特許 6336473 タンパク質沈殿のためのコポリマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6336473

(24)【登録日】2018年5月11日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】タンパク質沈殿のためのコポリマー

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/30 20060101AFI20180528BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/30

【請求項の数】15

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2015-548253(P2015-548253)

(86)(22)【出願日】2013年11月25日

(65)【公表番号】特表2016-501275(P2016-501275A)

(43)【公表日】2016年1月18日

(86)【国際出願番号】EP2013003552

(87)【国際公開番号】WO2014094957

(87)【国際公開日】20140626

【審査請求日】2016年11月25日

(31)【優先権主張番号】12008475.1

(32)【優先日】2012年12月20日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591032596

【氏名又は名称】メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】バウアー，ヨハン

(72)【発明者】

【氏名】ラップ，アルマット

(72)【発明者】

【氏名】スタニスラウスキー，ベルント

(72)【発明者】

【氏名】カピト，フロリアン

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０２５５０２７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５２８７８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１４６３９４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５１６７７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０５９２２５３１（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／３０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）試料を供給すること、
ｂ）疎水性およびアニオン性基を含む１または２以上のコポリマーを試料とともに混合すること、それによって標的分子−コポリマー沈殿物が形成され、
ｃ）ステップｂ）の混合物から沈殿物を分離すること
を含む、試料から標的分子を単離する方法であって、
前記疎水性基は、ベンジルアクリルアミド（ＢｚＡＡｍ）、ベンジルメタクリラート（ＢｚＭＡ）、Ｎ−イソプロピルアクリアミド（ＮＩＰＡＭ）、メチルメタクリラート（ＭＭＡ）、ブチルアクリラート、ｔｅｒｔ−ブチルアクリラートおよび４−（アクリルアミド）安息香酸（４−ＡＢＺ）から選択される少なくとも１種のモノマー単位により導入され、
前記アニオン性基は、２−アシルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、ビニルスルホン酸（ＶＳ）、スチレンスルホン酸および（メタ）アクリル酸から選択される少なくとも１種のモノマー単位により導入されることを特徴とする、前記方法。

【請求項2】

コポリマーの疎水性およびアニオン性基のうち３５〜６５％が、アニオン性基であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

疎水性基が、ベンジルアクリルアミド（ＢｚＡＡｍ）および４−（アクリルアミド）安息香酸（４−ＡＢＺ）から選択される少なくとも１種のモノマー単位により導入され、アニオン性基が、２−アシルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）により導入されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

疎水性基が、直鎖状、分枝状または環状のアルキル基、ハロゲンで置換されたアルキル基、芳香族基、複素芳香族基、ハロゲンで置換された芳香族および／または複素芳香族基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

コポリマーが、１０，０００ｇ／ｍｏｌと１２０，０００ｇ／ｍｏｌとの間の重量平均分子量、および／または、１．０５〜２．５の間の多分散性を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

標的分子が、抗体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ステップａ）において、試料のｐＨが、標的分子の等電点より下のｐＨに調節されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

ステップａ）において、試料のｐＨが、４と５．５との間のｐＨに調節されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

試料のイオン強度が、２０℃で測定された、１７ｍＳ／ｃｍ以下の導電率と等しくなるように調節されることを特徴とする、請求項１〜８の記載のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

標的分子が、抗原結合領域断片であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

試料のイオン強度が、２０℃で測定された、９ｍＳ／ｃｍと１８ｍＳ／ｃｍとの間の導電率と等しくなるように調節されることを特徴とする、請求１０に記載の方法。

【請求項12】

さらなるステップｄ）において、ステップｃ）からの沈殿物が、再溶解されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ステップｄ）の再溶解された混合物が、高分子電解質を備えるビーズで処置されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

高分子電解質を備えるビーズが、ガラスまたはシリカフレークであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

高分子電解質が、ＤＭＡＥおよび／またはＴＭＡＥ基を含むことを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養液体からの捕捉または浄化のために、コポリマーを使用する、組換えおよび／またはバイオ治療タンパク質のような標的分子の精製に関する。本発明のプロセスに従い使用されるコポリマーは疎水性およびアニオン性の残基を含む。

【背景技術】

【0002】

モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、臨床応用、診断システムおよび異なる研究分野で広く使用される。これらのタンパク質の生産は、哺乳動物細胞発現システムを使用して、１９８６年における最初の認可生産から、大いに成長した。今まで、主に３つの異なる細胞株：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫（ＮＳ０）およびＳｐ２／０細胞が、ｍＡｂ生産のために使用される一方で、生産は、５０００リットルから２５０００リットルまでの範囲のバイオリアクターで行われる。

【0003】

一般に、抗体およびバイオ治療タンパク質の下流処理は、例えばディスクスタック遠心分離機等を使用するファーメンターの回収に始まり、その後、デプスメンブレンフィルターシステム(depth- and membrane filter system)に通して浄化する、一連の精製ステップを使用する。その後、いくつかのクロマトグラフィーステップが使用され、それは、プロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィーを使用する最初の捕捉に始まり、その後陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィーに続く。

【0004】

追加のクロマトグラフィーステップは、疎水性または親水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを含むことができる。ウイルス不活性化は、低ｐＨ溶出を介し達成され、追加の濾過が残留ウイルス粒子を除去する。しかしながら、２５年前の１ｇｌ^−１に比べ、最近の１０〜１３ｇｌ^−１の細胞培養発現レベルの増加並びに経済的圧力の上昇は、現在のクロマトグラフィーをベースとしたシステムの性能と比較し、より高い収率およびハイスループットを有する、増強された精製方法の必要性を要求する。

【0005】

これらの需要は、クロマトグラフィーカラム材料容積、カラム寸法を増大させること、または、クロマトグラフィーに代わる精製手段を開発すること、のいずれかによって満たされることがある。これらは、同等の収率および純度を得るべきであるが、また一方で、コストを下げ、より良好に拡大縮小可能であるべきである。ラージスケールの領域においては、バッチ精製方法が開発され、所望のタンパク質が回収細胞溶液から沈殿する。これによって、タンパク質沈殿のよく用いられる方法は、アンモニア硫酸沈殿（ＡＳ）(Venkiteshwaran, Heider, et al., 2008)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿であるか、または、沈殿剤としてカプリル酸を使用することである（Wang, Diehl, et. al., 2009; Temponi, Kageshita, et al., 1989）。

【0006】

しかしながら、ラージスケール精製においてＰＥＧまたはＡＳを使用することは、それらの大量の沈殿剤およびより高濃度のタンパク質を必要とし、中程度の純度グレードしか産出せず、高い廃棄物負荷を生産することになる。既存の精製方法は費用がかかり、大きなバッファー体積により骨が折れ、ならびに、低ハイスループット（クロマトグラフィー）または十分な純度および収率（沈殿）を欠く。低ｐＨでのプロテインＡからの結合ｍＡｂの溶出は、免疫原性の凝集(immunogenic aggregates)を形成する場合があり、それらを除去し、プロテインＡをろ過することは、さらにコストを増加させる。

