特許 6357154 荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6357154

(24)【登録日】2018年6月22日

(45)【発行日】2018年7月11日

(54)【発明の名称】荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180702BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180702BHJP

   C07K 1/06 20060101ALI20180702BHJP

   C40B 50/06 20060101ALI20180702BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C12P21/02 C

   C07K1/06

   C40B50/06

【請求項の数】13

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2015-530880(P2015-530880)

(86)(22)【出願日】2014年8月4日

(86)【国際出願番号】JP2014070487

(87)【国際公開番号】WO2015019999

(87)【国際公開日】20150212

【審査請求日】2017年6月29日

(31)【優先権主張番号】特願2013-162440(P2013-162440)

(32)【優先日】2013年8月5日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(73)【特許権者】

【識別番号】506269633

【氏名又は名称】ペプチドリーム株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】村上 裕

(72)【発明者】

【氏名】川上 隆史

(72)【発明者】

【氏名】パトリック・リード

(72)【発明者】

【氏名】佐々木 亨

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０２６５６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００７−３１９０６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 川上隆史, et al.，遺伝暗号リプログラミング技術を用いたＮメチル化ペプチドのリボソーム翻訳合成，日本化学会第８８春季年会講演予稿集ＩＩ，２００８年，p.853, 3 C2-29

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法であって：
(i) 少なくとも1種の、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAと、
(ii) 前記ペプチドをコードする核酸であって、前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸と、
を含む無細胞翻訳系でペプチドを発現させる工程と；
前記ペプチドに含まれる非タンパク質性アミノ酸残基の保護基を除去する工程と
を含む方法。

【請求項2】

荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリの製造方法であって：
(i) 少なくとも1種の、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAと、
(ii) 前記ペプチドライブラリをコードする核酸ライブラリであって、各核酸が前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸ライブラリと、
を含む無細胞翻訳系でペプチドライブラリを発現させる工程と；
前記ペプチドライブラリのペプチドに含まれる非タンパク質性アミノ酸残基の保護基を除去する工程と
を含む方法。

【請求項3】

前記荷電基が、アミノ基又はカルボキシ基である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記荷電基がアミノ基であって、前記保護基がアジド基である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

前記荷電基がカルボキシ基であって、前記保護基がアルキルエステル基又はアラルキルエステル基である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項6】

荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを製造するための無細胞翻訳系であって、
(i) 少なくとも1種の、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAと、
(ii) 前記ペプチドをコードする核酸であって、該tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸と、
を含む翻訳系。

【請求項7】

荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリを製造するための無細胞翻訳系であって、
(i) 少なくとも1種の、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAと、
(ii) 前記ペプチドライブラリをコードする核酸ライブラリであって、各核酸が前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸ライブラリと、
を含む翻訳系。

【請求項8】

前記荷電基が、アミノ基又はカルボキシ基である、請求項６又は７に記載の翻訳系。

【請求項9】

前記荷電基がアミノ基であって、前記保護基がアジド基である、請求項６又は７に記載の翻訳系。

【請求項10】

前記荷電基がカルボキシ基であって、前記保護基がアルキルエステル基又はアラルキルエステル基である、請求項６又は７に記載の翻訳系。

【請求項11】

荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリを用いるin vitroセレクション法であって、
ａ）荷電基に保護基を導入した非タンパク質性アミノ酸が結合した、少なくとも1つのtRNAと、前記ペプチドライブラリの各ペプチドをコードするmRNAライブラリであって、各mRNAが前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含み、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンが結合している、mRNAライブラリと、を含む無細胞翻訳系でペプチド−mRNA複合体ライブラリを発現させる工程と、
ｂ）前記ペプチド−mRNA複合体ライブラリに対して逆転写反応を行い、ペプチド−DNA複合体ライブラリを得る工程と、
ｃ）前記荷電基の保護基を除去する工程と、
ｄ）前記ペプチド−DNA複合体ライブラリから、標的物質に結合するペプチド−DNA複合体群を選択する工程と、
ｅ）前記選択したペプチド−DNA複合体群のDNAを増幅する工程と、
ｆ）前記増幅したDNAを転写してmRNAライブラリを製造し、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンを結合させてピューロマイシン結合mRNAライブラリを製造し、これを翻訳してペプチド−mRNAライブラリを製造する工程と、を含み、
前記工程ａ）から工程ｆ）を1回または、2回以上繰り返して、標的物質に親和性の高いペプチドを選択する、方法。

【請求項12】

荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリ用いるin vitroセレクション法であって、
ａ）荷電基に保護基を導入した非タンパク質性アミノ酸が結合した、少なくとも1つのtRNAと、前記ペプチドライブラリの各ペプチドをコードするmRNAライブラリであって、各mRNAが前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含み、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンが結合している、mRNAライブラリと、を含む無細胞翻訳系でペプチド−mRNA複合体ライブラリを発現させる工程と、
ｂ）前記荷電基の保護基を除去する工程と、
ｃ）前記ペプチド−mRNA複合体ライブラリに対して逆転写反応を行い、ペプチド−DNA複合体ライブラリを得る工程と、
ｄ）前記ペプチド−DNA複合体ライブラリから、標的物質に結合するペプチド−DNA複合体群を選択する工程と、
ｅ）前記選択したペプチド−DNA複合体群のDNAを増幅する工程と、
ｆ）前記増幅したDNAを転写してmRNAライブラリを製造し、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンを結合させてピューロマイシン結合mRNAライブラリを製造し、これを翻訳してペプチド−mRNAライブラリを製造する工程と、を含み、
前記工程ａ）から工程ｆ）を1回または、2回以上繰り返して、標的物質に親和性の高いペプチドを選択する、方法。

【請求項13】

荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリを用いるin vitroセレクション法であって、
ａ）荷電基に保護基を導入した非タンパク質性アミノ酸が結合した、少なくとも1つのtRNAと、前記ペプチドライブラリの各ペプチドをコードするmRNAライブラリであって、各mRNAが前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含み、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンが結合している、mRNAライブラリと、を含む無細胞翻訳系でペプチド−mRNA複合体ライブラリを発現させる工程と、
ｂ）前記荷電基の保護基を除去する工程と、
ｃ）前記ペプチド−mRNA複合体ライブラリから、標的物質に結合するペプチド−mRNA複合体群を選択する工程と、
ｄ）前記ペプチド−mRNA複合体ライブラリに対して逆転写反応を行い、ペプチド−DNA複合体ライブラリを得る工程と、
ｅ）前記選択したペプチド−DNA複合体群のDNAを増幅する工程と、
ｆ）前記増幅したDNAを転写してmRNAライブラリを製造し、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンを結合させてピューロマイシン結合mRNAライブラリを製造し、これを翻訳してペプチド−mRNAライブラリを製造する工程と、を含み、
前記工程ａ）から工程ｆ）を1回または、2回以上繰り返して、標的物質に親和性の高いペプチドを選択する、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、無細胞翻訳系で、荷電性非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドを製造する方法等に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、様々なペプチドが医薬品候補や研究用ツールとして注目されており、ペプチドライブラリを開発し、標的物質に親和性を有するペプチドをスクリーニングしようとする試みがなされている。
人工的にペプチドライブラリを作製する方法としては、従来、化学合成による方法、二次代謝産物の生合成酵素を用いる方法、翻訳合成系を用いる方法等がある。
しかしながら、化学合成による方法では、ライブラリの多様性を大きくするのが困難である。また、スクリーニングや、化合物の構造と活性の相関解析にも時間を要する。
これに対し、二次代謝産物の生合成酵素を用いる方法によれば、迅速かつ簡便に、精巧な骨格の構築や化学変換が可能となる。しかしながら、酵素には基質特異性があるため、合成できる化合物の種類が限られ、大規模な化合物ライブラリの構築に適用するのは難しい。

【0003】

翻訳合成系によれば、mRNAライブラリを作製し、これを翻訳することによって短時間で多様性に富んだペプチドライブラリを構築することができる。また、mRNAディスプレイ法等と組み合わせることにより、遺伝子型である核酸分子と表現型であるペプチドとを関連づけることができるため、所望の標的分子に結合するペプチドをライブラリの中から迅速かつ簡便に探索・濃縮することができる。このように、翻訳系によるペプチドライブラリの合成には優れた点が多いが、産生できるのは、ほぼタンパク質性アミノ酸からなるペプチドに限られる。

【0004】

特に、本発明者らは、in vitro翻訳系でペプチドを合成する場合、非タンパク質性アミノ酸で、側鎖に電荷を有するものは、非常に取り込まれにくいことを明らかにしている。同様に、細胞抽出物を用いた翻訳系でのナンセンスサプレッションによるN-アルキルアミノ酸のタンパク質への取り込みについても、荷電性N-アルキルアミノ酸の取り込み効率が著しく低く（非特許文献１−３）、非荷電性N-アルキルアミノ酸の取り込み効率が高いことが報告されている（非特許文献４−７）。

【0005】

最近、いくつかの非荷電性N-アルキルアミノ酸が、in vitroペプチドセレクションで好適に用いられることが報告されたが（参考文献８−１０）、リボソーム合成でペプチドに取り込むことができる荷電性非タンパク質性アミノ酸の構造的多様性は、依然として限られている。
そこで、荷電性非タンパク質性アミノ酸を、リボソーム合成でペプチドに取り込むことができれば、in vitroペプチドセレクションに用いることができるペプチドライブラリの構造的多様性を著しく増大させることができると考えられる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Karginov, V.A. et al. J. Am. Chem. Soc. 119, 8166-8176 (1997).

