特許 6366303 エリスロポエチン結合性タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6366303

(24)【登録日】2018年7月13日

(45)【発行日】2018年8月1日

(54)【発明の名称】エリスロポエチン結合性タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20180723BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20180723BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180723BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/12ZNA

   C07K14/705

   C12P21/02 C

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

【請求項の数】6

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2014-43915(P2014-43915)

(22)【出願日】2014年3月6日

(65)【公開番号】特開2015-167505(P2015-167505A)

(43)【公開日】2015年9月28日

【審査請求日】2017年2月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】000173762

【氏名又は名称】公益財団法人相模中央化学研究所

(72)【発明者】

【氏名】畑山 耕太

(72)【発明者】

【氏名】井出 輝彦

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−１７０３３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５０７６７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 The Journal of Biological Chemistry，１９９７年，Vol.272, No.8，p.4985-4992

【文献】 The Journal of Biological Chemistry，１９９６年，Vol.271, No.24，p.14045-14054

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／１２

Ｃ０７Ｋ １４／７０５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２から配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる、エリスロポエチン結合性タンパク質。

【請求項2】

請求項１に記載のエリスロポエチン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項4】

請求項３に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。

【請求項5】

宿主が大腸菌である、請求項４に記載の形質転換体。

【請求項6】

請求項４または５に記載の形質転換体を培養することによりエリスロポエチン結合性タンパク質を生産させる工程、得られた培養物から生産されたエリスロポエチン結合性タンパク質を回収する工程の２つの工程を含むエリスロポエチン結合性タンパク質の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エリスロポエチンに対し結合親和性を有する、エリスロポエチン結合性タンパク質に関するものである。より詳しくは、遺伝子工学的手法を用いてエリスロポエチン結合性と生産効率を向上させたエリスロポエチン結合性タンパク質に関するものである。

【背景技術】

【0002】

ヒトのエリスロポエチンは、赤血球系前駆細胞の分化・増殖を促進させる作用を有する糖タンパク質ホルモンであり、それに由来した組換えエリスロポエチンは、腎性貧血の治療薬などのバイオ医薬品としてすでに普及している。一方、その受容体であるエリスロポエチン受容体を遺伝子組換えによって生産させたタンパク質（以下、エリスロポエチン結合性タンパク質）に関しても、そのエリスロポエチンへの結合性を利用して、バイオ医薬品などへの応用が可能である。例えば、エリスロポエチン結合性タンパク質をエリスロポエチン製剤と共に投与することで、患者にエリスロポエチン製剤のみを投与した場合に起こり得る高血圧を防止しつつ、貧血を処置する方法が報告されている（特許文献１）。また、エリスロポエチン結合性タンパク質を癌腫、肉腫、筋腫などの増殖性臓器疾病に対する治療・改良剤として利用すること（特許文献２）、肥厚性瘢痕、ケロイドまたは慢性関節炎症性疾病に対する予防・治療剤として利用すること（特許文献３）も報告されている。

【0003】

エリスロポエチン結合性タンパク質の生産方法としては、動物細胞宿主を用いた方法（例えば、特許文献２と特許文献３）や微生物細胞宿主を用いた方法（例えば、特許文献１、特許文献４と非特許文献１）などが報告されている。

【0004】

しかしながら、エリスロポエチン結合性タンパク質のアミノ酸の置換を行い、その生産性やエリスロポエチンへの結合性を向上させた先行技術はない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特表２００８−５０５１９１号公報

【特許文献2】特開平１０−１０１５７４号公報

【特許文献3】特開２００２−３２６９５８号公報

【特許文献4】特開２０１２−１４７７７２号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｃ．Ｂｉｎｎｉｅ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１１，２７１−２７８，１９９７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、エリスロポエチンに対して高い結合性を有し、効率的な生産が可能なエリスロポエチン結合性タンパク質、およびその製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは鋭意検討した結果、エリスロポエチン結合性タンパク質において、該エリスロポエチン結合性タンパク質を構成するアミノ酸のうちの特定のアミノ酸を他の特定のアミノ酸に置換することにより、エリスロポエチンに対して高い結合性を有し、効率的に生産可能なエリスロポエチン結合性タンパク質へと改変できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0009】

すなわち、本発明は、
１．以下の（ａ）または（ｂ）のエリスロポエチン結合性タンパク質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）から（５）のアミノ酸の置換を１つ以上されたアミノ酸配列からなるエリスロポエチン結合性タンパク質
（１）配列番号１の１０３番目のアルギニンがセリンに置換
（２）配列番号１の１４１番目のヒスチジンがチロシンに置換
（３）配列番号１の１５９番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（４）配列番号１の１８９番目のアラニンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（５）配列番号１の２０８番目のシステインがチロシンに置換
（ｂ）上記（ａ）のエリスロポエチン結合性タンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるエリスロポエチン結合性タンパク質
２．配列番号２から配列番号１０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる、前記１．に記載のエリスロポエチン結合性タンパク質。
３．前記１．または２．のいずれかに記載のエリスロポエチン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
４．前記３．に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
５．前記４．に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
６．宿主が大腸菌である、前記５．に記載の形質転換体。
７．前記５．または６．に記載の形質転換体を培養することによりエリスロポエチン結合性タンパク質を生産させる工程、得られた培養物から生産されたエリスロポエチン結合性タンパク質を回収する工程の２つの工程を含むエリスロポエチン結合性タンパク質の製造方法。

【0010】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0011】

本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質は、エリスロポエチン受容体の組換えタンパク質であり、ヒトのエリスロポエチンまたはヒトのエリスロポエチンの組換えタンパク質に結合するタンパク質である。

【0012】

前記のエリスロポエチン受容体は、エリスロポエチン受容体を有する生物由来のものであれば特に制限はないが、産業上の利用の観点から安全なヒトのエリスロポエチン受容体であることが好ましい。一例として、ヒトのエリスロポエチン受容体の構成を説明すると、ヒトのエリスロポエチン受容体は５０８個のアミノ酸からなり（ヒトのエリスロポエチン受容体のアミノ酸配列：ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにアクセッションナンバーＰ１９２３５として登録・公開）、Ｎ末端側から２４個のアミノ酸からなるシグナルペプチド領域、２２６個のアミノ酸からなるエリスロポエチン受容体の細胞外領域、２３個のアミノ酸からなるエリスロポエチン受容体の細胞膜貫通領域、そして２３５個のアミノ酸からなるエリスロポエチン受容体の細胞内領域から構成される。ヒトのエリスロポエチンは、該ヒトのエリスロポエチン受容体の細胞外領域の部分に結合する。

【0013】

本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の１０３番目のアルギニンのセリンへの置換（以下、Ａｒｇ１０３Ｓｅｒと表記する）、配列番号１の１４１番目のヒスチジンのチロシンへの置換（以下、Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒと表記する）、配列番号１の１５９番目のアラニンのアスパラギン酸への置換（以下、Ａｌａ１５９Ａｓｐと表記する）、配列番号１の１８９番目のアラニンのアスパラギン酸への置換（以下、Ａｌａ１８９Ａｓｐと表記する）またはバリンへの置換（以下、Ａｌａ１８９Ｖａｌと表記する）、および配列番号１の２０８番目のシステインのチロシンへの置換（以下、Ｃｙｓ２０８Ｔｙｒと表記する）から選択されるアミノ酸の置換を１つ以上されたアミノ酸配列（以下、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質のアミノ酸配列とする）からなるエリスロポエチン結合性タンパク質である。

