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特許6372890乳酸菌増殖促進剤、制御性Ｔ細胞増加剤、乳酸菌増殖促進方法、制御性Ｔ細胞を増加させる方法、制御性Ｔ細胞増加効果の評価方法、および乳酸菌増殖促進効果の評価方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6372890
(24)【登録日】2018年7月27日
(45)【発行日】2018年8月15日
(54)【発明の名称】乳酸菌増殖促進剤、制御性Ｔ細胞増加剤、乳酸菌増殖促進方法、制御性Ｔ細胞を増加させる方法、制御性Ｔ細胞増加効果の評価方法、および乳酸菌増殖促進効果の評価方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20180806BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20180806BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20180806BHJP
C12R 1/225 20060101ALN20180806BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
C12N1/20 AZNA
C12Q1/06
C12R1:225
【請求項の数】9
【全頁数】54
(21)【出願番号】特願2015-504466(P2015-504466)
(86)(22)【出願日】2014年3月10日
(86)【国際出願番号】JP2014056220
(87)【国際公開番号】WO2014136982
(87)【国際公開日】20140912
【審査請求日】2017年1月13日
(31)【優先権主張番号】61/775,309
(32)【優先日】2013年3月8日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】000125370
【氏名又は名称】学校法人東京理科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100079049
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(74)【代理人】
【識別番号】100099025
【弁理士】
【氏名又は名称】福田 浩志
(72)【発明者】
【氏名】岩倉 洋一郎
(72)【発明者】
【氏名】唐 策
(72)【発明者】
【氏名】大野 尚仁
【審査官】
戸来 幸男
(56)【参考文献】
【文献】
特開２０１１−１２１９２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第９８／０２６７８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００６／０８８９２３（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
国際公開第０２／０９８４３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２０１１−５０３１６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
PLoS ONE，２０１２年，vol.7, no.10，pp.e47244(1-14)
【文献】
Lett. Appl. Microbiol.，２００８年，vol.47, no.4，pp.269-274
【文献】
Future Microbiol.，２０１０年，vol.5, no.5，pp.759-774
【文献】
Biosci. Biotechnol. Biochem.，２００９年，vol.73, no.2，pp.457-460
【文献】
Biol. Pharm. Bull.，２０１２年，vol.35, no.4，pp.612-616
【文献】
日本免疫学会総会要旨集，２０１１年，vol.40，p.163[2-J-W42-6-O/P]
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８
Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／
ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する、ラクトバチルス・ムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）もしくはラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）との間での１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌の増殖促進剤を含有する、制御性Ｔ細胞増加剤。
【請求項2】
前記βグルカンが、分子量１Ｋ〜１０Ｋのβグルカンである、請求項１に記載の制御性Ｔ細胞増加剤。
【請求項3】
前記βグルカンが、β（１→３）グルカンである、請求項１または請求項２に記載の制御性Ｔ細胞増加剤。
【請求項4】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析すること、および、全細菌に対するラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間での１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌の割合を算出すること、を含む制御性Ｔ細胞増加効果の評価方法。
【請求項5】
請求項４に記載の評価方法であって、（１）請求項１〜３のいずれか一項に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を投与される前の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対するラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間の１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌の割合を算出すること、および、（２）請求項１〜３のいずれか一項に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を投与された後の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対するラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間の１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌の割合を算出すること、とを含む、評価方法。
【請求項6】
ラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間での１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌の増殖促進剤であって、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する増殖促進剤を投与された対象から採取した試料中における制御性Ｔ細胞数を測定すること、を含むラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間での１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌の増殖促進効果の評価方法。
【請求項7】
請求項６に記載の評価方法であって、（１）前記増殖促進剤を投与される前の対象から採取した試料中における制御性Ｔ細胞数を測定すること、および、（２）前記増殖促進剤を投与された後の対象から採取した試料中における制御性Ｔ細胞数を測定すること、とを含む、評価方法。
【請求項8】
前記βグルカンが、分子量１Ｋ〜１０Ｋのβグルカンである、請求項６または請求項７に記載の評価方法。
【請求項9】
前記βグルカンが、β（１→３）グルカンである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乳酸菌増殖促進剤、制御性Ｔ細胞増加剤、乳酸菌増殖促進方法、制御性Ｔ細胞を増加させる方法、制御性Ｔ細胞増加効果の評価方法、および乳酸菌増殖促進効果の評価方法に関する。ここで、乳酸菌はラクトバチルス・ムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）もしくはラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）との間での１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌を表し、以後、ラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間での１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌を「特定乳酸菌」と記載することもある。
【背景技術】
【0002】
骨髄ＩＩ型Ｃ型レクチンファミリーのメンバーであるデクチン−１（Ｄｅｃｔｉｎ−１）は、β−１，３またはβ−１，６結合グルカン（βグルカン）の受容体であり（Tayloret al., 2002）、真菌の重要な細胞壁構成要素である。マウスおよびヒトの両方において、デクチン−１の遺伝的欠損は特異的な真菌種に対する顕著に過剰な感受性をもたらし（Ferwerda et al., 2009; Saijo et al., 2007; Taylor et al., 2007）、真菌感染からの宿主保護におけるデクチン−１の重要な役割を実証している。カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質９−核内因子κＢ経路の活性化を介して、デクチン−１は、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージ（ＭΦ）において活性酸素種および炎症性サイトカイン産生を誘導し、続いてＴｈ１７免疫応答を誘導する（Conti et al., 2009; LeibundGut-Landmann et al., 2007）。天然由来のβグルカンは、一般に宿主の免疫向上に対して効果を有すると信じられており食品添加物として広く用いられているが、デクチン−１シグナル伝達の消化管の粘膜免疫系に対する正確な機能は依然としてほとんど知られていない。
【0003】
腸内微生物叢のバランスは、腸の疾患および健康において重要な役割を果たしている。いくつかの研究により哺乳類腸内にも共生真菌類が存在することが明らかにされているが（Iliev et al., 2012; Ott et al., 2008; Scupham et al., 2006）、真正細菌のメンバーがヒトの腸遠位部に含まれる何兆個もの微生物の中心となっており、宿主に役立つ種々の機能を果たしている（Berg, 1996; Bjorksten et al., 2001; Martin and Rhodes, 2000; Umesaki and Setoyama, 2000）。粘膜免疫系は、微生物叢と共に発達し、微生物の構成要素に対する寛容性および侵入病原体に対する防御の両方を含む二重の能力特性を獲得している。Ｔｏｌｌ様受容体およびヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメインタンパク質様受容体などの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）受容体を介して、腸細胞またはパネート細胞は、細菌性病原体を感知して、続いて粘液および抗菌ペプチド（ＡＭＰ）を産生して保護バリアを与える（Janeway and Medzhitov, 2002; Petnicki-Ocwieja et al., 2009; Vaishnava et al., 2008; Vaishnava et al., 2011）。一方で腸の貪食細胞は、防御性ＩｇＡまたはサイトカインを誘導することにより管腔の細菌性病原体を感知して応答する（Lande et al., 2007; Macpherson and Uhr, 2004; Niess et al., 2005）。ＰＡＭＰ受容体のメンバーとして、Ｃ型レクチン受容体であるデクチン−１は、腸内免疫細胞に対するその機能および腸内微生物に対するその影響について、ほとんど研究されていない。【0004】
最近の研究により、単一の特定腸内共生細菌属が、養子腸免疫に影響を及ぼし、その後腸疾患および自己免疫疾患に影響を及ぼし得ることが示されている。ＲＯＲγｔ＋Ｔｈ１７細胞の分化誘導により、セグメント細菌（ＳＦＢ）は実験的な自己免疫性脳髄膜炎または自己免疫性関節炎を促進することができる（Lee et al., 2011; Wu et al., 2010）。一方でＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の発生を促進することにより、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）は化学的に誘発された大腸炎を抑制することができる（Atarashi et al., 2011）。しかし、その他の共生細菌による免疫系に対する機能は、未だ明らかにされていない。【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、上記状況を考慮して行われたものである。本発明の態様には、以下が包含される。【0006】
＜１＞ 分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する、特定乳酸菌増殖促進剤。＜２＞ 前記βグルカンが、分子量１Ｋ〜１０Ｋのβグルカンである、＜１＞に記載の特定乳酸菌増殖促進剤。
＜３＞ 前記βグルカンが、β（１→３）グルカンである＜１＞または＜２＞に記載の特定乳酸菌増殖促進剤。
＜４＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の乳酸菌増殖促進剤を含有する、制御性Ｔ細胞増加剤。
【0007】
＜５＞ 分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を対象に投与すること、を含む特定乳酸菌の増殖促進方法。＜６＞ 前記βグルカンが、分子量１Ｋ〜１０Ｋのβグルカンである、＜５＞に記載の特定乳酸菌の増殖促進方法。
＜７＞ 前記βグルカンが、β（１→３）グルカンである＜５＞または＜６＞に記載の特定乳酸菌の増殖促進方法。
＜８＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を対象に投与すること、を含む制御性Ｔ細胞の増加方法。
【0008】
＜９＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析すること、および、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、を含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法。＜１０＞ ＜９＞に記載の特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法であって、（１）＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与される前の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、および、（２）＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与された後の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、とを含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法。
＜１１＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料中における制御性Ｔ細胞数を測定すること、を含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法。
＜１２＞ ＜１１＞に記載の特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法であって、（１）＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与される前の対象から採取した試料中における制御性Ｔ細胞数を測定すること、および、（２）＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与された後の対象から採取した試料中における制御性Ｔ細胞数を測定すること、とを含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法。
＜１３＞ ＜４＞に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析すること、および、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、を含む制御性Ｔ細胞増加効果の評価方法。
＜１４＞ ＜１３＞に記載の制御性Ｔ細胞増加効果の評価方法であって、（１）＜５＞に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を投与される前の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、および、（２）＜５＞に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を投与された後の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、とを含む制御性Ｔ細胞増加効果の評価方法。
【0009】
＜１５＞ ラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間の１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌の細胞を含む、制御性Ｔ細胞増加剤。【0010】
