特許 6383650 荷電粒子線装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6383650

(24)【登録日】2018年8月10日

(45)【発行日】2018年8月29日

(54)【発明の名称】荷電粒子線装置

(51)【国際特許分類】

   H01J 37/20 20060101AFI20180820BHJP

   H01J 37/28 20060101ALI20180820BHJP

   H01J 37/26 20060101ALI20180820BHJP

   H01J 37/244 20060101ALI20180820BHJP

   H01J 37/22 20060101ALI20180820BHJP

   G01N 23/04 20180101ALI20180820BHJP

【ＦＩ】

   H01J37/20 A

   H01J37/28 C

   H01J37/26

   H01J37/244

   H01J37/22 501A

   G01N23/04 310

【請求項の数】13

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2014-240748(P2014-240748)

(22)【出願日】2014年11月28日

(65)【公開番号】特開2016-103387(P2016-103387A)

(43)【公開日】2016年6月2日

【審査請求日】2017年3月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】501387839

【氏名又は名称】株式会社日立ハイテクノロジーズ

(74)【代理人】

【識別番号】110000350

【氏名又は名称】ポレール特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】奥村 大河

(72)【発明者】

【氏名】大嶋 卓

(72)【発明者】

【氏名】大南 祐介

(72)【発明者】

【氏名】庄子 美南

(72)【発明者】

【氏名】久田 明子

(72)【発明者】

【氏名】米山 明男

【審査官】 右▲高▼ 孝幸

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１０−２８３９７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６１−２６３０３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−０７２１１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−１３４９７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０７３４２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平８−７８１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−３６１７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｈ０１Ｊ ３７／００−３７／０２

３７／０５

３７／０９−３７／１８

３７／２１

３７／２４−３７／２４４

３７／２５２−３７／２９５

３７／２０

Ａ６１Ｆ ７／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料台に保持された試料に一次荷電粒子線を照射する荷電粒子光学鏡筒と、
前記試料台表面と前記一次荷電粒子線の光軸とのなす角を垂直でない角度に傾斜させた状態で当該試料台を回転することが可能な試料台回転部と、
前記試料台回転部の回転角度を制御する制御部と、
前記試料台回転部を複数の異なる角度であって前記傾斜させた方向とは異なる方向に回転させた状態で前記一次荷電粒子線を前記試料に照射することによって取得した、各角度に対応する前記試料の透過荷電粒子画像を断層撮影法にて表示する表示部と、
前記表示部に表示された前記試料の透過荷電粒子画像の一部を選択させることで、前記画像の回転図または断面図を表示する選択入力部と、を有し、
前記試料台は、前記試料の内部を散乱または透過してきた荷電粒子を検出する検出素子を含んで構成される、
ことを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項2】

請求項１に記載の荷電粒子線装置において、
前記制御部は、前記傾斜させた方向とは異なる方向として、前記試料台の面に垂直な軸に対して回転させることを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項3】

請求項１に記載の荷電粒子線装置において、
前記制御部は、前記傾斜させた方向とは異なる方向として、前記試料に対する前記光軸方向の投影面が回転する方向に回転させることを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項4】

請求項１乃至３のいずれか１項に記載の荷電粒子線装置において、
前記試料台を着脱可能に配置する試料ステージを有し、
前記試料ステージは複数の異なる角度に前記試料台を傾斜させることが可能である試料台傾斜部を有することを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項5】

請求項１乃至３のいずれか１項に記載の荷電粒子線装置において、
前記一次荷電粒子線を当該一次荷電粒子線の光軸に対して傾斜させて前記試料に入射する光学レンズを備えることを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項6】

請求項５に記載の荷電粒子線装置において、
前記検出素子は前記試料の内部を透過または散乱してきた荷電粒子によって発光する発光部材であり、
前記発光部材は特定のまたは全ての波長領域の可視光もしくは紫外光もしくは赤外光が通過可能であることを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項7】

請求項１乃至３のいずれか１項に記載の荷電粒子線装置において、
前記一次荷電粒子線を透過または通過させる着脱可能な隔膜を有し、当該隔膜により前記荷電粒子光学鏡筒の内部空間と前記試料が載置された空間とが隔離されていることを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項8】

試料台に保持された試料に一次荷電粒子線を照射する荷電粒子光学鏡筒と、
前記試料台を着脱可能に配置する試料ステージと、
前記一次荷電粒子線と前記試料との相対角度を、第１の軸および前記第１の軸とは異なる第２の軸にて制御する角度制御部と、
前記第１の軸および前記第２の軸における、複数の異なる前記相対角度での一次荷電粒子線の照射によって取得した、各相対角度に対応する前記試料の透過荷電粒子画像を断層撮影法にて表示する表示部と、
前記表示部に表示された前記試料の透過荷電粒子画像の一部を選択させることで、前記画像の回転図または断面図を表示する選択入力部と、を有し、
前記試料台は、前記試料の内部を散乱または透過してきた荷電粒子を検出する検出器を含んで構成される、
ことを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項9】

請求項８に記載の荷電粒子線装置において、
前記角度制御部は、前記一次荷電粒子線と前記試料との相対角度を前記第１の軸にて制御する第一軸角度制御部と、前記一次荷電粒子線と前記試料との相対角度を前記第1の軸とは異なる前記第２の軸にて制御する第二軸角度制御部と、を有することを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項10】

請求項９に記載の荷電粒子線装置において、
前記第二軸角度制御部は、前記試料台の水平面と平行でない前記第２の軸を中心とする回転運動であり、前記回転運動によって前記試料台を回転させ前記一次荷電粒子線と前記試料との相対角度を制御することを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項11】

請求項８に記載の荷電粒子線装置において、
前記角度制御部は、前記荷電粒子光学鏡筒の傾斜、一次荷電粒子線のビームチルト、試料ステージの傾斜、前記試料台の傾斜のいずれか１つ、もしくは２つ以上の組み合わせによって前記一次荷電粒子線と前記試料との相対角度を制御することを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項12】

試料台に保持された試料に一次荷電粒子線を照射する荷電粒子光学鏡筒と、
前記試料台を着脱可能に配置する試料ステージと、
傾斜軸によって、前記試料台表面と前記一次荷電粒子線の光軸とのなす角を垂直でない角度に傾斜させる試料台傾斜部と、
前記試料台傾斜部の傾斜角度を制御する制御部と、
前記試料台を複数の異なる相対角度に傾斜させ、前記傾斜軸とは異なる軸で回転させ、
前記一次荷電粒子線を前記試料に照射することによって取得した、各相対角度に対応する前記試料の透過荷電粒子画像を断層撮影法にて表示する表示部と、
前記表示部に表示された前記試料の透過荷電粒子画像の一部を選択させることで、前記画像の回転図または断面図を表示する選択入力部と、を有し、
前記試料台は、前記試料の内部を散乱または透過してきた荷電粒子を検出する検出部を含んで構成される、
ことを特徴とする荷電粒子線装置。

【請求項13】

請求項１２に記載の荷電粒子線装置において、
前記検出部は前記試料の内部を透過または散乱してきた荷電粒子によって発光する発光部材であることを特徴とする荷電粒子線装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、荷電粒子線の照射によって試料の内部を観察することが可能な荷電粒子線装置及び試料観察方法に関する。

【背景技術】

【0002】

物体の微小な領域の内部構造を観察するために走査型透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）や透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）などが用いられる。このような電子顕微鏡を用いて試料内部を観察するための一般的な観察方法として、多数の空孔を備えたメッシュ状の試料台の上に電子線が透過可能な程度に薄くスライスされた試料を配置し、試料面に対して電子源側とは反対側に配置された検出器にて透過電子線を取得することが知られている。さらに、物体の内部構造の三次元観察をする方法として試料を傾斜させて様々な方位の透過電子顕微鏡像を取得する方法が、材料、医学、生物分野で近年注目されている。特許文献１では、試料を傾斜することによって三次元的位置配置を知る方法が提案されている。

【0003】

また、電子顕微鏡だけでなく光学顕微鏡によっても物体の内部構造を観察することが可能である。光学顕微鏡を用いることで電子顕微鏡にて取得することができない色情報を取得することが可能である。このような光学顕微鏡観察用の試料調製法として、スライドガラスなどの平坦な台の上に、光が透過するぐらい薄い試料を載せる、または液体状態の試料を薄く塗抹して観察する方法などが広く用いられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平４−３３７２３６号公報（米国特許第５２７８４０８号明細書）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

光学顕微鏡では焦点深度が浅いので、光学顕微鏡画像は試料のある特定の深さまたは厚さのみの情報を持つ画像となる。このため、スライドガラスなどを傾斜しても試料の三次元内部構造観察はできない。一方、電子顕微鏡では光学顕微鏡に比べて焦点深度が大きいので、一つの画像中に深さ方向の情報が重畳されてしまう。したがって、電子顕微鏡を用いて試料内部の三次元構造を観察するには、試料内部の三次元方向のどの位置に、どのような大きさおよび密度の構造物があるのかを正確に特定する必要がある。

