特許 6292671 ミモシン誘導体並びにこれを含有する殺虫剤、抗線虫剤および日焼け防止剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6292671

(24)【登録日】2018年2月23日

(45)【発行日】2018年3月14日

(54)【発明の名称】ミモシン誘導体並びにこれを含有する殺虫剤、抗線虫剤および日焼け防止剤

(51)【国際特許分類】

   C07D 213/69 20060101AFI20180305BHJP

   C07F 9/6584 20060101ALI20180305BHJP

   A01N 43/40 20060101ALI20180305BHJP

   A01N 57/36 20060101ALI20180305BHJP

   A01P 5/00 20060101ALI20180305BHJP

   A01P 7/04 20060101ALI20180305BHJP

   A61K 8/49 20060101ALI20180305BHJP

   A61K 8/55 20060101ALI20180305BHJP

   A61K 31/4412 20060101ALI20180305BHJP

   A61K 31/675 20060101ALI20180305BHJP

   A61P 33/10 20060101ALI20180305BHJP

   A61P 33/14 20060101ALI20180305BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180305BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20180305BHJP

【ＦＩ】

   C07D213/69CSP

   C07F9/6584

   A01N43/40 101Q

   A01N57/36 A

   A01P5/00

   A01P7/04

   A61K8/49

   A61K8/55

   A61K31/4412

   A61K31/675

   A61P33/10

   A61P33/14

   A61P43/00 111

   A61Q19/02

【請求項の数】4

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2014-125504(P2014-125504)

(22)【出願日】2014年6月18日

(65)【公開番号】特開2016-3217(P2016-3217A)

(43)【公開日】2016年1月12日

【審査請求日】2017年3月6日

(73)【特許権者】

【識別番号】510266941

【氏名又は名称】有限会社バイオシステムコンサルティング

(73)【特許権者】

【識別番号】504145308

【氏名又は名称】国立大学法人 琉球大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000590

【氏名又は名称】特許業務法人 小野国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】多和田 真吉

(72)【発明者】

【氏名】ウェン ガオ クェン ビン

(72)【発明者】

【氏名】平良 望

【審査官】 三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０６−２２７９５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１０４１４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／０６０６５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 NGUYEN, Binh Cao Quan et al.，Insecticidal and nematicidal activities of novel mimosine derivatives，Molecules，２０１５年，Vol.20, No.9，pp.16741-16756，ISSN:1420-3049, DOI:10.3390/molecules200916741

【文献】 Ishaaya, Isaac et al.，Mimosine, a nonprotein amino acid, inhibits growth and enzyme systems in Tribolium castaneum，Pesticide Biochemistry and Physiology，１９９１年，39(1)，35-42.

【文献】 Gal, Joseph，Synthesis of (R)- and (S)-amphetamine-d3 from the corresponding phenylalanines，Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals，１９７７年，13(1)，3-9.

【文献】 Hider, Robert C.; Lerch, Konrad，The inhibition of tyrosinase by pyridinones，Biochemical Journal，１９８９年，257(1)，289-90.

【文献】 Ponce, Yovani Marrero et al.，Atom-based 2D quadratic indices in drug discovery of novel tyrosinase inhibitors: results of In Silico studies supported by experimental results，QSAR & Combinatorial Science ，２００７年，26(4)，469-487.

【文献】 Tawata, Shinkichi; Kuwano, Eiichi; Eto, Morifusa，Studies on oxazaphospholidines with pesticidal activities. III. Synthesis and chemical properties of insecticidal 2-alkoxy-4-alkyl-1,3,2-oxazaphospholidine 2-sulfides derived from optically active amino acids，Agricultural and Biological Chemistry，１９８０年，44(7)，1489-98.

【文献】 Zografou, E. N.; Tsiropoulos, G. J.; Margaritis, L. H.，Effect of phenylalanine and tyrosine analogues on Bactrocera oleae Gmelin (Dipt., Tephritidae) reproduction，Journal of Applied Entomology ，２００１年，125(7)，365-369.

【文献】 Eto, Morifusa; Hirashima, Akinori; Tawata, Shinkichi; Oshima, Kohei，Studies of oxazaphospholidines with pesticidal activities. 4. Structure-insecticidal activity relation of five-membered cyclic phosphoramidates derived from amino acids，Nippon Kagaku Kaishi，１９８１年，(5)，705-11.

【文献】 Hirashima, Akinori; Eto, Morifusa，Synthesis of optically active cyclic phosphorothionates and phosphoramidothionates with insecticidal activity by using a chiral phosphorylating agent，Agricultural and Biological Chemistry ，１９８３年，47(12)，2831-9.