【発明の概要】

【0007】

したがって、プロテインＡクロマトグラフィーに代わる手段およびタンパク質および抗体精製における改善が早急に必要とされる。加えて、抗体の抗原結合領域である断片は、診断および治療における適用への関心が高まっている。かかる断片を得るために、エンドペプチターゼを使用することができる。パパインによるモノクローナル抗体の処置は、抗原結合断片(antigen binding fragment)または抗原に結合する断片(fragment antigen binding)を産生するためによく用いられる方法であり、抗体の定常領域を表すＦｃ断片の生産をもまた結果として生じる。

【0008】

ＦａｂおよびＦｃを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、分離することができるが、しかし、この分離技術は、Ｖ_Ｈ３サブファミリーに属するｍＡｂ由来のＦａｂにとっては不十分である。それは、この種のＦａｂに対するプロテインＡの結合親和性が原因である。ヒト化ｍＡｂは、Ｖ_Ｈ３の多種多様な遺伝子配列に大きく依存する。加えて、ヒトファージディスプレイライブラリーは、Ｖ_Ｈ３が多く存在することを示す。よってＦａｂおよびＦｃ断片を分離するための代替戦略が必要とされる。修飾されたプロテインＡは１つの選択肢である一方、むしろコスト高である。

【0009】

ごく近年に追及されたプローチは、カスタマイズに対する需要がなく、大多数の抗体に適用されてもよい沈殿剤としてポリマーを使用することである。

【0010】

US 6,927,282は、ポリマーの軟凝集(flocculation)のための異なる電荷密度を有するアニオン性ポリマーの使用を開示する。US 5,922,531は、タンパク質吸着のための高分子電解層で処置された、制御された孔ガラスの使用に言及する。WO 2008/079280は、ある条件下で溶解し、条件変更の際に溶液から沈殿する高分子電解層の使用を開示する。
WO 2008/091740は、タンパク質沈殿のためのポリアニオン性またはポリカチオン性ポリマーの使用を開示する。

【0011】

これは、沈殿剤としてポリマーを使用するアプローチがより多くの関心を集めることを示す。しかし、バイオ医薬の生産に好適であるのに十分効率的である方法を見つけるという問題が依然としてある。加えて、種々の標的分子のための手順を調節し、最適化するという問題も依然としてある。

【0012】

本発明の簡単な説明
アニオン性および疎水性特性を有するポリマー−いわゆるアニオン性混合モードポリマー−が、タンパク質沈殿に対し、理想的なポリマーであることが見出された。疎水性およびアニオン性基を含む、ポリマーを使用することにより、抗体は、最大９０％までの収率で、浄化された細胞培養培地から沈殿され得、良好な純度でより多くの抗体を回収し得る。

【0013】

よって、本発明は、試料から標的分子を分離または単離するための方法に向けられ、
ａ）試料を提供すること、
ｂ）疎水性およびアニオン性基を含む１または２以上のコポリマーを試料に加えること、それによって標的分子−コポリマー沈殿物が形成され、
ｃ）ステップｂ）の混合物から沈殿物を分離すること
を含む。

【0014】

好ましい態様において、コポリマーが３５〜６５％アニオン性基を含む。
１つの好ましい態様において、アニオン性基は、スルホン酸、硫酸、カルボン酸および／またはホスホン酸またはリン酸を含む。

【0015】

別の好ましい態様において、疎水性基は、直鎖状、分枝状または環状のアルキル基、ハロゲンで置換されたアルキル基、芳香族基、複素芳香族基および／またはハロゲンで置換される芳香族または複素芳香族基を含む。

【0016】

別の好ましい態様において、コポリマーは、１０，０００ｇ／ｍｏｌと１２０，０００ｇ／ｍｏｌとの間の重量平均分子量および／または１．０５〜２．５０の間の多分散性を有する。
好ましい態様において、標的分子は、抗体である。
別の好ましい態様において、標的分子は、抗体のＦｃ（定常領域の断片）の一部またはＦａｂ（抗原結合の断片）領域のいずれかである。

【0017】

好ましい態様において、ステップａ）における試料のｐＨは、標的分子の等電点より下であり、かつ適用可能である場合、それが分離されるべき試料の他の成分の等電点より上であるｐＨに調節される。
好ましい態様において、ステップａ）における試料のｐＨは、４と５．５との間のｐＨに調節される。

【0018】

別の好ましい態様において、試料のイオン強度は、２０℃で測定された、１７ｍＳ／ｃｍ以下の導電率と同様となるように調節される。
別の好ましい態様では、さらにステップｄ）において、ステップｃ）からの沈殿物が、再溶解される。

【0019】

別の好ましい態様において、ステップｄ）の再溶解された混合物は、シリカまたはガラスフレークで処置される。
別の好ましい態様において、シリカまたはガラスフレークは、ＤＭＡＥおよび／またはＴＭＡＥ基で官能化される。

【図面の簡単な説明】

【0020】

図

【図1】図１は、本発明の方法において使用されるコポリマーに好適な基本単位(building block)の異なる種の化学構造を示す。

【0021】

【図2】図２は、ａ）本発明による精製技術で処置されたモノクローナル抗体Cetuximab、ｂ）沈殿に供されていないモノクローナル抗体Cetuximabの２次構造を比較するため、スペクトルのオーバーレイとして中赤外スペクトルを示し、および、抗体の２次構造が、沈殿の際に有意に変化しないことを示す。

【0022】

【図3】図３は、ａ）沈殿しないモノクローナル抗体、ｂ）同封の精製技術で処置された、沈殿させられ再溶解したモノクローナル抗体のバイオレイヤー干渉分光法（ＢＬＩ）後のセンサーグラムを示す。それは、沈殿および非沈殿の抗体の結合アフィニティーにおける差異がないことを明らかにする。赤線は、１：１相互作用モデルに対する広範囲なフィッティングを示す。データはOctet Redを使用して集めた。非沈殿および沈殿した抗体の動力学は、同じ抗原を含有するウェル（６、４、３、２および１ｎＭ）において測定した。

【0023】

定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、組成物またはプロセスステップが変動してもよいため、特定の組成物またはプロセスステップに限定されないことが理解されるべきである。本明細書および添付のクレームにおいて使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈から明確に定められない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「リガンド（単数）」への言及は複数のリガンドを含み、「抗体（単数）」への言及は複数の抗体などを含む。

【0024】

別途定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術または科学用語は、本発明が関連する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。以下の用語は、本発明の目的において、本明細書に記載されるとおりに定義される。

【0025】

本明細書に使用される用語「標的分子」は、１または２以上の他の化合物（例えば試料中の不純物等）から、単離、分離または精製されるべき、あらゆる分子、物質または化合物を指す。標的分子の例は、抗体、抗原に結合する断片（Ｆａｂ）、定常領域の断片（Ｆｃ）、タンパク質、ペプチド、組換えタンパク質、他の天然の化合物、他のバイオ医薬化合物、ワクチンまたはバイオ医薬化合物の集合体等である。

【0026】

好ましい態様において、標的分子は、生体分子、好ましくは、タンパク質である。極めて好ましい態様において、標的分子は、抗体である。典型的には、標的分子は、本発明の方法を適用することにより、単離されるべき産物であるが、単離される産物ではない標的分子を沈殿させるために、本発明の方法を用いることもまた可能である。