【0014】

前記の配列番号１に示されるアミノ酸配列を説明すると、該アミノ酸配列の１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列は大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナルであるＭａｌＥシグナル配列であり、２７番目のメチオニンはリンカー配列であり、２８番目のアラニンから２５２番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列は前記のヒトのエリスロポエチン受容体の細胞外領域のアミノ酸配列に由来する配列であり、２５３番目のヒスチジンから２５８番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。

【0015】

本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質は、エリスロポエチン結合性を有する限り、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。ここで複数のアミノ酸とは、２〜１７０個のアミノ酸を意味し、望ましくは２〜５０個のアミノ酸を意味し、更に望ましくは２〜３０個のアミノ酸を意味する。例えば、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質のアミノ酸配列における大腸菌ペリプラズムへの分泌発現シグナルであるＭａｌＥシグナル配列の部分を他のシグナル配列（例えばＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＴｏｒＴなどのシグナル配列、特開２０１１−０９７８９８号公報）に置換してもよいし、該ＭａｌＥシグナル配列の部分を欠失させてもよい。また、例えば、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質のアミノ酸配列におけるポリヒスチジン配列の部分を他の配列（例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などのオリゴペプチドなど）に置換してもよいし、該ポリヒスチジン配列の部分を欠失させてもよい。本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を行うには、当業者に周知の遺伝子工学的な方法を用いて行う方法が例としてあげられる。

【0016】

本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質の具体的な例としては、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を例示することができる。

【0017】

前記のＡｒｇ１０３Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｌａ１５９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９ＶａｌおよびＣｙｓ２０８Ｔｙｒのアミノ酸の置換についてそれらの効果を説明する。前記のＨｉｓ１４１Ｔｙｒは、特に、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチン結合性を高める効果がある。そして、前記のＡｒｇ１０３Ｓｅｒ、Ａｌａ１５９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９ＶａｌおよびＣｙｓ２０８Ｔｙｒは、特に、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質の発現宿主による生産性を高める効果がある。
例えば、エリスロポエチン結合性の高い本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を所望する場合は、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質が前記のＨｉｓ１４１Ｔｙｒを有することが好ましい。また、発現宿主での生産性が高い本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を所望する場合は、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質が前記のＡｒｇ１０３Ｓｅｒ、Ａｌａ１５９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９ＶａｌおよびＣｙｓ２０８Ｔｙｒのうちのいずれか１つ以上を有することが好ましく、より高い生産性のためにはＡｒｇ１０３Ｓｅｒ、Ａｌａ１５９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９Ａｓｐ（またはＡｌａ１８９Ｖａｌ）およびＣｙｓ２０８Ｔｙｒの４つのアミノ酸の置換を有することがより好ましい。

【0018】

エリスロポエチン結合性が高くて発現宿主での生産性が高い本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を所望する場合は、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質が前記のＨｉｓ１４１Ｔｙｒを有し、なおかつ前記のＡｒｇ１０３Ｓｅｒ、Ａｌａ１５９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９ＶａｌおよびＣｙｓ２０８Ｔｙｒのうちのいずれか１つ以上を有することが好ましい。さらに、エリスロポエチン結合性が高くて発現宿主での生産性がより高い本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を所望する場合は、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質が前記のＡｒｇ１０３Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｌａ１５９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９Ａｓｐ（またはＡｌａ１８９Ｖａｌ）およびＣｙｓ２０８Ｔｙｒの５つのアミノ酸の置換を有することがより好ましい。

【0019】

以下、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質の製造方法について、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチドとする）の作製、本発明のポリヌクレオチドを用いての宿主の形質転換、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を用いた本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質の製造、の順に説明する。

【0020】

本発明のポリヌクレオチドの作製方法として、エリスロポエチン受容体のｃＤＮＡ等のエリスロポエチン受容体をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドやエリスロポエチン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドなどをもとに、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法といったＤＮＡ増幅法を利用して、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドへ改変して合成する方法や、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号２から１０に記載のいずれか）からポリヌクレオチド配列に変換し、該ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法を例示することができる。

【0021】

これらの方法において、アミノ酸配列からポリヌクレオチド配列に変換する際、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質の発現に利用する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すれば良い。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。前記のＤＮＡ増幅法を用いてポリヌクレオチドを調製する際、エラープローンＰＣＲ法を用いて変異を導入することにより、本発明のポリヌクレオチドを作製しても良い。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、エリスロポエチン受容体をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ_２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。

【0022】

本発明のポリヌクレオチドの具体的な例としては、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１１の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチド、配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号１２の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチド、配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号１３の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチド、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号１４の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチド、配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号１５の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチド、配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号１６の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチド、配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号１７の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチド、配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号１８の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチド、および配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号１９の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチドを挙げることができる。

【0023】

本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換するには、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いて形質転換しても良いが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド）中の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入し、それを用いて形質転換したほうが、安定した形質転換が実施できる点で好ましい。なお、使用する発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はない。例えば、大腸菌を宿主とする場合の発現ベクターとしては、ｐＥＴ発現ベクター、ｐＵＣ発現ベクター、ｐＴｒｃ発現ベクター、ｐＣＤＦ発現ベクター、ｐＢＢＲ発現ベクター等が例示できる。

【0024】

なお前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で発現ベクターに挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等が挙げられる。

【0025】

前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換することで、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得することができる。形質転換する宿主は特に制限はないが、遺伝子工学に関する実験が容易な点で大腸菌が好ましい。本発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主として大腸菌（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すれば良い。

【0026】

本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを抽出するときには、適当な抽出方法または市販のキットなどを用いて抽出すれば良い。例えば、宿主が大腸菌の場合には、アルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて抽出すれば良い。

【0027】

本発明の形質転換体を用いて本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を製造するには、本発明の形質転換体を培養することで本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を生産させる工程、得られた培養物から本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を回収する工程の２つの工程を含む製造を行えば良い。なお本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。

【0028】

本発明の形質転換体を培養する際は、当該形質転換体を宿主の培養に適した培地で培養すれば良い。例えば、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地が好ましい培地の一例として挙げることができる。なお、培地に本発明の発現ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると、本発明の発現ベクターの導入の有無による形質転換体の選択的増殖が可能となるため好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すれば良い。

【0029】

また、培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加しても良い。さらに、前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促すためにグリシンなどの試薬を培地に添加しても良く、グリシン濃度は大腸菌の増殖に影響を与えない範囲であれば良く、培地に対して１０％（Ｗ／Ｖ）以下で良く、好ましくは０．１％から２％である。培養温度は、当該技術分野において一般的な培養温度であれば良く、例えば、宿主が大腸菌の場合、１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは３０℃前後であり、発現させる本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質の特性により適宜選択すればよい。培地のｐＨは、当該技術分野において一般的な範囲の中から宿主の種類など諸条件に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲が好ましく、ｐＨ７．０前後がさらに好ましい。