【0006】

さらに、光学顕微鏡にて観察した試料の三次元内部構造観察を電子顕微鏡で実施する場合は、特許文献１のような三次元構造観察が可能な電子顕微鏡装置に光学顕微鏡にて観察した試料を導入する必要がある。しかし、スライドガラス上に載っている試料を公知文献のようなＴＥＭやＳＴＥＭ装置に入れることができないため、光学顕微鏡で観察した場所を電子顕微鏡にて三次元内部構造観察を実施することは難しかった。例えば、光学顕微鏡にて観察されたスライドガラスなどの平坦台上の試料を樹脂で固めて、平坦台から剥がした後にミクロトームなどによって薄片化し、多数の空孔を備えたメッシュ上に配置するといったことで実現可能であるが、この作業は非常に煩雑な試料の置き換え作業となる。

【0007】

本発明はかかる問題に鑑みてなされたもので、透過荷電粒子線像によって試料内部構造の三次元位置関係や密度分布を正確に特定することができる荷電粒子線装置、試料観察方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記課題を解決するために、本発明における荷電粒子線装置は、試料台に保持された試料に一次荷電粒子線を照射する荷電粒子光学鏡筒と、前記試料台表面と前記一次荷電粒子線の光軸とのなす角を垂直でない角度に傾斜させた状態で当該試料台を回転することが可能な試料台回転部と、前記試料台回転部の回転角度を制御する制御部と、を有し、前記試料台は、前記試料の内部を散乱または透過してきた荷電粒子を検出する検出素子を含んで構成され、前記試料台回転部を複数の異なる角度に回転させた状態で前記一次荷電粒子線を前記試料に照射することによって、各角度に対応する前記試料の透過荷電粒子画像を取得することを特徴とする。

【0009】

また、本発明における他の荷電粒子線装置は、試料台に保持された試料に一次荷電粒子線を照射する荷電粒子光学鏡筒と、前記試料台を着脱可能に配置する試料ステージと、前記一次荷電粒子線と前記試料との相対角度を、第１の軸および前記第１の軸とは異なる第２の軸にて制御する角度制御部と、を有し、前記試料台は、前記試料の内部を散乱または透過してきた荷電粒子を検出する検出器を含んで構成され、前記第１の軸および前記第２の軸における、複数の異なる前記相対角度での一次荷電粒子線の照射によって、各相対角度に対応する前記試料の透過荷電粒子画像を取得することを特徴とする。

【0010】

また、本発明における他の荷電粒子線装置は、試料台に保持された試料に一次荷電粒子線を照射する荷電粒子光学鏡筒と、前記試料台を着脱可能に配置する試料ステージと、前記試料ステージの傾斜軸とは異なる傾斜軸によって、前記試料台表面と前記一次荷電粒子線の光軸とのなす角を垂直でない角度に傾斜させる試料台傾斜部と、前記試料台傾斜部の傾斜角度を制御する制御部と、を有し、前記試料台は、前記試料の内部を散乱または透過してきた荷電粒子を検出する検出部を含んで構成され、前記試料ステージとは異なる傾斜軸によって前記試料台を複数の異なる前記相対角度に傾斜させ、前記一次荷電粒子線を前記試料に照射することによって、各相対角度に対応する前記試料の透過荷電粒子画像を取得することを特徴とする。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、透過荷電粒子線像によって試料内部構造の三次元位置関係や密度分布を正確に特定することができる。

【0012】

特に、透過荷電粒子線を検出可能な試料台を用いることによって、光学顕微鏡により観察された試料の三次元内部構造観察を荷電粒子顕微鏡装置にて簡便に実施できる。

【0013】

上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】光学顕微鏡観察と荷電粒子線顕微鏡観察の概略説明図。

【図2】検出素子を具備した試料台の詳細図。

【図3】検出素子を具備した試料台の詳細図。

【図4】検出素子を具備した試料台の詳細図。

【図5】検出素子によって透過荷電粒子を検出する方法の説明図。

【図6-1】検出素子によって透過荷電粒子を検出する方法の説明図。

【図6-2】検出素子によって透過荷電粒子を検出する方法の説明図。

【図6-3】検出素子によって透過荷電粒子を検出する方法の説明図。

【図7-1】実施例１における装置の説明。

【図7-2】実施例１における装置の説明。

【図7-3】実施例１における装置の説明。

【図8】操作画面の説明図。

【図9】実施例１における観察方法の説明図。

【図10】操作画面の説明図。

【図11】検出素子によって透過荷電粒子を検出する方法の説明図。

【図12】光学顕微鏡観察と荷電粒子線顕微鏡観察の概略説明図。

【図13】光学顕微鏡観察と荷電粒子線顕微鏡観察の概略説明図。

【図14】光学顕微鏡観察と荷電粒子線顕微鏡観察の概略説明図。

【図15】検出素子を具備した試料台の詳細図。

【図16】検出素子によって透過荷電粒子を検出する方法の説明図。

【図17】試料と荷電粒子線との相対角度をステレオ投影した図。

【図18】試料と傾斜や回転の座標関係を示した図。

【図19】試料と荷電粒子線との相対角度をステレオ投影した図。

【図20】ステージでの傾斜とモータでの傾斜を表現した図。

【図21】ステージでの傾斜と回転台での回転を表現した図。

【図22】実施例２における検出素子の説明図。

【図23】実施例２におけるにおける装置の説明図。

【図24】実施例３におけるにおける装置の説明図。

【図25】実施例３におけるにおける装置の説明図。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本出願は本明細書の一部を構成するものとしてPCT/JP2014/056392の内容を援用する。そして、上記出願は本出願の出願時において公知でないと思料する。以下、図面を用いて各実施形態について説明する。

【0016】

以下では、本発明における試料台の詳細及び当該試料台が適応される荷電粒子線装置について説明する。ただし、これは本発明の単なる一例であって、本発明は以下説明する実施の形態に限定されるものではない。本発明は、荷電粒子線を照射することによって試料を観察する装置、例えば走査電子顕微鏡、走査イオン顕微鏡、走査透過電子顕微鏡、透過電子顕微鏡、これらと試料加工装置との複合装置、またはこれらを応用した解析・検査装置にも適用可能である。なお、本発明における試料台と当該試料台が載置される荷電粒子線装置とにより、透過荷電粒子線像の観察が可能な観察システムを構成する。

【0017】

また、本明細書において「試料台」とは試料を載置した状態で荷電粒子線装置から試料とともに取り外しできるユニットのことを意味する。具体的には、以下で説明するように、当該「試料台」ユニットは検出素子と土台とを有していてもよいし、検出素子のみで形成されていてもよい。

【実施例1】

【0018】

＜概要＞
はじめに、本実施例で用いられる試料台の概要に関して説明する。以下で説明する三次元内部構造観察方法は従来の一般的な電子顕微鏡用試料台においても可能であるが、次に説明する試料台を用いることでさらに利便性が向上する。

【0019】

本実施例では、試料内部を透過または散乱した荷電粒子線を光に変換し、その光を検出することで透過荷電粒子線像を生成する荷電粒子顕微鏡、観察システムについて説明する。より具体的には、試料が載置される試料台の少なくとも一部は荷電粒子線の照射により発光する発光部材で形成され、当該発光部材上にある試料を透過または散乱した荷電粒子線が当該発光部材に照射されることで光が発生し、その光を荷電粒子顕微鏡に備えられた検出器で検知することで、透過荷電粒子線像を生成する。つまり、本実施例では試料を透過した荷電粒子線を直接検出するのではなく、光に変換して検出する。以下に詳述するように、荷電粒子線を光に変換する発光部材には外部から接続される電源ケーブルや信号線等の配線が不要である。そのため、同じ試料台を用いて荷電粒子線顕微鏡とその他の装置で観察することができ、装置間の試料の移動に際して電気配線を外すという非常に手間な作業が不要となる。また、発光部材自体または発光部材を有する試料台を簡単に装置に着脱できるので、どのような試料でも簡単に試料を試料台にセットすることが出来る。特に、顕微鏡観察用の試料台上で試料自体を培養させる必要がある培養細胞などを観察する場合に非常に有効である。

【0020】

さらに、図１に示すように本実施例の試料台を用いれば荷電粒子線顕微鏡による観察と光学顕微鏡などの他の装置による観察とを同じ試料台で行うことができる。図１には本実施例における荷電粒子線を光に変換または増幅して発光させることが可能な検出素子５００（発光部材ともいう）を具備する試料台と、荷電粒子線顕微鏡６０１と、光学顕微鏡６０２を示す。試料台の検出素子５００上には試料６を直接または後述する所定の部材を介して搭載することができる。後述するように、検出素子５００からの光を電気信号に変換及び増幅するために荷電粒子線顕微鏡６０１内には光検出器５０３を備える。この構成により、荷電粒子線顕微鏡内で発生された荷電粒子線が試料６に照射された後に試料の内部を透過または散乱した「荷電粒子透過信号」を、試料台の一部を成す検出素子にて光に変換して検出することにより、透過荷電粒子顕微鏡画像を取得することが可能である。また、本試料台は荷電粒子線顕微鏡と光学顕微鏡と共用に用いられる共通試料台であるので、図中矢印で図示したように同一試料台を各顕微鏡間で移動させて観察することで、それぞれの顕微鏡観察向けに試料を複数作製したり試料を移し変えたりすることなく、一つの試料台に試料を配置したまま荷電粒子線観察と光学観察が可能である。