＜１６＞ ＜１５＞に記載の制御性Ｔ細胞増加剤を投与することを含む、制御性Ｔ細胞を増加させる方法。【0011】
＜１７＞ ラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間の１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌の細胞を含む、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状の予防、治療もしくは改善のため、または整腸のための組成物。【0012】
＜１８＞ 前記ラクトバチルス・ムリヌスがラクトバチルス・ムリヌスＮＢＲＣ１４２２１株である、＜１７＞に記載の組成物。【0013】
＜１９＞ 前記ラクトバチルス・サリバリウスがラクトバチルス・サリバリウスＮＢＲＣ１０２１６０株である、＜１７＞または＜１８＞に記載の組成物。【0014】
＜２０＞ 前記細胞が生細胞または死細胞である、＜１７＞〜＜１９＞のいずれか一つに記載の組成物。【0015】
＜２１＞ 前記炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状が炎症性腸疾患である、＜１７＞〜＜２０＞のいずれか一つに記載の組成物。【0016】
＜２２＞ 前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、＜２１＞に記載の組成物。【0017】
＜２３＞ 前記炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状が食品アレルギーである、＜１７＞〜＜２０＞のうちいずれか一つに記載の組成物。【0018】
＜２４＞ 前記炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状が全身アレルギーである、＜１７＞〜＜２０＞のいずれか一項に記載の組成物。【0019】
＜２５＞ 前記全身アレルギーが花粉症である、＜２４＞に記載の組成物。【0020】
＜２６＞ 医薬組成物である、＜１７＞〜＜２５＞のいずれか一つに記載の組成物。【0021】
＜２７＞ 前記医薬組成物が経口医薬組成物である、＜２６＞に記載の組成物。【0022】
＜２８＞ 前記組成物が食品または飼料である、＜１７＞〜＜２５＞のいずれか一つに記載の組成物。【0023】
＜２９＞ 炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状の予防もしくは治療のため、または整腸のための医薬の製造における、ラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間の１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌の細胞の使用。【0024】
＜３０＞ ＜２６＞または＜２７＞に記載の医薬組成物を治療有効量、それを必要とする対象に投与することを含む、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状の予防もしくは治療のための、または整腸のための方法。【0025】
＜３１＞ 活性成分として、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含む、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状を予防、治療もしくは改善するための、または腸の健康を維持するための組成物。【0026】
＜３２＞ 前記βグルカンが水溶性である、＜３１＞に記載の組成物。【0027】
＜３３＞ 分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカン混合物を含む、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状を予防、治療もしくは改善するための、または腸の健康を維持するための組成物。【0028】
＜３４＞ 前記炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状が炎症性腸疾患である、＜３１＞〜＜３３＞のいずれか一つに記載の組成物。【0029】
＜３５＞ 前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎またはクローン病である、＜３４＞に記載の組成物。【0030】
＜３６＞ 前記炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状が食品アレルギーである、＜３１＞〜＜３３＞のいずれか一つに記載の組成物。【0031】
＜３７＞ 前記炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状が全身アレルギーである、＜３１＞〜＜３３＞のいずれか一つに記載の組成物。【0032】
＜３８＞ 前記全身アレルギーが花粉症である、＜３７＞に記載の組成物。【0033】
＜３９＞ 医薬組成物である、＜３１＞〜＜３８＞のいずれか一つに記載の組成物。【0034】
＜４０＞ 前記医薬組成物が経口医薬組成物である、＜３９＞に記載の組成物。【0035】
＜４１＞ 食品である、＜３１＞〜＜３８＞のいずれか一つに記載の組成物。【0036】
＜４２＞ 炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状の予防もしくは治療のための、または腸の健康を維持するための医薬品または飼料の製造における、分子量が０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの使用。【0037】
＜４３＞ ＜３１＞〜＜４１＞のいずれか一つに記載の組成物を治療有効量、必要とする対象に投与することを含む、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状を予防もしくは治療するための、または腸の健康を維持するための方法。【0038】
本発明の一の態様によれば、ラクトバチルス細菌、特にラクトバチルス・ムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ１４２２１株、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間の１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌が、腸内で制御性Ｔ細胞を誘導することにより腸炎症を抑制することが示された。このため、このような細菌の生細胞または死細胞を摂取すると、腸内の免疫バランスが抗炎症側にシフトし、炎症誘発食品、微生物感染、ストレス、食物アレルギーなどによって誘導される炎症性大腸炎に対しまたは自己免疫性大腸炎に対し、炎症抑制効果を示す。よって、炎症性腸疾患の予防又は治療のための新たな薬剤、および整腸作用を有する機能性食品を提供することができる。さらに、その効果は腸疾患に限定されず、本発明の第一の態様は、全身性アレルギー又は自己免疫の予防、治療または改善に対しても有効である。【0039】
本発明において同定されたラクトバチルス・ムリヌスおよびラクトバチルス・サリバリウスは、デクチン−１欠損マウスのメタゲノム解析から抗炎症性特性を付与する株として同定され、制御性Ｔ細胞誘導効果を有する新たなグループの細菌である。【0040】
本発明の一の態様には、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを投与することを含む特定乳酸菌の増殖促進方法、および、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの投与による特定乳酸菌の増殖促進効果の評価方法、が包含される。【0041】
発明者らは、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンがデクチン−１を介して特定乳酸菌の増殖を促進することを見いだした。デクチン−１は、真菌の細胞壁構成要素であるβグルカンの受容体であり、グルカンは、デクチン−１を介して自然免疫反応を活性化することが知られている。発明者らは、デクチン−１を欠損するＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便中において、全細菌叢における特定乳酸菌の割合が増大することを見出した。さらに、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの投与によって、大腸の特定乳酸菌の割合が分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカン非投与のコントロール群と比較して顕著に増加することを見出した。さらに、特定乳酸菌を投与することによって制御性Ｔ細胞数が増加し、炎症性腸疾患等の炎症性疾患もしくはアレルギー性の疾患が抑制されることを見い出した。発明者らは、これらの知見に基づいて、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを投与することを含む、特定乳酸菌の増殖促進方法、および、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの投与による特定乳酸菌の増殖促進効果の評価方法、を完成させた。【0042】
分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンは、治療薬または機能性食品として投与された際に潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患の予防および治療において有用であることが見いだされた。分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンは、潰瘍性大腸炎だけでなく食品アレルギーまたは全身性アレルギーの予防、治療または改善においても有用であると考えられる。さらに、本発明により、分子量が０．２Ｋ〜５０Ｋの範囲であるβグルカン分子が該範囲外の分子量を有するβグルカン分子と比べ、デクチン−１の抑制において強い活性を示すことが明らかにされた。上記範囲内の分子量を有するβグルカン分子は、特定乳酸菌の増殖を促進するための食品または医薬品、制御性Ｔ細胞を増加させるための食品または医薬品、炎症性腸疾患のための新たな治療薬に使用可能であり、健康増進を図る新たな機能性食品に応用のために特に適している。更に、家畜、家禽、ペットなどに投与する事により、炎症を抑制する事によって、健康を維持し、成長、体重増加などを促進する事ができる。【0043】
分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンによる特定乳酸菌の増殖促進、制御性Ｔ細胞の増加効果または、炎症性腸疾患の抑制については知られておらず、本発明により初めて明らかにされた。βグルカンの免疫賦活活性の効果は、実験系によって一定ではない（すなわち、抑制型または活性化型に変化する）。これは、不純物として含まれるリポ多糖（ＬＰＳ）などにより引き起こされるデクチン−１以外の因子の活性化によって結果が影響を受けていること、βグルカンの受容体が知られていないこと、および、βグルカンの分子量が多様であること、が原因であると考えられる。本発明では、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンがデクチン−１に作用してデクチン−１の活性化を阻害することが初めて明らかにされた。さらに、βグルカンの分子量によってデクチン−１の活性化を阻害する作用の強さが相違すること明らかにされた。これまで用いられてきたβグルカン試料は、種々の分子量を有する種々の分子の混合物であり、この混合物は、分子量が５０Ｋより大きい免疫賦活活性を有する分子、および分子量が０．２Ｋ〜５０Ｋであって免疫抑制活性を示す分子を含むものである。これらの分子の割合によって試料が異なった活性を示していたと推定される。一方、本発明では、両分子量範囲の分子を互いに分離し、免疫抑制活性を有する画分のみが良好に単離される。その結果、混入していた免疫賦活活性成分が除去されるため、抽出画分は強い免疫抑制効果を示す。さらに、これまで用いられてきた粒子状のβグルカンとはことなり、本発明で使用される分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンは可溶性であり、透析法などにより分子量に基づいて容易に分画することが可能である。したがって、本発明により、従来の技術では得ることができなかった、特定乳酸菌の増殖を促進する機能、制御性Ｔ細胞を増加させる機能、腸炎症を抑制する機能を有する分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンが良好に産生される。【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1A】Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスはＤＳＳ誘発性大腸炎に対して抵抗性を示し、その大腸菌内微生物叢はこの非感受性を伝達することができる。生存率（Ａ）を毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。
【図1B】Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスはＤＳＳ誘発性大腸炎に対して抵抗性を示し、その大腸菌内微生物叢はこの非感受性を伝達することができる。疾患スコア（Ｂ）を毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。
【図1C】２％ＤＳＳ処理後１１日目にマウスを屠殺し、大腸の長さを測定した（Ｃ）。
【図1D】ｃＬＰ中の好中球の細胞絶対数をＦＡＣＳで評価した（Ｄ）。
【図1E】刺激を加えずに４８時間培養した後にＥＬＩＳＡでサイトカイン産生を測定した。図１Ｃ、Ｄ、およびＥにおいては、４〜６匹のマウスを１グループで使用した。（図１Ａ〜Ｅ）のデータは、３回の独立実験を代表するものである。
【図1F】ＳＰＦマウスに１％ＤＳＳを投与し、体重を毎日測定した（ｎ＝５／グループ）。データは、２回の独立実験を代表するものである。
【図1G】無菌マウスに１％ＤＳＳを投与し、体重を毎日測定した（ｎ＝５／グループ）。データは、２回の独立実験を代表するものである。
【図1H】無菌野生型レシピエントマウスの盲腸の大きさ、およびＳＰＦ野生型マウスまたはＣｌｅｃ７ａ−／−マウスからのパイエル板（ＰＰ）移植後の盲腸の大きさ。
【図1I】野生型マウスまたはＣｌｅｃ７ａ−／−マウスからパイエル板を移植後、レシピエントマウスに１％ＤＳＳを１１日間投与し、大腸の長さを測定した。
【図1J】大腸中のＴｎｆａ ｍＲＮＡおよびＩｌ１２ｐ３５ ｍＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した（ｎ＝５／グループ）。
【図1K】ＳＰＦの野生型マウスまたはＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸微生物叢を接種した無菌野生型マウスまたは無菌Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスに２％ＤＳＳを３日後に投与し、体重を３日毎に測定した。
【図1L】ＤＳＳ処理後１１日目のレシピエントマウスの大腸の長さを測定した（図１ＫおよびＬにおいて、ｎ＝４／グループ）。データは、２回の独立実験を代表するものである。（図１Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｌ）のデータは、平均±標準偏差で表される。野生型に対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図2A】Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸において、ラクトバチルス・ムリヌス、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ集団が上方制御され、ＲＯＲγｔの発現が増強される。野生型マウスおよびＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便微生物叢について細菌１６Ｓ ｒＤＮＡ解析を行い、主要な共生細菌の割合を示した。
【図2B】野生型マウスおよびＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便微生物叢について細菌１６Ｓ ｒＤＮＡ解析を行い、グラム陽性菌：グラム陰性菌の比率を示した。
【図2C】野生型マウスおよびＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便およびパイエル板における共生微生物叢全体に占める全ラクトバチルス属の割合を示した。
【図2D】野生型マウスおよびＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便およびパイエル板における共生微生物叢全体に占める糞便クロストリジウム属の割合を示した。
【図2F】無感作マウスまたはＤＳＳ投与マウスのｃＬＰ細胞におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を、フローサイトメトリーで評価した。各記号は別々のマウスを示す。
【図2G】マウス大腸におけるＴ−ｂｅｔ、ＲＯＲγｔ、またはＴＧＦ−βをコードするｍＲＮＡ転写物の発現をＲＴ−ＰＣＲで測定した（ｎ＝４／グループ）。
【図2H】マウス大腸におけるＴ−ｂｅｔ、ＲＯＲγｔ、またはＴＧＦ−βをコードするｍＲＮＡ転写物の発現をＲＴ−ＰＣＲで測定した（ｎ＝４／グループ）。（図２Ｆ〜Ｈ）のデータは、３回の独立実験を代表するものである。
【図2I】ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋ナイーブＴ細胞をＲａｇ２−／−マウスまたはＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスに移植し、３５日後に、回収したＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーで評価した（ｎ＝４／グループ）。
