℃〜０．１℃の速度で５〜２００時間、−１２℃までゆっくりと冷却することで、アセトンと２−プロパノールの混合物中から、該得られた結晶質（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を再結晶化する工程、
その際、前記調製された溶液の温度は、２５℃〜３５℃の範囲に選択され、
前記調製された溶液は、１部の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物：４部の溶媒〜１部の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物：１００部の溶媒までの濃度の範囲で、アセトンと２−プロパノールの混合物中溶解された（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を含んでいる；
前記アセトンと２−プロパノールの混合物は、０質量％を超え、２５質量％を超えない範囲で２−プロパノールを含んでいる
ことを特徴とする、結晶の製造方法。

【請求項13】

請求項２、４、６、８のいずれか一項に記載の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶を製造する方法であって、
該方法は、
アセトンと２−プロパノールの混合物中の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の調製された溶液を、毎分０．００１℃〜０．１℃の速度で５〜２００時間、−１２℃までゆっくりと冷却することで、アセトンと２−プロパノールの混合物中から（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を結晶化する工程、
その際、前記調製された溶液の温度は、２５℃〜３５℃の範囲に選択され、
前記調製された溶液は、１部の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物：４部の溶媒〜１部の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物：１００部の溶媒までの濃度の範囲で、アセトンと２−プロパノールの混合物中溶解された（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を含んでいる；
得られた結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を、アセトンと２−プロパノールの混合物中に溶解して調製された溶液を、毎分０．００１℃〜０．１℃の速度で５〜２００時間、−１２℃までゆっくりと冷却することで、アセトンと２−プロパノールの混合物中から、該得られた結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を再結晶化する工程、
その際、前記調製された溶液の温度は、２５℃〜３５℃の範囲に選択され、
前記調製された溶液は、１部の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物：４部の溶媒〜１部の（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物：１００部の溶媒までの濃度の範囲で、アセトンと２−プロパノールの混合物中溶解された（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を含んでいる；
前記アセトンと２−プロパノールの混合物は、０質量％を超え、２５質量％を超えない範囲で２−プロパノールを含んでいる
ことを特徴とする、結晶の製造方法。

【請求項14】

前記結晶化工程で使用される、アセトンと２−プロパノールの混合物中に、１０〜２０質量％の含有量で、２−プロパノールが含まれている
ことを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

前記結晶化工程、ならびに、再結晶化工程は、不活性雰囲気下で行われる
ことを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

結晶化が毎分０．００４℃〜０．０５℃の速度で１０〜５０時間、徐冷することによって行われる
ことを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記徐冷は、１０〜１００時間の期間である
ことを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記結晶化工程は、先行精製することなく、（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物または（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の製造工程からの反応溶液から直接実施され、
前記結晶化工程は、２５℃から、−１２℃までゆっくりと冷却することで行われる
ことを特徴とする、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

結晶化工程で得られる、結晶質（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物または結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の再結晶化工程は、２５℃から、−１２℃までゆっくりと冷却することで行われる
ことを特徴とする、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ラセミ体、鏡像異性的に純粋なＤＯＴＡＰ塩化物の結晶改質物、その製造方法、及び医薬組成物の調製のためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶形及び対応する医薬組成物は、ＤＯＴＡＰ塩化物の非結晶形のものと同じ周知の用途を有する。

【0003】

上記及び下記のＤＯＴＡＰ塩化物とは、（Ｚ，Ｚ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２，３−ビス［（−１−オキソ−９−オクタデセニル）オキシ］−１−プロパンアミニウムクロライド又は１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパンクロライドとしても知られている、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２，３−ビス［［（９Ｚ）−１−オキソ−９−オクタデセニル］オキシ］−１−プロパンアミニウムクロライドのラセミ（２Ｒ，Ｓ）−形又は異性体的にそれぞれ純粋な（２Ｒ）−若しくは（２Ｓ）−形、及びその水和物を示す。

【0004】

【化1】

【0005】

ＣＡＳ番号：１３２１７２−６１−３及び４７７２７４−３２−８（ラセミ体）
１９７９７４−７３−５８（ラセミ体、一水和物）
４２８５０６−５１−８（２Ｓ形態）、３２８２５０−２８−８（２Ｒ形態）。

【0006】

ＤＯＴＡＰは、とりわけリポソーム及び他の脂質小胞集合体を構築することができる。リポソームは、親水性物質を水性の内部に封入することができ、また親油性物質を脂質膜の内部に組み込むことができる両親媒性の物質で、通常、天然脂質を含む合成多層小胞（球状で自己内蔵型の膜）である。

【0007】

それらは、特に化粧品や薬品、なかでも皮膚科において用いられる。この点で、特にビタミン、補酵素、スキンケア剤及び日焼け止めが組み込まれている。リポソームは、一般に、局所的に適用される。

【0008】

さらに、リポソームの非経口適用は、活性化合物が自由に溶解された形で使用されている場合よりも、より特徴的な器官分配を達成可能にするので、リポソームは製薬技術におけるさらなる重要性をますます博している。

【0009】

ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質がリポソーム及び他の脂質小胞集合体に組み込まれる場合、リポプレックスが得られる。

【0010】

油類の添加及び高圧ホモジナイザーの使用は、リポソームから、強化された、いわゆるナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｓ）の形成を可能にする。これらは、リポソームとほぼ同じ大きさの粒子であるが、水相を有さず、その代わりに、その内部に油相を有するものである。それらは、親油性物質のカプセル化に特に適している。

【0011】

マイクロエマルションは、水性、脂質様及び界面活性な成分を含むコロイド分散単相系である。それらは、１〜５００ｎｍの粒径を有し、液体と同様に振る舞う。

【0012】

特に、通常は難溶性を有する、ペプチド性活性化合物、ヌクレオチド、ワクチン及び他のバイオ医薬品に関連して、可溶化効果は、前述の用途の場合に非常に大きな重要性を有する。

【0013】

また、体内での活性化合物の分解を遅くすることができ、こうして持続する徐放効果を達成することができる。

【0014】

ＤＯＴＡＰ塩化物は、カチオン性脂質の部類に属する。天然由来のリン脂質とは対照的に、これらは、両性イオン特性を有していない。カチオン性脂質を単独で、又はリン脂質または他の脂質様化合物との組み合わせで含むリポソームは、正に帯電した表面を有する。これは、外側に負に帯電した表面を有する細胞、例えば、内皮細胞に対して高い親和性を生じさせる。

【0015】

特に重要なことは、しかしながら、細胞内に浸透する、つまり、組み込まれた活性化合物を細胞の内部に輸送（形質移入：transfection）するＤＯＴＡＰベースの及び他のカチオン性のリポソーム及びリポプレックスの能力である。

【0016】

すべてのこれらの特性は、殊更、ＤＯＴＡＰ塩化物を癌治療のために非常に興味深いものとする。これらの特性は、カチオン性ＤＯＴＡＰリポソームに組み込まれた従来の細胞増殖抑制剤の適用の可能性を生じさせる。

【0017】

ＤＯＴＡＰ塩化物並びに、酢酸塩、臭化物、リン酸二水素物、硫酸水素塩、ヨウ化物、メシル酸塩、メチル硫酸塩、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩または二硫酸塩及びトリフレートなどの他のＤＯＴＡＰ塩類の形質移入特性は、文献から十分に公知である。