【0021】

本実施例において、この試料台の一部を成す検出素子は透明な部材で作られているとよい。以下、本明細書において、「透明」の意味は、特定の波長領域の可視光もしくは紫外光もしくは赤外光が通過可能、またはすべての波長領域の可視光もしくは紫外光もしくは赤外光が通過可能ということである。紫外光は波長がおおよそ１０〜４００ｎｍであり、可視光は波長がおおよそ３８０ｎｍから７５０ｎｍであり、赤外光とは波長がおおよそ７００ｎｍ〜１ｍｍ（＝１０００μｍ）程度の波長の領域のことを言う。例えば、多少の色が混在されていても透けて見えれば特定の波長領域の可視光が通過可能ということであり、無色透明であればすべての波長領域の可視光が通過可能という意味である。ここで「通過可能」とは少なくとも当該波長領域の光によって光学顕微鏡観察が可能な光量の光が通過することを指す（例えば透過率５０％以上であることが望ましい）。また、ここで特定の波長領域とは少なくとも光学顕微鏡の観察に用いる波長領域を含む波長領域である。そのため、本実施例の試料台の一面側からの光が試料を透過することによって得られる「光透過信号」を試料台のもう一面側から検出することが可能な一般的な光学顕微鏡（透過型光学顕微鏡）に用いることが可能である。光学顕微鏡としては、生物顕微鏡、実体顕微鏡、倒立型顕微鏡、金属顕微鏡、蛍光顕微鏡、レーザ顕微鏡等の光を用いた顕微鏡ならばどんなものでもかまわない。また、ここでは説明のため「顕微鏡」としているが、この試料台は画像の拡大率に関らず、試料に光を照射することで情報を取得する装置一般に適用可能である。

【0022】

さらに、この試料台を用いれば、共通試料台上に配置された試料を光学顕微鏡観察した後に、荷電粒子顕微鏡装置にて三次元内部構造観察することが可能となるために、同一試料台上の同一試料から様々な情報を入手することが可能となる。以下で、試料台、試料搭載方法、画像取得原理、装置構成等の詳細に関して説明する。

【0023】

＜試料台の説明＞
本実施例における試料台の詳細の説明と原理説明をする。本実施例の試料台は荷電粒子線を光に変換する検出素子５００で構成される。図２のように試料６は検出素子５００上に直接搭載される。図中試料６は一つだけ搭載されているが、複数配置されていてもかまわない。または、後述するように膜などの部材を介して間接に搭載されても良い。試料台５００の下に、無色透明または多少の色が混在されている土台５０１（図示せず）を配置してもかまわない。土台５０１としては、透明ガラス、透明プラスチック、透明の結晶体などである。蛍光顕微鏡などで観察したい場合は、蛍光が吸収されない方がよいのでプラスチックがよい。土台５０１は必ずしもなくともよい。

【0024】

検出素子５００は例えば数ｋｅＶから数十ｋｅＶぐらいまでのエネルギーで飛来してくる荷電粒子線を検知し、荷電粒子線が照射されると可視光や紫外光や赤外光などの光を発光する素子である。本実施例の試料台に用いられる場合、当該検出素子は試料台に載置された試料の内部を透過または散乱した荷電粒子を光に変換する。発光波長は、可視光、紫外光、赤外光のうち特定のまたは任意のいずれかの波長領域であればよい。検出素子としては例えばシンチレータ、ルミネッセンス発光材などを用いることができる。シンチレータの例としてはＳｉＮ（シリコンナイトライド）、ＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット）素子、ＹＡＰ（イットリウム・アルミニウム・ペロブスカイト）素子、ＢＧＯ素子（ビスマスゲルマニウム酸化物）、ＧＳＯ（ガドリニウムシリコン酸化物）素子、ＬＳＯ（ ルテチウムシリコン酸化物）素子、ＹＳＯ（イットリウムシリコン酸化物）素子、ＬＹＳＯ（ルテチウムイットリウムシリコン酸化物）素子、ＮａＩ(ＴＩ)（タリウム活性化ヨウ化ナトリウム）素子などの無機シンチレータ材料がある。または、ポリエチレンテレフタレートなど発光することが可能な材料が含有するプラスチックシンチレータあるいは有機シンチレータや、アントラセンなどが含有した液体シンチレータが塗布された材料などでもよい。荷電粒子線を光に変換可能な素子であれば検出素子５００はどのような材料であってもかまわない。また、本発明における発光とは、蛍光やその他の発光現象を利用することも含まれる。

【0025】

また、荷電粒子線が照射されることによって蛍光を発生する蛍光剤がコーティングされた薄膜や微粒子であってもよい。例えば、コーティング材として、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein，ＧＦＰ）などの蛍光たんぱく質などがある。蛍光色は緑に限らず青や赤など何でも構わない。特に、荷電粒子線を照射しても瞬時に劣化することがないようなＧＦＰがよい。例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（enhancedGFP，ＥＧＦＰ）などである。観察したい試料が細胞などの生体試料の場合には、タンパク質であるＧＦＰと細胞試料などの密着性がよいといった効果もある。また、ＧＦＰが塗布された基板に対して、試料搭載後に荷電粒子線を照射してＧＦＰの蛍光強度を高めてから観察してもよいし、試料搭載前に荷電粒子線を照射して、ＧＦＰの発光強度を高めてから試料を搭載してもよい。この場合、コーティング材は図示しない透明な土台５０１に支持、塗布、または散布される。本実施例では、これらも含め、荷電粒子を受光面に受けることにより光を発生する部材を総称して発光部材と称する。荷電粒子線の固体内平均自由行程は荷電粒子線の加速電圧に依存するが数十ｎｍから数十μｍである。そのため、検出素子５００の上面の発光領域も検出素子表面から同程度の厚みの領域となる。よって、検出素子５００の厚みはこの厚みを上回っていればよい。一方で、前述の通り、光学顕微鏡観察を同じ試料台で行うことを考えた場合には、光学顕微鏡にて観察した際の光透過信号ができるかぎり透過可能な必要があるので、多少の色が混在された検出素子の場合はできるかぎり薄いほうがよい。

【0026】

なお、光学顕微鏡６０２が蛍光顕微鏡である場合には、試料に蛍光材を注入する必要がある。この場合、試料に注入する蛍光材料の蛍光波長帯と、本実施例における上記発光部材としての蛍光材料の発光波長帯とがずれているほうが望ましい。例えば、緑色である蛍光たんぱく質で検出素子５００をコーティングした場合には、赤や青などの蛍光たんぱく質で試料を染めることが望ましい。もし、発光部材のコーディングと試料の染色を同一色で実施する場合は、蛍光顕微鏡下では色ではなく発光強度の違いを識別すればよい。また、試料に蛍光材が含まれる場合はそれがどのような色であっても、荷電粒子線装置内の光検出器５０３では試料台５００からの光と試料からの光を検出することになる。この場合、光検出器５０３は予め発光波長の増幅率が異なる検出器を用いれば、結果として荷電粒子による透過情報が取得できることになる。具体的には、発光部材からの光に対する増幅率が試料からの光に対する増幅率より高い光検出器５０３を用いれば、荷電粒子による透過信号を選択的に増幅することができる。

【0027】

光学顕微鏡にて良く用いられる試料台としてスライドグラス（又はプレパラート）やディッシュ（又はシャーレ）などの透明試料台がある。つまり、本実施例における荷電粒子線を光変換することが可能な検出素子を具備した試料台５００をこれら光学顕微鏡向けの一般的なスライドグラス（例えば約２５ｍｍ×約７５ｍｍ×約１．２ｍｍ）の形状の上にのせれば、これまでユーザが使用していたような経験や感覚で試料台操作や試料搭載や試料観察が可能である。または、スライドグラスやシャーレなどの試料台自体を上記のような発光部材で形成し発光する試料台としてもよい。これによって、光学顕微鏡で観察対象とする試料を一次的にスクリーニングし、選別された試料をそのまま荷電粒子顕微鏡で詳細観察するといった使い方をすることができる。また、一般の高性能の透過型荷電粒子線顕微鏡装置での試料調製は大変な労力を要するので、本実施例における試料台による観察によって、高性能の透過型荷電粒子線顕微鏡観察前のスクリーニングをすることも可能である。また、後述するように、これら顕微鏡間で試料を移動する際に位置情報等をコンピュータ上や紙面上でマップとして共有化すると、各顕微鏡で同一部位を観察することが可能となる。