【非特許文献2】Short, G.F., 3rd et al. Biochemistry 39, 8768-8781 (2000).

【非特許文献3】Choudhury, A.K., Golovine, S.Y., Dedkova, L.M. & Hecht, S.M. Biochemistry 46, 4066-4076 (2007).

【非特許文献4】Bain, J.D., Wacker, D.A., Kuo, E.E. & Chamberlin, A.R. Tetrahedron 47, 2389-2400 (1991).

【非特許文献5】Ellman, J.A., Mendel, D. & Schultz, P.G. Science 255, 197-200 (1992).

【非特許文献6】Chung, H.H., Benson, D.R., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10145-10149 (1993).

【非特許文献7】Chung, H.H., Benson, D.R. & Schultz, P.G. Science 259, 806-809 (1993).

【非特許文献8】Yamagishi, Y. et al. Chem. Biol. 18, 1562-1570 (2011).

【非特許文献9】Kawakami, T. & Murakami, H. J. Nucleic Acids 2012, 713510 (2012).

【非特許文献10】Schlippe, Y.V., Hartman, M.C., Josephson, K. & Szostak, J.W. J. Am. Chem. Soc. 134, 10469-10477 (2012).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、無細胞翻訳系で、荷電性非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドを製造する方法等を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、陽電荷又は陰電荷を有する荷電性非タンパク質性アミノ酸であっても、荷電基に保護基を導入してからtRNAに結合させ、得られた保護基付きアミノアシルtRNAを添加した無細胞翻訳系でペプチドを発現させると、保護基付きアミノ酸は効率よくペプチドに取り込まれ、翻訳後に脱保護して荷電基を露出させることにより、荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを製造できることを見出した。
さらに、mRNAにピューロマイシンリンカーを結合させ、これを鋳型として保護基付きアミノアシルtRNAを添加した無細胞翻訳系で発現させると、保護基付きアミノ酸を含むペプチドが、mRNAに提示されることを見出し、上記荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法がin vitroディスプレイ法に応用できることを確認して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法であって：
(i) 少なくとも1種の、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAと、
(ii) 前記ペプチドをコードする核酸であって、前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸と、
を含む無細胞翻訳系でペプチドを発現させる工程と；
前記ペプチドに含まれる非タンパク質性アミノ酸残基の保護基を除去する工程と
を含む方法；
〔２〕荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリの製造方法であって：
(i) 少なくとも1種の、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAと、
(ii) 前記ペプチドライブラリをコードする核酸ライブラリであって、各核酸が前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸ライブラリと、
を含む無細胞翻訳系でペプチドライブラリを発現させる工程と；
前記ペプチドライブラリのペプチドに含まれる非タンパク質性アミノ酸残基の保護基を除去する工程と
を含む方法；
〔３〕前記荷電基が、アミノ基又はカルボキシ基である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記荷電基がアミノ基であって、前記保護基がアジド基である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔５〕前記荷電基がカルボキシ基であって、前記保護基がアルキルエステル基又はアラルキルエステル基である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔６〕荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを製造するための無細胞翻訳系であって、
(i) 少なくとも1種の、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAと、
(ii) 前記ペプチドをコードする核酸であって、該tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸と、
を含む翻訳系；
〔７〕荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリを製造するための無細胞翻訳系であって、
(i) 少なくとも1種の、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAと、
(ii) 前記ペプチドライブラリをコードする核酸ライブラリであって、各核酸が前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸ライブラリと、
を含む翻訳系；
〔８〕前記荷電基が、アミノ基又はカルボキシ基である、上記〔６〕又は〔７〕に記載の翻訳系；
〔９〕前記荷電基がアミノ基であって、前記保護基がアジド基である、上記〔６〕又は〔７〕に記載の翻訳系；
〔１０〕前記荷電基がカルボキシ基であって、前記保護基がアルキルエステル基又はアラルキルエステル基である、上記〔６〕又は〔７〕に記載の翻訳系；
〔１１〕荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリを用いるin vitroセレクション法であって、
ａ）荷電基に保護基を導入した非タンパク質性アミノ酸が結合した、少なくとも1つのtRNAと、前記ペプチドライブラリの各ペプチドをコードするmRNAライブラリであって、各mRNAが前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含み、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンが結合している、mRNAライブラリと、を含む無細胞翻訳系でペプチド−mRNA複合体ライブラリを発現させる工程と、
ｂ）前記ペプチド−mRNA複合体ライブラリに対して逆転写反応を行い、ペプチド−DNA複合体ライブラリを得る工程と、
ｃ）前記荷電基の保護基を除去する工程と、
ｄ）前記ペプチド−DNA複合体ライブラリから、標的物質に結合するペプチド−DNA複合体群を選択する工程と、
ｅ）前記選択したペプチド−DNA複合体群のDNAを増幅する工程と、
ｆ）前記増幅したDNAを転写してmRNAライブラリを製造し、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンを結合させてピューロマイシン結合mRNAライブラリを製造し、これを翻訳してペプチド−mRNAライブラリを製造する工程と、を含み、
前記工程ａ）から工程ｆ）を1回または、2回以上繰り返して、標的物質に親和性の高いペプチドを選択する、方法；
〔１２〕荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリ用いるin vitroセレクション法であって、
ａ）荷電基に保護基を導入した非タンパク質性アミノ酸が結合した、少なくとも1つのtRNAと、前記ペプチドライブラリの各ペプチドをコードするmRNAライブラリであって、各mRNAが前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含み、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンが結合している、mRNAライブラリと、を含む無細胞翻訳系でペプチド−mRNA複合体ライブラリを発現させる工程と、
ｂ）前記荷電基の保護基を除去する工程と、
ｃ）前記ペプチド−mRNA複合体ライブラリに対して逆転写反応を行い、ペプチド−DNA複合体ライブラリを得る工程と、
ｄ）前記ペプチド−DNA複合体ライブラリから、標的物質に結合するペプチド−DNA複合体群を選択する工程と、
ｅ）前記選択したペプチド−DNA複合体群のDNAを増幅する工程と、
ｆ）前記増幅したDNAを転写してmRNAライブラリを製造し、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンを結合させてピューロマイシン結合mRNAライブラリを製造し、これを翻訳してペプチド−mRNAライブラリを製造する工程と、を含み、
前記工程ａ）から工程ｆ）を1回または、2回以上繰り返して、標的物質に親和性の高いペプチドを選択する、方法；及び
〔１３〕荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリを用いるin vitroセレクション法であって、
ａ）荷電基に保護基を導入した非タンパク質性アミノ酸が結合した、少なくとも1つのtRNAと、前記ペプチドライブラリの各ペプチドをコードするmRNAライブラリであって、各mRNAが前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含み、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンが結合している、mRNAライブラリと、を含む無細胞翻訳系でペプチド−mRNA複合体ライブラリを発現させる工程と、
ｂ）前記荷電基の保護基を除去する工程と、
ｃ）前記ペプチド−mRNA複合体ライブラリから、標的物質に結合するペプチド−mRNA複合体群を選択する工程と、
ｄ）前記ペプチド−mRNA複合体ライブラリに対して逆転写反応を行い、ペプチド−DNA複合体ライブラリを得る工程と、
ｅ）前記選択したペプチド−DNA複合体群のDNAを増幅する工程と、
ｆ）前記増幅したDNAを転写してmRNAライブラリを製造し、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンを結合させてピューロマイシン結合mRNAライブラリを製造し、これを翻訳してペプチド−mRNAライブラリを製造する工程と、を含み、
前記工程ａ）から工程ｆ）を1回または、2回以上繰り返して、標的物質に親和性の高いペプチドを選択する、方法、
に関する。