【0018】

いくつかのインビトロ研究では、例えば、ＤＯＴＡＰメチル硫酸塩などの他の塩類は、ＤＯＴＡＰ塩化物よりも優れた形質移入率を達成している。

【0019】

しかしながら、インビボで使用すると、リポソーム表面でのアニオン交換が生体内で起き、他の塩の長所がここでは発現しないことを意味している。特にヒトにおける医療用途、中でも非経口応用のために、例えば、生理学的に許容されるアニオンとのＤＯＴＡＰの塩、例えば、相当する塩化物または酢酸塩は、それ故好ましい。

【0020】

医療、特に非経口応用は、使用される活性化合物及びアジュバント（adjuvants）の品質と純度の最大要求を生じさせる。そのため、これら化合物の調製、調製の再現性及び副生物プロファイルに関して、当局側に非常に厳しい規制がある。非経口的に使用される物質の場合には、病原性微生物及びエンドトキシンによる微生物汚染は、さらに、厳密に回避され、制御されなければならない。

【0021】

ＤＯＴＡＰ塩化物及びその他のＤＯＴＡＰ塩の現在入手可能な非晶質形態は極めて不安定であり、それらが医薬製剤の製造のための使用に適するように、それ自体を許容される純度で調製することは困難である。

【0022】

例えば、天然のリン脂質ＤＯＰＣとＤＯＰＥ等のオレイン酸基を持つすべての脂質のように、すべてのＤＯＴＡＰ塩は、酸化に対して非常に敏感であり、不飽和脂肪酸誘導体の酸化生成物は、一般に、高い毒性を有する。

【0023】

適した調製、精製及び安定化方法が、ここで必要とされる。ＤＯＴＡＰ酢酸塩は、例えば、高沸点油状形態であり、それ故工業的には、適切な品質は大きな困難を伴ってのみ得ることができる。

【0024】

例えば、アスコルビン酸や還元Ｌ−グルタチオンの形態の酸化防止剤の添加のような不安定性を克服する従来の方法は、後から投入されるべき活性化合物との相互作用を除外できないことからＤＯＴＡＰ塩化物の一般的な使い勝手を大いに制限する。製造、保存及び使用中の酸素の完全排除は、事実上不可能であるか、極めて多大な努力によってのみ可能性が高められる。

【0025】

ＤＯＴＡＰ塩化物は、クロロホルム溶液又は非晶質の固体として市販されている。

【0026】

その酸化感受性に加え、非晶質のＤＯＴＡＰ塩化物は、また、非常に吸湿性であり通常の大気湿度レベルで極めて短時間にグリース状の膜を与えるように潮解する。これは、この化合物の取り扱い性を遙かに困難なものとしている。

【0027】

技術的にＤＯＴＡＰ塩化物の現在入手可能な非晶質形の処理は、それ故、積極的な保護措置下でのみ可能である。つまり、非晶質ＤＯＴＡＰ塩化物の製造者は一般的に−２０℃で保護ガス下に保存することを勧めており、約六ヶ月の貯蔵寿命を保証しているに過ぎない。

【0028】

アイベル（Eibel）及びウンガー（Unger）は、ＤＥ４０１３６３２Ａ１に、ＤＯＴＡＰ臭化物からクロロホルム／メタノール／ＨＣｌ水溶液の溶媒系でのイオン交換、それに続くクロマトグラフィーを用いた精製による（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の合成を概説している。ＤＯＴＡＰ臭化物は、１−ブロモ−２，３−ジオレオイルオキシプロパンからインサイチュで予め得られる。

【0029】

レヴェンティス（Leventis）及びシルビウス（Silvius）は、Biochim. Biophys. Acta, 1023(1990) 124-132に、二相溶媒／ＮａＣｌ溶液系でイオン交換によるＤＯＴＡＰヨウ化物からの（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の合成を報告している。ＤＯＴＡＰヨウ化物は、対応するジメチルアミノ化合物のヨウ化メチルを用いたメチル化によって予め得られる。

【0030】

ナンツ（Nantz）らは、Biochim. Biophys. Acta, 1299 (1996) 281-283、J. Med. Chem. 40(1997)4069-4078に、非水性イオン交換クロマトグラフィーによる（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の合成を記載している。所望の化合物は溶離液の蒸発によって得られる。

【0031】

フェルグナーら（Felgner et al）は、米国特許５，２６４，６１８にて、塩化メチルを用いて直接（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物への対応するジメチルアミノ化合物のメチル化を実施している。彼らは明らかに−２０℃でアセトニトリルからの結晶化により黄色ワックスを得ている。しかしながら、（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物は、室温でアセトニトリルに事実上不溶である。このいわゆる結晶化の再現の試みは、熱溶液からの冷却により得られた油状物の凝固を介して非晶質材料のみを与えた。これが結晶化ではないという事実は、また、著者らが明らかに精製効果に達しておらず、クロマトグラフィーにより物質を精製する必要があるという事実から明らかである。また、フェルグナーらが、結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物に達しないことを実証している比較例を参照されたい。

【0032】

特に、化合物が非経口用途に意図されている場合、イオン交換樹脂で処理することを含む製造は、相当する交換樹脂がバクテリアにとって最適な栄養培地であり、それらが殺菌された後でもエンドトキシンによる汚染危機が依然として残ることから、考え得る微生物汚染の点から非常に問題である。

【0033】

ＷＯ ２００６／０５６３１２ Ａ１は、鏡像異性的に純粋なＤＯＴＡＰ塩化物について開示している。結晶化のための詳細なプロセスは開示されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0034】

【特許文献1】ＤＥ４０１３６３２Ａ１

【特許文献2】米国特許５２６４６１８

【特許文献3】ＷＯ ２００６／０５６３１２ Ａ１

【非特許文献】

【0035】

【非特許文献1】Biochim. Biophys. Acta, 1023 (1990) 124-132

【非特許文献2】Biochim. Biophys. Acta, 1299 (1996) 281-283

【非特許文献3】J. Med. Chem. 40 (1997) 4069-4078

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0036】

本発明の目的は、結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物塩及び水和物を、高純度に、十分な化学的及び物理的安定性を伴って提供することである。本発明のさらなる目的は、それらを医薬製剤の調製のために使用されることを可能にする長期貯蔵寿命を伴ってこれらの結晶質の塩を提供することである。工業的規模で実施できるＤＯＴＡＰ塩化物塩及び水和物の安定形態を再現可能な製造方法の大きな需要が引き続き存在する。

【課題を解決するための手段】

【0037】

鏡像異性的に純粋なＤＯＴＡＰ塩化物は、ラセミ体について記載された方法と同様に、鏡像異性的に純粋な出発物質から、すなわち、
（Ｒ）−または（Ｓ）−１−クロロ−２，３−ジオレオイルオキシプロパンを介して、
（Ｒ）−または（Ｓ）−１−ＬＧ−２，３−ジオレオイルオキシプロパン及びイオン交換を介して（ＬＧ＝脱離基）、又は
（Ｒ）−または（Ｓ）−１−ジメチルアミノ−２，３−ジオレオイルオキシプロパンを介して得ることができる。ＷＯ ２００６／０５６３１２を参照されたい。

【0038】

挙げることのできるさらなる製造方法は、ラセミ体ＤＯＴＡＰ塩化物のラセミ分割である。

【0039】

従って、本発明は、ラセミ体及び鏡像異性的に純粋なＤＯＴＡＰ塩化物の安定な結晶改質物に関する。

【発明の効果】

【0040】

実験によって、驚くべきことに、ラセミ体及び鏡像異性的に純粋な結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物は、高い化学純度、優れた安定性、及びかなりの技術的規模でこれらの化合物を処理するための適切な取り扱い性をもって単純な方法で得られることが見出された。この方法で得られた結晶製品は、保護ガス下、室温で実質的に制限のない安定性を有する。それらは、薬剤形態の調製のための成分として、または出発物質としても好適である。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】図１は、結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物のＸ線スペクトルを示す。