【図2J】Ｆｏｘｐ３またはＴＧＦ−βの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した（ｎ＝４／グループ）。データは、２回の独立実験を代表するものである。（図２Ｆ〜Ｉ）のデータは、平均±標準偏差で表される。野生型マウスまたはＲａｇ２−／−マウスに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図3A】ラクトバチルス・ムリヌス生着マウスにおいてＴｒｅｇ細胞およびＴｈ１７細胞が増大する。ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の割合を、１０６ＣＦＵのラクトバチルス・ムリヌスを無菌ＩＣＲ野生型マウスに５週間経口移植した後にＦＡＣＳで調べた。
【図3B】全ｃＬＰ細胞中のＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞含有量を、１０６ＣＦＵのラクトバチルス・ムリヌスまたはアルカリゲネス・フェカリスを無菌Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスに５週間経口移植した後にＦＡＣＳで調べた（ｎ＝３〜４／グループ）。
【図3C】ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞およびＩＬ−１０＋Ｔｒ１細胞の割合を、１０６ＣＦＵのラクトバチルス・ムリヌスを無菌ＩＣＲ野生型マウスに５週間経口移植した後にＦＡＣＳで調べた。
【図3D】ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞、ＩＬ−１０＋Ｔｒ１細胞、およびＩＬ−１７＋Ｔｈ１７細胞の割合を、１０６ＣＦＵのラクトバチルス・ムリヌスを無菌ＩＣＲ野生型マウスに５週間経口移植した後にＦＡＣＳで調べた。
【図3E】ＬＰリンパ球を抗ＣＤ３マウス抗体で４８時間刺激し、培養上清中のＩＬ−１０濃度およびＩＬ−１７濃度をＥＬＩＳＡで測定した（ｎ＝５〜６／グループ）。データは、２回の独立実験を代表するものである。 データは、２回の独立実験を代表するものである。（図３Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）のデータは、平均±標準偏差で表される。無菌コントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図4A】ラクトバチルス・ムリヌスは、大腸ＤＣおよびＭΦ（マクロファージ）においてＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０を特異的に誘導する。ＣＤ１１ｂ＋細胞およびＣＤ１１ｃ＋細胞はＡｕｔｏＭａｃｓを用いて野生型ｃＬＰ細胞から精製し、４×１０４個の細胞を（１ウエルあたり）４×１０５ＣＦＵのラクトバチルス・ムリヌス、アルカリゲネス・フェカリス、または大腸菌と１２時間共培養した。サイトカイン遺伝子の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【図4B】全ｃＬＰ細胞を図１Ａに記載のように細菌と共培養し、Ｆｏｘｐ３、ＲｏＲγｔ、およびＴ−ｂｅｔをコードする遺伝子をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。３回の独立実験を代表するデータを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１
【図5A】デクチン−１シグナル伝達の下流で抗菌ペプチドが誘導される。無感作の野生型マウスおよびＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸におけるＳ１００Ａ、ホスホリパーゼＡ２（Ｐｌａ２ｇ２ａ）、Ｒｅｇ３、デフェンシンαおよびデフェンシンβ、ならびにリゾチームファミリーのメンバーの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した（ｎ＝４／グループ）。
【図5B】ラクトバチルス・ムリヌスまたはアルカリゲネス・フェカリスを組み換えＳ１００Ａ８＋Ｓ１００Ａ９（１：１混合物、各ペプチド５ｍｇ／ｍｌ）の存在下で９時間培養し、分光計で細菌増殖を測定した。（図５ＡおよびＢ）のデータは、３回の独立実験を代表するものである。
【図5C】新鮮大腸切片（５ｍｍ）を１００μｇ／ｍｌのＴＬＲリガンド除去ザイモサン（Ｄ−ザイモザン）と共に１２時間培養し、Ｓ１００ａ８の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。データは、２回の独立実験を代表するものである。データは、平均±標準偏差で表される。
【図6A】デクチン−１のアンタゴニストであるラミナリンは、マウスのＤＳＳ誘発性大腸炎を予防する。野生型マウスを蒸留水中の４％チオグリコール酸培地（ＴＧＣ）で４日間腹腔内処理してＴＧＣ誘導腹腔内ＭΦ（マクロファージ）を回収し、１０００μｇ／ｍｌのラミナリンで３時間前処理した後、１００μｇ／ｍｌのＴＬＲリガンド除去ザイモサンで３時間刺激した。Ｉｌ１ｂ ｍＲＮＡおよびＩｌ６ ｍＲＮＡをリアルタイムｑＰＣＲで測定し、ＧＡＰＤＨで標準化した。データは、２回の独立実験を代表するものである。
【図6B】５％のラミナリン（デクチン−１アンタゴニスト）またはカードラン（アゴニスト）を含む食品を３日間投与後の野生型マウスにおいてＤＳ大腸炎が誘発された。これらのリガンドは実験期間中投与し続け、体重を毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。
【図6C】５％のラミナリン（デクチン−１アンタゴニスト）またはカードラン（アゴニスト）を含む食品を３日間投与後の野生型マウスにおいてＤＳ大腸炎が誘発された。これらのリガンドは実験期間中投与し続け、大腸炎疾患スコアを毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。
【図6E】ｃＬＰ細胞を回収し、全ＣＬＰ細胞、好中球、および炎症性ＤＣの絶対数をフローサイトメトリーで評価した。
【図6F】ｃＬＰ細胞を刺激を加えずに４８時間培養し、培養上清中のＴＮＦおよびＩＬ−１０をＥＬＩＳＡで測定した。
【図6G】ｃＬＰ細胞中のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の頻度をフローサイトメトリーで評価した（ｎ＝４／グループ）。
【図6I】β−アクチンまたは１６Ｓ ｒＤＮＡに対する、糞便中ラクトバチルス・ムリヌスのリボソームＤＮＡ含有量を、ラミナリン処理の９日後にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した（ｎ＝６〜８／グループ）。データは、２回の独立実験を代表するものである。平均±標準偏差。コントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図7A】ラクトバチルス・ムリヌスは、ヒトの腸にはほとんど存在せず、抗炎症性サイトカインをより効率的に誘導することができる。全ラクトバチルスＤＮＡに対する、ヒト糞便中ラクトバチルス・ムリヌスのリボソームＤＮＡ含有量を、リアルタイムＰＣＲで測定した。２種類の用量の糞便ＤＮＡテンプレート（０．５ｎｇ／μｌおよび５ｎｇ／μｌ）を使用した。
【図7B】１６Ｓ ｒＤＮＡに対する、ヒトおよびマウスの糞便中のラクトバチルス・サリバリウスのリボソームＤＮＡ含有量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【図7C】野生型マウスの１×１０５個の全ｃＬＰ細胞を（１ウエルあたり）１×１０６ＣＦＵのラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・アニマリス（Ｌ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、またはラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）と共に１２時間共培養した。サイトカイン遺伝子の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。（図７Ａ〜Ｃ）のデータは、２回の独立実験を代表するものである。
【図8A】デクチン−１の発現は、ＤＳＳ投与後に上方制御される。無感作の野生型およびＣｌｅｃ７ａ−／−脾細胞由来の免疫細胞におけるデクチン−１の発現、を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した（ｎ＝３／グループ）。
【図8B】無感作マウスまたはＤＳＳ投与マウスの大腸におけるサイトカインの発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した（ｎ＝３／グループ）。
【図8C】無感作マウスまたはＤＳＳ投与マウスの大腸におけるデクチン−１の発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した（ｎ＝３／グループ）。
【図8D】無感作の野生型マウスおよびＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸の長さを測定した（ｎ＝３／グループ）。両試料とも黄褐色であった。
【図8E】ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋（Ｔｈ１）細胞およびＩＬ−１７＋ＣＤ４＋（Ｔｈ１７）細胞の割合を、フローサイトメトリーで調べた（ｎ＝４／グループ）。
【図8F】無感作Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスのＣＤ４＋ｃＬＰ Ｔ細胞中のＴｈ１７細胞の絶対数を、フローサイトメトリーで調べた（ｎ＝４／グループ）。
【図8G】無感作の野生型マウスまたはＣｌｅｃ７ａ−／−マウスのＩＬ−２３＋ｃＬＰ非リンパ球の割合をフローサイトメトリーで調べた（ｎ＝４／グループ）。
【図8H】無感作の野生型マウスまたはＣｌｅｃ７ａ−／−マウスのＩＬ−２３＋ｃＬＰ非リンパ球の絶対数をフローサイトメトリーで調べた（ｎ＝４／グループ）。２回の独立実験の代表データを示す。（図８Ｂ〜Ｄ）のデータは、平均±標準偏差で表される。無感作コントロールまたは野生型コントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図9A】Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスは、ＤＳＳ誘発性大腸炎に対して抵抗性を示す。図１に示すＤＳＳ処理した野生型マウスまたはＣｌｅｃ７ａ−／−マウスのｃＬ細胞によるサイトカイン産生を、刺激を加えずに２４時間培養した後にＥＬＩＳＡで評価した。
【図9B】野生型マウスまたはＣｌｅｃ７ａ−／−マウスのｃＬＰにおける炎症性の自然免疫細胞浸潤をフローサイトメトリーで測定した。左ブロックは、Ｇｒ１＋好中球、Ｆ４／８０＋ＭΦ（マクロファージ）、およびＣＤ１１ｂ＋／−ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの割合を示し（象限中の数はパーセンテージを表す）、右ブロックは、ＭΦ（マクロファージ）およびＤＣの絶対数を示す。
【図9C】ＬＰリンパ球をＰＭＡおよびイオノマイシンで５時間刺激して、ＩＬ−１７＋Ｔ細胞またはＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーで分析した（ＡおよびＢ中、ｎ＝３〜５／グループ）。データは、３回の独立実験を代表するものである。野生型コントロールに対して、＊ｐ＜０．０５。
【図9D】ＨＥ染色により大腸遠位部の組織構造を調べた（４０倍）。
【図9E】ＤＳＳ投与した野生型マウスおよびＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸の肉眼所見を示す。Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの試料は黄褐色であったが、野生型マウスの試料はほぼ黒色だった。
【図10A】食品由来βグルカンは、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスのＤＳＳ大腸炎抵抗性に関与していない。野生型マウスおよびＣｌｅｃ７ａ−／−マウスにβグルカンを含まない合成飼料を３日間与え、２％ＤＳＳを飲料水投与して大腸炎を誘発した。生存率を毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。
【図10B】体重を毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。
【図10C】大腸疾患スコアを毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。
【図10D】ＤＳＳ投与１２日後、全ｃＬＰ細胞を回収して刺激を加えずに４８時間培養し、ＥＬＩＳＡでＴＮＦ産生を測定した（ｎ＝４／グループ）。（Ａ〜Ｄ）のデータは、３回の独立実験を代表するものである。（図１０Ｂ〜Ｄ）のデータは、平均±標準偏差で表される。野生型コントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図11A】大腸中に生存真菌は存在しない。Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスではラクトバチルスの割合が増加していたが、真菌ｒＤＮＡはＣｌｅｃ７ａ−／−ＳＰＦマウス、野生型ＳＰＦマウス、および無菌マウスのいずれにおいても同様に検出された。マウス糞便中の細菌ｒＤＮＡを定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【図11B】Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスではラクトバチルスの割合が増加していたが、真菌ｒＤＮＡはＣｌｅｃ７ａ−／−ＳＰＦマウス、野生型ＳＰＦマウス、および無菌マウスのいずれにおいても同様に検出された。真菌ｒＤＮＡを定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【図11C】ＳＰＦマウスの糞便中に生存真菌は検出されなかった。ポジティブコントロールとして、既知のＣＰＵのカンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）をマウス糞便と混合し、真菌ＣＦＵを真菌特異的培地プレート上で４８時間後に測定した、データは、２回の独立実験を代表するものである。野生型コントロールに対して、＊ｐ＜０．０５。
【図12A】ＢＡＬＢ／ｃ Ｒａｇ２−／−バックグラウンドのＣｌｅｃ７ａ−／−マウスもまた、ラクトバチルス・ムリヌスが豊富である。Ｒａｇ２−／−マウスまたはＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスに２％ＤＳＳを投与し、生存率を１２日目まで毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。
【図12B】Ｒａｇ２−／−マウスまたはＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスに２％ＤＳＳを投与し、大腸疾患スコアを１２日目まで毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。
【図12C】Ｒａｇ２−／−マウスまたはＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便中の全細菌ｒＤＮＡおよびラクトバチルス・ムリヌスのｒＤＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量的に測定した（ｎ＝４／グループ）。データは、３回の独立実験を代表するものである。
【図12D】野生型マウスのナイーブＴ細胞を図に示したマウスに移植し、大腸炎を誘発した。３５日後、レシピエントであるＲａｇ２−／−マウスまたはＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおける、大腸の長さを調べた（ｎ＝４〜６／グループ）。
【図12E】野生型マウスのナイーブＴ細胞を図に示したマウスに移植し、大腸炎を誘発した。３５日後、レシピエントであるＲａｇ２−／−マウスまたはＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおける、盲腸炎症性浮腫の肉眼所見を調べた（ｎ＝４〜６／グループ）。
【図12F】野生型マウスのナイーブＴ細胞を図に示したマウスに移植し、大腸炎を誘発した。３５日後、レシピエントであるＲａｇ２−／−マウスまたはＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおける、ｃＬＰ Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ１細胞、およびＩＦＮ−γ＋ＩＬ−１７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合をフローサイトメトリーで調べた（ｎ＝４〜６／グループ）。データは、２回の独立実験を代表するものである。（図１２Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）のデータは、平均±標準偏差で表される。Ｒａｇ２−／−コントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図13】腸内共生細菌は脾臓ＤＣおよびＭΦ（マクロファージ）において種々のサイトカインを誘導することができる。 共生細菌を脾臓ＤＣおよびＭΦ（マクロファージ）と１２時間共培養し、サイトカインの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。データは、２回の独立実験を代表するものである。
【図14A】Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸では特定の抗菌タンパク質の発現が低下する。無感作のＲａｇ２−／−マウスまたはＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸におけるＳ１００ａ８、ホスホリパーゼＡ２（Ｐｌａ２ｇ２ａ）、Ｒｅｇ３ｇ、およびＲｅｇ３ｂの発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した（ｎ＝４／グループ）。