【発明の効果】

【0009】

本発明に係る製造方法及び無細胞翻訳系によれば、荷電性非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドを、無細胞翻訳系で効率よく産生することができる。また、この方法を応用することにより、荷電性非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドで構成されるペプチドライブラリを得ることができる。
荷電性非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドは、プロテアーゼ耐性や細胞膜透過性に優れたものも多く、かかる性質を備えた医薬品候補となり得る。また、荷電性非タンパク質性アミノ酸を含むペプチドライブラリは、かかる性質を備えた医薬品候補のスクリーニングに好適に用いられる。この点、本発明に係る製造方法は、各種のin vitroディスプレイによるセレクションにも適用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１には、本発明に係る方法による、荷電性N-アルキルアミノ酸のリボソームによるペプチドへの取り込みスキームを示す。（Ａ）正電荷を有するN-アルキルアミノ酸のリボソームペプチドへの取り込みの概略と、実験に用いられたN-アルキルアミノ酸の構造を示す。翻訳非適合性のアミン含有N-アルキルアミノ酸の正電荷をマスクするアジド基を含むN-アルキルアミノ酸前駆体は、リボソームによってペプチドに取り込まれた。ペプチドのアジド基は、翻訳後に、トリアルキルホスフィンで化学的にアミノ基へ変換され、ペプチド中のアミン含有N-アルキルアミノ酸残基となる。^MeLysは、Nα-methyl-L-lysine; ^NH2C3Glyは、N-(3-aminopropyl)-glycineは、^NH2C3Glyは、N-(2-aminoethyl)-glycine; Pro(NH₂) は、cis-4-amino-L-proline; ^MeAnlは、6-azido-N-methyl-L-norleucine; ^N3C3Glyは、N-(3-azidopropyl)-glycine; ^N3C3Glyは、N-(2-azidoethyl)-glycine; Pro(N₃) は、cis-4-azido-L-proline。（Ｂ）負電荷を有するN-アルキルアミノ酸のリボソームによるペプチドへの取り込みの概略と、実験に用いられたN-アルキルアミノ酸の構造を示す。負電荷のカルボキシ基をもつN-アルキルアミノ酸は翻訳非適合性である。そこでカルボキシ基をエステル化することで、このN-アルキルアミノ酸前駆体は、リボソームによってペプチドに取り込まれるようになる。このエステル基は、翻訳後に、カルボキシルエステラーゼで酵素的にカルボキシ基に変換できる。^MeAspは、N-methyl-L-aspartic acid; ^MeGluは、N-methyl-L-glutamic acid; ^COOHC2Glyは、 N-(2-carboxylethyl)-glycine; ^COOHC1Glyは、N-carboxylmethyl-glycine; ^MeAsp(OMe) は、N-methyl-L-aspartic acid O-methyl ester; ^MeGlu(OMe) は、N-methyl-L-glutamic acid O-methyl ester; ^COOMeC2Glyは、N-(2-carboxylethyl)-glycine O-methyl ester; ^COOMeC1Glyは、N-carboxylmethyl-glycine O-methyl ester; ^MeAsp(OBn) は、N-methyl-L-aspartic acid O-benzyl ester; ^MeGlu(OMe) は、N-methyl-L-glutamic acid O-benzyl ester; ^COOMeC2Glyは、N-(2-carboxylethyl)-glycine O-benzyl ester; ^COOMeC1Glyは、N-carboxylmethyl-glycine O-benzyl ester。

【図2】図２は、本発明に係る方法を用いた、正電荷N-アルキルアミノ酸を含むペプチドの、リボソーム合成の結果を示す。（Ａ）N-アルキルアミノ酸取り込みに用いられたmRNAの配列と、mRNAにコードされるペプチドの配列を示す。（Ｂ）オートラジオグラフィーにより検出される[¹⁴C]-Aspで標識されたペプチドのtricine-SDS-PAGE解析の結果を示す。ペプチドは、非アミノアシル-tRNA^Asn-E2_GUG、又はflexizymeに調製された図示されたアミノアシル-tRNA^Asn-E2_GUGの存在下で発現させた。オートラジオグラフィーに基づく各ペプチドの相対産生量をゲルの下に示す。各相対産生量は、二回の実験を行い、その平均値とした。（Ｃ）翻訳産物（上段）及びTCEP処理後（下段）のMALDI-TOFマススペクトルを示す。一価イオン[M + H]⁺についての、目的とするペプチドの計算値（Ｃ）、及び主なピークの実測値（Ｏ）を示す。H⁺は、目的とするペプチドのプロトン化付加物([M + H]⁺)を示す。ダガー（†）は、MALDI解析中に産生したアミン副産物を示す。アスタリスク(*)は、未知のマイナーピークを示す。

【図3】図３は、本発明に係る方法を用いた、負電荷N-アルキルアミノ酸を含むペプチドの、リボソーム合成の結果を示す。（Ａ）オートラジオグラフィーにより検出される[¹⁴C]-Aspで標識されたペプチドのtricine-SDS-PAGE解析。ペプチドは、flexizymeで調製したアミノアシル-tRNA^Asn-E2_GUGの存在下で発現させた。オートラジオグラフィーに基づく各ペプチドの相対産生量をゲルの下に示す。各相対産生量は、二回の実験を行い、その平均値とした。（Ｂ）翻訳産物（最上段と３段目）及びカルボキシルエステラーゼ処理後（２段目と４段目）のMALDI-TOFマススペクトルを示す。一価イオン[M + H]⁺についての、目的とするペプチドの計算値（Ｃ）、及び主なピークの実測値（Ｏ）を示す。H⁺は、目的とするペプチドのプロトン化付加物([M + H]⁺)に対応し、K⁺は、そのカリウム付加物([M + K]⁺)を示す。

【図4】図４は、本発明に係る方法による荷電性N-アルキルアミノ酸取り込みのTRAPディスプレイへの適合性を示す。（ａ）ペプチド提示効率を評価するために、ビオチン標識ペプチドを提示したmRNA/cDNA複合体に対して行った、ストレプトアビジンpull-downの概略を示す。TRAPシステムでは、発現したペプチドは、翻訳系内で、自発的に自身をコードするmRNAにピューロマイシン-DNAリンカーを介して提示される。N-biotinyl-phenylalanine (^BiotF)を含むペプチドを提示するmRNAを、ペプチドを提示していないmRNAから、ストレプトアビジン（StAv）固定ビーズを用いて分離し、定量PCRで定量した。（ｂ）提示効率の定量に用いられたmRNAとペプチドの配列を示す。開始AUGコドンは、^BiotFに再割当した。リボソームを引き止めてペプチドをピューロマイシンに効率よく移転させるための空きUAGコドンには下線を付し、ピューロマイシンDNAリンカーの結合領域はイタリック体で示した。aaは、荷電性N-アルキルアミノ酸又はコントロールのヒスチジンを示す。（ｃ）コントロールのタンパク質性ペプチドと、荷電性N-アルキルアミノ酸を含むペプチドの提示効率を示す。

【図5】O-ベンジル-メチルセリン及びO-ベンジル-N-メチルトレオニンを含むペプチドのリボソーム合成。（Ａ）N-メチルセリン(^MeSer)、O-ベンジル-N-メチルセリン[^MeSer(Bn)]、N-メチルトレオニン(^MeThr)、及びO-ベンジル-N-メチルトレオニン[MeThr(Bn)]の化学構造。（Ｂ）ジニトロフレキシザイム（dFx）による、O-ベンジル-N-メチルアミノ酸でのマイクロヘリックスRNAのアミノアシル化を、Acid urea PAGEで確認した結果を示す。O-ベンジル-N-メチルアミノ酸と対応するDBEは、dFxにより、マイクロヘリックスRNAに結合させた。N-メチル-アミノアシル-（^Meaa-）マイクロヘリックスRNAの収率は、^Meaa-microhelix RNAs (I)及びmicrohelix RNAs (II)の蛍光強度で、(I) / [(I) + (II)]として求めた。（Ｃ）N-メチルアミノ酸の取り込みに用いられたmRNAと、mRNAにコードされるペプチドの配列。（Ｄ）[¹⁴C]-Aspで標識されたペプチドのTricine-SDS-PAGE。ペプチドは、図に示すN-methyl-aminoacyl-tRNA^Asn-E2_GUGの存在下で発現させ、オートラジオグラフィで検出した。（Ｅ）O-ベンジル-N-メチルアミノ酸含有ペプチドのMALDI-TOFマススペクトル。一価イオン[M + H]⁺の計算値（C:）と、実測値（O:）を示す。