【図2】図２は、結晶質（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物のＸ線スペクトルを示す。

【図3】図３は、結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物のＸ線スペクトルを示す。

【図4】図４は、非晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物のＸ線スペクトルを示す。

【図5】図５は、結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（ａ）、結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（ｂ）、結晶質（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（ｃ）のＸ線スペクトルを、（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の市販サンプル（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）（ｄ）と比較して示す。

【図6】図６は、フェルグナーらと同様に冷却した場合のアセトニトリル中の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物エマルション（ＳＭ−０３１８−Ｅ）を示す。

【図7】図７は、フェルグナーらと同様に−２０℃に冷却した後のアセトニトリル中の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物エマルション（ＳＭ−０３１８−Ｅ）を示す。

【図8】図８は、フェルグナーらと同様に冷却する前のアセトニトリル中の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物エマルション（ＳＭ−０３６４−Ｅ）を示す。

【図9】図９は、フェルグナーらと同様に−２０℃に冷却した後のアセトニトリル中の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物エマルション（ＳＭ−０３６４−Ｅ）を示す。

【図10】図１０は、ラセミ結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を示す。

【図11】図１１は、純粋な結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物と純粋な結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物並びに両方の結晶形の２つの混合物の相転移温度及び融点を示す。

【図12】図１２は、（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（上部）と（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（下部）のＤＶＳ曲線であり、非晶質形態：右の図及び結晶形態（左の図）を示す（特性評価例５を参照）。

【発明を実施するための形態】

【0042】

安定な結晶改質物は、結晶形及び部分的に結晶形であり得る。それらは、従来到達していない、少なくとも約９５％、好ましくは＞９８％の純度を有する。また、（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物は、従来到達していない、２５℃で３６ヶ月間又は４０℃で１２ヶ月間保存した時に、開始値に関連して質量基準及びＨＰＬＣにより測定した面積％基準で９９％より高い安定性を有する（これに関しては、表１及び表１ａを参照）。

【0043】

当業者であれば、ＤＯＴＡＰ塩化物の純度と成分を決定するために適したＨＰＬＣ法を準備することが可能である。例えば、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３カラム（１５０×３ ｍｍ、３μｍ）（ＧＩサイエンス社製）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣはその装置として使用することができる。典型的な溶離液は、Ｈ_３ＰＯ_４水溶液（０．０８５％）中の１０ｍＭのペンタンスルホン酸ナトリウム塩（溶離液Ａ）及びＨ_３ＰＯ_４水溶液（０．０８５％）を含む９４％アセトニトリル中の３．８５ ｍＭのペンタンスルホン酸ナトリウム塩（溶離液Ｂ）である。適切なグラジエントは以下の通り（走査時間２５分、ポスト時間５分；流速：１．５ｍｌ／分；２２０バール；５０℃；注入量；１０μｌ）：

【0044】

【表1】

【0045】

ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶改質物は、ＤＯＴＡＰ塩化物当量あたり１当量未満の結晶水又は結晶溶媒の含量を有する。

【0046】

結晶質（２Ｒ）−、（２Ｓ）−及び（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰは、大幅に低減された吸湿性と非常に優れた自由流動機能など優れた非常に望ましい取り扱い性を示す。

【0047】

結晶質（２Ｒ）−、（２Ｓ）−及び（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰは、１６０℃より高い、特に１８３℃と１８５℃との間に融点と、少なくとも−１３０Ｊ／ｇ、好ましくは少なくとも−１４０Ｊ／ｇ、特に−１４３Ｊ／ｇと−１５９Ｊ／ｇの間に融解エンタルピーとを有する（これに関して表３を参照）。

【0048】

ラセミ体（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶改質物は、粉末Ｘ線回折測定における適度に鋭いバンド（これに関して図１及び表２参照）を示す。

【0049】

その結晶改質物に対する２シータ値は、約６．５、１２．６、１３．４、１９．５、２０．２、２１．５、２５．２及び２９．８であり、ここで選択した２シータ値は約１２．６、１９．５、２０．２、２１．５及び２５．２である。図１に示されるＸ線粉末回折パターンに対応した結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物は、本発明の範囲内である。

【0050】

鏡像異性的に純粋な（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物は、同様に結晶形で得られる。その結晶改質物のための２シータ値は約６．５、１２．８、１９．５、１９．８、２０．２、２０．７、２１．６及び２５．３であり、選択された２シータ値は約１２．８、１９．５、１９．８、２０．２、及び２１．６である（図２、表２を参照）。図２に示されるＸ線粉末回折パターンに対応する（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶形は、本発明の範囲内である。

【0051】

鏡像異性的に純粋な（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物は、同様に結晶形で得られる。その結晶改質物のための２シータ値は約６．６、１２．８、１９．５、１９．８、２０．３、２０．８、２１．６及び２５．３であり、選択された２シータ値は約１２．８、１９．５、１９．８、２０．３、及び２１．６である（図３、表２を参照）。図３に示されるＸ線粉末回折パターンに対応する（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶形は、本発明の範囲内である。

【0052】

本発明はさらに、（２Ｒ）−、（２Ｓ）−及び（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶改質物の製造方法に関し、（２Ｒ）−、（２Ｓ）−及び（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を非プロトン性媒体から結晶化させることを特徴する。この目的のために使用される非プロトン性媒体は、１種の非プロトン性溶媒、または非プロトン性溶媒の混合物、又は１種又はそれ以上の非プロトン性溶媒と１種のプロトン性溶媒またはプロトン性溶媒の混合物との混合物であることができる。

【0053】

好適な非プロトン性溶媒は、非プロトン性の酸素含有溶媒であり、特に、
例えば、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどのエーテル類、
例えば、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン、メチルイソプロピルケトンなどのケトン類、
例えば、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート及び１，３−ジオキソリジン−２−オンなどのエステル類、である。

【0054】

好ましい非プロトン性溶媒は、ケトン類である。

【0055】

好適なプロトン性溶媒は、特に、
例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、エチレングリコール、メトキシエタノール、エトキシエタノールなどのアルコール類である。

【0056】

非プロトン性媒体が非プロトン性溶媒の１種又はそれ以上とプロトン性溶媒との混合物であるならば、非プロトン性溶媒は上記で定義した非プロトン性の酸素含有溶媒であり得るか、または例えばアセトニトリルなどのニトリルであり得る。

【0057】

溶媒は、それぞれの場合に純粋な形態で、または混合物の形態で使用することができ、すなわち、混合物の形態で１つのグループ内の様々な非プロトン性溶媒を使用することも、互いに混合物の形態で非プロトン性溶媒の様々な種類を使用することの両方が可能である。

【0058】

非プロトン性媒体が、１種又はそれ以上の非プロトン性溶媒とプロトン性溶媒との混合物であるならば、プロトン性溶媒は、適用された条件、原料の純度や処理の目標（収率、生成物の純度、結晶化度）に応じて、０質量％を超え４０質量％まで、好ましくは１０質量％〜２０質量％で存在させることが可能である。好ましくは、水の非常に少量を含有する非プロトン性媒体を用いるべきである。特に好ましい実施形態では、水は除外される。

【0059】

本発明の好ましい実施形態では、アセトン又は２−プロパノールが非プロトン性媒体として使用される。非常に好ましい実施形態では、アセトンと２−プロパノールの混合物が使用される。典型的には、２−プロパノールとアセトンの混合物は、０〜２５％の２−プロパノールを含む。