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ

Ａ０１Ｎ

Ａ０１Ｐ

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

Ａ６１Ｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の式（Ｉ）

【化1】

［ 式中、Ａは次の基（ａ）または（ｂ）

【化2】

（ここで、Ｒ_１は水素原子または重水素原子を示し、Ｒ_２は低級アルキル基を示す）
を示す ］
で表されるミモシン誘導体。

【請求項2】

請求項１記載の式（Ｉ）で表されるミモシン誘導体を有効成分として含有する殺虫剤。

【請求項3】

請求項１記載の式（Ｉ）で表されるミモシン誘導体を有効成分として含有する抗線虫剤。

【請求項4】

請求項１記載の式（Ｉ）で表されるミモシン誘導体を有効成分として含有する美白剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ミモシン誘導体に関し、更に詳細には、アセチルコリンエステラーゼ(ＡＣｈＥ)阻害活性、チロシナーゼ阻害活性等を有し、殺虫剤、抗線虫剤、日焼け防止剤等の成分として利用されるミモシン誘導体に関する。

【背景技術】

【0002】

今日の、農業の重大な課題の１つは、人口の増加に対応する食料生産の増大化である。これを実現化するための障害の1つは、病害虫による収穫の損失である。殺虫剤がなければ、作物が取り入れられる前に世界の作物の３０％が失われると見積もられている。昆虫の食害は、毎年、作物に４０００億ドルの損失をもたらす原因となり、このうち寄生的な線虫は、世界中で毎年１５７０億ドルの農業損失に原因となる。

【0003】

他方で、寄生的な線虫は、２０億以上の人間、家畜、動物の共通の感染の原因であり、このうち３億の人間、家畜等は激しい病気にさらされている。

【0004】

年数を重ねる化学物質の繰り返しの使用は、昆虫や線虫種の抵抗性の獲得を導き出した。しかし、植物二次性代謝産物からの殺虫剤は、抵抗性の発現がより遅く、汚染も低下させる。従って、植物から導かれる新しい二次性代謝産物の発見や、このものから更に構造変更した化合物を導くことは、新しい殺虫剤の研究開発のための重要な方法の1つであり、その研究の発展が求められている。

【0005】

ところで、ミモシン（Mimosine）は、熱帯あるいは亜熱帯のいくつかの植物中に見出される非タンパクアミノ酸であるが、抗ウイルス、抗炎症、制ガン作用等を有する化合物であるが、同時にトレハラーゼ、インベルターゼ、アミラーゼに対する活性を有し、昆虫の成長を抑圧することができる。

【0006】

しかしながら、殺虫作用や抗線虫作用を有するミモシン誘導体は、未だ文献で報告はされておらず、この分野での研究の進展が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２０１２―７７０５８

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Tawata, S. ら、“J. Pestic. Sci.” （2008） 33, 40-43.

【非特許文献2】Dai, Y.ら、“ Virology. ”（1994） 205, 210-216.

【非特許文献3】Conti, P.ら、“ Trichinella spiralis. Mol. Cell. Biochem. ” （2002） 229, 129-137.

【非特許文献4】Tawata, Sら、“Pesticide and Alternatives” Casida J. E. Eds.; Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1990; pp. 541-544.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の課題は、昆虫等による農作物の食害を防止するための殺虫剤等として使用可能な物質を、植物、特にミモシンの二次性代謝物あるいはその誘導体中から見出すことである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、予てよりギンネム（ Leucaena leucocephala ）や、これに含まれるミモシンについて研究を行っていたが、ミモシンの構造を改変してそのアミノアルコール、すなわちミモシノールや、その重水素化物およびその誘導体を合成し、それらの生理活性等を検索していた。

【0011】

そしてその結果、ミモシンを還元して得られる化合物や、これに更にリンを含有する基を導入した化合物には、すぐれた殺虫効果や酵素阻害活性があることを見出し、本発明を完成した。

【0012】

すなわち本発明は、次の式（Ｉ）

【化1】

［ 式中、Ａは次の基（ａ）または（ｂ）

【化2】

（ここで、Ｒ_１は水素原子または重水素原子を示し、Ｒ_２は低級アルキル基を示す）
を示す ］
で表されるミモシン誘導体である。

【0013】

また本発明は、上記式（Ｉ）で表されるミモシン誘導体を有効成分として含有する殺虫剤である。

【0014】

更に本発明は、上記式（Ｉ）で表されるミモシン誘導体を有効成分として含有する抗線虫剤である。

【0015】

更にまた本発明は、上記式（Ｉ）で表されるミモシン誘導体を有効成分として含有する美白剤である。

【発明の効果】

【0016】

本発明のミモシン誘導体（Ｉ）は、アセチルコリンエステラーゼ(ＡＣｈＥ)阻害活性や、チロシナーゼ活性阻害活性を有するものであり、新規な殺虫剤や抗線虫剤を提供することができる。

【0017】

また、本発明のミモシン誘導体（Ｉ）のチロシナーゼ阻害活性を利用し、皮膚の黒化の防止に使用することもでき、化粧品等の外用剤の美白成分として利用することもできる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】シロアリ虫体からのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）に対する各ミモシン誘導体等の阻害活性を示す図面である。数値は２回繰り返しの平均±ＳＥであり、ＩＣ_５０値は、テストされた化合物のＡＣｈＥ活性の５０％阻害を表す。

【図2】チロシナーゼに対する各ミモシン誘導体の阻害を示す図面である。数値は２回繰り返しの平均±ＳＥであり、ＩＣ_５０値は５０％阻害を表す。

【図3】Ｃ.エレガンスに対するミモシンの抗線虫活性を示す図面である。線虫の生死は、処理４８時間後に記録し、線虫死亡率はコントロール群との比較における割合として計算した。数値は２回繰り返しの平均±ＳＥである。