【0028】

前述のように荷電粒子線の固体内平均自由行程は荷電粒子線の加速電圧に依存するが数十ｎｍから数十μｍであるため、その平均自由行程よりも十分薄い膜５０２を検出素子５００と試料との間に配置してもよい。すなわち、検出素子５００を覆う薄い膜５０２の上に試料が載置される。この試料台を図３（ａ）に示す。この厚みは図中Ａで記載されている。この薄い膜５０２は、荷電粒子線の少なくとも一部が透過可能な厚さおよび材質である必要がある。光学顕微鏡での観察も実施されるのでこの薄い膜５０２はさらに光に対して透明である必要もある。このような薄い膜５０２を配置すると、検出素子５００の表面の汚れや傷などを防止することが可能である。この薄い膜５０２として、試料が試料台と分離しないように、試料と試料台の密着性を高めるための物質が試料台に塗布されてもよい。例えば、試料が細胞等の生体試料の場合、細胞表面は脂質二重層のリン酸脂質による負の荷電状態であるため、正の荷電状態の分子（リジンやアミノシランなど）をスライドグラスなどの試料台上に塗布することによって、細胞試料が試料台から剥離することを防止することができる。そのため、検出素子５００にも同様に正の荷電状態の分子が付着されていてもよい。または、液体を多く含んだ状態の試料を搭載しやすくなるように親水性を有する材料が塗布されていてもよい。または、生きた細胞や細菌が搭載または培養しやすくなるようにコラーゲンのような生体試料と親和性が高い材料を塗布してもよい。なお、ここで塗布とは、散布、浸漬、コーティング等試料台表面にコーティング材を付着させる方法を広く含むものとする。また、図３（ｂ）のように所定の位置だけに前記分子や膜を配置させてもよい。ここで、所定の位置とは検出素子５００のうち一部の領域という意味である。例えば、試料が細胞等の生体試料の場合には、所定の位置だけに正の荷電状態の分子を配置することで当該所定の位置のみに前記試料を配置することが可能となる。例えば、観察したい領域を狭めることで、観察時間を短くしたい場合などに本手法が有用となる。また、荷電粒子線が照射された際に帯電が発生しないように少なくとも試料が載置される面に導電性部材（帯電防止部材）が具備されていてもよい。導電性部材とは例えばカーボン材や金属材やＩＴＯ（酸化インジウムスズ）や導電性有機物などである。なお、前述の膜の層数は複数あってもかまわない。

【0029】

また、試料が含水試料などの場合は図４（ａ）のように観察試料を囲うまたは覆う様に薄い膜７０２を配置してもよい。薄い膜７０２とは例えば界面活性材や有機物などである。薄い膜７０２を試料周辺部に配置することによって、試料からの水分蒸発防止や試料の形状変化を防止することが可能となる。または、図４（ｂ）のように、試料内部または周辺に置換物質７０３を導入してもよい。置換物質７０３は例えばイオン液体などの有機物などである。イオン液体は電子照射面に導電性を付与することができる性質を有する。イオン液体が観察試料の内部や周辺部に配置されていることによって、真空中で荷電粒子線を照射させた時に、試料が帯電することを防止することが可能となる。さらに、イオン液体を試料中の水分と置換させることで、試料形態を維持した状態を保つことが可能となる。そのため、イオン液体を含んだ試料を透過または散乱してきた荷電粒子線による発光を検出することで、よりウェットな試料の透過画像を取得することが可能となる。イオン液体を試料に搭載する方法は、試料をイオン液体中に含浸させてもよいし、スプレーなどで試料にイオン液体を吹きかけるなどしてもよい。

【0030】

以下で、本実施例の試料台を用いた光検出方法及び透過荷電粒子線が取得可能な原理について説明する。図５に、検出素子５００上に試料６が配置されている状態を示している。試料台の下には光検出器５０３を示している。光検出器５０３は検出素子５００からの光信号を電気信号に変換または増幅することが可能である。変換または増幅された電気信号は通信線を介して制御部やコンピュータに入力され、これらの制御系により画像化される。取得された画像（透過荷電粒子線画像）はモニタ等に表示されてもよい。

【0031】

ここでは、試料内で密度が高い部位５０８と密度が低い部位５０９があることを考える。試料内で密度が高い部位５０８に一次荷電粒子線５１０が照射された場合、荷電粒子線は大多数が後方散乱されるため、検出素子５００には荷電粒子線は到達しない。一方、試料内で密度が低い部位５０９に一次荷電粒子線５１１が照射された場合、荷電粒子線は検出素子５００まで透過することが可能となる。その結果、検出素子５００にて試料内部の密度差を検出（すなわち光信号に変換）することが可能となる。この透過具合は荷電粒子線の加速エネルギーによってかわる。そのため、荷電粒子線の加速エネルギーを変えることで、画像化される試料内部構造物の密度を選択することができる。すなわち観察したい内部情報とその領域を変えることができる。また、荷電粒子線のビーム電流量を変化させることによって、ビーム径を変更することが可能である。この結果、観察した内部構造の大きさと前記ビーム径との相対サイズを変更することが可能である。つまり、ビーム電流を変更することで、観察したい内部情報を見えるようにしたり見えなくなるようにしたりすることが可能となる。

【0032】

光検出器５０３と試料台との間（図中ｈ部分）は空間があってもよいが、光を出来る限り効率よく検出するためには、この光伝達部ｈは出来る限り短い方がよい。または、光伝達部ｈに光学レンズやミラーなどを配置して集光してもよい。光伝達部ｈは、空気中であってもよいし真空中であってもよい。発光の波長領域を通過させることが可能な固体材料とは、例えば、石英、ガラス、光ファイバ、プラスチック等、光に対して透明または半透明な材料である。この構成にすると、光検出器５０３をステージから分離して配置することができるので、光検出器５０３に接続される配線や電気回路を試料台や試料台を保持する試料ステージとは離れた位置に配置することが可能となる。いずれにしても、光伝達部ｈは出来る限り発光の波長領域を通過させる領域であることが好ましい。なお、図５では、光検出器５０３は試料台５００の下側に配置されているが、横方向や上側などに配置されていてもよく、検出素子５００からの光を取得できればどの位置にあってもかまわない。

【0033】

試料台に試料を搭載する方法を以下で述べる。荷電粒子線（光学顕微鏡観察を併用する場合にはさらに光）が透過しなければならないために、試料は薄い必要がある。例えば、数ｎｍから数十μｍ程度の厚みである。検出素子５００上に直接搭載可能な試料としては例えば細胞が含まれている液体や粘膜、血液や尿など液状生体検体、切片化された細胞、液体中の粒子、菌やカビやウイルスのような微粒子、微粒子や有機物などを含むソフトマテリアル材などである。試料の搭載方法は、前述の培養の他にも、以下の方法が考えられる。例えば、試料を液体の中に分散させて、この液体を検出素子に付着させる方法がある。また、試料を荷電粒子線が透過可能な厚さに切片化して、切片化された試料を検出素子上に配置してもよい。より具体的には、例えば綿棒の先端に試料を付着させこれを検出器上に塗りつけてもよいし、スポイトで垂らしてもよい。また微粒子の場合は検出器上に振りかけてもよい。スプレーなどで塗布してもよいし、液体を試料台に高速回転させて塗布するスピンコーティング法を用いてもよいし、液体に試料台をつけて引き上げることによって塗布するディップコーティング法を用いてもよい。いずれの方法にしても、試料厚みを数十ｎｍから数十μｍ程度の厚みにすることができればどのような方法であってもかまわない。

【0034】

＜三次元内部構造観察の原理説明＞
次に、図６を用いて、荷電粒子線を用いて試料の三次元内部構造観察を実施するための原理に関して説明する。図では試料６と荷電粒子線９００が照射される際の相互関係を示す。試料６には密度が比較的小さい物質９０４の中に、密度が比較的大きい内部物質９０１と内部物質９０２と内部物質９０３を持つ。内部物質９０３は内部物質９０１、９０２に比べると大きさが小さいかつ密度が小さいとする。試料として例えば細胞試料などを考えると、物質９０４は細胞内部であり、内部物質９０１、９０２、９０３などは細胞核などの細胞小器官などに対応する。

【0035】

荷電粒子光学鏡筒の軸である光軸９０５を図中縦方向とする。荷電粒子線９００が試料６に照射され、紙面上左右方向に走査され、その結果、検出素子５００によって光信号に変換された信号を顕微鏡画像としてモニタ上に表示させることを考える。図６−１（ａ）では内部物質９０１、９０２は密度が大きいので、入射した荷電粒子線９００の多くは後方散乱される一方、内部物質９０３は密度が小さいために多くの荷電粒子線は通過する。その結果、荷電粒子線が走査されて試料下側で検出される画像は投影画像（または検出画像、透過荷電粒子画像）９０６のようになる。例えば、投影画像９０６における内部物質９０１と内部物質９０２との距離は実際の距離ではなく、上から投影された距離Ｃとなる。内部物質９０３では荷電粒子線の多くが透過し検出できないので投影画像９０６には現れない。

【0036】

次に、図６−１（ｂ）は荷電粒子線９００の入射エネルギーＥを図６−１（ａ）の場合より小さくした場合の説明図およびその場合に得られる投影画像である。入射エネルギーＥの大きさは図中矢印の太さで明示的に図示している。入射エネルギーＥが小さいと内部物質９０３でも荷電粒子線が通過できずに後方散乱される量も増えるので、投影画像（または検出画像）９０７には内部物質９０１，９０２の構造に加えて内部構造９０３ａが検出されている。これは、低エネルギーの荷電粒子線のほうがより物質による散乱を受けやすいといった現象による。