【0030】

なお本発明の発現ベクターに誘導性のプロモータを含んでいる場合は、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導剤を添加しタンパク質発現を誘導すれば良い。好ましい誘導剤としてはｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を例示することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すれば良く、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえば良い。具体例として、宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．１から１．０のときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質の発現を誘導することができる。

【0031】

本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を回収するには、当業者が通常用いる方法の中から適宜選択して用いれば良く、前記培養物からの本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質の抽出は、発現の形態に応じて実施すれば良い。培養液中に分泌生産される場合は、細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を抽出すれば良い。細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合は、遠心分離操作により細胞を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより細胞を破砕し、細胞破砕液から本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を抽出すれば良い。

【0032】

前述した方法で得られた抽出物の中から本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を分離精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いれば良く、その一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製を挙げることができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製を行うことで、本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質を高純度に回収することができる。

【発明の効果】

【0033】

エリスロポエチン結合性が高く、効率的に生産可能なエリスロポエチン結合性タンパク質、およびその製造方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】エリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチン結合性の評価結果を示す図である。

【図2】エリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチン結合性の評価結果を示す図である。

【図3】エリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチン結合性の評価結果を示す図である。

【図4】精製したＥＰＯｂｐ−ｍ５のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。

【図5】ＥＰＯｂｐ−ｍ５を利用したＥＬＩＳＡ法によるエリスロポエチンの検出の結果を示す図である。

【実施例】

【0035】

以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。

【0036】

実施例１ 発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐの構築
（１）ｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターの構築
鋳型ＤＮＡとして特許文献４で開示されているプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥＦｃＲ−ｐ７を、ＰＣＲプライマーとして配列番号２０（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）および配列番号２１（５’−ＴＴＧＴＣＣＣＡＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＭａｌＥ２１ｐ１と命名した。

【0037】

【表1】

ＰＣＲ産物ＭａｌＥ２１ｐ１を、アガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した（以下、同様方法での精製をＤＮＡ断片精製と略記する）。精製したＰＣＲ産物ＭａｌＥ２１ｐ１を制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製した。制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化したＰＣＲ産物ＭａｌＥ２１ｐ１を、あらかじめ制限酵素ＸｂａＩとＮｃｏＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へライゲーションすることでｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターを作製し、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することでｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターを調製した。

【0038】

（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるエリスロポエチン結合性タンパク質（以下、野生型ＥＰＯｂｐとする）の発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐとその形質転換体の構築を行った。
（２−１）鋳型ＤＮＡとして特許文献４で開示されているプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲを、ＰＣＲプライマーとして配列番号２２（５’−ＴＣＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡ−３’）および配列番号２３（５’−ＡＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＥＰＯｂｐｐ１と命名した。

【0039】

（２−２）鋳型ＤＮＡとして特許文献４で開示されているプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ−ｐ７−ＥＰＯＲを、ＰＣＲプライマーとして配列番号２４（５’−ＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＧＡＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴ−３’）および配列番号２５（５’−ＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＣＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＥＰＯｂｐｐ２と命名した。

【0040】

（２−３）ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ＥＰＯｂｐｐ１およびＥＰＯｂｐｐ２を混合後、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をＥＰＯｂｐｐ３と命名した。

【0041】

【表2】

（２−４）ＰＣＲ産物ＥＰＯｂｐｐ３を鋳型とし、配列番号２２および配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＥＰＯｂｐｐ４と命名した。

【0042】

（２−５）ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ＥＰＯｂｐｐ４を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションすることで発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐを作製し、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換体（ｐＥＴＥＰＯｂｐ形質転換体）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐを調製した。

【0043】

発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐのうち、制限酵素ＸｂａＩ認識配列からＨｉｎｄＩＩＩ認識配列までのポリヌクレオチドの配列を配列番号２６に示す。

【0044】

実施例２ ランダム変異導入ライブラリーの構築
（１）エラープローンＰＣＲ法を用いて、野生型ＥＰＯｂｐをコードするポリヌクレオチドにランダムに変異を導入した。鋳型ＤＮＡとして発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐを、ＰＣＲプライマーとして配列番号２２および配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。エラープローンＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間熱処理することで実施した。

【0045】

【表3】

（２）ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いてエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、エリスロポエチン結合性タンパク質のランダム変異導入ライブラリーを作製した。

【0046】

実施例３ エリスロポエチン結合性の高いエリスロポエチン結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例２で作製したエリスロポエチン結合性タンパク質のランダム変異導入ライブラリーの各コロニーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地（１０ｇ／ＬのＴｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ＬのＹｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）４００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で好気的に一晩振とう培養した。

【0047】

（２）培養後、２０μＬの培養液を５００μＬのＬＢ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で好気的に２４時間振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清をエリスロポエチン結合性タンパク質サンプル溶液とした。次いで、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１３７ｍＭのＮａＣｌ，２．６８ｍＭのＫＣｌ，０．５パーセント（ｗ／ｖ）のＢｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，ｐＨ７．４）を用いて１０倍希釈した各エリスロポエチン結合性タンパク質サンプルについて、そのエリスロポエチンとの結合性を下記に示すＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法により評価した。

【0048】

（４）ＥＬＩＳＡ法によるエリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチンとの結合性評価
（４−１）抗エリスロポエチン受容体抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｅｐｏ Ｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号ＭＡＢ３０７１）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、抗エリスロポエチン受容体抗体を固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液を各ウェルに添加し、ブロッキングを行った（３０℃で２時間）。
（４−２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で各ウェルを洗浄後、調製したエリスロポエチン結合性タンパク質サンプル溶液をウェルに添加し、固定化抗体と反応させた（３０℃で１時間半）。

【0049】

（４−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄し、事前にＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）試薬を用いてビオチン標識を行ったエリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＣＨＯ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）をＴＢＳ−Ｂ緩衝液で４００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整して、各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４−４）３０℃で１時間半反応後、前記洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄しＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＴＢＳ−Ｂ緩衝液で２５００倍に希釈して、各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４−５）３０℃で１時間半反応後、前記洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0050】

（５）実施例３の（４）のＥＬＩＳＡ法による評価を実施した約１２００株の形質転換体の中から、エリスロポエチンとの高い結合性を示したエリスロポエチン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。その結果、３株の形質転換体が選択され、それらをＡ株、Ｂ株およびＣ株と命名した。前記選択した各形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて各発現ベクターを得た。

【0051】

（６）得られた発現ベクターのうち、エリスロポエチン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２０または配列番号２７（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。