【図4】Ｃ.エレガンスに対するミモシン誘導体の抗線虫活性を示す図面である。図中（Ａ）はミモシノールについてのものであり、（Ｂ）〜（Ｄ）は、これから誘導される化合物（１ａ）−（１ｃ）についてのものである。線虫の生死は、処理４８時間後に記録し、線虫死亡率はコントロール群との比較における割合として計算した。数値は２回繰り返しの平均±ＳＥである。

【図5】Ｃ.エレガンスに対する重水素化されたミモシン誘導体の抗線虫活性を示す図面である。図中（Ａ）はＤ−ミモシノールについてのものであり、（Ｂ）〜（Ｄ）は、これから誘導される化合物（２ａ）−（２ｃ）についてのものである。線虫の生死は、処理４８時間後に記録し、線虫死亡率はコントロール群との比較における割合として計算した。数値は２回繰り返しの平均±ＳＥである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本願発明のミモシン誘導体（Ｉ）の原料となるミモシンは、後記式（II）で表されるものであり、ギンネムを含むいくつかの熱帯性や、亜熱帯性の植物中に見出される非たんぱくアミノ酸で、広範囲の抗生物活性を持ち、抗ウィルス性、抗炎症性、抗癌性等を含む医薬分野での大きな利用可能性を持っているものである（特許文献１、非特許文献１〜３等）。また、ミモシン（II）は、除草活性にも重要であり（非特許文献４）、更に、昆虫の成長の潜在的サプレッサであることが、用量依存的な、トレハラーゼ、インハーターゼ、およびアミラーゼ酵素活性を通じて示されているものである。

【0020】

このミモシン（II）からのミモシン誘導体（Ｉ）の合成は、例えば次の様にして行われる。すなわち、下式に従って、ミモシン（II）にトリス（トリエチルシリル）シリルトリフレート（III）を反応させてそのシリル化エステル（IV）とし、次いでこれを溶媒中、ホウ酸水素ナトリウムまたは重水素化ホウ酸ナトリウム（Ｖ）（以下、「ホウ酸ナトリウム等」という）を作用させて一つのミモシン誘導体であるミモシノールまたは重水素化ミモシノール（Ｉａ）（以下、「ミモシノール等」と略す）を得る。

【0021】

【化3】

［ここで、Ｒ_１は前記した意味を有し、Ｓｉはトリス（トリエチルシリル）シリル基を、Ｔｆはトリフルオロメチルスルホニル基を意味する］

【0022】

ミモシン（II）のエステル化に使用されるトリス（トリエチルシリル）シリルトリフレート（ＳｉＯＴｆ）（III）は、その場で（in situ）、トリス（トリエチルシリル）シランとトリフリック酸（トリフルオロメチルスルホン酸）を混合することにより製造される。また、ミモシン（II）とＳｉＯＴｆ（III）の反応は、イミダゾールと、例えばＤＭＦ−ＣＨ_２Ｃｌ_２の混合溶媒等の溶媒の存在下、０℃〜室温で撹拌することで行われる。

【0023】

また、シリル化エステル（IV）と、ホウ酸ナトリウム等（Ｖ）の反応は、室温下で、５.５時間程度撹拌することにより終了する。

【0024】

次いで、下記式に従い、得られたミモシノール等（Ｉａ）に、トリホスホニルクロライド（VI）を作用させて、式（VII）で表される中間体とし、最後にナトリウムメトキシド等の存在下、低級アルコール（VIII）を作用させることで、別のミモシン誘導体であるミモシノール若しくは重水素化ミモシノールのホスホアミドチオネート誘導体（Ｉｂ）（以下、「ホスホアミドチオネート誘導体」という）を得る。

【0025】

【化4】

（ここで、Ｒ_１およびＲ_２は前記した意味を有する）

【0026】

ミモシノール（Ｉａ）とトリホスホニルクロライド（VI）の反応は、トリエチルアミン等の有機アミンの存在下、１時間程度撹拌することにより行われる。また、中間体（VII）と反応させる低級アルコール（VIII）としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールが挙げられ、反応は、ナトリウムメトキシドやトリエチルアミンのようなアルカリ性物質の存在下、５０〜２００分程度行われる。

【0027】

以上の方法により得られるミモシン誘導体（Ｉ）は、後記実施例で明らかにするように、アセチルコリンエステラーゼ(ＡＣｈＥ)阻害活性や、チロシナーゼ阻害活性を有するものであり、殺虫剤や抗線虫剤の成分として、また、外用剤の美白成分として利用することができる。

【0028】

より詳しくは、前記式（Ｉａ）で示されるミモシノール等は、チロシナーゼ阻害活性がより強いため、この活性を生かし、殺虫剤や美白剤としての利用が強く期待される。

【0029】

これに対して、前記式（１ｂ）で示されるホスホアミドチオネート誘導体は、抗線虫活性に優れているため、殺虫剤の他、抗線虫剤としての利用が強く期待される。

【0030】

本発明のミモシン誘導体（Ｉ）を用いて殺虫剤や抗線虫剤を調製するには、一般的に農薬分野で使用されている成分と組合せ、粉剤、粒剤、顆粒剤、フロアブル剤、液剤、乳化剤等の形態とすれば良い。