【0037】

図６−１（ａ）と図６−１（ｂ）で得られる投影画像からは、内部物質９０１と内部物質９０２と内部物質９０３の三次元位置関係は不明である。そこで、荷電粒子線の入射方向と試料との相対角度を変えて複数の投影画像を取得する。具体的には試料自体を傾斜するか荷電粒子線の入射自体を光軸９０５に対して傾斜する。この複数の投影画像に基づいて内部構造の三次元位置配置を把握することが可能となる。例として、照射カラムを傾斜させる方法、照射ビームを電界もしくは磁界によってビームチルトさせる方法、もしくは試料台を傾斜させる方法が挙げられ、これらの２つ以上の方法の組み合わせによっても実現できる。図６−１（ｃ）では試料台５００をθ傾斜することによって荷電粒子線を斜めから試料６に照射する様子を図示する。投影画像９０７と投影画像（または検出画像）９０８を比較すると、内部物質９０１と内部物質９０２と内部物質９０３の間の距離が変化する（図中Ｃ’部やＤ’部）。さらに、物質９０４の大きさも変化する（図中Ｂ’部）。つまり、投影画像９０７と投影画像９０８を比較して観察して変化量をみることによって、試料６全体及び内部の三次元内部構造観察をすることが可能となる。

【0038】

また、荷電粒子線が試料に照射される際の相対的な照射角度θの代わりに又はこれに加えて、試料の回転方向φを動かすことによって試料内部の三次元内部構造観察を実現する方法について以下記載する。はじめに、図６−２（ａ）で図示したような状態から、荷電粒子線の入射方向に対する試料の相対角度θをつける。この時に、試料を保持している試料ステージを使って試料を傾けてもよいし、あらかじめ傾斜させて試料を配置してもよいし、荷電粒子線の照射する方向が傾斜してもよい。図６−２（ｂ）の例では、相対角度θは０°以外の角度に固定であってもよい。

【0039】

このとき、試料ステージではなく、後述する図２０のような試料台５００に設けられた傾斜機構(部)を用いて試料と荷電粒子線の照射する方向を変更してもよい。この場合、試料ステージの傾斜軸とは異なる傾斜軸にて試料を傾斜させることが出来るので、試料ステージの傾斜可動範囲の制約を受けることなく試料を傾斜させることが出来る。ちなみに、元々試料ステージに傾斜機能が無い装置の場、「異なる傾斜軸」は試料室内のどの位置を指しても良い。

【0040】

なお、一般的な荷電粒子線装置においては、試料ステージの最大傾斜範囲が５度〜３０度程度であるものもあり、また、大傾斜させる場合は片側のみの傾斜しか行えない試料ステージもある。使用する装置によっては大傾斜が可能な試料ステージを有するものもあるが、無い場合は別の傾斜機構を用いて傾斜させることが有効である。

【0041】

また、試料ステージの傾斜軸より光軸に近づいた傾斜軸を有する傾斜機構を用いて試料を傾斜させると、傾斜に要する試料の空間移動が減少し、試料室の空間的制約が緩和できる効果もある。

【0042】

次に、試料台５００の面に垂直な軸Ｒに対して試料を回転させる。ここで説明の都合上、軸Ｒは試料台５００の面に垂直としたが、実質的に垂直であればその後の画像処理演算が簡便化できる。

【0043】

また図７にて述べるとおり、軸Ｒは試料ステージ自体または試料ステージ上に配置された回転機構の回転軸である。この場合において、試料台５００の面が地面に対して傾斜していると、軸Ｒは試料台５００の面に垂直ではないが、このような場合にも本実施例と同様の方法により試料内部の三次元構造を構築することが可能である。したがって以下では、軸Ｒは、試料ステージ自体または試料ステージ上に配置され、試料を回転させる回転機構の回転軸を意味するものとする。

【0044】

初期状態を、図６−２（ｂ）とし、図６−２下段の投影図で図中横方向をＸ軸、図中縦方向をＹ軸と置いた場合に、軸Ｒに対してこのＸ軸とＹ軸を含む面を回転させる。回転角度をφとすると、回転角度φを変えて複数の投影画像を取得でき、それらの取得結果に基づいて内部構造の三次元位置配置を把握することが可能となる。例えば、図６−２（ｂ）から、試料台５００の回転角度φを９０°回転すると、図６−２（ｂ）は図６−２（ｃ）のようになる。図６−２（ｃ）から、試料台５００の回転角度φをさらに９０°回転すると、図６−２（ｃ）は図６−２（ｄ）のようになる。図からわかるとおり、投影画像９１６と投影画像（または検出画像）９１８を比較すると、内部物質９０１と内部物質９０２と内部物質９０３の間の距離が変化する（図中Ｅ’部やＦ’部）。さらに、投影画像における物質９０４の大きさや形状も変化する（図中Ｇ’部）。つまり、取得された投影画像を比較して観察して各変化量をみることによって、試料６全体及び内部の三次元内部構造観察をすることが可能となる。

【0045】

ちなみに、試料角度θを変更する場合は試料、試料台及び試料ステージの全体が傾斜するため、荷電粒子光学鏡筒の下で試料を含む部材の位置を大きく可動させる必要がある。つまり、装置構成によっては、試料室の空間的な制限やステージ等の傾斜機構の可動範囲などにより試料の傾斜角度θが狭い範囲に制限されてしまう可能性がある。このように十分傾斜できない場合、トモグラフィ等を行う場合に必要な情報量を取得することができない可能性がある。

【0046】

これに対して試料回転角度φを回転する構成は試料、試料台及び試料ステージの一部が回転しているだけであるため、荷電粒子光学鏡筒の下で、試料を含む部材の位置を大きく動かす必要はない。つまり、回転動作は試料台５００の面内で行われるので、回転角度によって必要となる空間が大きく増えることはなく、容易に角度φを大角度（例えば３６０度）回転させることが可能である。そのため、荷電粒子光学鏡筒に試料を極力接近させたい場合や、試料室空間が狭い場合などは、照射角度θをあらかじめ固定にしておき、その後試料回転角度φが回転する構成のほうが望ましい。

【0047】

また、図示しないが、荷電粒子線のビーム電流量Ｉを変化させることによって、ビーム径を変更することが可能である。この結果、観察した内部構造の大きさと前記ビーム径との相対サイズを変更することが可能である。つまり、ビーム電流を変更することで、観察したい内部情報を見えるようにしたり見えなくなるようにしたりすることが可能となる。つまり、見たい情報と見たくない情報を分離するために、荷電粒子線のビーム電流量Ｉをベクトルパラメータとしてもよい。

【0048】

以上の説明をまとめると、三次元の内部構造観察を実施するためには、荷電粒子線が試料に照射される際の相対的な照射角度θ（または試料回転角度φ）と荷電粒子線エネルギーＥと荷電粒子線のビーム電流量Ｉが重要となる。これは荷電粒子線のベクトルそのものである。この様子を図６−３を用いて説明する。図６−３（ａ）で複数の試料内部構造物を線で結んで構成される試料内部構造体９１４を考えた場合、図６−３（ｂ）のように照射角度θを変化させたり、図６−３（ｃ）のように試料を傾斜させた状態で試料回転角度φを変化させたりすると、一次荷電粒子線の入射方向９０５に対する前記試料内部構造体９１４の向きが変化することになる。また、荷電粒子線エネルギーＥと荷電粒子線のビーム電流量Ｉを変化させると一次荷電粒子線の入射方向９０５の試料内部構造体９１４の深さ方向への侵入深さが変化することになる。すなわち、試料内部構造体９１４の位置が一定であると考えた場合において、照射角度θ、試料回転角度φ、荷電粒子線エネルギーＥ、荷電粒子線のビーム電流量Ｉを変化させることで、結果として荷電粒子線のベクトル（向きと強度）を変化させることができる。そこで、本明細書において、一次荷電粒子線入射方向と試料との相対的な照射角度θまたは試料回転角度φと一次荷電粒子線の入射エネルギーＥと荷電粒子線のビーム電流量Ｉを組にして、そのいずれか１つ以上、もしくは準ずるものをベクトルパラメータと称する。

【0049】

すなわち、ベクトルパラメータとは一次荷電粒子線と試料との相互関係を決定するパラメータであるといえる。つまり、ベクトルを決定するベクトルパラメータとして照射角度θ（または試料回転角度φ）と荷電粒子線エネルギーＥと荷電粒子線のビーム電流量Ｉを制御することによって、ベクトルパラメータが異なる条件での一次荷電粒子線の照射によって取得した複数の画像に基づいて試料台５００上の試料の内部構造を観察できる。ここでいう複数の画像とは各ベクトルパラメータに対応する透過荷電粒子画像である。ベクトルパラメータの照射角度θ（または試料回転角度φ）と荷電粒子線エネルギーＥと荷電粒子線のビーム電流量Ｉを変更して複数の画像取得を行い、これら画像を並べて観察したり連続的に表示させたりすることによって、三次元内部構造がどのようになっているかを識別することが可能である。また、内部構造の距離や面積などの大きさを計測していくつかの画像を比較することによって三次元内部構造の定量化も可能となる。これらの演算は、計算機内部で行って測定結果のみを表示しても良いが、操作者に途中の画像を表示することで結果の妥当性を確認できるメリットがある。以下で「ベクトルパラメータの変更」とは一次荷電粒子線入射方向と試料との相対的な照射角度θ（または試料回転角度φ）、一次荷電粒子線の入射エネルギーＥ、荷電粒子線のビーム電流量Ｉの少なくとも一つを変更または制御することを意味する。