【0027】

このケースにおいて、標的分子は除去されるべき成分である一方、最終産物は上清中に残存し、標的分子を除去することにより精製される。ＦａｂおよびＦｃ断片の精製および分離のために本発明を使用するとき、例えば、沈殿される標的分子が、望まれる産物であることも可能であるが、望まれる産物が上清中に残存する断片である一方、ある種の断片を沈殿させることもまた可能である。あらゆるケースにおいて、沈殿される成分は、標的分子と呼ばれる。

【0028】

用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。典型的には、抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる４ポリペプチド鎖の基本構造を有し、前記鎖は、例えば鎖間ジスルフィド結合等により、安定化されている。抗体は、モノクローナルであっても、ポリクローナルであってもよく、モノマーまたはポリマーの形態で存在していてもよく、例えばＩｇＭ抗体は５量体形態で存在し、および／または、ＩｇＡ抗体は単量体、二量体または多量体の形態で存在する。

【0029】

抗体はまた、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体等）も、それらが、リガンド特異的な結合ドメインを保持またはそれを含むように修飾される限り、抗体断片も含んでよい。用語「断片」は、無傷または完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む、抗体または抗体鎖の一部または一部分を指す。

【0030】

断片は、無傷または完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的な処置を介して得ることができる。断片はまた、組換え手段によっても得ることができる。組換え的に産生される場合、断片は、単独で、または、融合タンパク質と呼ばれるより大きなタンパク質の一部として、発現されてもよい。例となる断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖ断片等を含む。例となる融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質等を含む。本発明によると、融合タンパク質はまた、用語「抗体」によっても包含される。

【0031】

上述したように、いくつかの態様において、抗体は、Ｆｃ領域を含有するタンパク質、例えば免疫グロブリン等である。いくつかの態様において、Ｆｃ領域を含有するタンパク質は、別のポリペプチドまたはそれらの断片に融合した免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、組換えタンパク質である。

【0032】

例となるポリペプチドは、例えば、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む、成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１アンチトリプシン；インスリンα鎖；インスリンβ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびヴォン・ヴィレブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；

【0033】

造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T- cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラキシンα鎖；リラキシンβ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；

【0034】

ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（例えばＣＴＬＡ−４等）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）などの神経栄養因子、または、ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；αＦＧＦおよびβＦＧＦなどの繊維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−βｌ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（Ｉ−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰｓ）；

【0035】

ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４およびＣＤ４０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−βおよび−γなどのインターフェロン；例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）；例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０等のインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープの一部分等のウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭなどのインテグリン；

【0036】

ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連抗原；ならびに、上に列記されたポリペプチドのいずれかの断片および／または変異体を含む。加えて、本発明の抗体は、上に列記されたポリペプチドのいずれかに特異的に結合する、あらゆるタンパク質またはポリペプチド、それらの断片または変異体である。

【0037】

本明細書に使用されるとおりであるが、特に記載のない限り、用語「試料」は、標的分子を含有するあらゆる組成物または混合物を指す。試料は、生物学的なまたは他の供給源に由来してもよい。生物学的な供給源は、植物および動物細胞、組織および器官など、真核性および原核性の供給源を含む。好ましい試料は、哺乳動物細胞培養のような細胞培養液、例えばＣＨＯ、ＮＳ−０、ＳＰ２／０、ＢｉｏＷａ、細菌細胞培養等、例えばE. coli、B. subtilis、酵母細胞培養または糸状菌からのものである。

【0038】

試料はまた、希釈剤、バッファー、界面活性化剤、および、標的分子との混合物から見出される汚染種、デブリなども含んでもよい。試料は、「部分的に精製され」てもよく（すなわち、濾過ステップなどの１または２以上の精製ステップに供される）、または、標的分子を産生する宿主細胞または生体から直接的に得られてもよい（例えば、試料が、回収される細胞培養液を含んでよい）。

【0039】

本明細書に使用される用語「不純物(impurity)」または「汚染物(contaminant)」は、外来のまたは好ましくないあらゆる分子を指し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１または２以上の宿主細胞タンパク質、核酸、エンドトキシン、脂質、合成起源の不純物などの生物学的な巨大分子、および、本発明のプロセスを使用して、外来のまたは好ましくない分子の１または２以上から分離される、標的分子を含有する試料中に存在していてもよい、１または２以上の添加物を含む。加えて、かかる不純物は、本発明の方法に先立ち存在してもよいステップにおいて使用されるあらゆる試薬を含んでもよい。

【0040】

本明細書において互換的に使用される用語「精製すること」、「分離すること」または「単離すること」は、標的分子の純度を、標的分子および１または２以上の他の成分（例えば不純物等）を含む組成物または試料からそれを分離することによって、高めることを指す。典型的には、標的分子の純度を、組成物から、少なくとも１つの不純物を（完全にまたは部分的に）除去することにより高める。

【0041】

用語「クロマトグラフィー」は、混合物中に存在する他の分子から、目的の分析物（例えば標的分子等）を分離する、あらゆる種類の技術を指す。通常、標的分子は、混合物の個々の分子が、移動相の影響下または結合および溶出プロセスにおいて、静止した媒体を介して移動する速度の差異の結果として、他の分子から分離される。

【0042】

用語「アフィニティークロマトグラフィー」は、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有する目的のタンパク質または抗体等）が、標的分子に特異的なリガンドに対し特異的に結合する、タンパク質分離技術を指す。かかるリガンドは、一般的に、生体特異的リガンドといわれる。いくつかの態様において、生体特異的リガンド（例えばプロテインＡまたはそれらの機能的変異体等）は、クロマトグラフィーマトリックス材料に共有結合的に取り付けられ、溶液がクロマトグラフィーマトリックスに接触する際に、溶液中の標的分子に接近しやすい。

【0043】

標的分子は、一般的に、クロマトグラフィーのステップの間、生体特異的リガンドに対するその特異的結合アフィニティーを保持する一方、混合物中の他の溶質および／またはタンパク質は、目に見えるほどに(appreciably)または特異的にリガンドへ結合しない。固定化リガンドへの標的分子の結合によって、汚染タンパク質またはタンパク質不純物が、クロマトグラフィーマトリックスを通過することができる一方、標的分子は、固体相材料上に固定化されたリガンドへ特異的に結合したままである。

【0044】

特異的に結合した標的分子は、次いで、好適な条件下（例えば低ｐＨ、高ｐＨ、高塩、競合リガンドなど）、固定化リガンドから活性化形成で除去され、溶出バッファーによりクロマトグラフィーカラムを通過させる。そこには、前にカラムを通過することができた汚染タンパク質またはタンパク質不純物の汚染がない。

【0045】

あらゆる成分が、そのそれぞれの特異的結合タンパク質（例えば抗体等）を精製するためのリガンドとして、使用することができる。しかしながら、本発明による様々な方法において、プロテインＡが、Ｆｃ領域を含有する標的分子に対するリガンドとして使用される。標的分子（例えばＦｃ領域を含有するタンパク質等）の生体特異的リガンド（例えばプロテインＡ等）からの溶出のための条件は、当業者によって容易に決定されることができる。

【0046】

いくつかの態様において、プロテインＧまたはプロテインＬまたはそれらの機能的変異体は、生体特異的リガンドとして使用されてもよい。いくつかの態様において、プロテインＡなどの生体特異的リガンドは、Ｆｃ領域を含有するタンパク質へ結合させること、生体特異的リガンド／標的分子コンジュゲートを洗浄または再平衡化すること、において、５〜９のｐＨ範囲で使用され、その後、少なくとも１つの塩を含有し、約４または４未満のｐＨを有するバッファーで溶出される。