【図6】図６は、フレキシザイム（dFx）による、N-アルキルアミノ酸を用いたマイクロヘリックスRNAのアミノアシル化を、Acid urea PAGEで確認した結果を示す。アミノアシル-（^Raa-）マイクロヘリックスRNAの収率は、^Raa-microhelix RNAs (I)及びmicrohelix RNAs (II)の蛍光強度で、(I) / [(I) + (II)]として求めた。

【図7】図７は、図２Ｃに示すN-アルキルアミノ酸のアジド前駆体を含むペプチドと、TCEP処理後のペプチドのMALDI-TOFマススペクトルを示す。各スペクトルにおいて、一価イオン[M + H]⁺の計算値（C:）と、実測値（O:）を示す。

【図8】図８は、連続して2つのN-アルキルアミノ酸を取り込ませたペプチドのMALDI-TOFマススペクトルを示す。（Ａ）2つのN-アルキルアミノ酸の連続取り込みに用いたmRNAと、それにコードされるペプチドの配列。N-アルキルアミノ酸には、空きコドンのCACコドンを再割当した。（Ｂ）翻訳産物のMALDI-TOFマススペクトル（第1及び第3パネル）とTCEP又はエステラーゼ処理後のMALDI-TOFマススペクトル（第2及び第4パネル）。一価イオン[M + H]⁺の計算値（C:）と、実測値（O:）を示す。ダガー（†）、MALDI解析中に産生したアミン副産物を示す。アスタリスク（*）は未知のマイナーピークを示す。

【図9】図９は、図２Ｃに示すN-アルキルアミノ酸のエステル前駆体を含むペプチドと、カルボキシエステラーゼ処理後のペプチドのMALDI-TOFマススペクトルを示す。一価イオン[M + H]⁺の計算値（C:）と、実測値（O:）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

〔ペプチドの製造方法〕
本発明に係る荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法は、
(i) 少なくとも1種の、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAと、
(ii) 前記ペプチドをコードする核酸であって、前記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸と、
を含む無細胞翻訳系でペプチドを発現させる工程と；
前記ペプチドに含まれる非タンパク質性アミノ酸残基の保護基を除去する工程と
を含む。

【0012】

本明細書において「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含む。アミノ酸は慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。本明細書においてアミノ酸又はその誘導体としては、天然タンパク質性L-アミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α-二置換アミノ酸（α-メチルアラニンなど）、N-アルキル-α-アミノ酸、D-アミノ酸、β-アミノ酸、α-ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0013】

アミノ酸には、タンパク質性アミノ酸（proteinogenic amino acids）と、非タンパク質性アミノ酸（non-proteinogenic amino acids）が含まれる。
本明細書において「タンパク質性アミノ酸」は、タンパク質を構成するアミノ酸（Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、及びVal）を意味する。
本明細書において「非タンパク質性アミノ酸」は、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を意味する。

【0014】

本明細書において「荷電性アミノ酸（charged amino acid）」とは、ペプチドやタンパク質に導入された状態で電離をする可能性のある、すなわち中性付近の水溶液中で正又は負の荷電基を有するアミノ酸を意味する。正の荷電基は典型的にはアミノ基であり、負の荷電基は典型的にはカルボキシ基であるが、それぞれこれらに限定されない。その他の荷電基としては、イミダゾール基、グアニジノ基、リン酸基、スルホ基、ピリジニウム基などや、これらが修飾されたもの（アルキル化、メチル化、ジメチル化修飾など）が例示される。

【0015】

本明細書において「荷電性非タンパク質性アミノ酸」は、タンパク質やペプチドに導入された状態で、中性付近において、一部電離をする官能基を持つ非タンパク質性アミノ酸を意味する。
荷電性非タンパク質性アミノ酸としては、例えば、正電荷を持つものとして、^MeLys、^NH2C3Gly、^NH2C2Gly、Pro(NH₂)、負電荷を持つものとして、^MeAsp、^MeGlu、^COOHC1Gly、^COOHC2GlyのようなN-アルキルアミノ酸が挙げられる。また、荷電基を持つD体アミノ酸、β-アミノ酸などがあるがこれらに限定されない。

【0016】

本明細書において「ペプチド」は、アミノ酸が2個〜100個、3個〜80個、5個〜30個ペプチド結合で結合した化合物をいう。本明細書において「荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチド」は、荷電性非タンパク質性アミノ酸を、少なくとも1個含むペプチドをいう。荷電性非タンパク質性アミノ酸の数は特に限定されず、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個等とすることができる。荷電性非タンパク質性アミノ酸が2個以上ペプチドに含まれている場合、荷電性非タンパク質性アミノ酸は連続していてもよく、間にタンパク質性アミノ酸等、他のアミノ酸を挟んでいてもよい。

【0017】

本明細書において、荷電性非タンパク質性アミノ酸の荷電基に導入される「保護基」は、荷電基の電荷をマスクする保護基である限り、どのような基であってもよく、荷電基の種類に応じて適宜選択される。例えば、荷電基がアミノ基である場合、公知の種々のアミノ基の保護基を用いることができ、アジド基（−N₃）、Alloc基、Troc基、Ns基、Boc基、Fmoc基、Cbz基、Pht基、Ts基、スルホンアミド基、その他の様々なアシル基などが好適に用いられる。また、荷電基がカルボキシ基である場合、公知の種々のカルボキシ保護基を用いることができ、アルキルエステル基（例えば、メチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル等の低級アルキルエステル）、又はアラルキルエステル基（例えば、ベンジルエステル等）が好適に用いられる。
保護基は、比較的温和な条件で化学的または酵素的に脱保護できるものが好ましい。

【0018】

本明細書において「荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNA」は、tRNAの3'末端に、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したものいう。
荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸をtRNAに結合させる方法は特に限定されないが、例えば、人工アミノアシル化RNA触媒フレキシザイム（flexizyme）を用いることができる（WO2007/066627、WO2012/026566）。フレキシザイム（Flexizyme）は、任意のtRNAに任意のアミノ酸、ヒドロキシ酸、カルボン酸などを連結（アシル化）することのできる人工RNA触媒（アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒）である。

【0019】

フレキシザイムとしては、例えば、以下の文献に記載されたものが公知である：H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662； H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084； H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359；N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894；及びWO2007/066627「多目的化アシル化触媒とその用途」）。フレキシザイムは、原型のフレキシザイム（Fx）、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイム（dFx）、エンハンスドフレキシザイム（eFx）、アミノフレキシザイム（aFx）等も知られる。

【0020】

再構成型の翻訳系において、天然のアミノアシルtRNA合成酵素に合成されるアミノアシルtRNAに代えて、フレキシザイムを用いれば、天然の遺伝暗号とは異なる、所望のアミノ酸、ヒドロキシ酸、カルボン酸などを任意のコドンと対応させて、遺伝暗号表を書き換えることができる。これをコドン再割当という。
本明細書において「再構成の翻訳系」とは、翻訳系の構成因子を目的に合わせて自由に取り除き、必要な成分だけを再構成してできる無細胞翻訳系をいう。例えば、特定のアミノ酸を除去した翻訳系を再構成すると、当該アミノ酸に対応するコドンが、いずれのアミノ酸もコードしない空きコドンになる。
そこで、フレキシザイム等を利用して、その空きコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに任意のアミノ酸、ヒドロキシ酸、カルボン酸などを連結し、これを加えて翻訳を行うと、当該任意のアミノ酸、ヒドロキシ酸、カルボン酸などがそのコドンでコードされることになり、除去したアミノ酸の代わりに当該任意のアミノ酸、ヒドロキシ酸、カルボン酸などが導入されたペプチドが翻訳される。
本発明においては、このような空きコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに、保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸を結合させることにより、当該非タンパク質性アミノ酸をペプチドの任意の場所に取り込むことができる。

【0021】

本発明に用いられるtRNAは、大腸菌由来野生型tRNAであってもよいし、in vitroの転写で調製した人工tRNAであってもよい。
荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が2以上ある場合、それぞれのアミノ酸に結合させるtRNAは、異なるものを用いてもよいし、アンチコドンループ部分以外、同じ配列を有しているものを用いてもよい。

【0022】

本明細書において「無細胞翻訳系」は、細胞を含まない翻訳系をいい、無細胞翻訳系としては、例えば、大腸菌抽出液、小麦胚芽抽出液、ウサギ赤血球抽出液、昆虫細胞抽出液等を用いることができる。また、本発明においては、それぞれ精製したリボソームタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）、リボソームRNA、アミノ酸、rRNA、GTP、ATP、翻訳開始因子（IF）伸長因子（EF）、終結因子（RF）、およびリボソーム再生因子（RRF）、ならびに翻訳に必要なその他の因子を再構成することで構築した、再構成型の無細胞翻訳系を用いても良い。DNAからの転写を併せて行うためにRNAポリメラーゼを含む系としてもよい。
市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のRTS-100（登録商標）、再構成型翻訳系としてはPGI社のPURESYSTEM（登録商標）やNew England BioLabs社のPURExpressR In Vitro Protein Synthesis Kit等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
また、大腸菌のリボソームを用いる系として、例えば次の文献に記載された技術が公知である：H. F. Kung et al., 1977. The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894; M. C. Gonza et al., 1985, Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America Vol. 82, 1648-1652; M. Y. Pavlov and M. Ehrenberg, 1996, Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16; Y. Shimizu et al., 2001, Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755; H. Ohashi et al., 2007, Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276。
無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。