【0031】

また、ミモシン誘導体（Ｉ）中には、従来より利用されている殺虫剤成分あるいは抗線虫成分と同等あるいはそれ以上の殺虫活性あるいは抗線虫活性を有するため、これら殺虫成分あるいは抗線虫成分の使用量や、配合量を参考にして製剤中の添加量を決めればよい。

【0032】

一方、ミモシン誘導体（Ｉ）を化粧品等の外用剤の美白成分として使用する場合は、この中に周知の美白剤成分であるコウジ酸と同等のチロシナーゼ阻害活性を有するものがあるので、コウジ酸の使用量や配合量を参考にし、外用剤の配合成分と組合せ、適当な形態とすればよい。この形態の例としては、液剤、クリーム剤、乳液、ファンデーション等の化粧料や外用剤を挙げることができる。

【実施例】

【0033】

次に実施例、参考例等を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。なお、本実施例等において、使用する原料化合物および試薬並びにデータ分析は、以下の通りである。

【0034】

（原料化合物および試薬）
トリス（トリエチルシリル）シラン、ロテノン、５,５−ジチオビス−(２−ニトロベンゾイック酸)、ヨウ化アセチルコリンおよび重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ４）は、シグマ−アルドリッチ社から購入した。Ｌ−チロシン、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）は和光純薬株式会社から購入した。

【0035】

トリフロロメチルスルホン酸はナカライ・テスク社から、塩化トリホスホリルは東京ケミカル工業株式会社から購入し、フェニトロチオン（Fenitrothion）はドクター・エーレンストファーＧｍｂＨ（ドイツ）から購入した。

【0036】

きのこチロシナーゼ酵素はシグマ−アルドリッチ Ｉｎｃ.(米国)から購入し、コウジ酸は関東ケミカル株式会社から入手した。

【0037】

また、別に言及されない限り、使用した試薬のすべてが、分析グレードであり、和光純薬株式会社と関東ケミカル株式会社から得られた。

【0038】

（データ分析）
すべての統計的分析は、ウインドウズ用ＳＡＳバージョン９.1.３を使用し、行われた。有意差分析は、データをワン−ウエイＡＮＯＶＡで分析し、ミーンは、ｐ＝０.０１でのダンカン テストにより分離された。計算は、エクセル、マイクロソフトオフィス２００３で行われた。ＩＣ５０値は、５０％阻害活性を与えるために各化合物において必要とされる濃度としててグラフィカルに決定した。

【0039】

参 考 例 １
ギンネム（L. leucocephala）葉からのミモシンの単離
ギンネム葉サンプルは、２６゜Ｎ、１２７゜Ｅに位置する琉球大学農学部の周囲から採取したものを使用した。ギンネムの新鮮な葉１.５ｋｇを、１０分間、５Ｌの熱水で処理した。

【0040】

この処理水を冷やして流エキス剤とし、吸引濾過によって篩過し、濾過物をイオン交換樹脂（２ｋｇ）に混合した。３０分間撹拌した後に、この撹拌混合物を一夜放置した。このイオン交換樹脂を、蒸留水で５〜６回すすぎ、葉緑素を取り除くために、５Ｌの８０％エタノールを滴下した。

【0041】

次いでこの樹脂に、６ＬのＮＨ_４ＯＨを滴下することで、樹脂からミモシンを含む画分が溶出された。このミモシンを含む流エキス剤は、４０℃、減圧下で最終的に容量３００ｍＬに濃縮され、６Ｎ−ＨＣｌでｐＨ４.５−５.０に調整し、一昼夜４℃で放置することで、ミモシンが沈殿した。

【0042】

得られたミモシンは、５Ｎ−ＮａＯＨを用いてｐＨ９.０の水溶液とした後、これに６Ｎ−ＨＣｌを加えてｐＨ４.５−５.０とすることで再結晶し、次に、４℃に放置することで精製ミモシンを得た。このミモシンは、使用されるまで、−２０℃で保管された。

【0043】

実 施 例 １
ミモシノール(１)および重水素化ミモシトール(２)の合成：
トリフルオロメチルスルホン酸(１８７μＬ、２ｍｍｏｌ)のジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）３.４ｍｌを、２５ｍＬ容の丸底フラスコに取り、これを室温で撹拌した。次いで、トリス（トリエチルシリル）シラン(６１８μＬ、２ｍｍｏｌ)の溶液を滴加し、この混合物を溶液が透明になるまで３時間、室温で撹拌した。

【0044】

ミモシン(０.４ｇ、２ｍｍｏｌ)を、前記丸底フラスコ中に取り、次いでイミダゾール(０.１５ｇ、２.２ｍｍｏｌ)を含む、３.４ｍｌのＤＭＦ−ＣＨ_２Ｃｌ_２混液（１：１）を加えた。反応フラスコを０℃に冷やし、そして、トリス（トリエチルシリル）シリルトリフレートを滴加した。