【図14B】全大腸細胞中のＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞、ＤＸ５＋細胞、およびＣＤ４５＋細胞を除去することにより上皮細胞を精製し、Ｒｅｇ３γおよびＲｅｇ３βの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した（ｎ＝４／グループ）。（図１４ＡおよびＢ）のデータは、３回の独立実験を代表するものである。
【図14C】Ｒａｇ２−／−マウスまたはＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸におけるリゾチーム（Ｌｙｓ１、２）、αデフェンシン（Ｄｅｆａ１、３、ｒｓ１）、βデフェンシン（Ｄｅｆｂ１〜３）、およびカテリシジン抗菌ペプチド（Ｃａｍｐ）などの抗菌タンパク質の発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。データは、２回の独立実験を代表するものである。
【図15】分子量０．２K〜５０Kのラミナリンは、デクチン−１を介したサイトカイン誘導を効果的に抑制する。 アラメ由来のラミナリン混合物を巨大分子透析膜で分画し、異なる分子量（＜１０００、＜３５００、＜１００００、および＜５００００）を有するラミナリン調製物に分離した。図６Ａに記載の方法と同じ方法でＴＧＣ−ＭΦ（ＴＧＣ−マクロファージ）を回収して１０００μｇ／ｍｌの分画前のラミナリン混合物または異なる分子量を有するラミナリンで３時間前処理した後、１００μｇ／ｍｌのＴＬＲリガンド除去ザイモサンで４８時間刺激した。細胞培養上清中のＴＮＦおよびＩＬ−１０の産生をＥＬＩＳＡで測定した、データは、２回の独立実験を代表するものであり、平均±標準偏差で表される。ＴＬＲリガンド除去ザイモサングループに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図16A】ラクトバチルス・ムリヌスは大腸炎の発症を改善することができる。無菌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにラクトバチルス・ムリヌス（ＮＢＲＣ１４２２１）またはアルカリゲネス・フェカリス（ＮＢＲＣ１３１１１）を生着させた。４カ月後、これらのマウスに２％ＤＳＳを投与し、体重減少を１１日間経時的に観察した。データは、２回の独立実験を代表するものである。
【図16B】無菌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにラクトバチルス・ムリヌス（ＮＢＲＣ１４２２１）またはアルカリゲネス・フェカリス（ＮＢＲＣ１３１１１）を生着させた。４カ月後、これらのマウスに２％ＤＳＳを投与し、疾患指数を１１日間経時的に観察した。データは、２回の独立実験を代表するものである。
【図16C】ＳＰＦ野生型マウスに熱殺菌した１×１０７個のラクトバチルス・ムリヌスを７日間経口投与した後、２％ＤＳＳで処理した。大腸疾患スコアを毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。データは、２回の独立実験で再現可能であり、平均±標準偏差で表される。コントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図16D】ＳＰＦ野生型マウスに熱殺菌した１×１０７個のラクトバチルス・ムリヌスを７日間経口投与した後、２％ＤＳＳで処理した。生存率を毎日評価した（ｎ＝６／グループ）。データは、２回の独立実験で再現可能であり、平均±標準偏差で表される。コントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【0045】
本発明の実施形態は、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する制御性Ｔ細胞増加剤、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを対象に投与することを含む特定乳酸菌の増殖促進方法、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを対象に投与することを含む制御性Ｔ細胞の増加方法、および、特定乳酸菌の増殖促進効果の評価方法、を含む。本発明の一つの態様によれば、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンが特定乳酸菌の増殖を促進する作用を有すること、特定乳酸菌の増殖が制御性Ｔ細胞を上方制御し、炎症性腸疾患を抑制する活性を有することが初めて明らかにされた。これに基づいて、（１）分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤、（２）特定乳酸菌増殖促進剤を含有する、制御性Ｔ細胞増加剤、（３）分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを対象に投与することを含む特定乳酸菌の増殖促進方法、（４）分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を対象に投与することを含む制御性Ｔ細胞の増加方法、（５）分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析すること、および、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、を含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法、（６）分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料中における制御性Ｔ細胞数を測定すること、を含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法、（７）分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する制御性Ｔ細胞増加剤を投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析すること、および、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、を含む制御性Ｔ細胞増加効果の評価方法、（８）ラクトバチルス・ムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）もしくはラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）との間の１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌の細胞を含む、制御性Ｔ細胞増加剤、が提供される。
【0046】
βグルカンは、グルコースがβ１−３結合を介して重合した多糖類である。βグルカンを製造するための材料は、βグルカンを含むものであれば特に限定されない。キノコ類、真菌類、酵母、海藻等の細胞壁に多く含まれ、これらを材料として製造することができる。βグルカンの製造は、公知の方法で行うことができる。例えば、キノコ類、真菌類、酵母、海藻等を熱水に浸漬することによってβグルカンを抽出することができる。本発明に用いられるβグルカンの材料のうち、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの分画を多く含有していることから、海藻が材料として好適である。海藻に含有されるβグルカンは、ラミナリンと呼ばれている。【0047】
ラミナリンは、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ Ｂｉｃｙｃｌｉｓ）などの海藻に由来するβグルカンを指し、ラミナランとも呼ばれる。ラミナリンの構造は、下記の一般式（１）で表される（ＣＡＳ登録番号９００８−２２−４）。一般式（１）において、ｎは、１以上の整数を表す。ラミナリンは、長鎖β−１，３結合糖鎖上にβ−１，６結合側鎖を有していてもよい。【化1】
【0048】
ラミナリンは、海藻類のうちコンブ目、ヒバマタ目等の褐藻類の細胞壁に多く含まれ、これらの褐藻類から抽出することができる。抽出は種々の方法によって行うことができる。例えば、材料を熱水に浸漬することによる抽出、あるいは、松田らによる北海道大学水産科学研究彙報（BULLETIN OF FISHERIES SCIENCES, HOKKAIDO UNIVERSITY, 56(3):75-86、2005年12月）に記載の方法によってラミナリンの抽出を行うことができる。【0049】
本発明のβグルカンの分子量は、デクチン−１の活性化阻害作用の観点から、０．２Ｋ〜５０Ｋであることが好ましく、１Ｋ〜１０Ｋであることがより好ましい。１Ｋ〜３．５Ｋ、３．５Ｋ〜１０Ｋ、４Ｋ〜１０Ｋ、３．５Ｋ〜８Ｋ、もしくは、５Ｋ〜７Ｋの分子量を有するβグルカンを用いてもよい。本発明のβグルカンの分子量の分布は１種類の分子量のβグルカンを含有する一峰性のものでもよいし、2種類の分子量のβグルカンを含有する二峰性、三峰性以上の多峰性、あるいはスメアな分子量分布を示すものでもよい。【0050】
本明細書において「分子量」は数平均分子量を示す。βグルカンの分子量は、既知の方法によって決定することができる。数平均分子量は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、膜浸透圧測定などによって測定することができる。 なお、分子量１Ｋは分子量が１０００であることを示す。【0051】
特定の分子量のβグルカンは、種々の分子量のβグルカンを含む混合物から、限外濾過、透析およびゲル濾過などの既知の方法によって得ることができる。所望の分子量を超える分子量のβグルカンを多く含有する材料を用いて本発明に用いるβグルカンを調製する場合には、化学的または酵素的に加水分解して使用することもできる。化学的な加水分解としては、例えば、酸を使用することができる。酵素的な加水分解としては、例えば、エンドβ−グルカナーゼ型の酵素を使用することができる。あるいは、本発明の効果を有する限りは、特定の分子量のβグルカンを高い割合で含有する褐藻の乾燥粉末等を使用することもできる。【0052】
対象に分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを投与する方法は特に制限されないが、経口投与、経腸投与が好ましい。本発明の特定乳酸菌増殖促進剤および制御性Ｔ細胞増加剤は、投与対象の腸内細菌叢の特定乳酸菌の割合を増大させる。分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを投与する対象は特に制限されないが、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、シカ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リスなどの哺乳類、ニワトリ、アヒル、カモ、ガチョウ、キジ、ハト、ウズラ、ホロホロ鳥、七面鳥、インコ、オウムなどの鳥類が好ましい。特に好ましい対象は哺乳類である。【0053】
本発明に用いる分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンは、医薬品または食品もしくは飼料に配合して対象に投与することが好適である。本発明の特定乳酸菌増殖促進剤または制御性Ｔ細胞増加剤は、本発明の効果を有する限りは分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカン以外の他の成分を含んでいてもよい。本発明の特定乳酸菌増殖促進剤または制御性Ｔ細胞増加剤は、本発明の効果を有する限りは分子量が０．２Ｋ〜５０Ｋの範囲内ではないβグルカンを含んでいてもよい。本発明の特定乳酸菌増殖促進剤または制御性Ｔ細胞増加剤が含んでいてもよい他の成分としては、例えば、ビタミン類、アミノ酸等の成分、賦形剤、増粘剤等が挙げられる。【0054】
本発明の特定乳酸菌増殖促進剤によって増殖が促進される特定乳酸菌は腸内に生息し得る乳酸菌である。制御性Ｔ細胞を増加させる効果を有する、特定乳酸菌は、ラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、または、これらとの間での１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上（例えば、９２％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上）である細菌である。ホモロジーは、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて算出することができる。ラクトバチルス・ムリヌスはラクトバチルス・ムリヌスＮＢＲＣ１４２２１株であってもよく、ラクトバチルス・サリバリウスはラクトバチルス・サリバリウスＮＢＲＣ１０２１６０株であってもよい。【0055】
本発明の分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を対象に投与することによって、投与対象の制御性Ｔ細胞を増加させることができる。つまり、本発明の特定乳酸菌増殖促進剤は、制御性Ｔ細胞増加剤として用いてもよい。【0056】
本発明の１つの実施形態は、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象において、特定乳酸菌の増殖促進効果を評価する方法である。特定乳酸菌の増殖促進効果を評価する方法としては、特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出することを含む方法、及び、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料中における制御性Ｔ細胞数を測定すること、を挙げることができる。【0057】
分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出することを含む方法は、（１）分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを投与される前の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、および、（２）分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを投与された後の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を測定すること、とを含むことが好ましい。（２）で算出した全細菌に対する特定乳酸菌の割合が、（１）で算出した全細菌に対する特定乳酸菌の割合より高い場合には、当該対象において分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの投与による特定乳酸菌増殖促進効果があったと評価する。（２）で算出した全細菌に対する特定乳酸菌の割合から、（１）で算出した全細菌に対する特定乳酸菌の割合を引いた値が大きいほど、当該対象において分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの投与による特定乳酸菌増殖促進効果が高かったと評価することができる。例えば、（２）で算出した全細菌に対する特定乳酸菌の割合が、（１）で算出した全細菌に対する特定乳酸菌の割合を引いた値が統計学的に有意に増加していれば、当該対象において分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの投与による特定乳酸菌増殖促進効果があったと評価してもよい。統計学的方法としては、一般的に用いられる方法のいずれも用いることができる。例えば、ステューデントｔ検定等が挙げられる。
【0058】
あるいは、（２）で算出した全細菌に対する特定乳酸菌の割合の、（１）で算出した全細菌に対する特定乳酸菌の割合に対する増加率について基準値を設定し、前記基準値より増加率が高いときに、当該対象において分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの投与による特定乳酸菌増殖促進効果があったと評価してもよい。基準値は、所望の特定乳酸菌増殖促進効果の大きさに応じて任意に設定することができる。例えば、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線から基準値を決定してもよい。基準値は、例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上などに設定され得る。【0059】
特定乳酸菌の増殖促進効果を評価する方法において対象とされる特定乳酸菌は、本発明の特定乳酸菌増殖促進剤によって増殖が促進される特定乳酸菌として本明細書に記載されている細菌の定義、説明および範囲がそのまま適用される。つまり、本発明の特定乳酸菌の増殖促進効果を評価する方法は、ラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間での１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上（例えば、９２％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上）である細菌の殖促進効果を評価する方法であってもよい。【0060】