【0023】

本発明に係る荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法に用いられる無細胞翻訳系には、(i) 保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAを少なくとも1種と、(ii) 上記ペプチドをコードする核酸であって、上記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸が含まれる。
上記ペプチドをコードする核酸であって、上記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸は、DNAであってもRNAであってもよい。
DNAである場合には、上述のとおり無細胞翻訳系にRNAポリメラーゼを加えて、転写反応を生じさせる。
かかる核酸は、当業者が公知の方法又はそれに準ずる方法によって適宜調製することができる。

【0024】

本明細書において「ペプチドを発現させる工程」は、上述の(i) 少なくとも1種の、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAと、(ii) 上記ペプチドをコードする核酸であって、上記tRNAのアンチコドンに対応するコドンを少なくとも１つ含む核酸と、を含む無細胞翻訳系を、適当な条件でインキュベートすることによって行うことができる。
無細胞翻訳系には、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸以外のアミノ酸であって、上記核酸がコードするアミノ酸が結合した伸長tRNAや開始tRNA、その他必要な成分を適宜添加することができる。

【0025】

本明細書において「ペプチドに含まれる非タンパク質性アミノ酸残基の保護基を除去する工程」は、保護基の種類に応じて、当業者が公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。保護基の除去は、化学的または酵素的に行うことができ、必要な化合物又は酵素を無細胞翻訳系に加えて、適当な条件でインキュベートすることによって行うことができる。
例えば、アジド基の脱保護は、翻訳産物にトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を加えて42℃、pH8.4で10分から60分インキュベートすることにより行うことができる。また、アルキルエステルやアラルキルエステルは、翻訳産物にカルボキシエステラーゼを加えて42℃、pH8.4で12時間から24時間インキュベートすることにより行うことができる。
本工程により、荷電性アミノ酸が有する荷電基が露出し、荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを得ることができる。

【0026】

〔ペプチドライブラリの製造方法〕
上述した本発明に係るペプチドの製造方法を用いて、荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリを製造することもできる。
本発明に係るペプチドライブラリの製造方法は、本発明に係るペプチドの製造方法において、ペプチドをコードする核酸に代えて、ペプチドライブラリをコードする核酸ライブラリを無細胞翻訳系に加える。
ペプチドライブラリをコードする核酸ライブラリは、当業者が公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。核酸ライブラリの各核酸はランダムな配列を含み、当該ランダムな配列の中に、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸が結合したtRNAのアンチコドンに対するコドンが含まれていると、当該非タンパク質性アミノ酸が取り込まれる。
こうして得られるペプチドライブラリは、各ペプチドが荷電性非タンパク質性アミノ酸を含む機能性の高いライブラリである。荷電性非タンパク質性アミノ酸の種類によって、ペプチドの膜透過性やプロテアーゼ耐性を向上させることが可能であり、医薬品候補のスクリーニングに有用である。

【0027】

本発明に係る方法で製造されたペプチド及びペプチドライブラリは、さらに大環状化させてもよい。本明細書において「大環状化」とは、1つのペプチド内において、1アミノ酸以上離れた2つのアミノ酸が直接に、又はリンカー等を介して間接的に結合し、分子内に大環状の構造を作ることを意味する。

【0028】

大環状化は、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、C-S-C結合、C-N-C結合、C=N-C結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、チオアミド結合などによることができるが、これらに限定されない。
ペプチドを大環状化することにより、ペプチドの構造を安定化させ、標的への親和性を高めることができる場合がある。

【0029】

環状化のためには、例えば、N末端にクロロアセチル化したアミノ酸を用い、C末端にCysを配してもよい。これにより、N末端アミノ酸とC末端Cysとのチオエーテル結合により、ペプチドは発現した後、自然に環状化する。クロロアセチル化アミノ酸とCysとの間に形成されるチオエーテル結合は生体内の還元条件下でも分解を受けにくいので、ペプチドの血中半減期を長くして生理活性効果を持続させることが可能である。
クロロアセチル化アミノ酸としては、例えば、N-chloroacetyl-L-alanine、N-chloroacetyl-L-phenylalanine、N-chloroacetyl-L-tyrosine、N-chloroacetyl-L-tryptophan、N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophane、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tryptophane、およびこれらに対応するD-アミノ酸誘導体を用いることができる。
また、クロロアセチル化アミノ酸として、Nγ-(2-chloroacetyl)-α,γ-diaminobutylic acid、又はNγ-(2-chloroacetyl)-α,γ-diaminopropanoic acidを用いれば、ペプチド鎖のどの部位にも導入できるので、任意の箇所のアミノ酸と、同じペプチド内のシステインとの間にチオエーテル結合が生成され、環状構造が形成される。
大環状化方法は、例えば、Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009)；Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)；Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)；Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008)；Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)に記載された方法に従って行うことができる。
クロロアセチル化アミノ酸とCysは、本発明に係るペプチドに直接結合していてもよいし、リンカー等を介して結合していてもよい。

【0030】

〔in vitroディスプレイ法〕
本発明は、荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドを含むペプチドライブラリ用いるin vitroセレクション法も包含する。
本発明に係るin vitroディスプレイ法では、上述した本発明に係るペプチドライブラリの製造方法において、ペプチドをコードするmRNAライブラリに代えて、各mRNAのORFの下流領域にピューロマイシンを結合させたピューロマイシン結合mRNAライブラリを無細胞翻訳系に加える。ピューロマイシンは、ペプチドや核酸で構成されるリンカーを介してmRNAに結合させてもよい。mRNAのORF下流領域にピューロマイシンを結合させることにより、mRNAのORFを翻訳したリボソームがピューロマイシンを取り込み、mRNAとペプチドの複合体が形成される。このようなペプチド−mRNA複合体は、遺伝子型と表現型を対応付けることができる。

【0031】

続いて、ペプチド−mRNA複合体に対して逆転写反応を行い、ペプチド−DNA複合体ライブラリを得る。本工程は、逆転写酵素を加えて適宜インキュベートすることにより行うことができる。
逆転写反応の後、荷電基に保護基が導入された非タンパク質性アミノ酸残基を脱保護し、荷電性非タンパク質性アミノ酸の荷電基を露出させる。
ペプチドは、標的物質と反応させる前に、大環状化してもよい。

【0032】

次に、ペプチド−DNA複合体ライブラリから、標的物質に結合するペプチド−DNA複合体群を選択する。

【0033】

上記の方法では、翻訳後、逆転写反応、保護基の除去、標的物質に結合するペプチド−DNA複合体群の選択の順としたが、翻訳後、保護基を除去してから逆転写反応及び標的物質に結合するペプチド−DNA複合体群の選択を行ってもよいし、翻訳後、保護基を除去してから標的物質に結合するペプチド−mRNA複合体群を選択し、その後逆転反応を行ってもよい。

【0034】

本明細書において「標的物質」は特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖、脂質等とすることができる。特に、本発明のライブラリによれば、標的物質がプロテアーゼ活性を有する場合や細胞内の分子である場合にも用いることができる。

【0035】

標的物質は、例えば、固相担体に固定して、本発明のライブラリと接触させてもよい。本明細書において、「固相担体」は、標的物質を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられ、標的物質は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
標的物質と、ライブラリは、適宜選択された緩衝液中で接触させ、pH、温度、時間等を調節して相互作用させる。その後、固相表面を洗浄し、固相表面に結合したペプチド−DNA複合体を緩衝液で溶出することにより、標的物質に結合するペプチド−DNA複合体群を選択することができる。

【0036】

こうして得られたペプチド−DNA複合体群のDNAを増幅する。増幅工程はPCR法で行うことができる。
増幅されたDNAを転写することにより、標的物質に結合したペプチド群をコードするmRNAライブラリが得られるので、これにピューロマイシンを結合させてピューロマイシン結合mRNAライブラリを製造することができる。このピューロマイシン結合mRNAライブラリは、最初のピューロマイシン結合mRNAライブラリよりも標的物質に親和性の高いペプチド群をコードする。したがって、上述の工程を繰り返すことにより、標的物質に対する親和性がより高いペプチドとそれをコードする核酸を濃縮することが可能である。
標的物質に結合するペプチドは、標的物質の活性の阻害などを通じて種々の活性を示す可能性が高く、医薬品や診断薬候補として有用である。