【0052】

ポリヌクレオチドの配列解析の結果を基に、各形質転換体により発現されるエリスロポエチン結合性タンパク質のアミノ酸配列を決定した。その結果、形質転換体Ａ株によって発現されるエリスロポエチン結合性タンパク質（以下、ＥＰＯｂｐ−Ａとする）はＨｉｓ１４１Ｔｙｒ（この表記は、配列番号１の１４１番目のヒスチジンのチロシンへの置換を表す、以下同様）のアミノ酸の置換を、形質転換体Ｂ株によって発現されるエリスロポエチン結合性タンパク質（以下、ＥＰＯｂｐ−Ｂとする）はＨｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｓｐ１６０ＶａｌおよびＧｌｙ１９０Ｃｙｓのアミノ酸の置換を、形質転換体Ｃ株によって発現されるエリスロポエチン結合性タンパク質（以下、ＥＰＯｂｐ−Ｃとする）はＨｉｓ９７Ａｒｇ、Ｈｉｓ１４１ＴｙｒおよびＴｈｒ２２０Ａｌａのアミノ酸の置換をそれぞれ有していた。

【0053】

ＥＰＯｂｐ−Ａのアミノ酸配列を配列番号２に、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１１に、それぞれ示す。配列番号２のアミノ酸配列の詳細を説明すると、配列番号２の１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列はＭａｌＥシグナル配列であり、２７番目のメチオニンはリンカー配列であり、２８番目のアラニンから２５２番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列はヒトのエリスロポエチン受容体の細胞外領域のアミノ酸配列に相当する配列であり、２５３番目のヒスチジンから２５８番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１つのアミノ酸が置換（Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ）されたアミノ酸配列である。

【0054】

ＥＰＯｂｐ−Ｂのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列においてさらに２つのアミノ酸が置換（Ａｓｐ１６０ＶａｌおよびＧｌｙ１９０Ｃｙｓ）されたアミノ酸配列である。
ＥＰＯｂｐ−Ｃのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列においてさらに２つのアミノ酸が置換（Ｈｉｓ９７ＡｒｇおよびＴｈｒ２２０Ａｌａ）されたアミノ酸配列である。

【0055】

実施例４ スクリーニングで得られた形質転換体の評価
（１）実施例３に記載の形質転換体Ａ株、Ｂ株およびＣ株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に前培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で２２時間、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて可溶性タンパク質抽出液を調製した。調製した可溶性タンパク質抽出液中のエリスロポエチン結合性タンパク質の濃度を、以下に記すＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。

【0056】

（５）ＥＬＩＳＡ法によるエリスロポエチン結合性タンパク質の定量
（５−１）抗エリスロポエチン受容体抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｅｐｏ Ｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号ＭＡＢ３０７１）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、抗エリスロポエチン受容体抗体を固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液を各ウェルに添加し、ブロッキングを行った（３０℃、２時間）。
（５−２）ブロッキング後、洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で各ウェルを洗浄した。その後、調製した可溶性タンパク質抽出液をＴＢＳ−Ｂ緩衝液で段階希釈し、それらをウェルの固定化抗体と反応させた（３０℃、９０分）。
（５−３）前記洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄後、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ 抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を各ウェルに添加し、３０℃で１時間半反応させた。

【0057】

（５−４）反応後、前記洗浄緩衝液で各ウェルの洗浄を行ない、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を各ウェルに添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（５−５）既知濃度の糖鎖付エリスロポエチン結合性タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＥＰＯ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ＥＰＯＲ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、カタログ番号１０７０７−Ｈ０８Ｈ）（以下、糖鎖付ＥＰＯｂｐとする）のＥＬＩＳＡの測定結果を基準として、測定吸光度から可溶性タンパク質抽出液中のエリスロポエチン結合性タンパク質のタンパク質濃度、および培養液あたりのエリスロポエチン結合性タンパク質の生産量を決定した。なお、糖鎖付ＥＰＯｂｐのアミノ酸配列は、ヒトのエリスロポエチン受容体のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにアクセッションナンバーＰ１９２３５として登録・公開）の１番目のメチオニンから２５０番目のプロリンまでのアミノ酸配列にポリヒスチジン配列がＣ末端に付加されたアミノ酸配列からなる。この糖鎖付ＥＰＯｂｐのアミノ酸配列の１番目のメチオニンから２４番目のトリプトファンまでのアミノ酸配列はシグナルペプチド領域の配列であり、発現後の成熟した糖鎖付ＥＰＯｂｐではこのシグナルペプチド領域は失われる。

【0058】

（６）エリスロポエチン結合性タンパク質の濃度が４００ｎｇ／ｍＬとなるように、実施例４の（４）で調製した可溶性タンパク質抽出液をＴＢＳ−Ｂ緩衝液で希釈した。これを用いて、実施例３の（４）に記載のＥＬＩＳＡ法により、各エリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチンとの結合性を評価した。
（７）比較対照として、野生型ＥＰＯｂｐを発現可能な実施例１に記載のｐＥＴＥＰＯｂｐ形質転換体についても実施例４の（１）から（６）に記載の実験と同様の実験を行った。さらに比較対照として、糖鎖付ＥＰＯｂｐについても実施例４の（５）と（６）に記載の実験と同様の実験を行った。

【0059】

（８）２連で測定を行なった結果、各形質転換体による培養液あたりのエリスロポエチン結合性タンパク質の生産量は、多い順に、形質転換体Ａ株（培養液あたりのＥＰＯｂｐ−Ａの生産量：３．９±０．７ｍｇ／Ｌ）、ｐＥＴＥＰＯｂｐ形質転換体（培養液あたりの野生型ＥＰＯｂｐの生産量：１．６±０．２ｍｇ／Ｌ）、形質転換体Ｃ株（培養液あたりのＥＰＯｂｐ−Ｃの生産量：０．５±０．０ｍｇ／Ｌ）、形質転換体Ｂ株（培養液あたりのＥＰＯｂｐ−Ｂの生産量：０．４±０．０ｍｇ／Ｌ）であった。

【0060】

（９）各エリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチンとの結合性を評価した結果を図１に示す。図１の縦軸はＥＬＩＳＡの４５０ｎｍにおける吸光度の値であり、大きいほどエリスロポエチン結合性が高いことを示す。測定は２連で行った。なお、大腸菌の形質転換体を用いているため、それぞれの形質転換体で生産されたエリスロポエチン結合性タンパク質には糖鎖は付加されない。

【0061】

図１に示すように、野生型ＥＰＯｂｐのエリスロポエチン結合性は、糖鎖付ＥＰＯｂｐに比べ低かった。野生型ＥＰＯｂｐのアミノ酸配列のＭａｌＥシグナル配列を除いた残りのアミノ酸配列部分（配列番号１に示すアミノ酸配列の２７番目のメチオニンから２５８番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列部分）は、糖鎖付ＥＰＯｂｐとほぼ同じアミノ酸配列である。このことから、野生型ＥＰＯｂｐでは、糖鎖がないためにエリスロポエチン結合性が低いと推測された。これは、公知の文献で報告されている糖鎖のないエリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチン結合親和性（解離定数ＫＤ＝２．９ｎＭ）（非特許文献１）が、糖鎖のあるエリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチン結合親和性（解離定数ＫＤ＝０．１３ｎＭ）（Ｓ．Ｌｉｕ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０４，５３３０−５３３５，２００７）より低いことからも支持された。