【0060】

ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶化は、ここでは、先行精製することなく、反応溶液から直接行うことができる。同様に、結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物は、非結晶質、部分的結晶質または結晶質材料の再結晶により得ることができる。

【0061】

好ましい実施形態では、その結晶形態を得るために使用されるＤＯＴＡＰ塩化物は、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上、さらに好ましくは約９９％以上の、高い化学純度及び光学純度のものである。この点において、結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物の調製は、反応物質として非常に純粋なオレイン酸を使用し、これにより、低い純度を有する従来入手可能なＤＯＴＡＰ塩化物よりも、より容易に結晶化する高純度ＤＯＴＡＰ塩化物をもたらす。現在入手可能なＤＯＴＡＰ塩化物の典型的な主要な不純物が含まれるが、これらは他の脂質やその誘導体に限定されない。オレイン酸の実際のＰｈＥＵＲ純度（それ故、「医薬品品質」である）は、最近までたかだか約６５〜８８％である。ここで非常に純粋なオレイン酸とは、約９５％以上、好ましくは約９９％以上を示す超高純度の品質を意味する。適した非常に純粋なオレイン酸は、例えば、ＲＣＡ社（ロットＯＡ １１．Ｇ．０１．２００７）またはＡｃｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（ロット０６０５２８）から商業的に取得することができる。

【0062】

鏡像異性的な純度は、例えば、旋光度を測定することによって決定することができる。

【0063】

好ましい実施形態では、結晶形態を製造するために使用されるＤＯＴＡＰ塩化物は、適当な溶媒と共に、１部のＤＯＴＡＰ塩化物：４部の溶媒から１部のＤＯＴＡＰ塩化物：１００部の溶媒までの範囲、最も好ましくは１部のＤＯＴＡＰ塩化物：４部の溶媒から１部のＤＯＴＡＰ塩化物：１０部の溶媒までの範囲の濃度で晶出されるか再晶出される。

【0064】

ＤＯＴＡＰ塩化物の改質物の結晶化は、特に、例えば、毎分０．００１℃〜毎分０．１℃、例えば、毎分０．０５℃又は毎分０．００４℃の冷却速度によって、約５〜２００時間、例えば、約１０〜５０時間で、３０℃以下の温度に調製された溶液をゆっくりと冷却することにより、通常達成される。特定のオプションは溶液を３５℃に加熱し、その後−１２℃まで１２時間かけて徐冷するか、又はより低い温度、例えば、２５℃に溶液を加熱するか、または加熱することなく室温から始め、その後好ましくは−１２℃に、１０〜５０時間かけて徐冷する。結晶の形成は、自発的にまたは対応するＤＯＴＡＰ塩化物の結晶改質物の種入れ（inoculation）によって実施される。

【0065】

徐冷は、当業者に公知の任意の方法によって実施することができる。典型的には、クライオスタットが使用される。

【0066】

前述のように、すべてのＤＯＴＡＰ塩は酸化に対して非常に敏感であり、それ自体、例えば不活性雰囲気を用いる、窒素雰囲気を用いる、及び／又は低い酸素及び過酸化物含有量の溶媒を用いることにより、本明細書に開示される製造方法中の酸素の排除が好ましい。

【0067】

非晶質又は部分的結晶質のＤＯＴＡＰ塩化物の再結晶への出発物質としての使用は、記載された製造過程によって、従来達成されなかった安定性と共に、従来達成されなかった純度の本質的に結晶質のＤＯＴＡＰ塩化物を与える。

【0068】

本発明は、また、結晶質（２Ｒ）−、（２Ｓ）−及び（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物が規定の条件下で固形における優れた安定性を有し、事実上無制限の時間、定常的に非常に良好な品質を有していることから、結晶質（２Ｒ）−、（２Ｓ）−及び（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の医薬製剤の調製のための使用に関する。

【0069】

従って、本発明はさらにまた、請求された結晶質（２Ｒ）−、（２Ｓ）−及び（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物形態の使用から得られる医薬組成物に関する。この種の医薬組成物は、通常の医薬製剤に用いられる他の医薬活性化合物や公知のアジュバントと、並びに一つ以上の溶剤と共に、（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−及び（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶改質物を含むことができる。

【0070】

これらの医薬組成物は、例えば、リポソーム、リポプレックス、マイクロエマルション及びナノ粒子の形態であって、例えば、ペプチド、ヌクレオチド、ワクチン又は細胞増殖抑制剤の群からの活性化合物を含むことができる。

【0071】

本説明は、包括的に本発明を適用することを、当業者に可能とする。また、以下の例は、理解を容易にするためであり、本発明の可能な変形について示すのに役立つ。これらの例は、従って、決して限定的とみなされるべきではない。

【実施例】

【0072】

以下の例に記載されているすべての温度は摂氏度で示されている。特に明記しない限り、内容物データは質量％として与えられる。

【0073】

本発明を説明するための例
実験条件に関する一般備考：
結晶質物質の沈殿を最適化するために、結晶化及び再結晶化の間は非常にゆっくりと冷却することが重要である。

【0074】

すべての試薬及び溶媒は、非常に低い含水量を有する。

【0075】

全ての操作は窒素雰囲気下に密閉装置内で実施される。

【0076】

９５％以上、好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上の純度を有する非常に純粋なオレイン酸が使用される。

【0077】

Ｘ線粉末回折の測定パラメータは以下のとおり。

【0078】

ＳＴＯＥ Ｘ線粉末回折
回折：透過
モノクロメータ：湾曲ゲルマニウム（１１１）
線波長：１．５４０６０ Ｃｕ
検出器：リニア位置感知型検出器
スキャンモード：デバイ−シェラー／移動位置検出器／固定オメガ
反射か透過か、又はキャピラリかウィンドウか等の異なる装置又は記録方法が利用される場合、あるいは異なる記録条件（例えば、大気湿度または温度）が使用されている場合、各バンドのわずかな違いが発生する可能性があることが、Ｘ線粉末回折研究において一般的である。当業者は、そのようなわずかな違いに非常に精通しており、容易に使用される方法を考慮した所定のＸ線粉末回折パターンに近似した一致により、所与の物質を識別することができるであろう。

【0079】

製造例１：
結晶質ラセミ体（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物［（Ｒ，Ｓ）−１，２−ジオレオイル−３−プロピルトリメチルアンモニウムクロライド］の製造：
出発物質
以下の化学物質が使用された：
・シグマアルドリッチ社からのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、ロット１２５２８１２。
・ＲＣＡ社からのオレイン酸、ロットＯＡ １１．Ｇ．０１．２００７、９９．１面積％（ＨＰＬＣ）。アッセイ（ａｓｓａｙ）は、オレイン酸よりもＵＶにおいてはるかに高い応答を示すリノール酸（主要不純物）として、９９．５％又はより高いかもしれない。
・ＭＥＲＣＫ ＥＰＲＯＶＡ社からの（Ｒ，Ｓ）−３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール、ロットＭＳＣＨ−１０３−Ａ、０．１１％の水、９９．４％（ＧＣ）。
・シグマアルドリッチ社からの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、ロット１０７６８４１、９９．７％（ＧＣ）。
・ＬＩＮＤＥ社からの塩化メチル、ロット６１４４８。
・シグマアルドリッチ社からのヨウ化ナトリウム、ロット１３３６３８５、０．２７％水。
・シグマアルドリッチ社からの酸化アルミニウム、ロット１３３６６４３。
・ＩＣＣ社からのアセトニトリル、ロット００００４２６１３０、１００．０％（ＧＣ）、＜０．０１５％の水。
・ＢＲＥＮＮＴＡＧ ＳＣＨＷＥＩＺＥＲＨＡＬＬ社からのｎ−ヘプタン、ロット００００２７８２４５、９６．４％（ＧＣ）。
・ＴＨＯＭＭＥＮＮ ＦＵＲＬＥＲ社からの２−プロパノール：、ロット０７０９２０２１１４８７、９９．９６％（ＧＣ）、０．０３％水。
・ＴＨＯＭＭＥＮＮ ＦＵＲＬＥＲ社からのアセトン、ロット０８０６０９３２４２１２、９９．９８％（ＧＣ）、０．１６％の水。