【0037】

本発明は、ペプチドのスクリーニング用キットも提供する。
本発明のスクリーニング用キットの一態様は、本発明に係る製造方法で製造されたペプチドライブラリ、又は、ペプチド−mRNA複合体ライブラリを含む。
本発明のスクリーニング用キットは、他に、標的物質とペプチド又はペプチド−mRNA複合体との結合を検出するのに必要な試薬及び装置を含む。かかる試薬及び装置としては、例えば、固相担体、緩衝液、標識用試薬、酵素、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダーが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。

【実施例】

【0038】

以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。

【0039】

１．材料と方法
１−１．荷電性N-アルキルアミノ酸含有ペプチドのリボソーム合成
翻訳系の調製、ペプチドをコードするDNA鋳型、及びN-アルキル-アミノアシル- tRNA^Asn-E2_GUGの調製は、後述する「３．補足」に記載する。
0.04 μM DNA鋳型、それぞれ0.5 mMのMet、Tyr、Lys、50 μMの[¹⁴C]-Asp、0.03 μMのMetRS、0.02 μMのTyrRS、0.11 μMのLysRS、0.13 μMのAspRS、及び100 μMのN-アルキル-アミノアシル-tRNA^Asn-E2_GUG を含む翻訳混合液（表２）を、37℃で60分インキュベートした。得られた翻訳産物を、tricine-SDS PAGEとオートラジオグラフィー（Pharox FX、BIO-RAD）で解析した。
MALDI-TOF解析では、上記[¹⁴C]-Aspの代わりにAspを用いて反応させた。

【0040】

アジドの脱保護は、翻訳産物に100mMのTCEPを加え、42℃、pH8.4で30分インキュベートして行った。
カルボキシルエステルの脱保護は、翻訳産物にカルボキシエステラーゼ（Sigma & Aldrich）を加え、42℃、pH8.4で18時間インキュベートして行った。
サンプルをC-TIP（Nikkyo Technos）で脱塩し、80％アセトニトリル、0.5％酢酸（CHCA飽和）で溶出し、autoflexII（BRUKER DALTONICS）のlinear positive modeで解析した。

【0041】

１−２．提示効率解析のための、ビオチン化ペプチド/mRNA/cDNA複合体のストレプトアビジンpull down
TRAPシステムの調製、ペプチドをコードするDNA鋳型、及びN-biotinyl-Phe-tRNAⁱⁿⁱ_CAUの調製は、後述する「３．補足」に示す。
DNA鋳型は、TRAPシステム（各0.5 mMのTyr、Gly、Ser、DNA鋳型を含む10% v/vのPCR反応液、2.5 μMのピューロマイシン-DNAリンカー（配列は表Ｓ１）、25 μMのN-biotinyl-Phe-tRNAⁱⁿⁱ_CAU、1 μMのT7 RNA polymerase、及び、100 μMのHis、^N3C2Gly-tRNA^Asn-E2_GUG、^MeGlu(OMe)-tRNA^Asn-E2_GUGのいずれかを含む）内で、37℃で25分、転写し、ビオチン化ペプチドに翻訳した。
EDTAによるリボソームとの解離後、G5S-4.R20プライマーとRNase H-inactivated reverse transcriptase (TOYOBO, Japan)を用いて、mRNAの逆転写反応を行った。逆転写反応をEDTAにより停止させ、HEPESで溶液を中和した後、ビオチン化ペプチドを提示したcDNA/mRNA複合体を、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ（VERITAS）で選択的に回収し、T7SD8M2.F44フォワードプライマーとG5S-4.an21.R41リバースプライマーを用いた定量PCRで定量した。

【0042】

２．結果
正電荷をもつアミンを含むN-アルキルアミノ酸を電荷のないアジド基で保護したN-アルキルアミノ酸前駆体をリボソームによってペプチドに取り込み、翻訳後にStaudinger反応により、トリアルキルホスフィンで脱保護し（参考文献40）、正電荷をもつアミンを含むN-アルキルアミノ酸を露出させる（図１Ａ）という2段階のステップにより、正電荷を有するN-アルキルアミノ酸がペプチドに取り込まれるか調べた。
同様に、負電荷をもつカルボン酸を含むN-アルキルアミノ酸が、メチルエステル化されたカルボン酸を含むN-アルキルアミノ酸を用いてペプチドを翻訳合成し、翻訳後にカルボキシエステラーゼでカルボン酸を露出させることにより、翻訳合成されたペプチドに取り込まれるか否かも調べた（図１Ｂ）。
さらに、芳香族性の側鎖を有するN-アルキルアミノ酸も、その嵩高さにかかわらずリボソームによる翻訳の基質となること（参考文献13、19）、また、ベンジル基で修飾したN-メチルセリンとN-メチルトレオニンが、修飾していないN-メチルセリン及びN-メチルトレオニンと同等の効率でペプチドに取り込まれることを見出したことから（図５）、ベンジルエステル化されたカルボン酸を含むN-アルキルアミノ酸が、翻訳合成において基質となり、翻訳後にカルボキシエステラーゼを反応させて脱保護できるか否かも調べた（図１Ｂ）。

【0043】

アジドを含むN-アルキルアミノ酸がリボソームによって取り込まれるか調べるため、まずN-メチルアジドノルロイシン（^MeAnl、図１Ａ）、3,5-ジニトロベンジルエステル（DBE）を化学合成し、人工tRNAアミノアシル化リボザイム（flexizymes）（参考文献41-43）の基質とした。^MeAnl-DBEとマイクロヘリックスRNA（tRNAアナログ）を用いて、アミノアシル化の条件を最適化し、^MeAnlが、α-N-メチルリシン（^MeLys）と同様にtRNAに結合することを確認した（図７）。
リボソームペプチドへの取り込み効率を評価するために、^MeAnl、及びコントロールのLys及び^MeLysを、アンチコドンGUGを有する大腸菌のAsn tRNA（tRNA^Asn-E2）に、flexizymeを用いて結合させた（参考文献44）。
N-アルキルアミノ酸の取り込みのために、HisのCACコドンを有し、且つ、[¹⁴C]-Aspで同位体標識するためにC末端にFLAGタグが結合したペプチドをコードするDNA鋳型も調製した（図２Ａ）。DNA鋳型と、非アミノアシル化tRNA^Asn-E2_GUGを含むHis欠損再構成無細胞翻訳系では、[¹⁴C]-Aspで標識されたペプチドは産生されなかった（図２Ｂ、レーン１）。同様に、^MeLys-tRNA^Asn-E2_GUG存在下では、ペプチドは産生されなかった（図２Ｂ、レーン３）。
このことは、過去の報告（参考文献13）と同様に、正電荷を帯びた^MeLysが翻訳に不適合であることを示す。一方、^MeAnl-tRNA^Asn-E2_GUGを含む翻訳系では、タンパク質性Lys-tRNA^Asn-E2_GUGに産生されるペプチドに匹敵する量のペプチドが発現した（図２Ｂ、レーン２及び４）。
このことは、電荷を有するアミンを、中性の小さなアジドでマスキングすることによって、取り込み効率が劇的に改善されることを示す。
^MeAnlの取り込みは、脱塩した翻訳産物のMALDI-TOF-MS解析によって、最終的に確認した（図２Ｃ、８）。アジド基を脱保護し、MALDI-TOF-MSで解析するために、翻訳産物を、100mMのトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）と共に、42℃、pH=8.4で0.5時間インキュベートした。この温度とpHは、in vitroペプチドセレクションの際の逆転写に用いたものである。
主生成物の分子量は、所望の^MeLysを含むペプチド（及び未知の副生成物のマイナーシグナル）と一致しており、^MeAnlをリボソームによって取り込み、生体直行型のStaudinger反応によってアジド基を変換してアミノ基にすることにより、結果として^MeLysがリボソームによってペプチドに取り込まれたことが確認された。