分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を測定することを含む方法において、対象から採取する試料は、糞便、腸管内容物、腸液、腸洗浄液、腸組織などを含む。非侵襲性であるという観点から、糞便であることが好ましい。採取された試料の微生物叢を解析して全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出する方法は、既知の微生物叢の解析方法のいずれを使用してもよい。例えば、細菌の全ゲノムシークエンスを決定する方法（メタゲノム解析法）や、１６Ｓ細菌リボソームＤＮＡ配列を分析する方法、などが挙げられる。１６Ｓ細菌リボソームＤＮＡ配列を分析する方法としては、ＦＩＳＨ法、１６Ｓｒ ＤＮＡクローンライブラリー法、ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ法、Ｔ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ法などが挙げられる。定量性に優れているという観点から、１６Ｓ ｒＤＮＡクローンライブラリー法が好適に使用される。具体的には、糞便中の細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを本明細書の表１に記載のユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅し、増幅された１６Ｓ ｒＤＮＡを大腸菌に導入してクローニングし、各クローンのＤＮＡ配列を決定する事により、特定細菌の全細菌中の割合を算出する。この時、特定細菌、例えば、Ｌ． ｍｕｒｉｎｕｓに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行う事により、容易に全細菌中のＬ．ｍｕｒｉｎｕｓの割合を知ることが出来る。それぞれの方法に用いるためのプロープやプライマーは公知のものから適宜選択することができる（例えば、Salzman NH et al., Nat. Immunol. 2010;11(1):76-83など）。あるいは、１６Ｓ細菌リボソームＤＮＡ配列からプローブやプライマーを設計してもよい。本明細書の表１に記載のプライマーを用いてもよい。【0061】
分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料中における制御性Ｔ細胞数を測定することを含む方法は、（１）分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を投与される前の対象から採取した試料中の制御性Ｔ細胞数を測定すること、および、（２）分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を投与された後の対象から採取した試料中の制御性Ｔ細胞数を測定すること、とを含むことが好ましい。（２）で測定した制御性Ｔ細胞数が、（１）で測定した制御性Ｔ細胞数より大きい場合には、当該対象において特定乳酸菌増殖促進剤の投与による特定乳酸菌増殖促進効果があったと評価する。（２）で測定した制御性Ｔ細胞数から、（１）で測定した制御性Ｔ細胞数を引いた値が大きいほど、当該対象において特定乳酸菌増殖促進剤の投与による特定乳酸菌増殖促進効果が高かったと評価することができる。例えば、（２）で測定した制御性Ｔ細胞数が、（１）で測定した制御性Ｔ細胞数を引いた値が統計学的に有意に増加していれば、当該対象において特定乳酸菌増殖促進剤の投与による特定乳酸菌増殖促進効果があったと評価してもよい。統計学的方法としては、一般的に用いられる方法のいずれも用いることができる。例えば、ｔ検定等が挙げられる。【0062】
あるいは、（２）で測定した制御性Ｔ細胞数の、（１）で測定した制御性Ｔ細胞数に対する増加率について基準値を設定し、前記基準値より増加率が高いときに、当該対象において分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの投与による特定乳酸菌増殖促進効果があったと評価してもよい。基準値は、所望の特定乳酸菌増殖促進効果の大きさに応じて任意に設定することができる。例えば、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線から基準値を決定してもよい。基準値は、例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上などに設定され得る。【0063】
分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含む特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料中における制御性Ｔ細胞数を測定することを含む方法において、対象から採取する試料は、血液、組織片などを含む、いずれの生体試料でもよい。侵襲性が低いという観点から、血液であることが好ましい。血液を遠心分離してバッフィーコートを回収して検体としてもよいし、Ｆｉｃｏｌｌ等を含む適当な分離液を用いてリンパ球を分離して検体としてもよい。採取された試料中にける制御性Ｔ細胞数を測定することを含む方法を測定する方法としては、制御性Ｔ細胞数測定方法のいずれをも使用することができる。例えば、ＣＤ４およびＦｏｘＰ３をマーカーとしてフローサイトメトリーなどを用いて制御性Ｔ細胞を判別および／または計数することができる。ＣＤ４およびＦｏｘＰ３が陽性であれば制御性Ｔ細胞であると判定される。制御性Ｔ細胞を分画する際のマーカーとしては、ＣＤ２５、ＣＤ１２７などを用いてもよい。【0064】
本発明の一の実施形態は、ラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスとの間の１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上（例えば、９２％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上）である細菌の細胞を含む、制御性Ｔ細胞増加剤、および、前記制御性Ｔ細胞増加剤を投与することを含む、制御性Ｔ細胞を増加させる方法、を提供する。【0065】
ラクトバチルス・ムリヌスおよびラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスと１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌は、ラクトバチルス・ムリヌスはラクトバチルス・ムリヌスＮＢＲＣ１４２２１株であってもよく、ラクトバチルス・サリバリウスはラクトバチルス・サリバリウスＮＢＲＣ１０２１６０株であってもよい。【0066】
本発明のある実施形態は、ラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスと１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上（例えば、９２％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上）である細菌を含む、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状の予防、治療もしくは改善のため、または整腸のための組成物を提供する。ラクトバチルス・ムリヌスはラクトバチルス・ムリヌスＮＢＲＣ１４２２１株であってもよく、ラクトバチルス・サリバリウスはラクトバチルス・サリバリウスＮＢＲＣ１０２１６０株であってもよい。したがって、例えば、組成物は、ラクトバチルス・ムリヌスＮＢＲＣ１４２２１株の細菌、ラクトバチルス・サリバリウスＮＢＲＣ１０２１６０の細菌、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスＮＢＲＣ１４２２１もしくはラクトバチルス・サリバリウスＮＢＲＣ１０２１６０と１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上である細菌を含んでいてもよい。【0067】
さらに、組成物中に含まれる細菌は、生菌または死菌のいずれであってもよい。疾患または症状について、組成物は、潰瘍性大腸炎またはクローン病などの炎症性腸疾患の予防、治療、または改善のために使用されてもよい。あるいは組成物は、食品アレルギーの予防、治療、または改善のために使用されてもよい。組成物はまた、花粉症などの全身アレルギーの予防、治療、または改善のために使用されてもよい。組成物は例えば、医薬組成物（医薬品）または食品であってもよい。医薬組成物は、経口投与されてもよいし、経腸投与されてもよい。【0068】
本発明はまた、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状の予防もしくは治療のため、または整腸のための医薬の製造における、ラクトバチルス・ムリヌス、ラクトバチルス・サリバリウス、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌスもしくはラクトバチルス・サリバリウスと１６Ｓ ｒＤＮＡのホモロジーが９０％以上（例えば、９２％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上）である細菌の細胞の使用も提供する。【0069】
本発明はさらに、上記医薬組成物を治療有効量、それを必要とする対象に投与することを含む、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状の予防もしくは治療のための、または整腸のための方法を提供する。ここで、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状の予防もしくは治療のための、または整腸のための組成物に対する上記説明は、使用および方法に直接適用される。【0070】
本発明の別の実施形態は、活性成分として、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含む、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状を予防、治療もしくは改善するための、または腸の健康を維持するための組成物を提供する。βグルカンは水溶性βグルカンであってもよい。また、分子量０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンを含む、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状を予防、治療もしくは改善するための、または腸の健康を維持するための組成物も提供する。両組成物について、組成物は潰瘍性大腸炎またはクローン病などの炎症性腸疾患の予防、治療、または改善のために使用されてもよい。あるいは組成物は、食品アレルギーの予防、治療、または改善のために使用されてもよい。組成物はまた、花粉症などの全身アレルギーの予防、治療、または改善のために使用されてもよい。組成物は例えば、医薬組成物（医薬品）または食品であってもよい。医薬組成物は、経口投与されてもよい。【0071】
本発明はまた、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状の予防もしくは治療のための、または腸の健康を維持するための医薬品の製造における、分子量が０．２Ｋ〜５０Ｋのβグルカンの使用を提供する。また、上記組成物（いずれかの組成物）を治療有効量、必要とする対象に投与することを含む、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状を予防もしくは治療するための、または腸の健康を維持するための方法も提供する。更には腸の炎症を抑制する事によって、家畜や家禽、ペット等の健康を維持し、成長を促進する事もできる。ここで、炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状を予防、治療もしくは改善するための、または腸の健康を維持するための組成物に対する上記説明は、使用および方法に直接適用される。【0072】
βグルカンは、真菌の細胞壁構成要素であり、受容体であるデクチン−１を介して自然免疫反応を活性化するとされている。発明者らは、デクチン−１欠損（Ｃｌｅｃ７ａ−／−）マウスが、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎に対して抵抗性を示すことを実証した。共生細菌におけるラクトバチルス・ムリヌス（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）の割合がＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸で増加し、その結果Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が増大した。ラクトバチルス・ムリヌスの経口投与によりＴｒｅｇ細胞の増大が引き起こされた。興味深いことに、ラクトバチルス・ムリヌスを死滅させることができる抗菌ペプチドであるカルプロテクチンＳ１００Ａが、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸で顕著に減少していた。さらに、デクチン−１のアンタゴニストであるラミナリンの経口投与により、ＤＳＳ誘発性大腸炎の発症が大幅に抑制された。これらの観察により、デクチン−１が腸内微生物叢の調節による腸内免疫の恒常性維持にとって重要であることが示され、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療標的候補であることが示唆される。【0073】
本発明では、デクチン−１シグナル伝達を介して腸内免疫系が大腸内微生物叢バランスおよびヘルパーＴ細胞分化を調節する機序が実証された。デクチン−１欠損マウスでは、共生微生物叢の主要メンバーの提示が著しく変化している。特に、この変化した微生物叢は、Ｔｒｅｇ細胞の発生および腸炎惹起性表現型と関連している。デクチン−１依存性殺菌分子の分泌は大腸内微生物叢のバランスを説明するものであり、デクチン−１シグナル伝達の阻害による大腸炎抑制に対する効果によりＩＢＤの治療戦略についての新しい知見がもたらされる。【0074】
結果Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスはＤＳＳ誘発性大腸炎に対して抵抗性を示す
デクチン−１は、リンパ球よりもＤＣおよびＭΦ（マクロファージ）などの骨髄細胞で発現していた（図８Ａ）。大腸におけるこの分子の発現は、ＤＳＳ投与後にＴＮＦの発現と共に著しく上方制御されていた（図８Ｂおよび図８Ｃ）デクチン−１の同様の上方制御はまたＩＢＤ患者で観察されており（de Vries et al., 2009）、デクチン−１が腸の炎症性疾患に関与していることが示唆される。次に、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスのＤＳＳ誘発性急性大腸炎に対する感受性を調べた。生理的条件下で、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸の長さは正常であった（図８Ｄ）。Ｃｌｅｃ７ａ−／−の大腸固有層（ｃＬＰ）において、Ｔｈ１細胞ではなくＴｈ１７細胞の割合は野生型マウスより顕著に低かったが（図８Ｅ）、Ｔｈ１７細胞数は野生型マウスとＣｌｅｃ７ａ−／−マウスで同様であった（図８Ｆ、１．５〜３．５×１０２個のＴｈ１７細胞／大腸）。ＩＬ−２３の主要産生細胞であるＣＤ１１ｃ−内在的ｃＬＰ細胞の数および割合は、無感作の野生型マウスとＣｌｅｃ７ａ−／−マウスで同様であった（図８Ｇおよび図８Ｈ）。
【0075】
２％ＤＳＳの飲料水投与１２日後、すべての野生型マウスが死んだが、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスはＤＳＳ投与に対して完全に抵抗性を示した（図１Ａ）。一貫して、下痢レベル、血便、および体重減少により評価した大腸炎重症度スコアは、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスで顕著に低かった（図１Ｂ）。Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおける炎症性浮腫誘導性の大腸短縮が緩和され（図１Ｃおよび図９Ｅ）、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスのｃＬＰ中の好中球、ＭΦ（マクロファージ）、およびＤＣの数および頻度が顕著に減少した（図１Ｄおよび図９Ｂ）。Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの自然免疫ｃＬＰ細胞によるＴＮＦおよびＩＬ−１２の産生が著しく減少していたが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＩＬ−１７Ｆの産生は減少していなかった（図１Ｅおよび図９Ａ）。一方、ｃＬＰ中のＴｈ１細胞およびＴｈ１７細胞の頻度は、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスで変化していなかった（図９Ｃ）。組織学的検査により、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスが大腸上皮細胞の損傷および炎症性細胞浸潤で評価されるように軽度の大腸炎のみを発症することが示された（図９Ｄ）。したがって、これらの観察により、デクチン−１シグナル伝達が自然免疫炎症性サイトカインの誘導を介してＤＳＳ誘導性大腸炎を悪化させることが示唆される。【0076】
Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウス腸由来の微生物叢は大腸炎に対する抵抗性に関与しているイーストなどのβグルカン成分を含む通常のマウス飼料として、食品由来βグルカンがＤＳＳ誘発性大腸炎をデクチン−１の活性化を介して促進する可能性について調べた。通常の固形飼料の代わりにβグルカンを含まない合成飼料をマウスに継続的に与えた後、大腸炎を誘導した。図１０Ａ〜図１０Ｄに示すように、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスはＤＳＳ投与後に依然として長期間生存し、体重減少および疾患活性が非常に軽度であり、ＴＮＦ産生が野生型マウスと比べて減少した。これらの観察により、食品中のβグルカンは、デクチン−１により促進される腸炎症の直接的な原因ではないことが示唆される。
【0077】