【0050】

また、リアルタイムに内部情報を迅速に取得したい場合がある。例えば、後述するように、試料が自動で動いてコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）によりトモグラフィ化する際などである。この場合、荷電粒子線装置内部に配置される時間が限られるため、このような場合は、照射角度θ（または試料回転角度φ）と荷電粒子線エネルギーＥと荷電粒子線のビーム電流量Ｉをセットにしてリアルタイムに可変してもよい。この結果、見たい内部情報をより迅速に観察することが可能となる。

【0051】

＜装置説明＞
ここで、図７−１に、本実施例の試料台を搭載して三次元内部構造観察が実施できる装置に関して説明する。荷電粒子顕微鏡は、主として、荷電粒子光学鏡筒２、荷電粒子光学鏡筒を装置設置面に対して支持する筐体７（以下、真空室と称することもある）およびこれらを制御する制御系によって構成される。荷電粒子顕微鏡の使用時には荷電粒子光学鏡筒２と筐体７の内部は真空ポンプ４により真空排気される。真空ポンプ４の起動および停止動作も制御系により制御される。図中、真空ポンプ４は一つのみ示されているが、二つ以上あってもよい。

【0052】

荷電粒子光学鏡筒２は、一次荷電粒子線を発生する荷電粒子源８、発生した荷電粒子線を集束して鏡筒下部へ導き、一次荷電粒子線を試料６上に走査する光学レンズ１などの要素により構成される。荷電粒子光学鏡筒２は筐体７内部に突き出すように設置されており、真空封止部材１２３を介して筐体７に固定されている。荷電粒子光学鏡筒２の端部には、上記一次荷電粒子線の照射により得られる二次的荷電粒子（二次電子または反射電子等）を検出する検出器３が配置される。検出器３は図示した位置ではなくても筺体７内部であればどこでもよい。

【0053】

試料６に到達した荷電粒子線によって試料内部または表面から反射荷電粒子などの二次的荷電粒子や透過荷電粒子を放出する。この二次的荷電粒子を検出器３にて検出する。検出器３は数ｋｅＶから数十ｋｅＶのエネルギーで飛来してくる荷電粒子線を検知及び増幅することができる検出素子である。例えば、シリコン等の半導体材料で作られた半導体検出器や、ガラス面またはその内部にて荷電粒子信号を光に変換することが可能なシンチレータ等である。

【0054】

筐体７には、一端が真空ポンプ４に接続された真空配管１６が接続され、内部を真空状態に維持できる。同時に、筐体内部を大気開放するためのリークバルブ１４を備え、試料台を装置内部に導入時に筐体７の内部を大気開放することができる。リークバルブ１４は、なくてもよいし、二つ以上あってもよい。また、筐体７におけるリークバルブ１４の配置箇所は、図７−１に示された場所に限られず、筐体７上の別の位置に配置されていてもよい。

【0055】

筐体７は側面に開口部を備えており、この開口部には蓋部材１２２及び真空封止部材１２４によって装置内部の真空気密を保っている。本実施例の荷電粒子顕微鏡は、前述のように試料台に搭載された試料を筺体７内部にいれた後に試料と荷電粒子光学鏡筒との位置関係を変更するための試料ステージ５を備えている。試料ステージ５には前述の発光部材または発光部材を有する試料台が着脱可能に配置される。蓋部材１２２が支持する底板となる支持板１０７が取り付けられており、ステージ５が支持板１０７に固定されている。ステージ５は、面内方向または高さ方向へのＸＹＺ駆動機構、試料を荷電粒子光学鏡筒の光軸２００に対して傾斜できる傾斜駆動機構を備えている。ここを変更すると試料角度θを変えることができる。また、試料ステージ５が前記光軸方向を軸にして回転することが可能な回転駆動機構を備えることで、試料回転角度φを変えることができる。また、試料ステージ５とは別体に構成される回転または傾斜可能な駆動機構を試料ステージ５上に配置してもよい。支持板１０７は、蓋部材１２２の対向面に向けて筺体７内部に向かって延伸するよう取り付けられている。ステージ５のいくつかの駆動機構からはそれぞれ支軸が伸びており、各々蓋部材１２２が有する駆動部５１及び駆動部５２に接続されている。図中駆動部は二つだけ示しているが、駆動機構の数だけ配置される。駆動部５１及び駆動部５２は電動モータなどである。駆動部５１及び駆動部５２はユーザが手動で回転させてもよい。装置ユーザは、手動で駆動部５１，５２を操作し、またはユーザインターフェース３４で上位制御部への命令を入力することによって、試料の位置を調整することが可能である。また、図示しないが、筺体７内に光学顕微鏡を具備すれば、２つ以上の顕微鏡による同時観察を行うことができ、もしくは試料室間の移動や位置合わせの手間を省略することができる。

【0056】

試料ステージ５の上には試料が搭載された検出素子５００を搭載できる。前述の通り検出素子５００では荷電粒子線を光に変換する。この光を検出して電気信号に変換及び信号増幅するための光検出器５０３を試料ステージ５上またはステージ近傍に備える。前述の通り、光信号を効率よく検出できる配置であることが望ましい。例えば検出素子５００を備えた試料台とこの光検出器は近接していてもよいし、接触していてもしていなくてもよい。またはこれらの間に光伝達部ｈを配置してもよい。図７−１では、光検出器は試料ステージに具備されているが、光検出器５０３は筐体７のどこかに固定されていて試料台５００からの発光を検出してもよい。また、光検出器５０３は筐体７外部に設置されており光を導いて筐体７外部で光検出してもよい。光検出器５０３が筺体７外部にある場合は、ガラスや光ファイバなどの光を伝達するための光伝達路が試料台５００近傍にあり、その光伝達路の中を検出素子５００で変換された光信号が伝達することにより光検出器にて信号を検出することが可能となる。光検出器５０３は例えば半導体検出素子やフォトマルチプライヤーなどである。いずれにしても、本実施例の光検出器は前述の試料台の検出素子で発光した光を検出するものである。

【0057】

図７−１ではステージ５の上部に光検出器５０３が具備されている様子を図示している。ステージ５に具備された光検出器５０３からは配線５０９経由でプリアンプ基板５０５が接続される。プリアンプ基板５０５は配線５０７などを経由し下位制御部３７に接続される。図では、プリアンプ基板５０５は筐体７内部にあるが筐体７外部にあってもよい（例えば図中のプリアンプ５４部）。後述する通り、試料台５００を傾斜する際に、試料台５００が試料ステージ５から落ちることがないようにする必要があるため、試料ステージ５上に試料台５００を配置する位置を決めることが可能な固定部材５０６が具備されている。この他に試料台５００と光検出素子５０３との間に図示しない固定部材があってもよい。これにより試料台５００の固定ができ位置ずれ防止をすることができる。

【0058】

本実施例の荷電粒子線装置には検出器３と検出素子５００の両方があるので、検出器３で試料から発生または反射してきた二次的荷電粒子を取得し、同時に検出素子５００にて試料を透過または散乱されてきた透過荷電粒子を取得することができる。したがって、下位制御部３７等を用いて、二次的荷電粒子線画像と透過荷電粒子画像のモニタ３５への表示を切り替えることが可能である。また、前記二種類の画像を同時に表示させることも可能である。

【0059】

本実施例の荷電粒子顕微鏡の制御系として、装置使用者が使用するキーボードやマウスなどのユーザインターフェース３４や顕微鏡画像が表示されるモニタ３５が接続され通信を行う上位制御部３６、上位制御部３６から送信される命令に従って真空排気系や荷電粒子光学系などの制御を行う下位制御部３７、駆動部５１や駆動部５２との信号送受信を行うステージ制御部３８を備える。それぞれは各々通信線により接続される。ステージ制御部３８と下位制御部３７は一つのユニット内に配置されていてもよいし、上位制御部３６内部に配置されていてもよい。

【0060】

下位制御部３７は真空ポンプ４、荷電粒子源８、光学レンズ１などを制御するための制御信号を送受信する手段を持つ。より具体的には、上述した３次元内部構造観察を実施するために、下位制御部３７は、ベクトルパラメータを制御する手段を有する。すなわち下位制御部３７は荷電粒子線源８からの荷電粒子線が試料に到達するまでのエネルギーＥや照射角度θ（または試料回転角度φ）を変更制御することができる。図中、下位制御部３７と荷電粒子光学鏡筒２との間には照射エネルギー制御部５９を図示している。照射エネルギー制御部５９は荷電粒子線の試料への照射エネルギーＥを決定することが可能である高圧電源などを具備している。照射エネルギー制御部５９の機能を持つ高圧電源などは下位制御部３７内部にあってもよい。