【0045】

添加が終了した後、反応物は２時間室温下で撹拌し、濾過した。濾過物を蒸留することで、ミモシントリス（トリエチルシリル）シリルエステル（以下、「ミモシンエステル」という）が得られた。

【0046】

水素化ホウ素ナトリウム(ＮａＢＨ_４；０.２８ｇ、７.２ｍｍｏｌ)または重水素化ホウ素ナトリウム(ＮａＢＤ_４；０.３ｇ、７.２ｍｍｏｌ)を含む５０％エタノール溶液３ｍLに、ミモシンエステルを含む５０％エタノール溶液３ｍLを加えた。室温下、得られた混合物を５.５時間還流し、次いで溶剤であるエタノールを減圧下留去した。

【0047】

得られた水溶液を、酢酸エチル(３×２０ｍL)で抽出し、抽出液を合せ、これを飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ソーダで乾燥し、蒸留して無色の結晶としてミモシノール(式（Ｉａ）中、Ｒ_１＝Ｈの化合物）３５２ｍｇ（収率９５％)または無色アモルファスとして重水素化ミモシノール（式（Ｉａ）中、Ｒ_１＝Ｄの化合物；以下、「Ｄ−ミモシノール」という）２７４ｍｇ（収率７３.５％）を得た。

【0048】

以下に得られたミモシノールおよびＤ−ミモシノールの^１Ｈ スペクトルを示す。なお、^１Ｈ スペクトルは、Ｄ_２ＯのＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＣＡ４００（ＪＥＯＬ、日本)で記録した。また、ケミカルシフトは、ＴＭＳに関連づけられたｐｐｍ（δ）で表現した。

【0049】

（ミモシノール）
¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ,４００ＭＨｚ）δ：
8.16 (s, 1H, OH), 7.93 (s, 1H, CH), 7.28 (s, 1H, CH), 3.02-2.86 (d, 2H,
CH),2.72 (s, 2H, NH2), 2.68 (s, 1H, OH), 2.08-1.91 (s, 2H, CH2), 1.58-
1.54 (m, 2H, CH2), 1.22-1.11 (m, 1H, CH).

【0050】

（Ｄ−ミモシノール）
¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ,４００ＭＨｚ）δ：
8.23 (s, 1H, OH), 7.93 (s, 1H, CH), 7.24 (s, 1H, CH), 3.02-2.86 (d, 2H,
CH), 2.72 (s, 2H, NH2), 2.68 (s, 1H, OH), 1.58-1.54 (m, 2H, CH2), 1.22-
1.11 (m, 1H, CH).

【0051】

実 施 例 ２
ミモシンのホスホアミドチオネート誘導体の調製：
（１）ミモシノール（１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２ｍｍｏｌ）を含むジオキサン溶液５ｍＬを、氷浴で冷やした。これに、チオホスホリルクロライド（１ｍｍｏｌ）を含むジオキサン５ｍＬを滴下し、次いで、反応混合物を１時間撹拌した。

【0052】

生成するトリエチルアンモニウムクロライドを濾去し、濾液を二度、ジオキサンによって洗浄した。この濾液に、ナトリウム・メトキシド（１ｍｍｏｌ）のメタノール溶液をゆっくりと加えた。

【0053】

１０分間撹拌した後、溶媒を留去し、油状残渣をクロロホルムで溶かし、これを飽和した塩化ナトリウム溶液で２回洗浄した。この有機相を無水硫酸ソーダ上で乾燥し、蒸留することで、ミモシノール誘導体として後記化合物（１ａ）を、収率４３％で得た。

【0054】

上記反応において、メタノールをエタノールに変えることにより、後記化合物（１ｂ）を収率３９.６％で、メタノールをイソプロパノールに代えることにより、後記化合物（１ｃ）を収率２８.９％で得た。

【0055】

実 施 例 ３
重水素化ミモシンのホスホアミドチオネート誘導体の調製：
Ｄ−ミモシノール（１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液１０ｍＬを、氷浴で冷やし、そして、チオホスホリルクロライド（１ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液１０ｍＬが滴下された。反応混合物は１０分間、１０℃以下の温度で撹拌された。

【0056】

反応終了後、トリエチルアミン塩酸塩が濾去され、濾液が得られた。この濾液に、メタノール（１.４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液１０ｍＬがゆっくりと加えられた。塩素原子のアルキル基への置き換えには、およそ１００分が必要であった。形成したトリエチルアミン塩酸塩は濾去され、そして、濾液は濃縮された。

【0057】

この濾液に、クロロホルムが追加され、クロロホルム溶液は飽和した塩化ナトリウム溶液で２回洗浄された。得られた有機相は、無水の硫酸ソーダの上で乾燥され、更に蒸留してＤ−ミモシノール誘導体として後記化合物（２ａ）を収率１５％で得た。

【0058】

上記反応において、メタノールをエタノールに変えることにより、後記化合物（２ｂ）を収率１２％で、メタノールをイソプロパノールに代えることにより、後記化合物（２ｃ）を収率１０％で得た。

【0059】

［ 化合物（１ａ）； ３−ヒドロキシ−１−（（（４Ｓ）−２−メトキシ−２−スル フィド−１,３,２−オキサアザホスホリジン−４−イル）メチル）ピリジン−
４（１Ｈ）−オン ］
黄色結晶
¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ,４００ＭＨｚ）δ：
9.09 (s, 1H, OH), 8.69 (s, 1H, CH), 7.92 (s, 1H, CH), 7.47 (s, 1H, CH),
3.96-4.00 (m, 2H, CH2), 3.90-3.94 (m, 3H, CH3), 3.16-3.22 (m, 2H, CH2),
1.27 (s, 1H, NH).