【0062】

一方、ＥＰＯｂｐ−Ａ、ＥＰＯｂｐ−ＢおよびＥＰＯｂｐ−Ｃは、いずれも糖鎖がないが、野生型ＥＰＯｂｐに比べ、高いエリスロポエチン結合性を示した（図１）。すなわち、この結果から、ＥＰＯｂｐ−Ａ、ＥＰＯｂｐ−ＢおよびＥＰＯｂｐ−Ｃのそれぞれが有していたアミノ酸の置換が、エリスロポエチン結合性の向上に寄与したことが示唆された。そして、ＥＰＯｂｐ−Ａ、ＥＰＯｂｐ−ＢおよびＥＰＯｂｐ−ＣにはいずれもＨｉｓ１４１Ｔｙｒのアミノ酸の置換を有していたこと、およびアミノ酸の置換としてＨｉｓ１４１Ｔｙｒのみ有していたＥＰＯｂｐ−Ａで高いエリスロポエチン結合性が認められたことから、Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒのアミノ酸の置換がエリスロポエチン結合性の向上に重要であることが示唆された。

【0063】

実施例５ ランダム変異導入ライブラリーの構築
（１）エラープローンＰＣＲ法を用いて、ＥＰＯｂｐ−Ａをコードするポリヌクレオチドへランダムに変異を導入した。鋳型ＤＮＡとして実施例３の（５）に記載の形質転換体Ａ株から得られた発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号２２および配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。エラープローンＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間熱処理することで実施した。

【0064】

（２）ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、再度ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いてエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、エリスロポエチン結合性タンパク質のランダム変異導入ライブラリーを作製した。

【0065】

実施例６ エリスロポエチン結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例５で作製したランダム変異導入ライブラリーの各コロニーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地４００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で好気的に一晩振とう培養した。
（２）培養後、２０μＬの培養液を５００μＬのＬＢ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で好気的に２４時間振とう培養した。

【0066】

（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清をエリスロポエチン結合性タンパク質サンプル溶液とした。スクリーニングの際の選択性を高めるため、エリスロポエチン結合性タンパク質サンプル溶液に対して、次に記すクエン酸緩衝液処理を行った。２０μＬの各エリスロポエチン結合性タンパク質サンプル溶液を３０μＬの０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）と混合し、３０℃で１時間置いた。その後、この混合液に対して、２５μＬの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）をさらに混合し、クエン酸緩衝液処理サンプル溶液とした。
（４）実施例６の（３）のクエン酸緩衝液処理サンプル溶液をＴＢＳ−Ｂ緩衝液を用いて２倍希釈し、それに含まれるエリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチン結合性を実施例３の（４）に記載のＥＬＩＳＡ法により評価した。

【0067】

（５）実施例６の（４）のＥＬＩＳＡ法による評価を実施した約１２００株の形質転換体の中から、クエン酸緩衝液処理を行ってもエリスロポエチンとの高い結合性を示したエリスロポエチン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。その結果、４株の形質転換体が選択され、それらをＤ株、Ｅ株、Ｆ株およびＧ株と命名した。前記選択した各形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて発現ベクターを得た。

【0068】

（６）得られた発現ベクターのうち、エリスロポエチン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域のヌクレオチド配列について、実施例３の（６）に記載の方法と同様の方法で解析を行った。

【0069】

ポリヌクレオチドの配列を基にアミノ酸配列を調べた結果、形質転換体Ｄ株によって発現されるエリスロポエチン結合性タンパク質（以下、ＥＰＯｂｐ−Ｄとする）は、Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒに加えＡｌａ１８９Ａｓｐのアミノ酸の置換を有していた（ＥＰＯｂｐ−Ｄのアミノ酸配列を配列番号３に、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１２に、それぞれ示す）。形質転換体Ｅ株によって発現されるエリスロポエチン結合性タンパク質（以下、ＥＰＯｂｐ−Ｅとする）は、Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒに加えＡｒｇ１０３ＳｅｒとＡｌａ１８９Ｖａｌのアミノ酸の置換を有していた（ＥＰＯｂｐ−Ｅのアミノ酸配列を配列番号４に、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１３に、それぞれ示す）。

【0070】

形質転換体Ｆ株によって発現されるエリスロポエチン結合性タンパク質（以下、ＥＰＯｂｐ−Ｆとする）は、Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒに加えＡｌａ１５９Ａｓｐのアミノ酸の置換を有していた（ＥＰＯｂｐ−Ｆのアミノ酸配列を配列番号５に、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４に、それぞれ示す）。形質転換体Ｇ株によって発現されるエリスロポエチン結合性タンパク質（以下、ＥＰＯｂｐ−Ｇとする）は、Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒに加えＣｙｓ２０８Ｔｙｒのアミノ酸の置換を有していた（ＥＰＯｂｐ−Ｇのアミノ酸配列を配列番号６に、当該アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１５に、それぞれ示す）。

【0071】

（７）実施例６の（５）に記載の形質転換体Ｄ株、Ｅ株、Ｆ株およびＧ株について、実施例４の（１）から（６）に記載の実験と同様の実験を行い、各形質転換体によるエリスロポエチン結合性タンパク質の生産量と、生産されたエリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチン結合性を評価した。

【0072】

比較対照として、実施例３に記載の形質転換体Ａ株についても実施例４の（１）から（６）に記載の実験と同様の実験を行った。さらに比較対照として、糖鎖付ＥＰＯｂｐについても実施例４の（５）と（６）に記載の実験と同様の実験を行った。

【0073】

２連で測定を行なった結果、各形質転換体による培養液あたりのエリスロポエチン結合性タンパク質の生産量は、多い順に、形質転換体Ｅ株（培養液あたりのＥＰＯｂｐ−Ｅの生産量：８．７±０．１ｍｇ／Ｌ）、形質転換体Ｄ株（培養液あたりのＥＰＯｂｐ−Ｄの生産量：６．６±０．８ｍｇ／Ｌ）、形質転換体Ｇ株（培養液あたりのＥＰＯｂｐ−Ｇの生産量：５．２±１．７ｍｇ／Ｌ）、形質転換体Ｆ株（培養液あたりのＥＰＯｂｐ−Ｆの生産量：４．８±０．８ｍｇ／Ｌ）、形質転換体Ａ株（培養液あたりのＥＰＯｂｐ−Ａの生産量：１．１±０．２ｍｇ／Ｌ）であった。この結果から、ＥＰＯｂｐ−Ｄ、ＥＰＯｂｐ−Ｅ、ＥＰＯｂｐ−ＦおよびＥＰＯｂｐ−Ｇのそれぞれが有していたアミノ酸のＨｉｓ１４１Ｔｙｒ以外の置換が、エリスロポエチン結合性タンパク質の生産量の向上に寄与したことが示唆された。

【0074】

各エリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチンとの結合性を評価した結果を図２に示す。図２の縦軸はＥＬＩＳＡの４５０ｎｍにおける吸光度の値であり、大きいほどエリスロポエチン結合性が高いことを示す。測定は２連で行った。なお、大腸菌の形質転換体を用いているため、それぞれの形質転換体で生産されたエリスロポエチン結合性タンパク質には糖鎖は付加されない。図２に示すように、ＥＰＯｂｐ−Ｄ、ＥＰＯｂｐ−Ｅ、ＥＰＯｂｐ−ＦおよびＥＰＯｂｐ−Ｇは、いずれも糖鎖がないが、ＥＰＯｂｐ−Ａ以上の高いエリスロポエチン結合性を示した。この結果から、ＥＰＯｂｐ−Ｄ、ＥＰＯｂｐ−Ｅ、ＥＰＯｂｐ−ＦおよびＥＰＯｂｐ−Ｇのそれぞれが有していたアミノ酸のＨｉｓ１４１Ｔｙｒ以外の置換が、エリスロポエチン結合性の向上に寄与したことが示唆された。