次に、デクチン−１シグナル伝達に関連する共生微生物叢候補のＤＳＳ誘発性大腸炎の発症に対する効果について調べた。ＤＳＳ誘発性炎症の発症は、腸内微生物叢に依存していることが報告されている（Tlaskalova-Hogenova et al., 2005）。発明者らの飼育条件下のＳＰＦマウスとは対照的に、無菌マウスはＤＳＳ誘発性大腸炎を発症しないことが確認された（図１Ｆおよび図１Ｇ）。パイエル板（ＰＰ）は重要な腸付属リンパ節であり、ここで腸内ＤＣが種々の腸内微生物に対してナイーブＴ細胞を活性化する（Obata et al., 2010）。ＰＰ関連微生物叢がＤＳＳ誘導性大腸炎に影響するか否かを調べるため、ＳＰＦ条件下で維持した野生型マウスおよびＣｌｅｃ７ａ−／−マウスのＰＰのホモジェネートを無菌野生型マウスに移植し、ＤＳＳを投与した。ＰＰ中の微生物叢を移植した後、無菌マウスにおける盲腸肥大はＳＰＦマウス同様に正常化した（図１Ｈ）。大腸炎誘導の際、Ｃｌｅｃ７ａ−／−ＳＰＦマウスの微生物叢を接種された野生型マウスの大腸の長さは、野生型の微生物叢を接種されたマウスの大腸の長さよりも顕著に長かった（図１Ｉ）。Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの微生物叢を接種された野生型マウスの大腸におけるＴＮＦおよびｂＩＬ−１２の発現は、ＳＰＦのＣｌｅｃ７ａ−／−マウスで見いだされるものと同様のレベルまで減少していた（図１Ｊおよび図１Ｅ）。微生物叢の大腸炎発症に対する貢献をさらに確認するため、ＳＰＦの野生型マウスまたはＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸管腔の微生物叢を無菌野生型マウスに移植した。Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウス中の大腸微生物叢はまた、大腸炎に対して抵抗性を与えることを見出した（図１Ｋおよび図１Ｌ）。しかし、野生型ＳＰＦマウスの微生物叢は、Ｃｌｅｃ７ａ−／−無菌マウスにおいてでさえ重度の大腸炎を発症させた。このことにより、第二宿主における直接的なデクチン−１シグナル伝達ではなく微生物叢の変化が大腸炎の発症にとって重要であることが示唆される（図１Ｋおよび図１Ｌ）。これらのデータは、デクチン−１の遺伝的変異により腸の微生物構成が変化して大腸炎の発症が抑制されたことを示唆する。【0078】
大腸微生物叢におけるラクトバチルスの割合はＣｌｅｃ７ａ−／−マウスにおいて増大する次に、ＰＰ調製物および糞便調製物由来のＤＮＡの１６Ｓ細菌リボソームＤＮＡ配列の分析により、マウス腸内微生物叢を野生型マウスとＣｌｅｃ７ａ−／−マウスで比較した。共生細菌の主要な門は、約８０％のファーミキューテス門、１０％のバクテロイデス門、２〜３％のプロテオバクテリア、およびその他であって、Ｃｌｅｃ７ａ−／−微生物叢と野生型微生物叢で同様であった（図２Ａ）。しかし、グラム陽性細菌のグラム陰性細菌に対する比率は、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおいて野生型マウスに比べて１．５倍高かった（図２Ｂ）。特に、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便微生物叢およびＰＰ微生物叢の両方において、ファーミキューテス門に属するラクトバチルスの割合が野生型マウスと比べて著しく増加していた（図２Ｃ）。ファーミキューテス門に属するクロストリジウムの頻度は、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスと野生型マウスで同様であった（図２Ｄ）。１６Ｓ細菌ｒＤＮＡの総量は野生型マウスとＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便で同様であったが、ラクトバチルスｒＤＮＡの割合はＣｌｅｃ７ａ−／−マウスで野生型マウスの４〜５倍高かった（図１１Ａ）。さらに、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便微生物叢における主要な株として、ラクトバチルス・ムリヌス（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ１４２２１株を同定し、これは、野生型微生物叢では＜１％であるのに対し、ラクトバチルス・ムリヌスが＞１０％を構成していた（図２Ｅ）。これらの観察から、このラクトバチルス株の割合がデクチン−１シグナル伝達により制御され、この共生細菌がＤＳＳ誘導性大腸炎に対する感受性に影響し得ることが示唆された。
【0079】
共生真菌は、マウスおよびヒトなどの哺乳類の腸で検出され（Iliev et al., 2012; Ott et al., 2008; Scupham et al., 2006）、Ilievらによる最近の研究によりＤＳＳ処理により病原性真菌類が腸壁から浸潤することが可能となり、デクチン−１が「真菌により悪化した」大腸炎から宿主を保護する重要な役割を果たしていることが示された（Iliev et al., 2012）。しかし、発明者らのＳＰＦマウスコロニーでは、糞便または腸粘膜中に生存真菌が全く検出されなかった（１０匹の野生型マウスおよび１０匹のＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便試料または管腔洗浄試料の各々について、０ＣＦＵ／プレート）。このような条件下で、Ilievの報告（Iliev et al., 2012）においてマウス糞便全真菌の＞６５％を構成するカンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、ＮＢＲＣ１４００）のコロニーを、糞便溶解物との共培養の後であっても検出することができた（図１１Ｃ）。ＳＰＦマウスの糞便において真菌ｒＤＮＡの内部転写スペーサー領域（ＩＴＳ１−２）およびカンジダ・トロピカリスｒＤＮＡがｑＰＣＲにより検出された（図１１Ｂ）。しかし、ＩＴＳ１−２およびカンジダ・トロピカリスｒＤＮＡはともに、無菌マウス糞便においてもＳＰＦマウスと同様のレベルで検出されたが（図１１Ｂ）、細菌１６Ｓ ｒＤＮＡおよびラクトバチルスＤＮＡは、無菌マウス糞便において全く検出されなかった（図１１Ａ）。したがって、これらの結果により、生存真菌はＳＰＦマウスの微生物叢を構成しておらず、糞便中で検出されたｒＤＮＡは食品から混入したものである可能性があることが示唆される。同時に、これらの結果により、真菌ではなく細菌がＳＰＦ条件下でのＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの軽度の大腸炎に関与している可能性があることが示される。【0080】
Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおいてＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞およびＲＯＲγｔ＋細胞の集団が増大する大腸炎マウスだけではなく未処理マウスにおいても、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスのｃＬＰにおいてＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞集団が野生型マウスと比較して顕著に増大していることが見出された（図２Ｆ）。さらに、Ｔ−ｂｅｔではなくＲＯＲγｔの大腸における発現が、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスおよびＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの両方で顕著に増加していた（図２Ｇ）。Ｆｏｘｐ３およびＲｏｒｃの発現誘導に重要である（Fontenot et al., 2003; Hori et al., 2003; Ivanov et al., 2006; Mangan et
al., 2006）ＴＧＦ−βの発現もまた、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスおよびＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの両方で顕著に高かった（図２Ｈ）。
【0081】
Ｔｒｅｇ細胞は炎症応答の制御において重要であるので（Atarashi et al., 2011; Friswell et al., 2010; Siddiqui and Powrie, 2008）、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおけるＴｒｅｇ細胞の増大は、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスのＤＳＳ誘導性大腸炎に対する相対的抵抗性を説明する可能性がある。実際、Ｔ細胞を有しないＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスが大腸炎に対して感受性を示すようになり、ＤＳＳ誘導性大腸炎後の生存がＣｌｅｃ７ａ−／−マウスとＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスで同様であることが見出された（図１２Ａ）。Ｒａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの重症度スコアもまた、Ｒａｇ２−／−マウスと同様であった（図１２Ｂ）。しかし、Ｒａｇ２−／−バックグラウンドでは、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおいてもラクトバチルス・ムリヌス（ＮＢＲＣ１４２２１）集団が依然として増大しており（図１２Ｃ）、このラクトバチルスの増大には獲得免疫系が関与していないことが示唆される。【0082】
デクチン−１シグナル伝達、ラクトバチルスの増大、およびＴｒｅｇ細胞の増大の関係を調べるため、ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をラクトバチルス・ムリヌス集団が増大しているＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスに移植した（図１２Ｃ）。５週間後、Ｒａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおいて、Ｒａｇ２−／−マウスよりも効率的にドナー由来のナイーブＴ細胞がＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞に分化したことが見出された（図２Ｉ）。Ｆｏｘｐ３のｍＲＮＡだけではなくＴＧＦ−βのｍＲＮＡもレシピエントＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸において顕著に上方制御されており（図２Ｊ）、Ｃｌｅｃ７ａ−／−条件下でＴｒｅｇ分化が促進されることが示唆される。実験中、大腸炎誘導性の体重減少は観察されなかったが、ナイーブＴ細胞を投与されたＲａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスは、Ｒａｇ２−／−マウスと比較して軽度の大腸短縮および盲腸炎症を示し（図１２Ｄおよび図１２Ｅ）、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおけるＴｒｅｇ細胞の増大と一致している。Ｃｌｅｃ７ａ−／−レシピエントにおいては、ＩＬ−１７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団も顕著に増大していたが、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団が減少していた（図１２Ｆ）。これらの結果により、ラクトバチルス・ムリヌスがＣｌｅｃ７ａ−／−マウスにおいてＴｒｅｇ細胞を誘導する可能性が示唆される。【0083】
ラクトバチルス・ムリヌスは、Ｔｒｅｇ細胞およびＴｈ１７細胞の分化を直接誘導するＣｌｅｃ７ａ−／−マウスにおいて増加したラクトバチルス・ムリヌスが直接Ｔｒｅｇ細胞分化を誘導する可能性を調べるため、無菌マウスにラクトバチルス・ムリヌスを５週間生着させＴ細胞集団を分析した。ｃＬＰ中のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞およびＩＬ−１０＋Ｔｒ１細胞がともにラクトバチルス・ムリヌス生着後に顕著に増加したが（図３Ａ、図３Ｃ）、アルカリゲネス・フェカリス（Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ）を生着後には増加しない（図３Ｂ）ことが見いだされた。興味深いことに、ＩＮＦ−γ産生Ｔｈ１細胞ではなく、ＩＬ−１７産生Ｔｈ１７細胞もまたラクトバチルス・ムリヌスの生着により顕著に増大した（図３Ｄ）。ラクトバチルス・ムリヌスで感作したＴ細胞におけるＩＬ−１０およびＩＬ−１７の産生はまた、ｅｘ ｖｉｖｏで確認された（図３Ｅ）。これらの知見は、デクチン−１シグナル伝達の抑制によりラクトバチルス集団が上方制御されて大腸における制御性Ｔ細胞集団が増加し、その結果、腸炎症が抑制されることを示唆している。
【0084】
ラクトバチルス・ムリヌスは、大腸ＤＣおよびＭΦ（マクロファージ）におけるＴＧＦ−β産生を上方制御することによりＦｏｘｐ３およびＲｏｒｃの発現を誘導する腸骨髄細胞で産生されるＴＧＦ−βは、ナイーブＴ細胞におけるＦｏｘｐ３発現の誘導によるＴｒｅｇ細胞分化において重要な役割を果たしている（Siddiqui and Powrie, 2008; Worthington et al., 2011）。最近の研究により、腸に常在するＤＣまたはＭΦ（マクロファージ）の病原性微生物に対する応答は、骨髄由来ＤＣ、脾臓ＤＣ、または脾臓ＭΦ（マクロファージ）の応答とは異なることが示されている（Franchi et al., 2012; Ueda et al., 2010）。ラクトバチルス・ムリヌスが大腸においてＴＧＦ−βを誘導する可能性について調べるため、ｃＬＰまたは脾臓からＤＣ＋ＭΦ（マクロファージ）を精製し、これらを典型的なマウス腸内共生微生物叢であるラクトバチルス・ムリヌス、アルカリゲネス・フェカリス、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２と１２時間共培養した。大腸抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるＴｇｆｂおよびＩｌ１０のｍＲＮＡ発現がラクトバチルス・ムリヌスの刺激により著しく上方制御されていたが、アルカリゲネス・フェカリスまたは大腸菌の刺激では上方制御されなかった（図４Ａ）。これら３種の共生細菌はいずれも大腸ＡＰＣにおけるＴｈｆ、Ｉｌ６、またはＩｌ１ｂの発現を上方制御せず（図４Ａ）、これらの炎症性サイトカインが著しく誘導された脾臓ＡＰＣとは明らかに対照的である（図１３）。全ｃＬＰ細胞をこれらの共生細菌と共培養すると、アルカリゲネス・フェカリスまたは大腸菌ではなくラクトバチルス・ムリヌスがＦｏｘｐ３およびＲｏｒｃの発現を誘導したが、Ｔｂｘ２１の発現は誘導せず（図４Ｂ）、ｉｎ ｖｉｖｏでのラクトバチルス・ムリヌス生着後にＴｒｅｇ細胞およびＴｈ１７細胞が増大したがＴｈ１細胞は増大しなかったことと一致している（図３）。これらの観察により、共生ラクトバチルス・ムリヌスがｃＬＰのＡＰＣにおいてＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０を特異的に誘導し、続いてＴｒｅｇ細胞およびＴｈ１７細胞の分化が促進されることが示唆される。
【0085】
デクチン−１シグナル伝達は抗菌ペプチドを直接誘導する抗菌ペプチド（ＡＭＰ）は腸上皮細胞、パネート細胞、および自然免疫細胞から分泌される低分子量タンパク質であり、細菌およびその他の微生物に対して幅広い抗菌活性を有する（Gallo and Hooper, 2012）。Ｓ１００Ａファミリーのメンバー、特にＳ１００Ａ８−Ｓ１００Ａ９ヘテロダイマーは、ブドウ球菌の抑制に効果的であり（Corbin et al., 2008）、Ｒｅｇ３γまたはＲｅｇ３βなどのＲｅｇ３ファミリーメンバーおよびホスホリパーゼはグラム陽性菌を特異的に死滅させる（Cash et al., 2006; Lehotzky et al., 2010; Qu and Lehrer, 1998）。Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸におけるＳ１００ａ８の発現が野生型と比べて特異的に低いことが見出された（図５Ａ）。しかし、Ｒａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸では、Ｓ１００ａ８の発現に加えて、Ｒｅｇ３ｂ、Ｒｅｇ３ｇ、およびＰｌａ２ｇ２ａ（ホスホリパーゼＡ２をコード）などのその他のＡＭＰの発現レベルがＲａｇ２−／−マウスの大腸と比べて顕著に低下していた（図１４Ａおよび図１４Ｃ）。Ｒａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウス大腸由来の精製上皮細胞におけるＲｅｇ３ｂおよびＲｅｇ３ｇの発現もまた、顕著に低下していた（図１４Ｂ）。
【0086】
次に、これらのＡＭＰがデクチン−１シグナル伝達の下流で直接誘導されるか否かについて調べた。ＴＬＲリガンド除去ザイモサンで刺激した後、デクチン−１のリガンドであるＳ１００ａ８の発現がＲａｇ２−／−マウスの大腸において顕著に誘導されたが、Ｒａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸では誘導されず、Ｓ１００ａ８がデクチン−１シグナル伝達により直接誘導されることが示唆される（図５Ｃ）。【0087】
次にＡＭＰが、腸内細菌叢の変化を説明する、細菌種特異的な効果を示すか否かを調べた。ラクトバチルス・ムリヌスおよびアルカリゲネス・フェカリスを組み換えＳ１００Ａ８＋Ｓ１００Ａ９ペプチドと９時間共培養すると、ラクトバチルス・ムリヌスの増殖のみが抑制されアルカリゲネス・フェカリスの増殖は抑制されなかった（図５Ｂ）。これらのデータにより、デクチン−１シグナル伝達の下流標的候補として、少なくともＳ１００ＡファミリーＡＭＰが大腸におけるラクトバチルス増殖を制限可能であることが示される。【0088】