【0060】

［ 化合物（１ｂ）； １−（（（４Ｓ）−２−エトキシ−２−スルフィド−１,３,
２−オキサアザホスホリジン−４−イル）メチル）ヒドロキシピリジン−４
（１Ｈ）−オン ］
黄色結晶
^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ,４００ＭＨｚ）δ：
9.09 (s, 1H, OH), 8.69 (s, 1H, CH), 7.92 (s, 1H, CH), 7.47 (s, 1H, CH),
3.98-4.02 (m, 2H, CH2), 3.95-3.98 (m, 3H, CH3), 3.62 (m, 2H, CH2), 3.18-
3.20 (m, 2H, CH2), 1.27 (s, 1H, NH).

【0061】

［ 化合物（１ｃ）； ３−ヒドロキシ−１−（（（４Ｓ）−２−プロポキシ−２−
スルフィド−１,３,２−オキサアザホスホリジン−４−イル）メチル）ピリジ
ン−４（１Ｈ）−オン ］
黄色結晶
¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ,４００ＭＨｚ）δ：
9.09 (s, 1H, OH), 8.69 (s, 1H, CH), 7.92 (s, 1H, CH), 7.47 (s, 1H, CH),
3.98-4.00 (m, 2H, CH2), 3.95-3.98 (m, 3H, CH3), 3.62 (m, 2H, CH2), 3.18
-3.20 (m, 2H, CH2), 1.27 (s, 1H, NH), 0.94-0.89 (m, 2H, CH2).

【0062】

［ 化合物（２ａ）； 重水素化３−ヒドロキシ−１−（（（４Ｓ）−２−メトキシ−
２−スルフィド−１,３,２−オキサアザホスホリジン−４−イル）メチル）ピリ
ジン−４（１Ｈ）−オン ］
黄色結晶
¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ,４００ＭＨｚ）δ：
9.09 (s, 1H, OH), 8.69 (s, 1H, CH), 7.92 (s, 1H, CH), 7.47 (s, 1H, CH),
3.90-3.94 (m, 3H, CH3), 3.16-3.22 (m, 2H, CH2), 1.27 (s, 1H, NH).

【0063】

［ 化合物（２ｂ）； 重水素化１−（（（４Ｓ）−２−エトキシ−２−スルフィド−
１,３,２−オキサアザホスホリジン−４−イル）メチル）ヒドロキシピリジン−
４（１Ｈ）−オン ］
黄色結晶
¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ,４００ＭＨｚ）δ：
9.09 (s, 1H, OH), 8.69 (s, 1H, CH), 7.92 (s, 1H, CH), 7.47 (s, 1H, CH),
3.95-3.98 (m, 3H, CH3), 3.62 (m, 2H, CH2), 3.18-3.20 (m, 2H, CH2),
1.27 (s, 1H, NH).

【0064】

［ 化合物（２ｃ）； 重水素化３−ヒドロキシ−１−（（（４Ｓ）−２−プロポキシ
−２−スルフィド−１,３,２−オキサアザホスホリジン−４−イル）メチル）ピ
リジン−４（１Ｈ）−オン ］
黄色結晶
¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ,４００ＭＨｚ）δ：
9.09 (s, 1H, OH), 8.69 (s, 1H, CH), 7.92 (s, 1H, CH), 7.47 (s, 1H, CH),
3.95-3.98 (m, 3H, CH3), 3.62 (m, 2H, CH2), 3.18-3.20 (m, 2H, CH2),
1.27 (s, 1H, NH), 0.94-0.89 (m, 2H, CH2).

【0065】

実 施 例 ３
シロアリに対する外用アッセイ：
各実施例で得られた化合物の、急性毒性の生化学的アッセイは、これを働きシロアリへの外用投与によって実施した。各化合物をエタノールに溶解し、その少量（０.５μＬ）を、各シロアリ１匹に投与した場合、それぞれ０.２５、０.５、１.５、２.５、７.５、１２.５および２５μｇとなるよう７つの異なる投与溶液を調製した。コントロールとしては、エタノールのみのものを利用し、陽性コントロールとしては、フェニトロチオンとロテノンを使用した。

【0066】

各投与溶液０.５μＬを働きシロアリの腹部に外用投与後、これらのシロアリをフィルタ−ペーパーを敷き詰めたペトリ皿(直径４.２ｃｍ)に移し、インキュべーター中で、２３−２５℃に保持した。実験の間、湿気を維持するために毎日ペトリ皿のボトムエッジに数滴の蒸留水を供給した。実験は、シロアリ各２０匹での処理を、４反復で行った。