【0075】

実施例７ エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ａの作製
実施例６で判明したアミノ酸の置換の中からＣｙｓ２０８Ｔｙｒを選択し、このアミノ酸の置換を実施例６に記載のエリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−Ｄに対してさらに導入することで、３つのアミノ酸の置換（Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｌａ１８９ＡｓｐおよびＣｙｓ２０８Ｔｙｒ）を有するエリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ａを作製した。

【0076】

（１）以下に示すＰＣＲを実施し、Ｃｙｓ２０８Ｔｙｒのアミノ酸の置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型として実施例６において形質転換体Ｄ株から調製したＥＰＯｂｐ−Ｄの発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号２０および配列番号２８（５’−ＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＣＧＧＴＧＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ａｐ１と命名した。
（１−２）鋳型として実施例６において形質転換体Ｄ株から調製したＥＰＯｂｐ−Ｄの発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号２９（５’−ＣＧＣＡＣＣＧＡＧＴＡＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴ−３’）および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ａｐ２と命名した。

【0077】

（１−３）ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ３ａｐ１およびｍ３ａｐ２を混合後、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ａｐ３と命名した。
（１−４）ＰＣＲ産物ｍ３ａｐ３を鋳型とし、配列番号２０および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ａをコードするポリヌクレオチドを得た。

【0078】

（２）エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ａをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。
（３）得られた形質転換体を形質転換体ｍ３ａ株と命名した。この形質転換体ｍ３ａ株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ａをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ３ａを得た。

【0079】

（４）発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ３ａのうち、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ａをコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例３の（６）と同様の方法により行なった。

【0080】

発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ３ａにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号７に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６に、それぞれ示す。配列番号７のアミノ酸配列の詳細を説明すると、配列番号７の１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列はＭａｌＥシグナル配列であり、２７番目のメチオニンはリンカー配列であり、２８番目のアラニンから２５２番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列はヒトのエリスロポエチン受容体の細胞外領域のアミノ酸配列に相当する配列であり、２５３番目のヒスチジンから２５８番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。配列番号７に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において３つのアミノ酸が置換（Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｌａ１８９ＡｓｐおよびＣｙｓ２０８Ｔｙｒ）されたアミノ酸配列である。

【0081】

実施例８ エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂの作製
実施例６で判明したアミノ酸の置換の中からＡｌａ１５９Ａｓｐを選択し、このアミノ酸の置換を実施例６に記載のエリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−Ｄに対してさらに導入することで、３つのアミノ酸の置換（Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｌａ１５９ＡｓｐおよびＡｌａ１８９Ａｓｐ）を有するエリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂを作製した。

【0082】

（１）以下に示すＰＣＲを実施し、Ａｌａ１５９Ａｓｐのアミノ酸の置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型として実施例６において形質転換体Ｄ株から調製したＥＰＯｂｐ−Ｄの発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号２０および配列番号３０（５’−ＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｂｐ１と命名した。
（１−２）鋳型として実施例６において形質転換体Ｄ株から調製したＥＰＯｂｐ−Ｄの発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号３１（５’−ＴＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＴＧＧＡＴＧＡＣＧＡＧＡ−３’）および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｂｐ２と命名した。

【0083】

（１−３）ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ３ｂｐ１およびｍ３ｂｐ２を混合後、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ３ｂｐ３と命名した。
（１−４）ＰＣＲ産物ｍ３ｂｐ３を鋳型とし、配列番号２０および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂをコードするポリヌクレオチドを得た。

【0084】

（２）エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。
（３）得られた形質転換体を形質転換体ｍ３ｂ株と命名した。この形質転換体ｍ３ｂ株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂを得た。

【0085】

（４）発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂのうち、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂをコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例３の（６）と同様の方法により行なった。

【0086】

発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号８に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７に、それぞれ示す。配列番号８のアミノ酸配列の詳細を説明すると、配列番号８の１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列はＭａｌＥシグナル配列であり、２７番目のメチオニンはリンカー配列であり、２８番目のアラニンから２５２番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列はヒトのエリスロポエチン受容体の細胞外領域のアミノ酸配列に相当する配列であり、２５３番目のヒスチジンから２５８番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。配列番号８に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において３つのアミノ酸が置換（Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｌａ１５９ＡｓｐおよびＡｌａ１８９Ａｓｐ）されたアミノ酸配列である。

【0087】

実施例９ エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ４の作製
実施例６で判明したアミノ酸の置換の中からＡｌａ１５９ＡｓｐとＣｙｓ２０８Ｔｙｒを選択し、これらのアミノ酸の置換を実施例６に記載のエリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−Ｄに対してさらに導入することで、４つのアミノ酸の置換（Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｌａ１５９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９ＡｓｐおよびＣｙｓ２０８Ｔｙｒ）を有するエリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ４を作製した。

【0088】

（１）以下に示すＰＣＲを実施し、Ａｌａ１５９ＡｓｐとＣｙｓ２０８Ｔｙｒのアミノ酸の置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型として実施例７の発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ３ａを、ＰＣＲプライマーとして配列番号３１および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ４ｐ１と命名した。

【0089】

（１−２）ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ４ｐ１および実施例８の（１−１）に記載のＰＣＲ産物ｍ３ｂｐ１を混合後、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ４ｐ２と命名した。
（１−３）ＰＣＲ産物ｍ４ｐ２を鋳型とし、配列番号２０および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＤＮＡ断片精製することで、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ４をコードするポリヌクレオチドを得た。

【0090】

（２）エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ４をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。
（３）得られた形質転換体を形質転換体ｍ４株と命名した。この形質転換体ｍ４株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ４をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ４を得た。

【0091】

（４）発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ４のうち、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ４をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例３の（６）と同様の方法により行なった。

【0092】

発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ４により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号９に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１８に、それぞれ示す。配列番号９のアミノ酸配列の詳細を説明すると、配列番号９の１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列はＭａｌＥシグナル配列であり、２７番目のメチオニンはリンカー配列であり、２８番目のアラニンから２５２番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列はヒトのエリスロポエチン受容体の細胞外領域のアミノ酸配列に相当する配列であり、２５３番目のヒスチジンから２５８番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。配列番号９に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において４つのアミノ酸が置換（Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｌａ１５９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９ＡｓｐおよびＣｙｓ２０８Ｔｙｒ）されたアミノ酸配列である。

【0093】

実施例１０ エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ５の作製
実施例６で判明したアミノ酸の置換の中からＡｒｇ１０３Ｓｅｒを選択し、このアミノ酸の置換を実施例９で作製したエリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ４に対してさらに導入することで、５つのアミノ酸の置換（Ａｒｇ１０３Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｌａ１５９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９ＡｓｐおよびＣｙｓ２０８Ｔｙｒ）を有するエリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ５を作製した。