デクチン−１アンタゴニストであるラミナリンは、ＤＳＳ誘導性大腸炎の発症を抑制することができるシグナルを伝達することなくデクチン−１に競合的に結合する短鎖βグルカンであるラミナリン（Huang et al., 2012; Maneu et al., 2011）のＤＳＳ誘導性大腸炎の発症に対する効果を評価した。最初に、ラミナリンが炎症性サイトカインの誘導においてＴＬＲリガンド除去ザイモサン活性化デクチン−１シグナル伝達を阻害可能であることを確認した（図６Ａ）。全ラミナリン混合物を異なった分子量（ＭＷ）のグルカンに分画することにより、分子量が約１０００〜１０，０００であるラミナリンがデクチン−１を介したサイトカイン産生を阻害する特に高い活性を有することを同定した（図１５Ｂ）。ＤＳＳ処理の３日前からラミナリンを継続的に投与すると、体重減少が防止されコントロール群と比較して大腸炎の重症度が軽減された（図６Ｂ〜図６Ｄ）。ＬＰにおける好中球および炎症性ＣＤ１０３−ＤＣの浸潤ならびにＴＮＦ産生もまた、ラミナリン処理マウスで顕著に抑制された（図６Ｅおよび図６Ｆ）。ｃＬＰ細胞によるＩＬ−１０産生は顕著に増大し（図６Ｆ）、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ集団がラミナリン投与後に大幅に増大した（図６Ｇおよび図６Ｈ）。ラミナリン投与９日後、糞便中のラクトバチルス・ムリヌスの割合はコントロール群と比較して顕著に増加し（図６Ｉ）、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおけるラクトバチルス・ムリヌス集団の増大と一致していた（図２Ｃ、図２Ｅ、図１１Ａ、図１２Ｃ）。無菌マウスにラクトバチルス・ムリヌスを生着させたマウスは、アルカリゲネス・フェカリス生着マウスと比較して顕著に軽度の大腸炎を示し（図１６Ａおよび図１６Ｂ）、熱殺菌ラクトバチルス・ムリヌスでマウスを経口的に前処理してもＤＳＳ誘導性大腸炎の症状を抑制することが可能であった（図１６Ｃおよび図１６Ｄ）。したがって、これらの知見は、デクチン−１シグナル伝達の阻害により、腸内のラクトバチルス・ムリヌスの割合の増加を介したＴｒｅｇ集団の増大によって大腸炎の発症を阻害可能であることを示している。
【0089】
ヒト糞便においてラクトバチルス近縁種が検出されるヒト糞便におけるラクトバチルス・ムリヌス（ＮＢＲＣ１４２２１）または近縁種の存在を調べた。１６Ｓ ｒＤＮＡの核酸配列を比較することにより、キムチの生産に使用される最も普及しているラクトバチルスの一種である（Nam et al., 2011）ラクトバチルス・アニマリス（Ｌ．ａｎｉｍａｌｉｓ、ＫＣＴＣ３５０１株、ＮＢＲＣ１５８８２）が、ラクトバチルス・ムリヌスと９９．７％の相同性を有することを見出した。さらに、ＴＧＦ−β産生またはＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞分化を誘導する（Castellazzi et al., 2007; O'Mahony et al., 2006）ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、ＮＢＲＣ１０２１６０）が、ラクトバチルス・ムリヌスと９４．２％の相同性を有することを見出した。各株に特異的なプライマーを使用することで、ヒト糞便中にはラクトバチルス・ムリヌス集団はほとんど存在しないが（図７Ａ、全ラクトバチルス中、約０．００００１％）、近縁種（９４．２％のｒＤＮＡ相同性）であるラクトバチルス・サリバリウスがマウスおよびヒト両方の糞便中で検出可能であった（図７Ｂ）。興味深いことに、ラクトバチルス・アニマリスではなくラクトバチルス・ムリヌスのみがＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０の発現を１００倍超上方制御し、Ｆｏｘｐ３の発現を８倍上方制御することが見出された（図７Ｃ）。ラクトバチルス・サリバリウスもまたＴｇｆｂおよびＩｌ１０を１０倍超誘導した（図７Ｃ）。ラクトバチルス・ムリヌスおよびラクトバチルス・アニマリスはＲｏｒｃの発現を誘導したが、ラクトバチルス・サリバリウスは誘導しなかった（図７Ｃ）。Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスの糞便中で過剰発現しているラクトバチルス・ジョンソニーおよびラクトバチルス・ロイテリ（図２Ｅ）では、これらの遺伝子の発現は変化しなかった（図７Ｃ）。
【0090】
考察今回の報告では、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスがＤＳＳ誘導性大腸炎に対して抵抗性を有することを示した。これはＴｒｅｇ細胞集団がＣｌｅｃ７ａ−／−マウスのｃＬＰにおいて増大していることが原因である。Ｔｒｅｇ細胞集団の増大は腸内微生物叢中のラクトバチルス・ムリヌスにより誘導され、Ｃｌｅｃ７ａシグナル伝達の欠損により、Ｓ１００ＡなどのＡＭＰの発現の下方制御によって腸でのラクトバチルス・ムリヌスの増殖が可能になる。さらに、ラミナリンでデクチン−１シグナル伝達を阻害することにより、腸におけるラクトバチルス・ムリヌスが同様に増殖し、Ｔｒｅｇ細胞の増大を介してＤＳＳ誘導性大腸炎の発症抑制が可能であることが示された。
【0091】
β−１，６結合側鎖を有する重合β−１，３結合β−Ｄ−グルコピラノシドは、デクチン−１のリガンドであり、真菌、酵母、細菌、海藻、およびキノコなどの種々の生物で発現している。これらのβグルカン発現生物は、多くの場合種々の食品に含有されており、これらの生物はまた腸内共生微生物叢にも存在している（Ott et al., 2008; Scupham etal., 2006）。デクチン−１の欠損はＤＳＳ誘導性大腸炎に対する感受性にこのような劇的な効果をもたらすため、最初にデクチン−１のリガンドが食品に由来するかまたは腸内微生物叢に由来するかについて調べた。βグルカンを含まない飼料を与えたＣｌｅｃ７ａ−／−マウスが依然としてＤＳＳ誘導性大腸炎に対して抵抗性を示し、Ｃｌｅｃ７ａ欠損の効果が無菌マウスで観察されなかったことから、大腸炎の重症度への共生微生物叢の関与が示唆された。この考えと一致して、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウス糞便に含まれる細菌叢の移植により野生型無菌マウスに抵抗性を与えることができることが見出された。最近の研究により哺乳類の腸における共生真菌の存在が示唆されているが（Iliev et al., 2012; Ott et al., 2008; Scupham et al., 2006）、マウス腸内共生真菌の主要な構成要素であるカンジダ・トロピカリスを含む生存真菌を実験マウスの糞便において全く検出することができなかった（１個の糞塊あたり１ＣＦＵ以下）。代わりに、マウス糞便においてある種の真菌ｒＤＮＡを検出した。これらは無菌マウスでも検出されているため（図１１Ｂ）、恐らくこれらは食品（Iliev et al., 2012）またはケージ床敷に由来する。したがって、最近の報告（Iliev et al., 2012）で示唆されているような病原性真菌のＤＳＳ誘導性大腸炎悪化への関与は、今回の場合は考えられない。ヒトおよびその他の哺乳類における共生細菌であるアルカリゲネス・フェカリスのある株が、ある種の培養条件においてβ−１，３−グルカンであるカードランを分泌可能であり（Matsushita, 1990; Phillips and Lawford, 1983）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）などの極めて少数の共生細菌が不溶性のグルカン合成酵素を分泌して（Abo et al., 1991）胃腸管系においてグルカンを合成し得ることが報告されている。しかしながら、これまで腸内でデクチン−１の活性化に関与している共生微生物叢はまだ完全には明らかになっていない。
【0092】
ラクトバチルス・ムリヌス（ＮＢＲＣ１４２２１）の割合はＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸において顕著に増加しており、野生型マウスにおける１％以下と比べるとＣｌｅｃ７ａ−／−マウスにおいては共生微生物叢の１０％以上であった。カルプロテクチンＳ１００Ａ８、Ｃ型レクチンであるＲＥＧ３γおよびＲＥＧ３β、ならびにホスホリパーゼＡ２などのいくつかの抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の発現がＣｌｅｃ７ａ−／−マウスにおいて著しく抑制されていることが見出された。このことは、これらのタンパク質の発現はデクチン−１シグナル伝達により制御されていることを示唆する。実際、Ｓ１００ａ８の発現はデクチン−１刺激により直接誘導された（図５Ｃ）。興味深いことに、これらの異なる抗菌ペプチドは異る腸細胞から産生されて異なる抗菌活性を有しているが、これらはともにグラム陽性菌を標的として抑制する（Cash et al., 2006; Corbin et al., 2008; Lehotzky et al., 2010; Qu and Lehrer, 1998）。これと一致して、微生物叢の主要集団をラクトバチルスが形成しているＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの大腸において、グラム陽性共生細菌の増大が観察された。特に、グラム陰性菌であるアルカリゲネス・フェカリスの阻害剤候補としてではなく、ラクトバチルス・ムリヌス増殖の阻害剤候補としてＳ１００Ａ８−９を同定した。したがって、これらの観察により、生理的条件下では、共生微生物叢を介したデクチン−１シグナル伝達により誘導されるＡＭＰによって、ラクトバチルスの増殖が抑制されることが示唆される。【0093】
ラクトバチルス・ムリヌス集団の増大と関連して、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスのｃＬＰにおけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞集団が増大することが見出された。さらに、アルカリゲネス・フェカリスではなくラクトバチルス・ムリヌスの生着により、無菌マウスにおいてＴｒｅｇ集団およびＴｒｌ集団を増加させることが可能であることが示された。これは、アルカリゲネス・フェカリスではなくラクトバチルス・ムリヌスがｃＬＰ常在ＤＣおよびＭΦ（マクロファージ）を直接的に刺激してＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０を産生したためである。ＴＧＦ−βはＴｒｅｇ細胞に特徴的な転写因子であるＦｏｘｐ３を誘導し（Fontenot et al., 2003; Hori et al., 2003; Ivanov et al., 2006; Khattri et al., 2003; Mangan et al., 2006; Veldhoen et al., 2006）、ＩＬ−１０もまた制御性Ｔ細胞の分化を誘導するので、ラクトバチルス・ムリヌスによるＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０の上方制御はＣｌｅｃ７ａ−／−マウスにおけるＴｒｅｇ細胞およびＴｒｌ細胞の発生に重要であるはずである。これらの制御性Ｔ細胞はＤＳＳ誘導性大腸炎の抑制に重要な役割を果たしている可能性がある（Ahern et al., 2010; Atarashi et al., 2011; Yang et al., 2008）。この考えの裏付けとして、いたラクトバチルス・ムリヌス生着マウスはＴｒｅｇ細胞およびＴｒｌ細胞が増大しておりＤＳＳ誘導性大腸炎に対して抵抗性を示したが、アルカリゲネス・フェカリス生着マウスは制御性Ｔ細胞が増大しておらず感受性を示した（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。さらに、Ｒａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスにおいてＴｈ１７集団もまた増大していたことが示され（図１２Ｆ）、ＲＯＲγｔ発現も誘導するＴＧＦ−βの上方制御と一致していた（図２Ｇ〜図２Ｊ、および図４Ｂ）。Ｔｈ１７細胞は、恐らく損傷腸細胞壁の修復において重要であるＩＬ−２２の産生および病原性Ｔｈ１細胞の分化抑制（O'Connor et al., 2009）によって大腸炎の発症において保護的な役割を果たしているため（Ogawa et al., 2004; Yang et al., 2008）、Ｔｈ１７集団のこのような増加はまたＣｌｅｃ７ａ−／−マウスのＤＳＳ誘導性大腸炎に対する抵抗性に貢献している可能性がある。この考えの裏付けとして、いくつかの研究により、あるラクトバチルス種がＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の分化と関連しており、皮膚炎および喘息の発症を抑制することが明らかにされている（Jang et al., 2012; Shah et al., 2012）。【0094】
ＭΦ（マクロファージ）をラミナリンで前処理すると、ＴＬＲリガンド除去ザイモサンにより誘導されるサイトカイン産生が阻害されることが示された（図６Ａ）。このことは、ラミナリンがデクチン−１を介したβグルカンの結合および貪食を特異的に阻害可能であるという以前の報告と一致している（Huang et al., 2012; Maneu et al., 2011）。ラミナリンを予め投与することにより、炎症性サイトカイン産生の減少を伴ってＤＳＳ誘導性大腸炎の発症が抑制される。ラミナリン前処理後に腸内微生物叢におけるラクトバチルス・ムリヌスの割合が著しく増加し、ｃＬＰにおけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞集団が大幅に増大する。ＤＳＳ誘導性大腸炎に対する感受性ならびに大腸微生物叢および大腸免疫細胞集団において観察された変化は、Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスで見いだされたものと酷似していた。したがって、これらの観察により、デクチン−１シグナル伝達はラクトバチルス集団の制御を介して大腸におけるＴｒｅｇ細胞分化を制御し、デクチン−１シグナル伝達の抑制によってＴｒｅｇ細胞の増大を介して大腸の炎症緩和が可能であることが示唆される。さらに、ラクトバチルス・ムリヌスに近縁のラクトバチルス種であるラクトバチルス・サリバリウが、ヒトの糞便中から検出され、大腸免疫細胞においてＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０の両方の発現を誘導可能であることが示された。これらすべての知見は、ヒトの腸炎症性疾患を予防または治療するための新しい戦略を開発する手がかりを提供するはずである。【0095】
実験手順すべての実験手順は、拡張実験手順に詳細に記載される。
【0096】
マウスＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの予備的特性評価はすでに述べた（Saijo et al., 2007）。マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに９世代戻し交配した後に実験に用いた。年齢および性別を一致させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア株式会社、川崎）を同じマウス室で３〜４週間飼育した後にコントロールとして使用した。Ｒａｇ２−／−Ｃｌｅｃ７ａ−／−マウスを作製するため、ＢＡＬＢ／ｃＡマウスに１０世代戻し交配したＣｌｅｃ７ａ−／−マウスを、ＢＡＬＢ／ｃＡバックグラウンドのＲａｇ２−／−マウス（京都大学 眞貝洋一博士より提供）と交配した。すべてのマウスは、東京大学医科学研究所システム疾患モデル研究センターおよび東京理科大学生命科学研究所において、特定病原体未感染条件下で環境制御された無菌室で維持した。実験は施設の動物実験倫理指針および遺伝子操作実験安全指針に従って実施し、施設の委員会により承認された。
【0097】
糞便微生物叢ＤＮＡの単離およびｒＤＮＡの定量マウスから糞便を回収し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）を用いて取扱説明書に従って糞便微生物叢の全ＤＮＡを単離した。糞便中の細菌ｒＤＮＡおよび真菌ｒＤＮＡの定量には、２０ｎｇの全糞便ＤＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析のテンプレートとして用いた。表１に示す細菌または真菌に対するプライマーを使用した。相対量はΔＣｔ法により計算し、全ＤＮＡ量またはマウスβ−アクチン量で標準化した。
【0098】
統計解析生存率の差はログランク検定（マンテル・コックス検定）で評価した。疾患活性指数および組織学的スコアは、マンホイットニーのＵ検定を用いて統計的に解析した。パラメトリックデータの差は、スチューデントｔ検定により評価した。ｐ＜０．０５の差を統計的に有意であるとみなした。
【0099】
補足データ補足データには、拡張実験手順、８つの図、１つの表、および１つの参考文献が含まれ、本論文とともにオンラインで検索可能である。
【0100】
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【実施例】
【0101】
拡張実験手順ＤＳＳ誘導性大腸炎
ＤＳＳによる急性大腸炎の誘導のため、２％または４％（重量／体積）のＤＳＳ（分子量３６〜５０ｋＤａ、ＭＰバイオメディカルズ、フランス、イルキルシュ）をマウスに飲料水投与した。大腸炎の程度を評価するために、体重、糞便の硬さ、および血便をCooperらの方法（Cooper et al., 1993）の改変法を用いて毎日モニターした。下痢は以下のようにスコア化した。０：正常、２：軟便、４：水様下痢。血便は以下のようにスコア化した。０：正常、２：わずかな出血、４：肉眼的な出血。体重減少は以下のようにスコア化した。０：なし。１：１〜５％、２：５〜１０％、３：１０〜１５％、４：＞１５％。疾患活性指数はこれらのスコアの平均、すなわち、（体重減少、糞便の硬さ、および出血を合わせたスコア）／３である。マウスは、１１日目または１２日目に屠殺した。盲腸および大腸を取り出し、細胞培養、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）、および組織学的検査のために切片を調製した。
【0102】
微生物ラクトバチルス・ムリヌス（ＮＢＲＣ１４２２１）、ラクトバチルス・アニマリス（ＮＢＲＣ１５８８２）、ラクトバチルス・サリバリウス（ＮＢＲＣ１０２１６０）、ラクトバチルス・ジョンソニー（ＮＢＲＣ１３９５２）、ラクトバチルス・ロイテリ（ＮＢＲＣ１５８９２）、アルカリゲネス・フェカリス（ＮＢＲＣ１３１１１）、大腸菌（ＮＢＲＣ１０２２０３）、およびカンジダ・トロピカリス（ＮＢＲＣ１４００）は、製品評価技術基盤機構生物遺伝資源センター（日本、２９２−０８１８、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）から直接入手した。括弧内のＮＲＢＣ番号は、寄託番号を表す。ラクトバチルスは、嫌気性条件下、ラクトバチルスＭＲＳ培地で培養し、ＭＲＣ寒天上でコロニーを形成させた。アルカリゲネスおよび大腸菌は、好気性条件下、液体または固形のＬＢ基本培地で培養した。カンジダ・トロピカリスまたはカンジダ・トロピカリス＋糞便溶解物混合物は、好気性条件下、クロムアガー（登録商標）カンジダプレートまたはサブローデキストロース培地で培養した。すべての微生物は３７℃で培養した。すべての培養液はＢＤ社（米国、メリーランド州）から購入した。