【0067】

外用投与処理４８時間後に、昆虫の生死を判断し、死亡率を求めた。昆虫が動かなくなり、外部刺激に反応しなくなったときは、昆虫が死んだとして評価した。ここで求めた死亡率から、グラフパッド・プリズム（Graphpad Prism） ６.０１を使用するプロビット解析によってＬＤ_５０が計算された。この結果を表１に示す。

【0068】

【表1】

【0069】

表１に示すように、ミモシノールとその誘導体（化合物１ａーｃ）は、０.５３９−１.２３４μｇ／シロアリで強い殺虫効果を有していたのに対し、Ｄ−ミモシノールとその誘導体（化合物２ａーｃ）では、１.２３−１.７８μｇ／シロアリというやや低い殺虫活性を示した。

【0070】

実 施 例 ４
シロアリに対する非選択的アッセイ：
殺虫活性の評価のための非選択的バイオアッセイは、多和田らの手法（Tawata, S.ら、“Biosci., Biotechno., Biochem.”（1996）, 60, 1643-1645.）にしたがっておこなわれた。試験化合物は、エタノールおよびアセトン中に３つの濃度(５０、１００、２５０ｐｐｍ)となるように溶解し、ペトリ皿(直径８.５ｃｍ)に入れられたフィルターペーパーに適用した。また、コントロールとしては、エタノールおよびアセトンで処理されたフィルターペーパーを使用した。ロテノンとフェニトロチオンを陽性コントロールとして使用した。

【0071】

これらフィルターペーパーを、室温下、２４時間の風乾を行うことによって溶剤をフィルターペーパーから除去し、２０匹のシロアリをそれぞれのフィルターペーパー片の上に置いた。次いで、ペトリ皿はカバーされ、２３℃のインキュベーター中に置かれた。実験の間湿気を維持するために、毎日ペトリ皿のボトムエッジに数滴の蒸留水が供給された。実験は、２回繰り返す各処理を、４回反復実施した。

【0072】

シロアリをフィルターペーパーに置いてから７日後にその生死を調べ、死亡率を評価した。昆虫が動かなくなり、外部刺激に反応しなくなったとき、昆虫が死んだとして評価した。昆虫の死亡率は、コントロール群のシロアリとの比較でのパーセンテージとして計算した。この結果を表２に示す。

【0073】

【表2】

【0074】

表２から、ミモシノール、Ｄ−ミモシノールおよびそれらの誘導体に強い殺虫力があったことを示される。この中でも、化合物１ｂおよび化合物１ａは、それぞれ、５０および１００μｇ／ｍＬ、処理後７日目で、死亡率５２−６２％、７１−８８％というシロアリに対する優れた活性を示した。これらの２個の化合物の殺虫力は、商業的に使用されている殺虫剤のロテノンに匹敵する。

【0075】

実 施 例 ５
Ｃ.エレガンスを用いる抗線虫活性アッセイ：
アッセイは、以前に説明された手順（Jang, S.-H.ら、“Biotechnology Letters.” （2004）, 26, 287-291.およびSolis, G. M.ら、“ J. Visualized experiments.” （2011）, 49, 1-6.）に若干の修正を加えて行った。線虫、カエノラブディテス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）は、大腸菌ＯＰ５０で覆われた、線虫培養培地（ＮＧＭ）［３ｇのＮａＣｌ、１５ｇの寒天、２.５ｇのポリペプトン、１３６.１ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、１７.９ｇ のＫＯＨ、１ＭのＭｇＳＯ_４の１ｍＬ、１ＭのＣａＣｌ_２の１ｍＬ、コレステロールの１ｍＬ(５ｍｇ／ｍＬ)、アンピシリンの５００μＬ(１００μｇ／ｍＬ)］プレートで培養された。耐アンピシリンのＯＰ５０は、虫培養物の交差汚染を防ぐためのフィードソースとして使用した。

【0076】

２０℃での４日間の培養の後、ＮＧＭプレートは、線虫でいっぱいであった。同期された虫の培養物の準備において、Ｓ−ベーザルバッファ（５.８５ｇ ＮａＣｌ、１ｇ Ｋ_２ＨＰＯ_４、６ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、1リットルあたり１ｍＬのコレステロール（５ｍｇ／ｍＬエタノール））で線虫は寒天培地からすすぎ落とされ、二度Ｓ−ベーザルバッファーで洗われ、家庭用漂白剤／１０Ｎ ＮａＯＨ溶液が加えられた。

【0077】

上記溶液の上清を１０−１５分間振蕩し、３０００ｒｐｍ、１分間の遠心で３回洗浄し、これをＳ−ベーザルバッファに再度懸濁させた。線虫／ＯＰ５０(１.２×１０^９バクテリア／ｍＬ)溶液１００μＬを９６ウエルプレートの各ウエルに移し、ミモシンと実施例で得た各化合物のサンプル液２０μＬを、最終的濃度が５０、１００、２５０および５００μＭとなるように加えた。水はネガティブコントロールとして使用した。各処理は、４回反復で行われ、実験は２度繰り返した。