【0047】

標的分子（例えばＦｃ領域を含有するタンパク質等）とコポリマー分子との間の相互作用を記載するために本明細書中に使用される用語「結合」は、例えばタンパク質およびコポリマー構造等の結合部位での空間相補性の複合効果を通じて、結合部位での静電気力、水素結合、疎水性相互作用および／またはファンデルワールス力によりカップリングされた、標的分子のコポリマー分子への一般的な可逆的な結合を指す。

【0048】

一般的に、空間相補性が大きくなればなるほど、および、結合部位における他の力が強くなればなるほど、そのそれぞれのリガンドに対するタンパク質の結合特異性は大きくなるであろう。特異的結合の非限定例は、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、酵素−補因子結合、金属イオンキレート、ＤＮＡ結合タンパク質−ＤＮＡ結合、調節タンパク質−タンパク質相互作用などを含む。理想的には、アフィニティークロマトグラフィーにおいて、特異的結合は、自由溶液中、約１０^“４〜１０^”８Ｍのアフィニティーで生じる。

【0049】

「バッファー」は、その酸−塩基のコンジュゲート成分の作用により、ｐＨの変化に抵抗する溶液である。例えばバッファーの所望のｐＨ等に依存し、用いることができる様々なバッファーは、Buffer A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)に記載される。バッファーの非限定例は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩およびアンモニウムバッファー並びにこれらの組み合わせを含む。

【0050】

本発明によると、用語「バッファー」は、
ａ）本発明の範囲内で使用される標的分子またはいずれか他の分子を含有する溶液の、ｐＨおよび／またはイオン強度、または、他の化学的または物理的な特性を調節するために、
ｂ）本発明の範囲内で使用される沈殿した標的分子またはいずれか他の分子を洗浄するために、
ｃ）本発明の範囲内で使用される沈殿した標的分子またはいずれか他の分子を再溶解するために、
使用される、あらゆる液体組成物に対して使用される。

【0051】

本発明によると、用語「重合」または「コポリマーの合成」は、互換的に使用することができ、以下の技術：これらに限定されないが、フリーラジカル重合、リビングラジカル重合（ＡＴＲＰ、ＲＡＦＴ、ＮＭＰなど）、アニオン性またはカチオン性重合、縮合重合またはあらゆる種類の開環重合の１つを使用する、コポリマーまたはポリマー合成を指してもよい。フリーラジカル重合は、例えば熱的に、光化学的に、酸化還元反応を通し、または、電気化学的に、開始してよい。

【0052】

本発明によれば、モノマー比は、コポリマーに存在する他の全ての種のコポリマー対する、コポリマーに存在する１つのモノマー種のモル比である。
本発明によれば、コポリマーの分子量は、重量平均分子量（本発明において、コポリマーについて述べるときは、Ｍｗとして略される）の観点から与えられ、これは、コポリマーの分子量を決定するための、したがって、当業者に知られている標準方法であるゲル透過クロマトグラフィーによって決定される。本発明によれば、用語「多分散性」は、所定のコポリマーの重量平均分子量と数平均分子量との比である。

【0053】

「脂肪族」または「脂肪族基」は、任意に置換され得る、非芳香族炭化水素部分を意味する。部分は、例えば直鎖状、分枝状または環状（例えば単環状、または、縮合、架橋等の多環状、または、スピロ−縮合多環状等）またはそれらの組み合わせであってもよい。特に断りのない限り、脂肪族基は、１〜３０個の炭素原子、好ましくは１〜２０個の炭素原子を含有する。好ましい脂肪族基は、アルキル基である。

【0054】

本明細書中に記載の「アルキル基」は、好ましくは、主鎖において１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子を、全体で最大３０個までの炭素原子を、含有する低級アルキルである。それらは、直鎖状、分枝状または環状であってもよく、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、へキシルなどを含んでもよい。

【0055】

用語「芳香族基」は、任意に置換され得る、合計５〜１４個の環メンバー(ring member)を有する単環状、二環状および三環状の環系を指し、ここで該系における少なくとも１つの環は芳香族であり、および、ここで該系における各環は３〜７個の環メンバーを含有する。好ましくは、フェニル、ビフェニル、ナフチル、置換フェニル、置換ビフェニルまたは置換ナフチルなどの環部分に６〜１２個の炭素を含有する、単環または二環基である。

【0056】

［疎水性基］は、モノマーまたはポリマーなどの分子に共有結合的に付着するとき、水素原子の代わりに、分子の疎水性が増大させる、置換基または残基などの部分である。

【0057】

本発明の詳細な説明
合成／コポリマーの特性
本発明によれば、コポリマーは、少なくとも２つの異なる種のモノマーからなるポリマーである。好ましくは、コポリマーは直鎖状であり、それは、水、および、例えば２０℃で測定された１０〜２０ｍＳ／ｃｍの導電率を含み、好ましくは生理学的な塩の条件下での、水性バッファーに、可溶である。本発明の方法で使用されるコポリマーは、少なくとも１つの種のアニオン性基、および、少なくとも１つの種の疎水性基を含む。一態様において、それは、アニオン性基および疎水性基を１つずつ含有する。

【0058】

本発明によれば、用語「アニオン性基」は、コポリマー中に存在する負に荷電した基を指す。アニオン性基の電荷が、あるｐＨ条件しか存在し得ないが、非電荷の状態において、アニオン性基は、例えば求電子試薬（例えばｐＨに依存したやり方で、例えばプロトン（Ｈ（＋）））の除去等によって、アニオン性に荷電するようになることが可能であるということは、当業者に明らかなことである。

【0059】

アニオン性基は、静電相互作用が可能であり、強イオン交換体、弱イオン交換体であってもよく、および／または、金属イオンを錯化することが可能であってもよい。アニオン性基は、以下の官能基：これらに限定されないが、スルホン酸およびその塩−ＳＯ_３⁻、硫酸エステル／アミドおよびそれらの塩−ＳＯ_４⁻、−ＮＨＳＯ_３⁻、ホスホン酸−ＰＯ_３^２−、リン酸エステルおよびその塩−ＰＯ_４^２−、カルボン酸およびその塩−ＣＯＯ⁻、の１つであってもよい。コポリマーにアニオン性基を導入するのに好適なモノマー単位の例は、２−アシルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、ビニルスルホン酸ＶＳ、スチレンスルホン酸または（メタ）アクリル酸等である。

【0060】

疎水性基は、直鎖状、分枝状または環状の脂肪族基、ハロゲンで置換された脂肪族基、芳香族、複素芳香族またはハロゲンで置換された芳香族基であってもよい。コポリマーに疎水性基を導入するのに好適なモノマー単位の例は、ベンジルアクリルアミド（ＢｚＡＡｍ）またはベンジルメタクリラート（ＢｚＭＡ）、Ｎ−イソプロピルアクリアミド（ＮＩＰＡＭ）、メチルメタクリラート（ＭＭＡ）、ブチルアクリラートまたはｔｅｒｔ−ブチルアクリラート等である。