【0094】

（１）以下に示すＰＣＲを実施し、Ａｒｇ１０３Ｓｅｒのアミノ酸の置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型として実施例９の発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ４を、ＰＣＲプライマーとして配列番号２０および配列番号３２（５’−ＡＣＣＧＣＡＣＣＡＣＴＡＧＣＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｐ１と命名した。

【0095】

（１−２）鋳型として実施例９の発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ４を、ＰＣＲプライマーとして配列番号３３（５’−ＡＧＧＣＴＣＣＣＡＣＧＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＣＧＧＴ−３’）および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｐ２と命名した。

【0096】

（１−３）ＤＮＡ断片精製したＰＣＲ産物ｍ５ｐ１およびｍ５ｐ２を混合後、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｐ３と命名した。
（１−４）ＰＣＲ産物５ｐ３を鋳型とし、配列番号２０および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ５をコードするポリヌクレオチドを得た。

【0097】

（２）エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ５をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ断片精製し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＴＭａｌＥ２１ベクターにライゲーションにより連結し、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を塩化カルシウム法により形質転換した。
（３）得られた形質転換体を形質転換体ｍ５株と命名した。この形質転換体ｍ５株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ５をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ５を得た。

【0098】

（４）発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ５のうち、エリスロポエチン結合性タンパク質ＥＰＯｂｐ−ｍ５をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例３の（６）と同様の方法により行なった。

【0099】

発現ベクターｐＥＴＥＰＯｂｐ−ｍ５により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１９に、それぞれ示す。配列番号１０のアミノ酸配列の詳細を説明すると、配列番号１０の１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでのアミノ酸配列はＭａｌＥシグナル配列であり、２７番目のメチオニンはリンカー配列であり、２８番目のアラニンから２５２番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列はヒトのエリスロポエチン受容体の細胞外領域のアミノ酸配列に相当する配列であり、２５３番目のヒスチジンから２５８番目のヒスチジンまでのアミノ酸配列はポリヒスチジン配列である。配列番号１０に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において５つのアミノ酸が置換（Ａｒｇ１０３Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１４１Ｔｙｒ、Ａｌａ１５９Ａｓｐ、Ａｌａ１８９ＡｓｐおよびＣｙｓ２０８Ｔｙｒ）されたアミノ酸配列である。

【0100】

実施例１１ エリスロポエチン結合性タンパク質の評価
（１）実施例３の形質転換体Ａ株、実施例６の形質転換体Ｄ株、実施例７の形質転換体ｍ３ａ株、実施例８の形質転換体ｍ３ｂ株、実施例９の形質転換体ｍ４株、および実施例１０の形質転換体ｍ５株を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）それぞれの前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に１％（ｖ／ｖ）接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧをそれぞれに添加し、引き続き２０℃で２２時間、好気的に振とう培養した。

【0101】

（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いてそれぞれの可溶性タンパク質抽出液を調製した。
（５）実施例１１の（４）で調製した可溶性タンパク質抽出液中のエリスロポエチン結合性タンパク質の濃度を、実施例４の（５）に記すＥＬＩＳＡ法と同様の方法で測定した。
（６）それぞれのエリスロポエチン結合性タンパク質の濃度が３７５ｎｇ／ｍＬとなるように、実施例１１の（４）で調製した可溶性タンパク質抽出液をＴＢＳ−Ｂ緩衝液で希釈した。これらを用いて、実施例３の（４）に記載のＥＬＩＳＡ法により、各エリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチンとの結合性を評価した。
（７）比較対照として野生型ＥＰＯｂｐを発現可能な実施例１に記載のｐＥＴＥＰＯｂｐ形質転換体についても実施例１１の（１）から（６）に記載の実験と同様の実験を行った。比較対照として、糖鎖付ＥＰＯｂｐについても実施例１１の（５）と（６）に記載の実験と同様の実験を行った。

【0102】

（８）２連で測定を行なった結果、各形質転換体による培養液あたりのエリスロポエチン結合性タンパク質の生産量は、多い順に、形質転換体ｍ５株（ＥＰＯｂｐ−ｍ５の生産量：２１０．７±２２．７ｍｇ／Ｌ）、形質転換体ｍ４株（ＥＰＯｂｐ−ｍ４の生産量：７０．９±１０．３ｍｇ／Ｌ）、形質転換体ｍ３ａ株（ＥＰＯｂｐ−ｍ３ａの生産量：３３．３±３．２ｍｇ／Ｌ）、形質転換体ｍ３ｂ株（ＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂの生産量：２４．２±０．６ｍｇ／Ｌ）、形質転換体Ｄ株（ＥＰＯｂｐ−Ｄの生産量：８．２±２．０ｍｇ／Ｌ）、形質転換体Ａ株（ＥＰＯｂｐ−Ａの生産量：２．６±０．３ｍｇ／Ｌ）、ｐＥＴＥＰＯｂｐ形質転換体（野生型ＥＰＯｂｐの生産量：２．３±０．１ｍｇ／Ｌ）であった。このように、エリスロポエチン結合性タンパク質が特定のアミノ酸の置換を有することで、その生産量が向上することがわかる。そして、エリスロポエチン結合性タンパク質が特定のアミノ酸の置換を多数有することで、その生産量がより向上することがわかる。

【0103】

（９）各エリスロポエチン結合性タンパク質のエリスロポエチンとの結合性を評価した結果を図３に示す。図３の縦軸はＥＬＩＳＡの４５０ｎｍにおける吸光度の値であり、大きいほどエリスロポエチン結合性が高いことを示す。測定は２連で行った。図３に示すように、野生型ＥＰＯｂｐのエリスロポエチン結合性は低く、検出できなかった。一方、ＥＰＯｂｐ−Ａ、ＥＰＯｂｐ−Ｄ、ＥＰＯｂｐ−ｍ３ａ、ＥＰＯｂｐ−ｍ３ｂ、ＥＰＯｂｐ−ｍ４およびＥＰＯｂｐ−ｍ５は、いずれも野生型ＥＰＯｂｐに比べ、高いエリスロポエチン結合性を示し、糖鎖付ＥＰＯｂｐと同等以上エリスロポエチン結合性を示した。

【0104】

実施例１２ ＥＰＯｂｐ−ｍ５のエリスロポエチン結合親和性の解析
（１）実施例１１の（１）から（４）の方法と同様の方法で、実施例１０の形質転換体ｍ５株にＥＰＯｂｐ−ｍ５を発現させ、ＥＰＯｂｐ−ｍ５を含む可溶性タンパク質抽出液を調製した。
（２）ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｃｏｂａｌｔ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて、実施例１２の（１）で調製したＥＰＯｂｐ−ｍ５を含む可溶性タンパク質抽出液からヒスチジンタグを有するＥＰＯｂｐ−ｍ５を精製し、精製溶液を得た。精製方法はＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｃｏｂａｌｔ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌの推奨方法に準じて行った。