【0044】

利用可能な、アミノ基を含むN-アルキルアミノ酸ビルディングブロックを拡大するため、N-(3-azidopropyl)-glycine (^N3C3Gly)、N-(2-azidoethyl)-glycine (^N3C2Gly)、cis-4-azido-proline [Pro(N₃]] (図１Ａ)、及びコントロールとしてN-(3-aminopropyl)-glycine (^NH2C3Gly)、並びにそれぞれに対応するDBE誘導体を、flexizymeによって、最適条件下でtRNA^Asn-E2にチャージして用いた（図６）。
ネガティブコントロールであるN-(2-aminoethyl)-glycine (^NH2C2Gly)及びcis-4-amino-proline [Pro(NH₂]]のDBEは、アミノアシル化産物を産生しなかった。これは、これらのaa-DBEまたはaa-tRNAにおいて、アミノ酸が自己環状化し、ラクタムを形成したためと考えられる。^N3C3Gly-、^N3C2Gly-、又はPro(N₃)-tRNA^Asn-E2_GUGを含む翻訳系は、[¹⁴C]-Aspで標識されたペプチドを発現し（図２Ｂ、レーン６−８）、質量分析の結果、翻訳産物にはリボソームによって^N3C3Gly、^N3C2Gly及びPro(N₃)が取り込まれたことが確認された（図２Ｃ及び７）。その後、上述のとおりアジド基を除去することにより、^NH2C3Gly、^NH2C2Gly、又はPro(NH₂)を含むペプチドに対応する明らかな質量のシフトが観察された。^N3C3Gly及びPro(N₃)については、^MeAnlを含むペプチドのTCEP還元で見られたのと同様にマイナーな未知の副生成物のピークが見られたが、^N3C2Glyを含むペプチドのTCEP還元では、均一な^NH2C3Glyを含むペプチドが得られた。

【0045】

これまでに、骨格を修正した非タンパク質性アミノ酸の中には、単独では効率よく取り込まれるものの、複数連続の取り込みは生じにくいものがあることが確認されていたので（参考文献45）、次に、fMet-(Tyr)₃-(^Raa)₂-Arg-(Tyr)₃（^Raaは、N-アルキルアミノ酸を示す）を発現させて、アジドを含むN-アルキルアミノ酸の連続した2つの取り込みを試験した（図８Ａ）。脱塩した翻訳産物のMALDI-TOF-MS解析により、アジド前駆体が連続してペプチドに取り込まれたことが示された（図８Ｂ）。TCEPで処理したサンプルをMALDI-TOF-MSで解析した結果、すべてのアジド前駆体について所望の産物が得られたことが示された。また、図2Cと同様に^N3C2Glyを含むペプチドの場合に、もっとも均一に正電荷を有するN-アルキルアミノ酸を含むペプチドが得られた。

【0046】

次に、エステル化されたカルボン酸を含むN-アルキルアミノ酸がリボソームによって取り込まれるか調べるために、化学合成したN-メチルアスパラギン酸O-メチルエステル及びO-ベンジルエステルのDBE（図１Ｂ、^MeAsp(OMe)及び^MeAsp(OBn)）を合成し、いずれのエステルも、Ｎ−メチルアスパラギン酸（^MeAsp）と同様にtRNAに結合することを確認した（図６）。
Hisの代わりに^MeAsp(OBn)-tRNA^Asn-E2_GUGを加えた翻訳系を用いた翻訳アッセイでは、以前の実験結果（参考文献13）と同様に、負電荷を有する^MeAspはペプチドに導入されないことが示された（図２Ｂ、レーン２）。
一方、^MeAsp(OMe)-tRNA^Asn-E2 _GUG及びand ^MeAsp(OBn)-tRNA^Asn-E2 _GUGを含む翻訳系では、タンパク質性のGlu-tRNA^Asn-E2_GUGを含むペプチドに匹敵する量のペプチドが発現した（図２Ｂ、レーン１と３及び４との比較。）。
このことは、カルボン酸のメチルエステルもベンジルエステルも、取り込み効率を著しく増大させることを示す。しかしながら、脱塩した翻訳産物を質量分析したところ、いずれのペプチドも、目的とした^MeAsp(OMe)及び^MeAsp(OBn)ではなく、aspartimideを主として含んでいた。^MeAsp(OMe)及び^MeAsp(OBn)は翻訳の際うまくペプチドに取り込まれたものの、Fmocを用いたペプチドの固相合成でもよく見られるように、βカルボキシルエステルと骨格のアミドが閉環しaspartimideが形成されたものと思われる。ただし、カルボキシエステラーゼで加水分解した際は、^MeAspを含むペプチドが検出されることから、このaspartimideの形成は質量分析の際に起こっていると考えられる。

【0047】

次に、リボソームによってペプチドに取り込まれる他のエステル化したカルボン酸を含むN-アルキルアミノ酸を探索した（図１Ｂ）。
N-メチルグルタミン酸とN-(2-カルボキシエチル)-グリシンのO-メチルエステル及びO-ベンジルエステル（それぞれ、^MeGlu(OMe)、^MeGlu(OBn)、^COOMeC2Gly及び^COOBnC2Gly；図１Ｂ）が結合したtRNA^Asn-E2を、対応するDBEとflexizymeによって最適条件下で調製した（図６）。
N-カルボキシメチル-グリシンのO-メチルエステル及びO-ベンジルエステル（^COOMeC1Gly及び^COOBnC1Gly、図１Ｂ）でアミノアシル化を解析したところ、主バンドは、N-カルボキシメチル-グリシル-RNAに相当し、目的とするエステル化N-カルボキシメチル-RNAのバンドはかすかなバンドしか見られなかった。これはおそらくアミノアシル化の際に、側鎖のα-カルボキシルエステルが加水分解されたことによるものと考えられる（データなし）。そこで、^COOMeC1Gly及び^COOBnC1Glyの直接翻訳アッセイにより、アミノアシル化の時間を最適化したところ、18時間のアミノアシル化によって[¹⁴C]-Asp標識したペプチドが得られることがわかった。同様に、^MeGlu(OMe)、^MeGlu(OBn)、^COOMeC2Gly及び^COOBnC2Glyはペプチドに取り込まれるが（図３Ｂ、レーン６、７、９、１０、１２及び１３）、負電荷を有する^MeGlu、^COOHC2Gly及び^COOHC1Glyは、まったく取り込まれないことを確認した（図３Ｂ、レーン５、８及び１１）。発現したペプチドの質量分析を行ったところ、試験に用いたすべてのアミノ酸について、エステル化されたカルボン酸含有N-アルキルアミノ酸が取り込まれたことが確認された（図３Ｃ及び９）。

【0048】

次に、エステルが、対応するカルボン酸に温和な条件で変換されることを示すために、翻訳産物を精製せずに、市販のカルボキシエステラーゼで42℃、pH8.4で18時間処理した。エステラーゼ処理したサンプルのMALDI-TOF-MSスペクトルによって、すべてのアミノ酸について、エステル基が定量的にカルボン酸に変換され、カルボン酸含有N-アルキルアミノ酸が露出したことが確認された（図３Ｃ及び９）。
さらに、単独で効率よく取り込まれた^MeGlu(OMe)が、2つ連続して取りこまれ、且つ、カルボキシエステラーゼで脱保護されることも、MALDI-TOF-MSで確認した（図８）。

【0049】

最後に、翻訳後の脱保護を介した荷電性N-アルキルアミノ酸の取り込みについて、本発明者らが開発したin vitro TRAP(Transcription-translation coupled with Association of Puromycin-linker)ディスプレイへの適合性を調べた（図４Ａ）。TRAPディスプレイでは、mRNAの3'末端で、相補的なオリゴDNAリンカーの3'末端にピューロマイシンを結合させ、無細胞転写-翻訳系に直接加える（図４Ａ）。この系（TRAPシステム）では、DNAは連続的に転写されてペプチドに翻訳され、ペプチドは、自身をコードするmRNAにピューロマイシンリンカーを介して自発的に提示される（trapped）。このように、ペプチド-mRNA複合体は、TRAPシステム内で対応する鋳型DNAから作られる。

【0050】

荷電性N-アルキルアミノ酸を含むペプチドの提示効率は、fMet-(Tyr)₃-aa-(Gly)₅-SerペプチドをコードするDNAを構築して評価した（図４Ｂ）。N-biotinyl-Phe（^BiotF）をtRNAⁱⁿⁱ_CAUに結合させ、ペプチドのN末端においてビオチンでペプチドを標識するために用いた（図４ａ）。His、^N3C2Gly-tRNA^Asn-E2_GUG、又は^MeGlu(OMe)-tRNA^Asn-E2_GUGを、鋳型DNAと^BiotF-tRNAⁱⁿⁱ_CAUを含むTRAPシステムに加えた。
^N3C2Gly-tRNA^Asn-E2_GUG又は^MeGlu(OMe)-tRNA^Asn-E2_GUGを含む翻訳産物からのストレプトアビジンによるpull-down、及びTCEP又はカルボキシルエステラーゼによる脱保護により、荷電性N-アルキルアミノ酸（^MeGlu又は^NH2C2Gly）を含むビオチン化ペプチドが、コントロールのタンパク質性ペプチドと同等の効率で、そのmRNA上に提示されることが確認された（図４Ｃ）。
また、非アミノアシル化tRNA^Asn-E2_GUGを含むコントロールの翻訳産物に対するストレプトアビジンpull-down実験では、ビオチン化ペプチドはmRNAに提示されないことが示された（図４Ｃ）。