【0103】
細胞の調製ＣＬＰ細胞は前述の方法をわずかに改変して用いて単離した（Arstila et al., 2000）。すなわち、腸片を２ｍｍ片に切り分けた後、３ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水中で各１５分間、３７℃で２回撹拌し、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＲＰＭＩ（シグマケミカル社、米国、ミズーリ州、セントルイス）中で各２０分間、２回撹拌した。その後、腸片を回収し、２０％ＦＢＳ、２００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｃ２１３９、シグマアルドリッチ社）、および５Ｕ／ｍｌ ＤＮａｓｅ１（シグマアルドリッチ社）を含むＲＰＭＩ中、３７℃で１２０分撹拌した。培養後、試料を１分間ボルテックスし、滅菌ガーゼ濾過後に単一細胞懸濁液を回収した。いくつかの実験では、４５％／６６．６％不連続パーコール（ファルマシア社、スウェーデン、ウプサラ）勾配上、２２００ｒｐｍ、２０分間で、ＬＰ細胞をＬＰリンパ球にさらに精製した。
【0104】
フローサイトメトリー抗ＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１）、抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５）、および抗ＩＬ−１７Ａ抗体（ＴＣ１１−１８Ｈ１０）は、ＢＤバイオサイエンス社（米国、フランクリンレイクス）から入手し、抗ＩＦＮ−γ抗体（ＸＭＧ１．２）、抗ＩＬ−１０抗体（ＪＥＳ５−１６Ｅ３）、抗Ｆｏｘｐ３抗体（１５０Ｄ／Ｅ４）、抗Ｇｒ−１抗体（ＲＢ６−８Ｃ５）、抗ＣＤ１１ｂ抗体（Ｍ１／７０）、抗ＣＤ１１ｃ抗体（Ｎ４１８）、抗ＣＤ１０３抗体（２Ｅ７）、抗Ｆ４／８０抗体（ＢＭ８）、抗ＣＤ２５抗体（ＰＣ６１．５）、および抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２）は、ｅバイオサイエンス社（米国、サンディエゴ）から入手した。２．４Ｇ２（抗ＦＣγＲＩＩ／ＩＩＩ特異的マウス抗体、ラットＩｇＧ１、産生ハイブリドーマ）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（バージニア州、マナッサス）から入手した。すべての抗体は、１：１００希釈で使用した。ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）、およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤバイオサイエンス社）またはＦｌｏｗＪｏ ＦＡＣＳソフトウエアを解析に用い、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）を細胞選別に用いた。
【0105】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養およびサイトカイン濃度測定ＣＬＰ細胞（２×１０５）を抗ＣＤ３（１７Ａ２）抗体（バイオレジェンド社、米国、サンディエゴ）を加えずに、または該抗体とともに、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２で、９６ウエル平底プレート（ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社、英国、オックスフォード）中、０．２ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ中で培養した。４８時間培養後、培養上清を回収し、サイトカイン濃度をマウスＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ４０（ＯｐｔｉＥＩＡキット、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、米国、フランクリンレイクス）、ならびにＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄシステムズ社、米国、ミネアポリス）に対する酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）発色キットで測定した。
【0106】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ全ＲＮＡは、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社、米国、セントルイス）を用いて取扱説明書に従って抽出した。ＲＮＡをオリゴｄＴプライマーの存在下で変性した後、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社、米国、サンフランシスコ）で逆転写した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｋｉｔ（米国、カールスバッド）およびｉＣｙｃｌｅｒ
ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド社、米国、ハーキュリーズ）で、表１に記載のプライマーセットを用いて行い、サイトカインをコードする各ｍＲＮＡの発現をｇａｐｄｈ発現レベルで標準化した。
【0107】
１６Ｓ ｒＤＮＡ解析１６Ｓ ｒＤＮＡは、抽出ＤＮＡから細菌ユニバーサルＰＣＲプライマーであるＢａｃｔ−２７Ｆ（５’−ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）およびＢａｃｔ−１４９２Ｒ（５’−ＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を用いて増幅した。以下の反応条件を用いた。全量５０μｌ中に、２．５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社、日本、大津）、２．５μｌのｄＮＴＰ（２５ ｍＭ、タカラバイオ株式会社）、０．５μｌのプライマー（各１０ｐｍｏｌ／μｌ）、０．１μｌのＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ、タカラバイオ株式会社）、０．５μｌのテンプレートＤＮＡ、および１８．４μｌのＤＮａｓｅフリー水。ＰＣＲは、Ｔ１ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（バイオメトラ社）を用いて行った。以下のサイクルパラメーターを用いた。９６℃で３０秒間の初期変性後、２０サイクルの変性（９６℃で３０秒間）、アニーリング（５６℃で２０秒間）、および伸長（６８℃で９０秒間）、ならびに７２℃で１０分間の最終伸長。全１０試料からの増幅産物は、１μｌのＰＣＲ反応混合液を用いたゲル電気泳動により１．０％アガロースゲルで確認した。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−４−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングし、シークエンス用ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（インビトロジェン）を用いてＤＨ１２Ｓコンピテント大腸菌を形質転換した。各細菌ＰＣＲ産物から９６コロニーをランダムに単離した。配列決定テンプレートはプライマーとしてＭ１３Ｆ（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）およびＭ１３Ｒ（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）を用いてコロニーＰＣＲにより調製した。その後、ＰＣＲ産物をエクソヌクレアーゼＩおよびエビアルカリフォスファターゼ（ＧＥヘルスケア社）で処理した。挿入断片の１６Ｓ配列は、サイクルシークエンス法により、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社）、ならびに３．２ｐｍｏｌのＴシークエンスプライマー７（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）、Ｔ３シークエンスプライマー（５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’）、およびＢａｃｔ−３５７Ｆシークエンスプライマー（５’−ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’）を用いて決定した。ＤＮＡをエタノール沈殿により洗浄し、自動ＡＢＩ３７３０キャピラリーシクエンサー（アプライドバイオシステムズ社）で泳動した。各クローンのデータは、Ｐｈｒｅｄ−Ｐｈｒａｐプログラムでアセンブルした。Ｐｈｒａｐでアセンブルした配列は、Ｃｌｕｓｔａｌｗ解析でアライメントし、マルチプルアライメント配列を全配列の距離行列に対して計算した。ＤＯＴＵＲを用いて操作上の分類単位（ＯＴＵ）計算を行い、全典型的ＯＴＵ配列をＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴのリボソームデータベースプロジェクトＩＩ（ＲＤＰ）データベースの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列とアライメントした。
【0108】
抗菌ペプチドの殺菌アッセイラクトバチルス・ムリヌスまたはアルカリゲネス・フェカリスは、組み換えＳ１００Ａ８＋Ｓ１００Ａ９（１：１混合物、各ペプチド５ｍｇ／ｍｌ）の存在下、嫌気性環境下、３７℃で９時間培養し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００ｃ分光計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、日本、横浜）で細菌増殖を測定した。
【0109】
養子移植脾臓またはリンパ節からの細胞をビオチン結合抗ＣＤ−２５、抗ＣＤ８α、抗Ｂ２２０、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＤＸ５、γδＴＣＲ、および抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩマウス抗体で標識し、続いて抗ビオチンマイクロビーズで標識した。ａｕｔｏＭＡＣＳを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を陰性精製した後、ＦＩＴＣ 抗ＣＤ２５マウス抗体、ＰＥ 抗ＣＤ４５ＲＢマウス抗体、およびＡＰＣ 抗ＣＤ４マウス抗体で染色した。ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋ナイーブＴ細胞をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）で選別し、レシピエントマウスにマウス１匹当たり４×１０５個の細胞で静脈内（ｉ．ｖ．）養子移植を行った。
【0110】
微生物叢の移植ＰＰは、ＳＰＦ条件の野生型マウスまたはＣｌｅｃ７ａ−／−マウスの小腸から単離した。７０％エタノールで２分間処理後、５個のＰＰをＰＢＳで２回洗浄し、スライドグラスを用いてＰＢＳ中で破砕し、レシピエント無菌マウスの胃腸管に移植した。３日後、１％ＤＳＳを飲料水投与した。大腸管腔由来の微生物叢の場合、ＳＰＦ条件マウスの糞便５粒をＰＢＳ中で滅菌ガラス棒を用いて粉砕し、２分間激しくボルテックスして１００ｍｍメッシュのナイロンフィルターで濾過した。次に回収した上清を４℃で、５０００×ｇ、１０分間遠心分離し、沈査をさらにＰＢＳで２回洗浄した。単一の細菌細胞懸濁液を無菌マウスに移植し、３日後に２％ＤＳＳを飲料水投与した。
【0111】
ラミナリン巨大分子の透析ラミナリン混合物（東京化成工業株式会社、日本、東京）を蒸留水（１００ｍｇ／ｍｌ）中に溶解し、各透析膜（分子量カットオフ：１０００、３５００、１００００、５００００、スペクトラムラボラトリーズ社）で、４℃、２日間、蒸留水に対して透析した。透析後、異なった分子量を有する透析された内部液を回収して凍結乾燥した。
【0112】
特別な試薬チオグリコール酸培地は日水製薬株式会社（日本、東京）から購入した。アラメ由来のラミナリンは東京化成工業株式会社（日本、東京）から購入した。カードラン（β−１，３−グルカン）は和光純薬工業株式会社（日本、大阪）から購入した。ＴＬＲリガンド除去ザイモサン（Ｄ−ザイモサン、熱アルカリ処理済み出芽酵母細胞壁）はインビトロジェン社（米国、カリフォルニア、サンディエゴ）から入手した。
【0113】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲプライマー以下のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲプライマーを用いた。
【0114】
【表1】
【0115】
【表2】
【0116】
ラクトバチルス・ムリヌスの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAAACTTCTTTATCACCGAGTGCTTGCACTCACCGATAAAGAGTTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCCAAAAGAGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAACCATAGTTACCGCATGGTAACTATGTAAAAGGTGGCTATGCTACCGCTTTTGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGGGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACCCTGTTGTTAGAGAAGAAAGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGTTTCGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAACGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGTAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGTTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCAATAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGACAATCCTAGAGATAGGACTTTCCCTTCGGGGACAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGACCGCGAGGTTTAGCAAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAG
【0117】
ラクトバチルス・サリバリウスの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAAACTTTCTTACACCGAATGCTTGCATTCANCGTAAGAAGTTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTAAAAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATATCTCTAAGGATCGCATGATCCTTAGATGAAAGATGGTTCTGCTATCGCTTTTAGATGGACCCGCGGCGTATTAACTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGTGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACACGAGTGAGAGTAACTGTTCATTCGATGACGGTATCTAACCAGCAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAACGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGTAGTGCATTGGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGTTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACCTAAGAGATTAGGCTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTGTCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAG
【0118】
２０１３年３月８日に出願された米国仮特許出願６１／７７５，３０９号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。本発明の例示的実施形態についての以上の記載は例示および説明の目的でされたものであり、網羅的であることあるいは発明を開示されている形態そのものに限定することを意図するものではない。明らかなことではあるが、多くの改変あるいは変更が当業者には自明である。上記実施形態は発明の原理及び実用的応用を最もうまく説明し、想定される特定の用途に適するような種々の実施形態や種々の改変と共に他の当業者が発明を理解できるようにするために選択され、記載された。本発明の範囲は以下の請求項およびその均等物によって規定されることが意図されている。【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図1J】
【図1K】
【図1L】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図8H】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]