【0061】

また、荷電粒子線の試料への照射エネルギーＥの変更は、荷電粒子線源からの加速電圧を変更するか、荷電粒子線が試料に照射する前に荷電粒子線を加速または減速させることが可能な光学レンズへの電圧を変更することによっても達成できる。または試料ステージに電圧を印加できる電源を備えてもよい。

【0062】

照射角度θの変更は荷電粒子線を光軸２００に対して傾斜して照射することが可能な光学レンズを制御することによって実施可能である。もしくは荷電粒子光学鏡筒２自体を傾斜させる機構を有してもよい。また、下位制御部３７には検出器３や光検出器５０３からのアナログ信号をデジタル画像信号に変換して上位制御部３６へ送信するＡ／Ｄ変換器を含む。デジタル画像信号データは上位制御部３６に送られる。下位制御部３７ではアナログ回路やデジタル回路などが混在していてもよく、また上位制御部３６と下位制御部３７が一つに統一されていてもよい。

【0063】

ステージ制御部３８は上位制御部３６よりステージ位置調整の情報が伝達され、それに応じて決められる駆動情報を駆動機構５１や５２に送信する。また、前述のベクトルパラメータである試料角度θや試料回転角度φも本系統から制御される。

【0064】

また、荷電粒子線のビーム電流量Ｉを変えることが可能な光学レンズを制御するための電流制御部も下位制御部３７中に備える。あるいは、照射エネルギー制御部５９としての高圧電源で電子源８から放出されるビーム電流量Ｉを制御してもよい。

【0065】

次に、上位制御部３６内部について説明する。上位制御部内部には、データ送受信部４０、データメモリ部４１、外部インターフェース４２、演算部４３が含まれる。データ送受信部４０は検出画像などのデータを受信するとともに、照射エネルギーＥや照射角度θや試料回転角度φを変更するためにデータを下位制御部３７やステージ制御３８に送信する。データメモリ部４１は下位制御部３７から送られたデジタル検出信号をデータ保管する。外部インターフェース４２は装置使用者が使用するキーボードやマウスなどのユーザインターフェース３４や顕微鏡画像が表示されるモニタ３５との信号送受信を行う。演算部４３は取得データやユーザからの操作情報を演算処理する。検出された画像情報はメモリ部４１から読みだしてモニタ３５上に表示させてもよいし、メモリにデータを格納することで記憶されてもよい。また、リアルタイムにモニタ３５に表示させてもよい。上位制御部とは例えばパーソナルコンピュータやワークステーションなどの計算機でもよいし、ＣＰＵやメモリなどが搭載された制御基板であってもよい。これら上位制御部３６では、データ送受信部４０経由で画像データをメモリ部４１に格納した後、演算部４３にて画像データの演算処理を実施して、その計算結果からデータ送受信部４０経由でベクトルパラメータである照射エネルギーＥや照射角度θや試料回転角度φを制御することなどが実施可能である。

【0066】

なお、図７−１に示す制御系の構成は一例に過ぎない。制御ユニットやバルブ、真空ポンプまたは通信用の配線などの変形例は、本実施例で意図する機能を満たす限り、本実施例の荷電粒子線顕微鏡の範疇に属する。すなわち各制御ブロックは、同一の装置に組み込まれても良いし、他の装置に分けられて配置されても良い。また、この方法によって得られた測定結果(画像情報)を用いて、他の計算機に情報を取り込み、測定結果の解析や表示を行ってもよい。

【0067】

荷電粒子線顕微鏡には、このほかにも各部分の動作を制御する制御部や、検出器から出力される信号に基づいて画像を生成する画像生成部が含まれている（図示省略）。制御部や画像生成部は、専用の回路基板によってハードウェアとして構成されていてもよいし、荷電粒子線顕微鏡に接続されたコンピュータで実行されるソフトウェアによって構成されてもよい。ハードウェアにより構成する場合には、処理を実行する複数の演算器を配線基板上、または半導体チップまたはパッケージ内に集積することにより実現できる。ソフトウェアにより構成する場合には、コンピュータに高速な汎用ＣＰＵを搭載して、所望の演算処理を実行するプログラムを実行することで実現できる。このプログラムが記録された記録媒体により、既存の装置をアップグレードすることも可能である。また、これらの装置や回路、コンピュータ間は図示した通信線以外にも有線又は無線のネットワークで接続され、適宜データが送受信される。

【0068】

図７−２は、試料６、検出素子５００及び光検出器５０３近傍の各部材の配置関係を示す図である。図７−２（ａ）はこれらの部材の上面図であるが、分かりやすさのため試料ステージ５は省略している。図７−２（ｂ）は図７−２（ａ）の側面図である。図７−２を用いて、ベクトルパラメータが試料回転角度φの場合の荷電粒子光学鏡筒１、試料ステージ５の駆動機構、光検出器５０３、試料６などの配置の詳細を記載する。

【0069】

図７−２では光検出器５０３が試料６の表面よりも荷電粒子光学鏡筒１側のどこかに配置されているものとする。本実施例において、図６−２で説明したように回転機構を組み合わせて用いる場合には、試料ステージ５には試料を傾けるための機構（図中Ｔ部：傾斜ステージ）と試料を回転させる機構（図中Ｒ部：回転ステージ）を有していることが望ましい。または、後述の通り、ステージ５上にステージ５とは独立して可動な傾斜機構または回転機構を備えていてもよい。なお、試料ステージ５には試料を縦や横方向に動かす機構（図中ＸＹ部：ＸＹステージ）や試料と荷電粒子光学鏡筒１との距離を変えることが可能な高さ調整機構を有していてもよい。

【0070】

ここで、試料ステージ５の試料６を傾けるための機構（図中Ｔ部）によって角度θを駆動する方向は、光検出器５０３の方向に向ける必要がある。例えば、図７−２で示したように光検出器５０３が荷電粒子光学鏡筒１の図中左側に配置されていて傾斜軸が紙面垂直方向である場合、試料６が図中左側を向くように角度θが調整される必要がある。光検出器５０３の検出面に垂直な軸を軸ａとし、試料を回転させる回転機構の回転軸を軸ｂとすると、理想的には軸ａと軸ｂが等しい（図７−２（ａ）に示すように上面からみた場合に軸ａと軸ｂが一致する）ことが望ましい。ただし、検出器の方向に傾斜できない場合は、光検出器５０３’や光検出器５０３’’のように角度ηの範囲内にあってもよい。この角度ηの範囲は最大で１８０度である。また、本実施例において３次元の内部構造を観察するためには、図で示したように試料を傾けるための機構（図中Ｔ部）の上に、試料を回転させる機構（図中Ｒ部）があることが望ましい。このようにすると、回転軸ｂによって試料６を回転させた場合に、光軸２００と試料台５００の面との位置関係が常に一定となるためである。もし、試料を回転させる機構（図中Ｒ部）の上に、試料を傾けるための機構（図中Ｔ部）がある場合は、回転軸ｂによって試料を回転すると、試料を傾けるための機構（図中Ｔ部）も回転してしまうと言った問題点がある。そのため、ベクトルパラメータのうち試料回転角度φを変化させて画像取得する場合には、試料ステージ５は試料を傾けるための機構（図中Ｔ部）の上に、試料を回転させる機構（図中Ｒ部）が配置された構成が望ましい。

【0071】

次に、図７−３を用いて、ベクトルパラメータのうち照射角度θを変化させて画像取得する場合の荷電粒子光学鏡筒１、試料ステージ５の駆動機構、光検出器５０３、試料６などとの構成の詳細を記載する。図７−３は、試料６、検出素子５００及び光検出器５０３近傍の各部材の配置関係を示す図である。図７−３（ａ）はこれらの部材の上面図であるが、分かりやすさのため試料ステージ５は省略している。図７−３（ｂ）（ｃ）は図７−３（ａ）の側面図であり、図７−３（ａ）における下側から見た配置を示している。図７−３（ｂ）は図７−３（ａ）において試料６が図中左側を向くように傾斜軸ｃを傾斜させた例であり、図７−３（ｃ）は図７−３（ａ）において試料６が図中右側を向くように傾斜軸ｃを傾斜させた例である。

【0072】

図７−３では光検出器５０３が試料６の表面よりも荷電粒子光学鏡筒１側のどこかに配置されているものとする。この例では、試料ステージ５は試料を傾けるための機構（図中Ｔ部）を有し、傾斜角度θを可変にできる構造である必要がある。なお、試料ステージ５には試料を縦や横方向に動かす機構（図中ＸＹ部）や試料と荷電粒子光学鏡筒１との距離を変えることが可能な高さ調整機構を有していてもよい。試料ステージの試料を傾けるための機構（図中Ｔ部）を駆動して角度θを変えても、試料台５００から放出される光を安定的に取得するためには、光検出器５０３方向へ試料台表面の発光領域を射影したときの面積が角度θの変化に対して大きく変化しないことが望ましい。理想的には、光検出器５０３の検出面に垂直な軸を軸ａとし、試料を角度θに傾斜させる傾斜機構の傾斜軸を軸ｃとすると、軸ａと軸ｃが等しい（図７−３（ａ）に示すように上面からみた場合に軸ａと軸ｃが一致する）ことが望ましい。軸ａと軸ｃが等しい場合には光検出器５０３からは角度θに依存せず常に試料台５００の側面だけが見えることになるため、全発光のうち検出できる光量の割合は角度θによらない。