【0080】

（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＤＡＰ［（Ｒ，Ｓ）−１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン］の合成
２．４１ｋｇのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを室温で、６．３３ｋｇの乾燥アセトニトリルに溶解する。得られた溶液を２５℃まで加熱する。次いで、添加速度の変更により反応温度を３５℃以下に規制しつつ、４．０ｋｇのオレイン酸を６０分間にわたって溶液にポンプで送る（二酸化炭素ガスの生成）。添加が完了した後、反応溶液を３０℃でさらに９０分間撹拌する（ガスの発生が終了）。次いで、１１ｇの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンを添加し、次に乾燥アセトニトリル０．３７ｋｇ中０．８３ｋｇのラセミ体（Ｒ，Ｓ）−３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオールの溶液を加える。３０℃での攪拌を２１時間継続する。得られたエマルションを２５℃に冷却し、攪拌を停止する。２つの層が現れる。下層を分離し、１ ｍｂａｒ／２５℃で２００分間脱気し、最終的に、１１．７ｋｇのｎ−ヘプタンで希釈する。溶液に、塩基性酸化アルミニウムの１．２１ｋｇを添加し、懸濁液を０℃で３時間撹拌する。懸濁液を濾過し、濾過残渣を予め０℃に冷却したｎ−ヘプタン１．５ｋｇで洗浄する。合わせた濾液を均質化して、純粋な（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＤＡＰ４．０８ｋｇのｎ−ヘプタン溶液１５．９ｋｇを得る（ロットＮｏ．ＭＢＡ−１１６、アッセイ：２５．７％、収率：８８．９％）。

【0081】

別のバッチは同様にして、純粋な（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＤＡＰ３．５２ｋｇのｎ−ヘプタン溶液１６．６ｋｇとなるように実施される（ロットＮｏ．ＭＢＡ−１１７、アッセイ：２１．２％、収率：８８．６％）。

【0082】

（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の合成
純粋な（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＤＡＰ３．５２ｋｇのｎ−ヘプタン溶液２３．４ｋｇ（ロットＮｏ．ＭＢＡ−１１６の１５．９ｋｇとロットＮｏ．ＭＢＡ−１１７の７．５ｋｇ）を反応容器に投入し、ｎ−ヘプタンを６０℃のジャケット温度で減圧蒸留する。真空が８ｍｂａｒで安定した時、ジャケット温度を２５℃に調整する。次に、７．０ｋｇの２−プロパノール、次いで３．１ｇのヨウ化ナトリウムを加える。次に、反応温度を３０℃に調整し、窒素雰囲気を１２００ｍｂａｒの一定の絶対圧で塩化メチル雰囲気に置き換える。この反応混合物は（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＤＡＰの（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物へのメチル化反応が終了するまで１３７時間にわたってこれらの条件下で撹拌する（９６％の転化率）。塩化メチルの消費量は１．３９ｋｇである。

【0083】

（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶化
上記のように調製された（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の２−プロパノール溶液を、乾燥アセトン３５．８ｋｇを用いて２５℃で希釈する。２−プロパノールの量は、上記のように、７ｋｇであり、溶液中のＤＯＴＡＰ塩化物の量は計算に基づいて３．６４ｋｇである。透明な溶液は毎分０．０５℃の冷却速度でゆっくり−１２℃まで冷却する、すなわち、１２ １／３時間（１２時間２０分）の期間にわたって冷却が行われる。得られた懸濁液はさらに１４時間−１２℃に維持し、その後予冷フィルタ（−１５℃）で濾過する。粗（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を、冷乾燥アセトン（−１８℃）の６．０ｋｇで２回洗浄する。

【0084】

この特定の実験では、この時点で得られた結晶改質物はチェックされないが、この時点で原料生成物が単離された対応する以前の実験から、結晶改質物が結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰの結晶改質物であることが分かっている。

【0085】

よりいっそう純粋な生成物を達成する、即ち、いくつかのマイナーな不純物を除去するために、再結晶化工程を行う。

【0086】

（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の再結晶
湿った粗（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を乾燥アセトン４４．１ｋｇと２−プロパノール３．５ｋｇの混合物に密閉フィルタ中、３５℃で溶解する。その溶液を反応容器に移し、０℃とする。溶液を毎分０．００４℃の冷却速度、すなわち、５０時間かけてゆっくり−１２℃まで冷却する。得られた懸濁液を−１２℃でさらに１６時間保持し、その後冷却したフィルタドライヤー（−１５℃）で濾過する。濾過残渣は０．８ｋｇの冷乾燥アセトン（−１８℃）で２回洗浄し、真空乾燥する。乾燥中にフィルタドライヤーを室温まで温める。真空度が７．９ｍｂａｒで安定したら、乾燥が完了する。収量：３．４６ｋｇの結晶ラセミ（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ、ロットＮｏ．ＭＢＡ−１１８、アッセイ：１００．０％、収率：（Ｒ，Ｓ）−３−（ジメチルアミノ）−１−プロパンジオールを参照として３７．８％、ＨＰＬＣ純度：９９．９％面積）。

【0087】

結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の写真は、図１０に見出すことができる。

【0088】

製造例２：
結晶質の鏡像異性的に純粋な（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物［（Ｒ）−１，２−ジオレオイル−３−プロピルトリメチルアンモニウムクロライド］の製造：
出発物質
以下の化学物質が使用された：
・シグマアルドリッチ社からのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、ロット１２５２８１２。
・ＡＣＭＥ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社からのオレイン酸、ロット０６０５２８、９７．８％（ＨＰＬＣ）。
・ＤＡＩＳＯ社からの（Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール、ロットＲＭＡ０６２１５１、０．１１％の水、９９．６％（ＧＣ）。
・シグマアルドリッチ社からの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、ロット１０７６８４１、９９．７％（ＧＣ）。
・ＬＩＮＤＥ社からの塩化メチル、ロット６１４４８。
・シグマアルドリッチ社からのヨウ化ナトリウム、ロット１３３６３８５、０．２７％水。
・シグマアルドリッチ社からのアセトニトリル、ロット７２１９Ｋ、１００．０％（ＧＣ）、０．００５％の水。
・ＢＲＥＮＮＴＡＧ ＳＣＨＷＥＩＺＥＲＨＡＬＬ社からのｎ−ヘプタン、ロット００００２７８２４５、９６．４％（ＧＣ）。
・ＴＨＯＭＭＥＮＮ ＦＵＲＬＥＲ社からの２−プロパノール、ロット０７０６２９１７６４３４、９９．９６％（ＧＣ）、０．０１６％の水。
・ＴＨＯＭＭＥＮＮ ＦＵＲＬＥＲ社からのアセトン、ロット０６１２０１１０１９４６、９９．９８％（ＧＣ）、０．１０％の水。