【0061】

好ましい態様において、疎水性基は、スルホン酸、カルボン酸またはホスホン酸のようなアニオン性基で、さらに官能化される。かかる官能化された疎水性基の例は、安息香酸等である。官能化された疎水性基をコポリマーに導入するのに好適なモノマーの例は、４−（アクリルアミド）安息香酸（４−ＡＢＺ）等である。

【0062】

本発明によるコポリマーは、典型的には、アニオン性および疎水性基が付着されているコポリマー骨格を含む。典型的には、コポリマーは、モノマー単位を重合することにより合成される。コポリマー骨格は、ラジカル重合（例えばフリーラジカル重合等）、リビングラジカル重合（ＡＴＲＰ、ＲＡＦＴ、ＮＭＰなど）、アニオン性またはカチオン性重合、縮合重合またはあらゆる種類の開環重合のような、あらゆる種の重合を介して作ることができる、いずれかのポリマーであってもよい。

【0063】

フリーラジカル重合は、例えば、熱的に、光化学的に、酸化還元反応を通して、または、電気化学的に、開始されてよい。典型的なポリマー骨格は、これらに限定されないが、ビニルポリマー（例えばポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリアクリアミド、ポリメタクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン等）、ポリエステル（例えばポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキシド等）、ポリエステル、ポリアミド等であってもよい。

【0064】

式Ｉ〜ＩＶにおいて、可能なコポリマーの模式図を挙げる。コポリマーは、ランダムまたはブロックコポリマー、好ましくはランダムであってもよい。以下の定義が適用される：
Ｒ＝ポリマー骨格
Ｒ’＝ポリマーにおいて存在していても、存在していなくてもよい、スペーサー
Ｆ＝官能基（Ｆ１＝アニオン性基、Ｆ２＝疎水性基、Ｆ３およびＦ４＝互いに独立して、いずれの官能基または−Ｈ
ｎ＞０、ｍ＞０、ｌ≧０、ｋ≧０

【化1】

【0065】

表１において、ポリマー骨格（Ｒ）およびポリマーの側基の好適な例が定義され、それによると、いわゆる側基は、官能基（Ｆ）およびスペーサー（Ｒ’）からなるか、または、スペーサー（Ｒ’）が存在しない場合、官能基（Ｆ）のみからなる。
好ましい態様において、コポリマーを合成するために使用される各モノマー単位は、少なくとも１つの疎水性基または１つのアニオン性基を有する。

【0066】

【表A】

【0067】

極めて良好な結果が、少なくともＡＭＰＳおよび４−ＡＢＺ並びにＡＭＰＳおよびＢｚＡＡｍから作られるコポリマーから得られることができる。
本発明の方法に有用なコポリマーは、典型的には、約千（１０００）ｇ／ｍｏｌから約１，１００，０００ｇ／ｍｏｌまでの範囲の重量平均分子量、および／または、１．０５〜２．５の間の多分散性を有する。本発明のコポリマーは、同種のモノマー単位を含むが多様な鎖長を有するコポリマーの混合物として使用されてもよく、すなわち約１０００ｇ／ｍｏｌから約百万（１，０００，０００）ｇ／ｍｏｌまでの重量平均分子量の範囲であり、好ましくは、１．０５〜２．５の間の多分散性を有する。混合物はまた、狭い範囲の重量平均分子量、例えば約３５，０００ｇ／ｍｏｌから約４５，０００ｇ／ｍｏｌまで、または、約５０，０００ｇ／ｍｏｌから約５５，０００ｇ／ｍｏｌまで等をも有してもよく、好ましくは全てが１．０５〜２．５の間の多分散性を有していてもよい。

【0068】

重量平均分子量および分子量分布のプロファイルは、濃度、重合開始剤または触媒、温度または時間などの、モノマー単位のある重合条件の下、制御されてもよい。コポリマーの重量平均分子量は、好ましくは、１．０５〜２．５の間の多分散性を有し、好ましくは１０，０００ｇ／ｍｏｌと１２０，０００ｇ／ｍｏｌとの間、最も好ましくは３５，０００ｇ／ｍｏｌと６０，０００ｇ／ｍｏｌとの間である。

【0069】

アニオン性および疎水性基の総数のうち、典型的には、基の１０〜９０％が、アニオン性基である。アニオン性および疎水性基の総数の、好ましくは３５〜６５％、最も好ましくは４５〜６０％が、アニオン性基である。

【0070】

コポリマーを、例えば定義された分子量、鎖長、または、定義された疎水度および組成のコポリマーを用いることにより、種々の標的分子を選択的に沈殿させるための要件を明確に満たすように、合成することができる。

【0071】

沈殿プロセス
本発明の方法は、アニオン性および疎水性基を含むコポリマーを使用して、バイオ医薬試料中に典型的に存在する標的分子の精製に向けられている。試料溶液にコポリマーを添加すると、コポリマーは標的分子に結合し、沈殿する。最適な沈殿結果を得るために、試料が提供され、標的分子濃度、ｐＨおよびイオン強度のようなある条件に調節される。

【0072】

これは、コポリマーを加える前か、または、それと並行して行うことができる。本発明の方法によるコポリマーを使用すると、試料が、２０℃で測定された最大２２．５ｍＳ／ｃｍまでの導電率である高いイオン強度を有する場合でさえ、良好な沈殿結果を達成することができることが見出された。

【0073】

典型的には、試料のイオン強度は、適切な希釈方法を使用し、２０℃で決定される導電率で、０ｍＳ／ｃｍ〜２２．５ｍＳ／ｃｍの導電率、好ましくは、０ｍＳ／ｃｍ〜１７ｍＳ／ｃｍの導電率に調節されるべきである。多くの知られている手順とは対照的に、本発明の方法は、２０℃で決定される、１０ｍＳ／ｃｍ〜２２．５ｍＳ／ｃｍの導電率の間のイオン強度においてさえ、標的分子の効率的な沈殿を可能にする。イオン強度を、適切な希釈技術またはバッファー交換技術を使用して、変更または低減させてもよい。

【0074】

とりわけモノクローナル抗体の酵素処置後にＦｃ領域からＦａｂを分離する特定のケースにおいて、８ｍＳ／ｃｍ〜２２．５ｍＳ／ｃｍの導電率の間のイオン強度の調節は、選択的な沈殿を可能にするために必要とされてもよい。好ましくは、Ｆｃ領域からのＦａｂの分離のために、イオン強度は、９ｍＳ／ｃｍと１８ｍＳ／ｃｍとの間、最も好ましくは１０ｍＳ／ｃｍと１６ｍＳ／ｃｍとの間の導電率へ調節される。

【0075】

ｐＨは、好ましくは、適切な方法を使用して、標的分子の等電点（ｐＩ）より低いｐＨを達成するために調節され、適用可能である場合、不純物タンパク質またはほとんどの不純物タンパク質の等電点を超えるｐＨに調節される。典型的には、ｐＨは、４〜７、好ましくは４〜５．５へ調節されるべきであることが見出された。特に、ＮＳ０、ＣＨＯ−ＳまたはＳＰ２／０細胞培養液のような細胞培養液から、７と９との間の等電点でモノクローナル抗体を沈殿させるとき、４と５．５との間のｐＨ、特に５．０と５．２との間のｐＨが、極めて好適である。