【0051】

３．補足
３−１．N-アルキルアミノ酸 3,5-ジニトロベンジルエステルの合成
すべてのN-アルキルアミノ酸、Boc基で保護したN-アルキルアミノ酸、及びFmoc基で保護したN-アルキルアミノ酸は、Watanabe Chemical、TCI、Chem-Impex、又はApollo Scientificから購入した。アジド基含有N-アルキルアミノ酸は、対応する一級アミン含有N-アルキルアミノ酸から、参考文献46の方法で合成した。すべてのN-アルキルアミノ酸は、参考文献13、41、及び19の方法で3,5-ジニトロベンジルエステル（DBE）に変換した。N-アルキルアミノ酸DBEのメチルエステル化は、トリメチルシリルジアゾメタンで行った。N-アルキルアミノ酸DBEのベンジルエステル化は、臭化ベンジルを用いて、アミノ酸の3,5-ジニトロベンジルエステル化（参考文献41）と同様の方法で行った。

【0052】

３−２．フレキシザイムによる、マイクロヘリックスRNAとN-アルキルアミノ酸のアミノアシル化アッセイ
マイクロヘリックスRNAとジニトロフレキシザイム（dFx）は、適切な鋳型のrun-off transcriptionにより調製した（参考文献41）。アミノアシル化効率は、マイクロヘリックスRNAを用いて測定した。反応は、通常以下の条件で行った。5 μLの25 μM dFx、25 μM マイクロヘリックスRNA、及び5 mM N-アルキルアミノ酸DBE（0.1 M Hepes-K buffer pH 7.5中）、20 mM MgCl₂並びに20 % DMSO（氷上）。
手順は、以下のとおりである。50 μMマイクロヘリックスRNA（0.2 M Hepes-Kバッファ、pH 7.5 (2.5 μL)中）を、95℃で1分加熱し、5分間で室温まで冷却した。MgCl₂（100 mM、1 μL）及びdFx（250 μM、0.5 μL）を混合液に加えた。N-アルキルアミノ酸DBE（DMSO中25mM、1μL）を加えて反応を開始させ、氷上でインキュベートした。15μLのローディングバッファ（150 mM酢酸ナトリウムpH 5、10 mM EDTA、及び83%ホルムアミド）を加えて反応を停止した。このサンプルを、20％変性酸PAGE（50mM 酢酸ナトリウム pH5、6M 尿素）で解析した。RNAをエチジウムブロマイドで染色し、Pharos FX (BIO-RAD)で解析した。

【0053】

３−３．N-アルキルアミノ酸でアミノアシル化したtRNA^Asn-E2のフレキシザイムによる調製
tRNA^Asn-E2は、参考文献19、44の方法で、適切な鋳型のrun-off transcriptionによって調製した。tRNA^Asn-E2のアミノアシル化は、通常以下の条件で行った。50 μLの25 μM dFx、25 μM tRNA^Asn-E2、及び5 mM N-アルキルアミノ酸DBE（0.1 M Hepes-Kバッファ、pH 7.5中）、20 mM MgCl₂並びに20 % DMSO（氷上）。
手順は以下のとおりである。50 μM tRNA^Asn-E2（0.2 M Hepes-Kバッファ、pH 7.5 （25 μL）中）を95℃で1分間加熱し、5分間で室温まで冷却した。MgCl₂（100 mM、10 μL）とdFx（250 μM、5 μL）を混合物に加えた。N-アルキルアミノ酸DBE（DMSO中25 mM、10 μL）を加えて反応を開始させ、氷上でインキュベートした。150μLの0.6M酢酸ナトリウムpH5を加えて反応を停止した。エタノール沈殿でRNAを回収し、70％エタノールでリンスした。

【0054】

３−４．ペプチドをコードする鋳型DNAの調製
鋳型DNAを調製するために用いたプライマーを表１に示す。図２Ａに示されるペプチドをコードする鋳型DNAは、プライマー伸長にはフォワードプライマーT7pEpsSD6MY3.F37とリバースプライマーeSD6MY3HFlag.R40を用い、増幅にはフォワードプライマーT7pEpsSD6.F40とリバースプライマーFlaguaa.R33を用いた。図８Ａに示されるペプチドをコードする鋳型DNAは、プライマー伸長にはフォワードプライマーT7pEpsSD6MY3.F37及びリバースプライマーeSD6MY3H2RY3.R40を用い、増幅にはフォワードプライマーT7pEpsSD6.F40及びリバースプライマーRY3uaa2.R18を用いた。図４Ｂに示されるペプチドをコードする鋳型DNAは、プライマー伸長にはフォワードプライマーSD8M2-Y3H-G5S-4.F40及びリバースプライマーG5S-4.an21.R41を用い、アニーリングと伸長はTaq DNAポリメラーゼ（Genscript）を用いた。続いて、得られたdsDNAを、フォワードプライマーT7SD8M2.F44及びリバースプライマーG5S-4.an21.R41を用い、Taq DNAポリメラーゼを用いて増幅した。

【0055】

３−５．無細胞再構成翻訳系の調製
再構成翻訳系は、過去の報告（参考文献22、20、16、45）にしたがって調製した。翻訳反応液におけるタンパク質因子及びリボソームの濃度を表２に示す。翻訳反応液にtRNA及び低分子化合物の濃度を表３に示す。

【0056】

３−６．TRAPシステムの調製
TRAPシステムは、2.5μMのピューロマイシンリンカー（BEX, Japan）と、1μM T7 RNAポリメラーゼを含む上記翻訳系で調製した。

【0057】

３−７．N-biotinyl-Phe-tRNA^fMet_CAUの調製
Enhanced flexizyme（eFx）及びtRNA^fMet_CAUは、参考文献41、47に従って適切な鋳型のrun-off transcriptionにより調製した。N- biotinyl -Phe-CMEは参考文献48に従って調製した。tRNA^fMet_CAUのアミノアシル化は、以下の条件で行った。50 μLの25 μM eFx、25 μMのtRNA^fMet_CAU及び5 mMのN-biotinyl-Phe-CME（0.1 M Hepes-KバッファpH 8）、600 mM MgCl₂ 並びに20 % DMSO（氷上）。手順は以下のとおりである。50 μM tRNA^fMet_CAU （0.2 M Hepes-K バッファ pH 7.5（25 μL）中）を95℃で1分間加熱し、5分間で室温まで冷却した。MgCl₂ （3 M、10 μL）及びeFx（250 μM、5 μL）を反応液に加えた。N-biotinyl-Phe-CME（DMSO中25 mM、10 μL）を加えて反応を開始させ、氷上でインキュベートした。150μLの0.6M酢酸ナトリウムpH5を加えて反応を停止した。エタノール沈殿でRNAを回収し、0.1M酢酸ナトリウム（pH5）を含む70％エタノールで2回リンスし、70％エタノールで1回リンスした。

【0058】

３−８．連続した2つのN-アルキルアミノ酸を含むペプチドのリボソーム合成
0.04 μMのDNA鋳型、それぞれ0.5 mMのMet、Tyr、Arg、0.03 μMのMetRS、0.02 μMのTyrRS、0.03 μM ArgRS、及び100 μMのN-アルキルアミノアシル-tRNA^Asn-E2_GUGを含む反応液を、37℃で60分インキュベートした。MALDI-TOF MS解析のために、翻訳産物をC-TIP（Nikkyo Technos）で脱塩し、80％アセトニトリル、0.5％酢酸（CHCA飽和）で溶出し、autoflexII（BRUKER DALTONICS）のlinear positive modeで解析した。

【0059】

逆転写反応、TRAPディスプレイ法又はペプチドをコードする鋳型DNAの調製に用いたオリゴDNA（Greiner Bio-One又はBEXから購入した。）

【表1】

翻訳混合液におけるタンパク質成分とリボソームの濃度。Creatine kinaseはRoche Diagnostics社より、MyokinaseはSigma-Aldrichより購入した。

【表2】

翻訳混合液における低分子化合物とtRNAの濃度。Creatine phosphateと、E. coli total tRNAはRoche Diagnosticsより購入した。10-ホルミル-5,6,7,8テトラヒドロ葉酸は合成した。

【表3】

【0060】

参考文献
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【配列表フリーテキスト】

【0061】

配列番号：１〜１０は、プライマーの配列を示す。
配列番号：１１は、ピューロマイシンDNAリンカーの配列を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]