【0089】

（２Ｒ）−ＤＯＤＡＰ［（Ｒ）−１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン］の合成
Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール１．６３ｋｇを、室温で、４．３ｋｇの乾燥アセトニトリル中に溶解する。溶液を２５℃まで加熱する。添加速度の変更により反応温度を３５℃以下に規制しつつ、オレイン酸２．７ｋｇを６０分かけて溶液にポンプで送る（二酸化炭素ガスの生成）。添加が完了した後、反応溶液を３０℃でさらに１０５分間撹拌する（ガスの発生終了）。次に、７．５ｇの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンを、次いで、乾燥アセトニトリル０．２５ｋｇ中０．５６ｋｇの鏡像異性的に純粋な（Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオールの溶液を添加した。３０℃での攪拌を１９時間継続する。得られたエマルションを１０℃に冷却し、攪拌を停止する。２つの層が現れる。下層は分離し、０．１ ｍｂａｒ／２０℃で３０分間脱気し、最後にｎ−ヘプタンの９．７ｋｇで希釈した。この懸濁液を０℃で１．５時間撹拌し、濾過して、２．６６ｋｇの純粋な（２Ｒ）−ＤＯＤＡＰのｎ−ヘプタン溶液１２．３ｋｇを得る（ロットＮｏ．ＭＢＲ−００１、アッセイ：２１．６％、収率：８８．４％）。

【0090】

（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の合成
２．６６ｋｇの純粋な（２Ｒ）−ＤＯＤＡＰのｎ−ヘプタン溶液１２．２ｋｇ（ロットＮｏ．ＭＢＲ−００１）を反応容器に投入し、ｎ−ヘプタンを６０℃のジャケット温度で減圧下に留去する。真空度が１ｍｂａｒで安定したら、ジャケット温度を２０℃に調整する。次に、２−プロパノール３．２６ｋｇを、次いで１．４ｇのヨウ化ナトリウムを添加する。次いで、反応温度を３０℃に調整し、窒素雰囲気を１２５０ｍｂａｒの一定の絶対圧で塩化メチル雰囲気に置き換える。反応混合物を、（２Ｒ）−ＤＯＤＡＰの（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物のメチル化反応が終了するまで（９７％転化率）、３３０時間にわたってこれらの条件下で撹拌する。塩化メチルの消費量は０．５８ｋｇである。

【0091】

（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶化
上記のように調製された（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の２−プロパノール溶液を、２５℃で１６．２ｋｇの乾燥アセトンで希釈する。２−プロパノールの量は、上述したように、３．２６ｋｇであり、計算に基づく溶液中のＤＯＴＡＰ塩化物の量は２．７８ｋｇである。
透明な溶液を−１２℃まで毎分０．０５℃の冷却速度、すなわち、１２ １／３時間かけてゆっくりと冷却する。得られた懸濁液はさらに１時間、−１２℃に保たれ、その後、予め冷却したフィルタ（−１２℃）を通して濾過する。粗（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を、冷乾燥アセトン（−１８℃）３．２ｋｇで２回洗浄する。結晶生成物は、結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰの結晶である。

【0092】

この特定の実験では、この時点で得られた結晶改質物はチェックされないが、この時点で原料生成物が単離された対応する以前の実験から、結晶改質物が結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰの結晶改質物であることが分かっている。

【0093】

よりいっそう純粋な生成物を達成する、即ち、いくつかのマイナーな不純物を除去するために、再結晶化工程を行う。

【0094】

（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の再結晶
湿った粗（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を乾燥アセトン２０．５ｋｇと２−プロパノール１．６３ｋｇの混合物に密閉フィルタ中、３５℃で溶解する。その溶液を反応容器に移し、２５℃とする。溶液を、毎分０．０５℃の冷却速度、すなわち、１２時間２０分かけてゆっくり−１２℃まで冷却する。得られた懸濁液を−１２℃でさらに９時間保持し、その後冷却したフィルタドライヤー（−１２℃）で濾過する。濾過残渣を３．２ｋｇの冷乾燥アセトン（−１８℃）で２回洗浄し、真空乾燥する。乾燥中にフィルタドライヤーを室温まで温める。真空度が０．６ｍｂａｒで安定したら、乾燥が完了する。収量：１．４７ｋｇの鏡像異性的に純粋な結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（ロットＮｏ．ＭＢＲ−００２、アッセイ：９９．７％、収率：（Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−プロパンジオールを参照して４４．７％、ＨＰＬＣ純度：９９．９％面積）。

【0095】

製造例３：
鏡像異性的に純粋な結晶質（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物［（Ｓ）−１，２−ジオレオイル−３−プロピルトリメチルアンモニウムクロライド］の調製：
（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物［（Ｓ）−１，２−ジオレオイル−３−プロピルトリメチルアンモニウムクロライド］は、鏡像異性的に純粋な出発物質の（Ｓ）−３−（ジメチルアミノ）−１−プロパンジオール（ＤＡＩＳＯ社からのロットＳＭＡ０６２２８１、０．１４％の水、ＧＣ：９９．８％、他のすべての化学物質が一致）から開始して（Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（上記参照）と同じ方法で製造され、１．６７ｋｇの鏡像異性的に純粋な結晶質（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（ロットＮｏ．ＭＢＳ−００２、アッセイ：９９．６％、収率：５０．４％［（Ｓ）−３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール参照］、ＨＰＬＣ純度：１００．０％面積）として得る。

【0096】

特性評価例１
安定性
結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の安定性を決定するために、物質は２５℃、相対湿度６０％（表１）又は４０℃、相対湿度７５％（表１ａ）で空気を排除して保存する。（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の残量を周期的な間隔で測定し、初期値と比較して引用している。

【0097】

ＤＯＴＡＰ塩化物の純度と成分は、以下の方法を用いてＨＰＬＣにより決定される。

【0098】

ＨＰＬＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣ
カラム：ＯＤＳ−３：１５０ｘ３ｍｍ、３μｍ、ＧＩサイエンス社：イナートシル
溶離液Ａ：０．０８５％Ｈ_３ＰＯ_４水溶液中の１０ｍＭペンタンスルホン酸ナトリウム塩
溶離液Ｂ：０．０８５％Ｈ_３ＰＯ_４水溶液を含む９４％アセトニトリル中の３．８５ｍＭのペンタンスルホン酸ナトリウム塩
グラジエント：０分 ７５％Ｂ
１分 ７５％Ｂ
６分 ９０％Ｂ
７分 １００％Ｂ
２０分 １００％Ｂ
２５分 ７５％Ｂ
ポスト時間： ５分 ７５％Ｂ
ランタイム：２５分
流量：１．５ｍｌ／分
圧力：約２２０バール
カラム温度：５０℃
注入量：１０μｌ
以下の値が検出された：
安定性判定は任意の時点で繰り返すことができ、表１及び表１ａに示される値が再現可能である。

【0099】

【表2】

【0100】

上記の安定性データは、結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物が安定な物質であることを確認する。
３６ヶ月後でさえ、２５±２℃で保存されたサンプルに有意な低下は認められなかった。

【0101】

【表3】

【0102】

上記の安定性データは、結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物が安定な物質であることを確認する。
加速された条件でさえ、４０±２℃で保存されたサンプルに１２ヶ月後では有意な低下は認められなかった。

【0103】

結晶質（２Ｒ）−及び（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物は匹敵する安定値を示す。

【0104】

特性評価例２
粉末Ｘ線図
結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物の構造的特徴（結晶改質物）の特性評価のために、これらの物質の粉末Ｘ線回折図（回折スペクトル）が記録される。