【0076】

とりわけモノクローナル抗体の酵素処置後にＦｃ領域からＦａｂを分離する特定のケースにおいて、４と５．５との間のｐＨ、特に５．０と５．２との間のｐＨへのｐＨ調節が、極めて好適である。

【0077】

本発明の方法に使用されるコポリマーの量は、試料中に存在する標的分子の量に依存する。典型的には、良好な結果は、ｍｇ標的分子あたり、０．２と１．２ｍｇコポリマーとの間で使用されるとき、得られることができる。好ましくは、ｍｇ標的分子あたり、０．３５と０．９ｍｇとの間のコポリマーが加えられる。

【0078】

最適な沈殿を達成するために、試料溶液へコポリマーを加えた後、混合物は、好ましくはインキュベートされる。典型的なインキュベーション時間は、１０分間と２時間との間である。好ましくは、混合物は、インキュベーションの間、例えばシェーカー上またはスターラーとともに、撹拌される。

【0079】

その後、標的分子およびコポリマーを含む、共沈殿物は、例えばろ過、沈降、遠心分離またはあらゆる他の手段によって、上清から単離することができる。典型的には、標的分子を含む共沈殿物は、次いで、標的分子を単離またはさらに精製するためのさらなるプロセスステップに供される。

【0080】

しかし、上清をさらなるプロセスステップに供することもまた可能である。例えば、標的分子が、試料から除去れるべき知られている物質（例えば抗体のＦｃ領域等）の場合であるが、試料から最終的に単離、精製されるべき産物は、本発明のプロセスを行った後、上清に今存在する別の分子（例えば抗体のＦａｂ領域等）である。

【0081】

しかし、ほとんどのケースにおいて、コポリマーを加えることにより沈殿された標的分子は、さらに精製されるべき化合物である。このケースにおいて、標的分子を含む共沈殿物を、１回または数回、例えば酸性バッファー等により、洗浄してもよい。好ましくは、洗浄バッファーは、試料にコポリマーを加えた後に得られる混合物と同じｐＨ、および、同じかまたはより低いイオン強度を有する。

【0082】

共沈殿物は、次いで、再溶解してもよい。これは、標的分子の等電点から１ｐＨ単位を超えて下回るｐＨを有する水性バッファー中で行うことができる。典型的には、７と９との間のｐＨを有するバッファー、例えばＴｒｉｓバッファーｐＨ８．０またはＫ−Ｎａ−リン酸バッファーｐＨ７．４（ＰＢＳ）等を、共沈殿物の再溶解のために使用する。再溶解は、例えば振盪または撹拌等によって、例えば３００〜６００ｒｐｍで５〜２０分間振盪する等によって、サポートすることができる。

【0083】

本発明の一態様において、高度に精製された標的分子を得るために、本発明による方法のさらなるスッテプにおいて、コポリマーを、再溶解した共沈殿物を含む溶液から、除去することができる。これは、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法のような、いくつかの方法により行うことができる。

【0084】

沈殿剤を加えることによってもまた、コポリマーを再沈殿させることが可能である。好適な沈殿剤は、例えば、高分子電解質が共有結合的に付着しているビーズである。高分子電解質は、繰り返し単位が電解質基を持つポリマーである。ポリカチオンおよびポリアニオンは、高分子電解質である。好適なビーズの例は、例えばガラスビーズ、シリカビーズまたはポリマービーズ等である。好適な高分子電解質は、例えば、Ｈ結合をすることができる、陽イオン高分子電解質、混合モード高分子電解質、疎水性高分子電解質または疎水性高分子電解質である。

【0085】

好適なビーズは、例えばUS 5,922,531等に開示される。
好ましい態様において、ビーズは、ガラスまたはシリカビーズ、より好ましくはガラスまたはマイカまたはシリカフレークである。０．８ｃｍ／ｍｉｎと１．２ｃｍ／ｍｉｎとの間の沈降速度を持つガラスまたはシリカフレークが、再沈殿に特に好適であることが見出された。典型的には、１０〜２００μＭの範囲の直径および１００ｎｍと１０００ｎｍとの間の厚さを持つ、シリカまたはガラスフレークは、かかる好適な沈降速度を示し、コポリマーの再沈殿に特に好適である。

【0086】

好ましい態様において、ガラスまたはシリカビーズ、および、他のタイプのビーズもまた、陽イオン基、または、陰イオンおよび疎水性または親水性基で官能化される。好ましくは、官能化は、陽イオン高分子電解質、または、陽イオンおよび疎水性または親水性官能基を持つ高分子電解質の共有結合によってなされる。

【0087】

特に好ましくは、ＴＭＡＥまたはＤＭＡＥを含む高分子電解質である。
ビーズは、典型的には、０．０００１ｍｇ／ｍｌと０．５ｍｇ／ｍｌとの間の最終混合物中、ビーズまたはフレークの最終濃度に達するように、再懸濁した標的分子−コポリマー溶液に加えられる。
ビーズは、典型的には、溶液のｐＨをｐＨ７．０〜８．５に水調節した後、再懸濁した標的分子−コポリマー溶液に加えられる。

【0088】

付着したコポリマーを持つビーズを、例えば遠心分離、沈降またはろ過することによって除去した後、高度に純粋な標的分子を含み、全くまたはほとんどコポリマー汚染を含まない上清を得る。典型的には、コポリマーを、これらのシリカフレークを使用して、試料中の最初のコポリマー濃度と比較し、＞９０％（重量／重量）まで、除去することができる。

【0089】

これらのシリカフレークの濃度を調整し、コポリマーを、試料中の最初のコポリマー濃度と比較して、典型的には＞９５％（重量／重量）まで、最大９９％（重量／重量）まで、除去することができる。
本発明の方法は、クロマトグラフィー、ろ過または遠心分離などのその後の精製ステップの不純物を低減させ、目詰まりを防止する。本発明の方法は、定義された体積で、選択的沈殿およびその後の再溶解により、標的分子を濃縮させることができ、最大１００までの濃縮係数を達成し、それによって、その後の精製ステップの処理時間が増加し、クロマトグラフィーの作業負荷が低減される（時間／ｋｇクロマトグラフィーで精製された標的分子）。

【0090】

先行技術に開示される沈殿のためのポリマーの使用はしばしば、高精製収率を与えるが、それは、これらの刊行物に示されるような５ｍＳ／ｃｍ以下の導電率と同程度に低いイオン強度でしか十分に働かない。
しかしながら、この制限は、沈殿のためのポリマーの適用前に、細胞培養液の希釈を必要とし、例えば、２５０００リットルの最初の細胞培養液と比較し、７５０００リットル以上の希釈細胞培養液に上る。
これらの大きな体積は、加減され、保管される必要があり、精製後の高い廃棄物負荷を有し、全てが高コストにつながる。

【0091】

これらの制限および欠点とは対照的に、本発明の方法は、生理食条件と同様のイオン強度であっても標的分子の高収率および純度を得るために、消費者が、特に最適化されたコポリマーを使用することを可能にする。これにより、過度の前希釈ステップが必要とされない。

【0092】

本発明は、バイオ医薬または組換えタンパク質の精製において今日まで使用されている精製ステップを、部分的または完全に置き換えることができるため、同等かまたはより良好なの収率、精製時間、効率、純度をもたらすことができる。