【0078】

プレートは、２−３分間、激しく振蕩し、次いで２０℃でインキュベーションした。処理４８時間後に、死んだ線虫および活動的な線虫の数を記録し、線虫の死亡率は、コントロール群と比較したパーセンテージで計算した。ミモシンについての結果を図３に、ミモシノールおよび関連化合物についての結果を図４に、重水素化ミモシノール及び関連化合物についての結果を図５にそれぞれ示す。

【0079】

この結果、興味あることに、ミモシンには、ＩＣ_５０値で１６.８１μＭという高い抗線虫活性があった（図３）。これに対し、ミモシノールおよびその重水素化物は、それぞれＩＣ_５０値で３７６.１９μＭおよび３９０.０３μＭというより弱い抗線虫活性であった（図４、図５）。

【0080】

また、ミモシノールから誘導されるホスホアミドチオネートは、Ｄ−ミモシノールから誘導される対応物より強い抗線虫活性があった。特に、化合物１ａと１ｂは強い抗線虫活性を示した。化合物１ｂのＩＣ_５０は、５０.２１μＭであり、化合物１ａのそれは３１.８１μＭであった。他の誘導体も、Ｃ.エレガンスに対する抗線虫活性が明らかであった。

【0081】

実 施 例 ６
アセチルコリンエステラーゼ(ＡＣｈＥ)阻害活性測定：
シロアリ全虫体(２０ｍｇ)を０.１Ｍの燐酸塩バッファ(ｐＨ８.０)でホモゲナイズし、得られたホモジェネートを、１２,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。この上清をＡＣｈＥの酵素源として使用した。酵素を調製するための全ての工程は、４℃で行われた。

【0082】

２５μＬの試料を、０.１Ｍの燐酸塩バッファ(ｐＨ８.０)１２５μＬを含む９６ウエルマイクロプレートに移し、次いで、酵素溶液(３０μＬ)が加えられた。この混合物を、２５℃で１０分間反応させ、次いで、ＤＴＮＢ５０μＬ（最終濃度 ０.４ｍＭ)およびヨウ化アセチルコリン２５μＬ(最終濃度 １ｍＭ)が加えられた。

【0083】

このもののＡＣｈＥ酵素活性を、改変されたエレマン（Ellman）法を使用し、４１２ｎｍで２０分間測定された。コントロールとしては、水２５μＬのみを加えたものを使用した。酵素活性は、ＡＣｈＥ抑制阻害分析を、各処理あたり４反復で、二度繰り返して行なうことによりおこない、以下の式からＡＣｈＥ活性の阻害率をパーセンテージで計算した。

【0084】

％阻害＝（Ａｏ−ＡＥ）／Ａｏ×１００
Ａｏ：コントロールの吸収
ＡＥ：試験サンプルの吸収

【0085】

この結果を図１に示すが、ミモシノールとその誘導体(化合物１ａ−ｃ)には、相対的なＡＣｈＥ抑制活性があった。すなわち化合物１ａと１ｂのＡＣｈＥ酵素に対するＩＣ_５０値は、それぞれ９５.８７μＭおよび１０４.０３μＭであり、フェニトロチオンのＩＣ_５０値、１８１.４９μＭより低かった。この結果は、Ｄ−ミモシノールおよびその誘導体(化合物２ａ−ｃ)と比べ、かなり良かった。

【0086】

実 施 例 ７
チロシナーゼ阻害活性分析：
チロシナーゼの阻害活性分析のためマイクロプレート試験は、文献記載の手順（Tadtong, S.ら“ J Health Res.”（2009）, 23, 99-102.）に従って行われた。

【0087】

まず、種々の濃度の試料（２０μＬ）を、９６ウエルプレートの各々のウエルに取り、これに２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ(ｐＨ６.８)の１２０μＬおよびバッファに溶解した２０μＬの５００Ｕ／ｍＬきのこチロシナーゼ酵素の２０μＬを加え混合した。混合物は、１５分間、２５℃でインキュベートされ、次に、０.８５ｍＭ Ｌ−チロシン溶液２０μＬを加えた。マイクロプレートリーダー(ベンチマーク プラス、ビオラッド社、イギリス)を使用し、４７０ｎｍでの吸収を記録した。この吸収値から、下記式により阻害率を求めた、なお陽性コントロールとしては、コウジ酸を使用した。

【0088】

阻害(％) ＝［（ＣＥ−Ｃｏ）−（ＳＥ−Ｓｏ）］／（ＣＥ−Ｃｏ）×１００
ＣＥ：酵素を含むコントロールの吸収
Ｃｏ：酵素を含まないコントロールの吸収
ＳＥ：酵素を含む試験サンプルの吸収
Ｓｏ：酵素を含まない試験サンプルの吸収

【0089】

この結果を図２に示すが、ミモシノールと重水素化ミモシノールは、それぞれのＩＣ_５０値が、３１.３８μＭおよび４６.０８μＭと、コウジ酸に匹敵チロシナーゼに対する強い阻害活性を有していた。これに対し、これらの誘導体は、それより低いチロシナーゼ阻害活性であった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】