【0105】

結晶質（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｒ）−及び（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物は、脂質のために比較的良好な解像度を有する適度にシャープなバンドでスペクトルを与える。スペクトルは、高結晶質の内容を示している。非晶質フラクションは、偏光顕微鏡下で表示されない。

【0106】

スペクトルの例を図１，図２及び図３に示す。

【0107】

比較のため、市販されている、非晶質試料のスペクトルを図４（アモルファス）に示す。図５は、Ｘ線スペクトルの比較であり、結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（ａ）、結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（ｂ）及び結晶質（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物（ｃ）、比較として（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の市販サンプル（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）（ｄ）である。

【0108】

表２は、ラセミ体及び鏡像異性的に純粋なＤＯＴＡＰ塩化物の種々の結晶改質物に対して選択された２シータ値を示す。

【0109】

【表4】

【0110】

特性評価例３
融点と融解エンタルピー
結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物の融点と融解エンタルピーは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（３０〜３５０℃、５．０℃／分、Ｎ_２ ８０ｍｌ／分）で決定される。

【0111】

ラセミ体（２Ｒ，Ｓ）−及びそれぞれ鏡像異性的に純粋（２Ｒ）−並びに（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の得られた融点及び溶融エンタルピーを表３に示す。

【0112】

【表5】

【0113】

特性評価例４
相転移温度とエンタルピー
結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物の相転移温度とエンタルピーが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（３０〜３５０℃、５．０℃／分、Ｎ_２ ８０ｍｌ／分）で決定される。

【0114】

融点（特性評価例３を参照）に加え、結晶相、液体−結晶相のいくつかの転位点が観察される。

【0115】

ラセミ体（２Ｒ，Ｓ）−及びそれぞれ鏡像異性的に純粋な（２Ｒ）−並びに（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物に対して対応する相転移温度及びエンタルピーを表４に記載する。

【0116】

【表6】

【0117】

ＤＳＣ実験は、純粋な結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物と純粋な結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の混合物において行われ、ラセミ体と鏡像異性体の両方のすべての相転移温度が観察される。図１１は、純粋な結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の相転移温度及び融点を、両結晶形の１００：５０及び６３：１００の比の混合物と共に示している。これらの比率は、混合物中でそれぞれ３３．３モル％と１９．３モル％の（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の量に相当する。

【0118】

結論：
結晶質で鏡像異性的に純粋なＤＯＴＡＰ塩化物及び結晶質のラセミＤＯＴＡＰ塩化物の結晶改質物は区別される。

【0119】

特性評価例５
相対湿度に依存する吸水率
ＤＯＴＡＰ塩化物の吸水率は、Ｐｒｏｊｅｋｔ Ｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ社製 ＳＰＳ １１−１００ｎ水蒸気吸着分析器を使用して動的蒸気吸着（Dynamic Vapor Sorption:ＤＶＳ）によって決定される。

【0120】

サンプルは天秤上部のアルミニウムるつぼに入れ、２５℃で、Δｒ．ｈ．＝５％ｈ^−１の走査速度及び極端な値での等湿度（isohumid）平衡期間の２回の加湿／乾燥サイクルに曝す前に、２５℃、０％ｒ．ｈ．（相対湿度）で一晩平衡化されている。

【0121】

結晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物、結晶質（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物、アモルファス（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物及びアモルファス（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物のサンプルを評価した。

【0122】

結果：
ＤＶＳ曲線の比較（図１２参照、第１サイクルを実線、第二サイクルを破線）は、結晶質と非晶質のサンプル間の特性差を指摘している。結晶質のサンプル（図１２の左図）は、低湿度で安定質量を示すが、対して非晶質のサンプル（図１２の右図）の質量は既に０％ｒ．ｈ．を超えるとすぐに増加している。また、開始時に結晶であったサンプルについて、かなり大きなヒステリシスが両サイクルにおいて観察される。違いはまた、ラセミ体サンプル（図１２の上図）と鏡像異性的に純粋なサンプル（図１２の下図）との間に観察することができる。ラセミ体サンプルは約１０〜１５％ｒ．ｈ．で含水量の急激な増加を示すのに対し、異性体的に純粋なサンプルは約２０〜２５％ｒ．ｈ．で、このステップを示す。

【0123】

比較例１
ここでのフェルグナーらの再現実験において、すべての実験条件は、米国特許５，２６４，６１８（フェルグナーら）のカラム２７、１５−４７行の例５に緊密に準拠するように選択された。

【0124】

３７．５ｍｌのクロロホルムと２５ｍｌのピリジンに溶解した３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール５．０ｇに、１２５ｍｌのクロロホルムに溶解した塩化オレオイル（ＦＬＵＫＡ ０７３３ＩＡＨ）３１．５ｇを、冷却下に４℃で１時間半かけて滴下した。黄色溶液を一晩撹拌した。次いで、１２５ｍｌの冷水及び１２５ｍｌのジエチルエーテルを加えた。有機相を１００ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌで２回、また１００ｍｌの０．５Ｎ炭酸水素ナトリウム溶液で２回洗浄した。３９ｇの無水硫酸ナトリウムを添加し、そうして得られた懸濁液を濾過し、１００ｍｌのクロロホルムで洗浄した。その後、濾液を４０℃で減圧下に濃縮した。ＨＰＬＣにより測定された２４．３％ｗ／ｗの（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＤＡＰ含量を有する褐色の液体（ＳＭ−０３１８−Ａ）４０．１ｇが得られた。さらに６０℃、減圧下での乾燥は、３１．２ｇへの質量減少をもたらした。

【0125】

この物質３１．０ｇを次のようにケイ酸カラムクロマトグラフィーで精製した。

【0126】

シリカゲル：１２９ｇ（シリカゲルの量は、（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＤＡＰ量に対して計算された）、メルク社製、６０ Ｆ ６３−２００ｕｍ
カラム：直径４ｃｍ、高さ６０ｃｍ
フロー：約８ｍｌ／分
移動相としてまず１，５００ｍｌの塩化メチレン（画分１−２７）、次いで、１，０００ｍｌの塩化メチレン／メタノール９５：５（画分２８−４７）、最後に１，０００ｍｌのメタノールを使用した。画分は、それらのＴＬＣ分析に従って採取混合した。それで画分４−３３を減圧下に一緒に濃縮した。ＨＰＬＣにより測定した６５．６％のｗ／ｗの（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＤＡＰ含量を有する褐色のオイル（ＳＭ−０３１８−Ｂ）１０．８ｇが得られた。そして画分３４−４２は、ＨＰＬＣにより測定した５４．２％ｗ／ｗの（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＤＡＰ含量を有する褐色のオイル（ＳＭ−０３１８−Ｄ）１２．６ｇをもたらした。

【0127】

１０．４ｇの塩化メチレンを、画分４−３３（ＳＭ−０３１８−Ｂ）の中から得られた化合物９．６ｇに高圧ガラスチューブ中で加えた。ガラスチューブを閉じ、茶色がかった溶液を５０℃で一晩加熱し、エマルションを形成した。次いで、チューブを開放し、残留塩化メチレンを蒸発除去した。ＨＰＬＣにより測定した６５．０％ｗ／ｗの（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物含量と１．３％ｗ／ｗの（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＤＡＰ含量を有する黄色ワックス（ＳＭ−０３１８−Ｅ）８．０ｇが得られた。

【0128】

１４．０ｇのアセトニトリルをこのワックス（ＳＭ−０３１８−Ｅ）に添加した。このようにして得られたエマルションを８０ｍｌのアセトニトリルでフラスコに移し（約１：１２の固液比を得るよう）、２０℃に冷却した。結晶化は観察できなかった。２０℃で固形蜜状の黄褐色の物質は、わずかに暖めただけで、どろどろの粘性茶色物質になる傾向にあった。