【0093】

以上以下で引用された全ての出願、特許および刊行物、および、２０１２年１２月２０日に提出された対応ＥＰ出願EP12008475.1の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0094】

例
以下の例は、本発明の方法において使用されるコポリマーを得るための可能な合成ステップを表す。

【0095】

例１ａ：
４．９２ｇの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸および６．８２ｇの４−アクリルアミド安息香酸を、３００ｍｌの水／ＤＭＦ（１／１）および３．４ｍｌのＮａＯＨ溶液（３２％）の混合物に溶解する。溶液を、窒素を使用し脱気する。０．４３６ｇのペルオキソ二硫酸ナトリウムを脱気した水に溶解し、水溶液に加える。温度を８０℃まで上げる。反応時間は５時間である。反応混合物を室温まで冷却し、空気にさらす。溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。固体ポリマーを、再び水に溶解し、２−プロパノールに沈殿させる。ポリマーをろ過し、乾燥する。重量平均分子量は約Ｍｗ＝１０００００ｇ／ｍｏｌであり、１．３の多分散性を有する。

【0096】

例１ｂ：
Sephadex（登録商標）カラム（架橋デキストランゲル）を使用する以外は例１ａと同様に、ポリマーの精製をする。カラムを５回×５ｍｌの水で洗浄し、２．５ｍｌの反応混合物を「注入」し、カラムを３．５ｍｌの水で洗浄する。溶出液を集めて、７回×５ｍｌの水で、再平衡化を行う。手順を３回繰り返す。溶媒を、ロータリーエバポレーターを使用し、溶出液から除去し、ポリマーを乾燥する。

【0097】

例１ｃ：
透析またはタンジェンシャルフローろ過に通して精製する以外は例１ａと同様である。反応後、混合物を室温まで冷却し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。固体ポリマーを再び水に溶解し、ポリマーを、例えば１２０００〜１４０００Ｄａ等の適切なＭＷＣＯを使用する透析またはタンジェンシャルフローろ過で精製する。

【0098】

例２ａ：
４．９２ｇの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸および６．８２ｇの４−アクリルアミド安息香酸を、３００ｍｌの水／ＤＭＦ（１／１）および３．４ｍｌのＮａＯＨ溶液（３２％）の混合物に溶解する。９５μＬの１−ブタンチオール（連鎖移動剤として）を加える。溶液を、窒素を使用し脱気する。脱気した水に溶解された０．４３６ｇのペルオキソ二硫酸ナトリウムを溶液に加える。温度を８０℃まで上げる。反応時間は５時間である。反応混合物を室温まで冷却し、空気にさらす。溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。固体ポリマーを再び水に溶解し、２−プロパノールに沈殿させる。ポリマーをろ過し、乾燥する。重量平均分子量は約Ｍｗ＝５５０００ｇ／ｍｏｌであり、１．１６の多分散性を有する。

【0099】

例２ｂ：
３８０μＬの１−ブタンチオールを加える以外は例２ａと同様である。結果として生じるポリマーの重量平均分子量は約Ｍｗ＝３５０００ｇ／ｍｏｌであり、１．６の多分散性を有する。

【0100】

例３：

【表B】

【0101】

例４：
４−アクリルアミド安息香酸の代わりにアクリル酸ベンジルをコモノマーとして使用する以外は、例３と同様である。
以下の例は、本発明の適用を示す。

【0102】

例５：
２．０ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体（ｍＡｂ０３）力価（プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる）を有するモノクローナル抗体細胞培養溶液（ＳＰ２／０細胞培養液）（ここで、ＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）量は、９０００ｎｇ／ｍｇ抗体ある（免疫酵素法ＳＰ２／０による））を、事前に細胞培養溶液をｐＨ５．０へ調節した後、アニオン性−疎水性コポリマーで処置する。コポリマーを、６１．７％（ｗ／ｗ）ＡＭＰＳおよび３８．３％（ｗ／ｗ）（ＡＢＺ）から、３．１７％（ｗ／ｗ）ペルオキソ二硫酸ジナトリウムおよび連鎖移動剤１−ブタンチオールを１：０．０３の比（ｍｏｌにおける全体のモノマー濃度（ＡＭＰＳ＋ＡＢＺ）に対し）で使用して、合成する。

【0103】

コポリマーの特徴づけによって、３６％（ｗ／ｗ）の４−（アクリロイルアミノ）安息香酸（ＡＢＺ、図１）；６４％（ｗ／ｗ）の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ、図１）；減衰全反射赤外分光によって決定された；ＳＥＣにおける示差屈折率によって決定された分子量分布：Ｍｗ２８０００Ｄａ、Ｍｎ１３０００Ｄａ、多分散性指標２．１が得られる。コポリマーを、１０ｍｇ／ｍｌの濃度、ｐＨ５．０に調節し、最終濃度が０．４ｍｇ／ｍｌポリマーから１．２ｍｇ／ｍｌポリマーまでの範囲になるように、そして最終抗体濃度が１．４ｍｇ／ｍｌ（イオン強度：２０℃で測定された、１２ｍＳ／ｃｍの導電率または１２０ｍＭ ＮａＣｌ当量）となるように、抗体細胞培養溶液に少量加える。

【0104】

１時間のゆっくりとした撹拌後、加えられたコポリマーとともに抗体細胞培養を、２５００ｒｃｆで１５分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを、５００ｒｐｍで１２分間振盪することにより、８０ｍＭのＫ−Ｎａ−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に再溶解する。シリカフレークに付着させた第４級アンモニア残基（トリメチルアミノエチル）を、再溶解したペレットに１０％（ｖ／ｖ）の比で加え、続いて、２５００ｒｃｆで１０分間遠心分離をする。

【0105】

上清を除去し、９８．８％のコポリマー除去、７０％のＨＣＰ除去、初期抗体力価と比較して８０％の抗体リカバリーを得る。ＩＲスペクトル（添付の図２を参照）は、沈殿前後、続く再溶解における抗体の２次構造に有意な変化がないことを示す。バイオレイヤー干渉分光法（ＢＬＩ）によって、本発明による沈殿および再分解を使用して精製された抗体（添付の図３Ｂを参照）と、非沈殿の抗体（添付の図３Ａを参照）とを比較しても、その標的への抗体の結合アフィニティーにおいて差異がないことが示される。

【0106】

例６：
２ｍｇ／ｍｌモノクローナル抗体（それぞれｍＡｂ０３、ｍＡｂ０４、ｍＡｂ０５、ｍＡｂ０７、追加情報は表２）および２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有する溶液を、事前に細胞培養溶液をｐＨ５．０へ調節した後、様々なアニオン性−疎水性コポリマーで処置する。

【0107】

コポリマー（１０〜７７．５％ＡＢＺ（ｗ／ｗ）；２２．５〜９０％ＡＭＰＳ（ｗ／ｗ）；減衰全反射分光によって決定された；ＳＥＣにおける屈折指標によって決定される分子量分布：Ｍｗ５０００〜３０００００Ｄａ、Ｍｎ５０００〜１３１０００Ｄａ、多分散性指票１〜２．３；ＳＥＣにおけるＵＶ計測によって決定される分子量分布は、Ｍｗ５０００〜３０００００Ｄａ、Ｍｎ５０００〜１３１０００Ｄａ、多分散性指標は１〜２．５）を、溶液に加える（各濃度、各ｐＨおよびイオン強度の各コポリマーを、別個の溶液容器に加える）ことによって、１ｍｇ／ｍｌの最終抗体濃度、１ｍｇ／ｍｌの最終ＢＳＡ濃度、ｐＨ５．０、２０℃で測定された約５ｍＳ／ｃｍの導電率のイオン強度、および、０．１〜１．５ｍｇ／ｍｌのコポリマー濃度を有するコポリマー−タンパク質溶液が構成される。