【0105】

（３）精製溶液はＳｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用サンプルバッファー（イージーアプライ、アトー社製）と混合後、９８℃で１０分間の熱変性処理を行い、１５％のポリアクリルアミドゲル（ｅ−ＰＡＧＥＬ、アトー社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。このとき、分子量マーカーとしてＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ，ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用した。電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルのタンパク質をイージーステイン・アクア（アトー社製）を用いて検出した。
このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示す。図４のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に示すように、精製溶液のＥＰＯｂｐ−ｍ５がアミノ酸配列から推定されるサイズ（約２５．８ｋＤａ、ＭａｌＥシグナル部分は含まず）の位置に一本のバンドとして観察され、また他のバンドは観察されなかったことから純度が高いことを確認した。
（４）精製溶液中のＥＰＯｂｐ−ｍ５の濃度は２８０ｎｍにおける吸光度から決定した。

【0106】

（５）Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ＥＰＯｂｐ−ｍ５とエリスロポエチンの結合に関して表面プラズモン共鳴による解析を行った。実験はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の推奨方法に準じて行った。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。
（５−１）Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）にＥＰＯｂｐ−ｍ５を２８３．８ＲＵ固定化した。このときの固定化にはアミンカップリングキット（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。

【0107】

（５−２）１０ｎＭのエリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＣＨＯ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の溶液を、ＨＢＳ−ＥＰ＋を用いて２倍の希釈で０．３ｎＭまで段階的に希釈した。それぞれの濃度のエリスロポエチン溶液を、実施例１２の（５−１）のＥＰＯｂｐ−ｍ５を固定したＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５に２５℃で３０μＬ／秒の流速で２１０秒流した。ＥＰＯｂｐ−ｍ５を固定したＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５の再生は１０ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）を用いて行った。
（５−３）結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）および解離定数（ＫＤ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．１．１）（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１：１の結合モデルを用いたカーブフィッティングの解析結果から決定した。

【0108】

（５−４）一連の解析は２連で行い、Ｒｍａｘの値は８１．６または７８．６ＲＵ、カイ二乗の値は０．４７または０．３２ＲＵ^２であった。解析の結果、ＥＰＯｂｐ−ｍ５とエリスロポエチンの結合の結合速度定数（ｋａ）は（１．４±０．０）×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、解離速度定数（ｋｄ）は（１．３±０．０）×１０^−４ｓ^−１、解離定数（ＫＤ）は０．０９±０．００ｎＭであった。
公知の文献で報告されているエリスロポエチン結合親和性における解離定数（ＫＤ）の値は、糖鎖のないエリスロポエチン結合性タンパク質はＫＤ＝２．９ｎＭであり（非特許文献１）、糖鎖のあるエリスロポエチン結合性タンパク質はＫＤ＝０．１３ｎＭである（Ｓ．Ｌｉｕ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０４，５３３０−５３３５，２００７）。これらの解離定数の値と比較して、ＥＰＯｂｐ−ｍ５のエリスロポエチン結合親和性の解離定数の値はＫＤ＝０．０９±０．００ｎＭと小さいことから、ＥＰＯｂｐ−ｍ５のエリスロポエチン結合親和性が高いことがわかる。

【0109】

実施例１３ ＥＰＯｂｐ−ｍ５を利用したエリスロポエチンの検出
（１）実施例１１の（１）から（４）の方法と同様の方法で、実施例１０の形質転換体ｍ５株にＥＰＯｂｐ−ｍ５を発現させ、ＥＰＯｂｐ−ｍ５を含む可溶性タンパク質抽出液を調製した。
（２）ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｉｃｋｅｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて、実施例１３の（１）で調製したＥＰＯｂｐ−ｍ５を含む可溶性タンパク質抽出液からヒスチジンタグを有するＥＰＯｂｐ−ｍ５を精製し、精製溶液を得た。精製方法はＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｉｃｋｅｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌの推奨方法に準じて行った。
（３）実施例１３の（２）で調製した精製溶液中のＥＰＯｂｐ−ｍ５の濃度は、実施例４の（５）に記すＥＬＩＳＡ法と同様の方法で測定した。

【0110】

（４）ＥＰＯｂｐ−ｍ５を利用したＥＬＩＳＡ法によるエリスロポエチンの検出を下記の方法で行った。
（４−１）抗エリスロポエチン受容体抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｅｐｏ Ｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号ＭＡＢ３０７１）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１μｇ／ｍＬの濃度に調整後、それを９６穴マイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、抗エリスロポエチン受容体抗体を固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、各ウェルの溶液を捨て、ＴＢＳ−Ｂ緩衝液を各ウェルに添加し、ブロッキングを行った（３０℃、２時間）。ブロッキング後、洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で各ウェルを洗浄した。
（４−２）実施例１３の（２）で精製したＥＰＯｂｐ−ｍ５をＴＢＳ−Ｂ緩衝液で４００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整して、各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。３０℃で１時間半反応後、前記洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄した。

【0111】

（４−３）エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＣＨＯ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）をＴＢＳ−Ｂ緩衝液で各濃度（６ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、２４ｎｇ／ｍＬ、４９ｎｇ／ｍＬ、９８ｎｇ／ｍＬと１９６ｎｇ／ｍＬ）に調整して、それぞれ３つのウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。３０℃で１時間半反応後、前記洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄した。
（４−４）事前にＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）試薬を用いてビオチン標識を行った抗エリスロポエチン抗体（Ａｎｔｉ−Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ， Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｎｏ（Ｅｐｏ１））（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製、カタログ番号ＡＭ００７４４ＰＵ−Ｎ）をＴＢＳ−Ｂ緩衝液で３．８μｇ／ｍＬの濃度に調整して、各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。３０℃で１時間半反応後、前記洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄した。
（４−５）ＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＴＢＳ−Ｂ緩衝液で２５００倍に希釈して、各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。３０℃で１時間半反応後、前記洗浄緩衝液で各ウェルを洗浄した。
（４−６）ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0112】

（５）実施例１３の（４）のＥＰＯｂｐ−ｍ５を利用したＥＬＩＳＡ法によるエリスロポエチンの検出の結果を図５に示す。図５の縦軸はＥＬＩＳＡ測定値（４５０ｎｍにおける吸光度）とし、横軸はエリスロポエチンの濃度の対数とした。各濃度のエリスロポエチンに対して３連で測定を行い、吸光度の平均値と標準偏差をもとに図５を作成した。図５に示すように、エリスロポエチンの濃度が高くなるとともに吸光度の値が増加した。このことから、ＥＰＯｂｐ−ｍ５を利用したＥＬＩＳＡ法によりエリスロポエチンを検出できることがわかる。また、図５に示すように、エリスロポエチンの濃度に対して吸光度をプロットすることで標準曲線を作成できることから、ＥＰＯｂｐ−ｍ５を利用したＥＬＩＳＡ法により未知濃度のエリスロポエチンの濃度測定が可能であることが示唆された。

【0113】

このように、ＥＰＯｂｐ−ｍ５は、エリスロポエチン結合性を利用した技術にとって有用であることがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0114】

本発明のエリスロポエチン結合性タンパク質は、効率的に生産可能であり、そのエリスロポエチン結合性から、診断薬を含む医薬品、生化学試薬およびエリスロポエチンを精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用のリガンドとして有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]