【0129】

結論
データは、米国特許５，２６４，６１８（フェルグナーら）の、カラム２７、４７〜１５行の実施例５にしたがって、上記手順で得られた１，２−ジオレオイル−３−プロピルトリメチルアンモニウムクロライド（（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物）は、結晶形態で得ることができないことを示す。

【0130】

また、それぞれ、アセトニトリル中の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物エマルション（ＳＭ−０３１８−Ｅ）の冷却開始時、及びアセトニトリル中の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物エマルション（ＳＭ−０３１８−Ｅ）が−２０℃まで冷却された後を示す図６及び７を参照されたい。

【0131】

（比較例２）
フェルグナーらの実験の更なる再現は、上記と同様の知見を確認して準備した。

【0132】

すべての実験条件は、米国特許５，２６４，６１８（フェルグナーら）のカラム２７の１５−４７行の例５に記載されるように、（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の調製／分離が可能な限り緊密に準拠するように選択された。

【0133】

この実験では、特別な重点が反応物質の規模、無水ピリジンの使用、メチル化時間及びチューブの温度において設定されている。

【0134】

米国特許５，２６４，６１８（フェルグナーら）の例５内では、使用される原料に有効なデータを見出すことはできない。再現実験の塩化オレオイルには、シグマアルドリッチ社製（製品番号３６７８５０，ロット０７３３ＩＡＨ）を、３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオールには、ＴＣＩ社製（製品番号Ｄ２０７２，ロットＦＧＣ０１ＥＦ）を用いた。ジエチルエーテル（製品番号８．２２２７０．１０００，ロット番号Ｋ３３２３７４７０）、硫酸ナトリウム（製品番号８．２２２８６．５０００，ロット番号ＴＡ６０３３８６）、海砂（製品番号１．０７７１１．５０００、ロット番号ＴＡ１４１７８１１）、シリカゲル６０ Ｆ ６３−２００μｍ（製品番号１．０７７３４．９０２５、ロット番号ＴＡ１５７０２３４）及びアセトニトリル（製品番号１．１５５００．１０００、ロット番号Ｋ３８１７２０００）はすべてメルクＫＧａＡ社のものであった。クロロホルム（製品番号３４８５４、ロット番号８１７８Ｃ）とモレキュラーシーブを通したＨ_２Ｏ≦０．００５％のピリジン（製品番号８２７０４，ロット番号１１６６９２１）はフルカ（Ｆｌｕｋａ）社のものであった。

【0135】

５．０ｇの３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオールは、２５ｍｌ無水ピリジンと３７．５ｍｌの新たに蒸留したクロロホルムに室温で溶解した。溶液を４℃に冷却した。３１．５ｇの塩化オレオイルを１２５ｍｌの蒸留クロロホルムに溶解した。塩化オレオイル溶液を１時間かけて冷３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール溶液に滴下した。黄色溶液を一晩撹拌した。次いで、１２５ｍｌの冷水及び１２５ｍｌのジエチルエーテルを添加した。有機相を１００ｍｌの０．５Ｎ ＨＣｌで２回、さらに１００ｍｌの０．５Ｎ重炭酸ナトリウム溶液で２回を洗浄した。その後、３９ｇの無水硫酸ナトリウムを加えた。このようにして得られた懸濁液を濾過し、残留固体を２０ｍｌのクロロホルムで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮した。ＨＰＬＣで測定による６２．２％ｗ／ｗの１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）含量を有する３１．５ｇの茶色液体（ＳＭ ０３６４ Ａ）となった。

【0136】

シリカゲルカラムは、以下のようにして調製した。

【0137】

カラム：直径４ｃｍ、高さ６０ｃｍ
シリカゲル：２００ｇシリカゲル及び４２．６ｇ海砂（ＤＯＤＡＰの量に対して計算）
フロー：約７ ｍｌ／分
上記で製造した材料（ＳＭ ０３６４ Ａ）１５ｇを、シリカゲルカラムに滴下し、５０ｍｌのクロロホルムですすいだ。カラムはまず１，０００ｍｌのクロロホルムで、次いで、１，０００ｍｌのクロロホルム／メタノール ９５／５で、次いで、１，２５０ｍｌのクロロホルム／メタノール ９０／１０、最後に２，５００ｍｌのメタノールで溶出した。画分を、体積比５０／１５／５／５／２のクロロホルム／アセトン／メタノール／酢酸／水で展開し、ヨウ素で検出するシリカゲルプレート（メルク社製、６０ Ｆ２５４）上での薄層クロマトグラフィー分析に従って採取混合した。減圧下で濃縮した後、以下すべてＨＰＬＣにより測定した７３．２％ｗ／ｗのＤＯＤＡＰ含量を有する混合画分１１−１７の４．８８ｇ（ＳＭ ０３６４ Ｂ）、６８．２％ｗ／ｗのＤＯＤＡＰ含量を有する画分１８−２７の７．２４ｇ（ＳＭ ０３６４ Ｃ）、４０．４％ｗ／ｗのＤＯＤＡＰ含量を有する画分２８−３１の１．９グラム（ＳＭ ０３６４ Ｄ）をもたらした。合計で９３．５％の質量バランスをもたらした。

【0138】

最も純粋な画分１１−１７（ＳＭ−０３６４−Ｂ）から得られた化合物１．０ｇを、高加圧可能な、厚肉ホウケイ酸ガラスチューブ（シグマアルドリッチ社製 Ｚ１８１０７２−１ ＥＡ）に加えた。次いで１０ｍｌの塩化メチルをガラスチューブに圧入した。ガラスチューブを密閉し、次いで、７０℃で７２時間保持した。次にチューブを０℃に冷却し、解放して、残留塩化メチルを留去した。これにより、６９．３％ｗ／ｗの（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物含量を有し、１．８％ｗ／ｗのＤＯＤＡＰ含量及び２．７％ｗ／ｗのオレイン酸含量を示す黄褐色のワックス（ＳＭ ０３６４ Ｅ）１．１１ｇをもたらした（すべてＨＰＬＣにより測定）。

【0139】

上記のように得られた化合物（ＳＭ ０３６４ Ｅ）１．０８ｇにアセトニトリル１０ｍｌを添加し、５０℃まで加熱した。このようにして得られたエマルションを−２０℃に冷却した。結晶化は観察することができなかった。−２０℃で黄褐色ワックスが得られた。

【0140】

結論：
上記のように米国特許５，２６４，６１８（フェルグナーら）の最も近接した実施形態を再現しても、非晶質（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物しか得られなかった。

【0141】

また、それぞれ、アセトニトリル中の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物エマルション（ＳＭ−０３６４−Ｅ）の冷却前、及びアセトニトリル中の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物エマルション（ＳＭ−０３６４−Ｅ）が−２０℃まで冷却された後を示す図８及び９を参照されたい。

【0142】

さらに詳述しなくても、当業者は、前述の説明を用いて本発明を最大限に利用することができると考えられる。前述の好ましい具体的な実施形態は単なる例示であり、いかなる方法でも本開示の残りの部分を限定するものではないと解釈されるべきである。

【0143】

前述の例は、前述の例において使用される反応物及び／または操作条件に対して、この発明の一般的又は具体的に説明した反応物及び／または動作条件を代入して同様の成功を繰り返すことができる。

【0144】

前述の説明から、当業者は容易に、その精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の本質的な特徴を確認することができ、種々の用途及び条件に適合させるために、本発明の様々な変更及び修正を行うことができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】