【0108】

３００ｒｐｍで１時間振盪した後、コポリマー−タンパク質溶液を、２５００ｒｃｆで１５分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを、５００ｒｐｍで１２分間振盪することにより、８０ｍＭのＫ−Ｎａ−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に再溶解する。１０％（ｖ／ｖ）ＴＭＡＥフレークを、再溶解したペレットに加え、続いて、２５００ｒｃｆで１０分間遠心分離する。

【0109】

上清を除去し、９５％のコポリマー除去、２０〜８０％のＢＳＡ除去、初期抗体力価と比較し８５％の抗体リカバリーを得る。最も有望なコポリマー（１０〜７０％ＡＢＺ、３０〜９０％ＡＭＰＳ、重量平均鎖長＜８００００Ｄａ）は、８５％のｍＡｂリカバリーおよび８０％のＢＳＡ除去を得る。

【0110】

【表C】

【0111】

例７：
０．７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体（ｍＡｂ０５）および既知量のＨＣＰタンパク質／ｍｇ抗体を含有するＣＨＯ−Ｓ細胞株におけるモノクローナル抗体細胞培養溶液を、ｐＨ５．０、および、２０℃で測定された１１ｍＳ／ｃｍの導電率に調節する。溶液を、アニオン性疎水性コポリマー（６５％ＡＢＺ、３５％ＡＭＰＳ；ＳＥＣにおける示差屈折率によって決定されたＭｗ８００００Ｄａ、Ｍｎ５５０００Ｄａ）により、最終コポリマーの抗体に対する重量比０．５７：１〜１．１４：１で、処置する。

【0112】

３００ｒｐｍで１時間振盪し、２５００ｒｃｆで１５分間遠心分離した後、上清を移して、再溶解したペレット（５００ｒｐｍで１２分間の振盪により、８０ｍＭのＫ−Ｎａ−リン酸バッファー（ｐＨ７．４））と同様に分析する。両者の測定により、５０％の宿主細胞タンパク質の除去および８０〜９０％の抗体沈殿が示される。中赤外線スペクトルにより、文献調査と一致して、沈殿前後の抗体の構造的変化がないことが明らかにされる。バイオレイヤー干渉分光法により、沈殿前後の抗体の結合アフィニティーにおいて、変化がないことが示される。

【0113】

例８：
２ｍｇ／ｍｌの濃度で、モノクローナル抗体（ｍＡｂ０３）のＦＡｂ部（抗原に結合する断片）を含有する溶液を、２ｍＳ／ｃｍ（２０℃で測定された）の導電率のイオン強度で、ｐＨ５．０に調節し、その後、ＦＡｂ−コポリマー溶液（１ｍＳ／ｃｍの導電率を有するイオン強度、ｐＨ５．０）において、０．１〜０．８ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように、１００％（ｖ／ｖ）のアニオン性−疎水性コポリマー（５０％ＢｚＡＡｍ、５０％ＡＭＰＳ；ＳＥＣにおける屈折率測定によって決定されたＭｗ６３０００、Ｍｎ４６０００）を加える。溶液を、３００ｒｐｍで１時間シェーカー上でインキュベートし、２５００ｒｃｆで１５分間遠心分離する。８０％のＦａｂが溶液から沈殿する。

【0114】

例９：
２ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体（ｍＡｂ０７）および既知量のＨＣＰタンパク質／ｍｇ抗体を含有するマウスミエローマ細胞株（ＮＳ０）におけるモノクローナル抗体細胞培養溶液を、ｐＨ５．０、１２ｍＳ／ｃｍの導電率に調節し、アニオン性−疎水性コポリマー（６５％ＡＢＺ、３５％ＡＭＰＳ；ＳＥＣにおける屈折率により決定されたＭｗ８００００Ｄａ、Ｍｎ５５０００Ｄａ）により、抗体に対するコポリマーの様々な最終重量比で、処置する。３００ｒｐｍで１時間振盪し、２５００ｒｃｆで１５分間遠心分離した後、上清を移し、溶解したペレット（５００ｒｐｍで１２分間の振盪により、８０ｍＭのＫ−Ｎａ−リン酸バッファー（ｐＨ７．４））と同様に分析する。両者の測定により、５０〜７０％の宿主細胞タンパク質の除去や８０〜９５％の抗体沈殿が示される。

【0115】

例１０：
沈殿の最初の体積が２０ｍＬであり、標的−分子−コポリマーペレットを５００ｕＬに溶解し、４０倍に標的−分子濃度を増大させる以外は例９と同様である。

【0116】

例１１：
パパイン消化後のモノクローナル抗体のＦａｂおよびＦｃ断片を含有する溶液を、ｐＨ５．０および１４ｍＳ／ｃｍの導電率に調節した。溶液を、アニオン性−疎水性コポリマー（６４％ＡＢＺ、３６％ＡＭＰＳ；ＳＥＣにおける屈折率よって決定されたＭｗ１６０．０００Ｄａ、Ｍｎ５５０００Ｄａ）により、全タンパク質に対するコポリマーの様々な最終重量比で、処置する。３００ｒｐｍで１時間振盪し、２５００ｒｃｆで１５分間遠心分離した後、上清を移し、溶解したペレット（５００ｒｐｍで１２分間の振盪により、８０ｍＭのＫ−Ｎａ−リン酸バッファー（ｐＨ７．４））と同様に分析する。ペレットがＦｃ断片のみからなる一方、上清は、１０％の非沈殿Ｆｃおよび１００％の最初に用いたＦａｂ断片から構成された。

【0117】

例１２：
シリカまたはジオールガラスフレーク−ＴＭＡＥ合成：
シリカまたはジオールガラスフレークを、グリシジルオキシプロピルトリメトキシシランで被覆され１０〜１００μｍの直径を有するジオールガラスフレークまたはシリカフレークを使用し、モノマーのＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（０．２２５Ｍ）、アクリル酸クロリド（０．２１６Ｍ）および硫酸ジメチル（０．２２８Ｍ）を加え、開始剤として４．５ｍＭの硝酸アンモニウムＩＶを使用して、合成する。

【0118】

他の課題
コポリマー組成物は、赤外分光法とともに減衰全反射分光（ＡＴＲ）と同様にＮＭＲ分光法を使用して、特徴づける。ＮＭＲおよびＡＴＲの結果は同等であり（表３）、このことはコポリマーの特徴づけに対するＡＴＲの実行可能性を示す。

【0119】

【表D】

表４は、例１〜４に記載の手順に従い調製される本発明の方法により使用されるコポリマーの例を示す。

【0120】

【表E】

【0121】

表５は、沈殿実験において使用されるタンパク質発現系のイオン強度を示す。

【表F】

【図1】

【図2】

【図3】