【0073】

一方で、もし、光検出器５０３’’’の位置に検出器があると、試料を傾斜し図７−３（ｃ）の位置になった場合は光が検出されない問題が生じうる。つまり、試料傾斜軸ｃと光検出器５０３の軸ａとのなす角の大きさが所定の範囲内にないと、傾斜角度θの大きさによって試料台５００からの発光のうち検出可能な光量が異なってしまうため、取得される画像は傾斜角度θの大きさに依存した明るさになってしまい正確な三次元情報を取得できない可能性がある。

【0074】

そのため、図７−３（ａ）に示すように上面からみた場合に試料傾斜軸ｃと光検出器５０３の軸ａとがなす角度は±３０°以内であるように光検出器５０３が配置されることが望ましい。つまり図７−３（ａ）に示される通り、光検出器５０３が配置可能な限界位置における光検出器の軸ａ’および軸ａ’’がなす角ηは試料傾斜軸ｃを中心に最大でも６０°であることが望ましい。軸ｃと軸ａのなす角の角度がこの範囲内になるように光検出器を配置することで、傾斜角度に依存せず安定した明るさの画像を取得することができ、これらの画像から正確な三次元情報を取得することができる。なお、図示していないが、傾斜角度に依存せず安定した明るさの画像を取得する方法として、光伝達部ｈにおける説明で述べたような部材(光ファイバ等)を試料近傍に配置し、試料台５００からの発光を検出器まで導く構成もある。この場合、装置構成が増加し必要な検出強度(光量)が変化することになるが、傾斜角度に依存せず安定した明るさの画像を取得することができる。

【0075】

＜操作画面＞
図８に操作画面の一例を示す。三次元の内部構造を観察するために設定するベクトルパラメータ設定部として、モニタ上には照射エネルギーＥ変更部４５、照射角度変更部４６、試料角度変更部４７、試料回転角度変更部６０などが表示される。照射エネルギーＥ変更部４５に入力された数値に従い荷電粒子線の照射エネルギーが設定される。照射角度変更部４６は荷電粒子線と光軸との角度を変更するための入力窓であって入力された数値に従い荷電粒子線の光軸に対する照射角度が設定される。試料角度変更部４７は試料６を傾斜する角度を入力する入力窓であり、入力された数値に従い試料ステージが傾斜することにより試料が傾斜される。試料回転角度変更部６０は試料の回転角度φを変更するため入力窓であって入力された数値に従い試料が回転する。

【0076】

前述のようにベクトルパラメータ照射エネルギーＥは観察可能な構造物の密度に対応し、照射角度または試料角度または試料回転角度は観察する方向に対応しているので、操作画面上の入力窓はそれぞれ「密度」または「観察方向」等の表示項目であってもよい。照射角度変更部４６と試料角度変更部４７はどちらか一方だけでもかまわない。照射角度θだけ変更するのであれば試料回転角度変更部６０はなくてもよい。さらに、荷電粒子線の焦点を変更する焦点調整部４８、画像の明るさ調整部４９、画像コントラスト調整部５０、照射開始ボタン５１、照射停止ボタン５２などからなる。

【0077】

さらに、顕微鏡画像をリアルタイムで表示することが可能な画面５５、メモリ部４１に保管されている画像を表示することが可能な画面５６などを備える。なお、メモリ部４１に保管されている画像を表示させることが可能な画面５６は別ウィンドウなどで表示させてもよいし、画面５６は２つ以上ありそれぞれの画面で異なるベクトルパラメータで取得した画像を表示してもよい。また、画像を保存するための画像保存ボタン５７、画像を読みだすことが可能な画像読み出しボタン５８も表示される。

【0078】

ベクトルパラメータである照射エネルギーＥや照射角度θや試料回転角度φの設定が異なる状態で表示された複数の画像を取得し、この複数のベクトルパラメータに対応する透過荷電粒子画像を並列して表示することで、装置使用者は試料の三次元内部構造を識別することが可能となる。また、並列表示の代わりにまたは並列表示に加えて、これらの画像を任意の時間ごとに切替えて表示してもよい。この際ベクトルパラメータの大小の順に画像を表示していくことで、ユーザはより三次元構造を把握しやすくなる。なお、図８に示す表示の構成は一例に過ぎず、表示位置や表示形態などの変形例は、本実施例で意図する機能を満たす限り、本実施例の荷電粒子線顕微鏡の範疇に属する。

【0079】

また、一連の計測ステップに用いる値をテーブルデータとして記憶部(図示せず)に格納することで、操作者が一連の計測ステップに用いる全てのベクトルパラメータのうち一部を入力する手間を省略することができる。また、テーブルデータは計測する試料の特性(試料の種類や膜厚)や計測したい深度や精度などに関連付けられたデータとして格納されておいても良い。この場合、上述した試料の特性を操作者が入力するか、装置が試料を計測し自動的に判断することで、各パラメータを入力する手間を省略できるメリットがある。

【0080】

＜手動観察手順＞
次に、図９を用いて、ユーザが三次元内部構造を観察する手順について記載する。

【0081】

はじめに、ユーザは試料を搭載するための検出素子５００（発光する試料台）を準備する。次に、必要に応じて検出素子５００に所定の部材を配置する。ここで、所定の部材とは、前述の通り、試料と試料台の密着性を高めるための物質や導電性物質や光を反射するための物質や、何らかの所定のガス材などである。もし、所定の部材を配置する必要がなければ本ステップは不要である。次に、ユーザは検出素子５００上に試料を搭載する。次に、荷電粒子顕微鏡または光学顕微鏡に搭載し観察するステップに移動する。ステップＡは光学顕微鏡にて観察するステップで、ステップＢは荷電粒子顕微鏡にて観察するステップである。

【0082】

光学顕微鏡による観察ステップＡでは、ユーザは、まず、試料が搭載された検出素子５００を光学顕微鏡装置内に配置する。前述のとおり、光学顕微鏡装置に配置する際に、スライドガラスの形状である必要があれば、検出素子５００をスライドガラス上に載せることも可能である。次に、ユーザは光学顕微鏡にて観察する。観察が終了したら、荷電粒子顕微鏡装置による観察ステップＢに移る。なお、後述するように光学顕微鏡がデジタルデータを取得可能であれば、上位制御部３６にデータを移して、モニタ３５上に光学顕微鏡画像を表示させてもよい。

【0083】

荷電粒子顕微鏡にて観察するステップＢでは、ユーザは、はじめに、前述のように試料が搭載された検出素子５００を荷電粒子顕微鏡装置内に配置する。次にステップ６１では、モニタ３５上の操作画面４４上にて所望のベクトルパラメータである照射エネルギーＥや照射角度θ（試料回転角度φ）、あるいはビーム電流量Ｉを設定する。次のステップ６２では、荷電粒子顕微鏡により荷電粒子線を試料に照射して試料台５００からの発光を検出する。次のステップ６３では、ステップ６２で取得した画像をモニタ３５上の画面５５に表示する。次のステップ６４で、前述の操作画面でのユーザの入力に基づいて光学レンズの励磁強度を調整することで、所望の位置で焦点を合わせる。次のステップ６５で、前述の操作画面でのユーザの入力に基づいて、プリアンプ基板５０５の中の検出信号の増幅率を変化させるなどして、所望の位置で画像の明るさやコントラストを調整する。所望の画像が取得できたら、次のステップ６６で、画像保存することにより、メモリ部４１に画像データを格納する。次のステップ６７では、ユーザはベクトルパラメータを変更するかどうかの決定を行う。ベクトルパラメータを変更する必要があればステップ６１に戻る。変更する必要がなければ、荷電粒子顕微鏡装置による観察が終了し、荷電粒子顕微鏡装置外に試料を取り出す。必要に応じてＡの光学顕微鏡による観察ステップに戻る。ステップＡとＢは入れ替えてもよい。また荷電粒子顕微鏡装置と光学顕微鏡装置が一体化された装置であれば、プロセスＡとＢを交互に繰り返してもよいし、同時に観察してもよい。このステップを実施することによって、光学顕微鏡にて観察した試料における三次元内部構造を荷電粒子線顕微鏡にて観察することが可能となる。

【0084】

＜自動観察手順＞
次に、図９のステップＢにおける三次元内部構造観察のための一連動作及び画像保存を実施するための手順を自動的に実施するための構成について説明する。具体的には、ステップ６１からステップ６７までを自動化すれば実施が可能である。

【0085】

例として、図１０で示した操作画面７０を用いて、試料角度θを変更して三次元内部構造観察を実施する方法について以下に説明する。操作画面７０では初期試料角度θ設定部７１と、最終試料角度θ設定部７２とその間の刻み幅を決定する変更角度Δθ設定部７３を具備する。初期試料角度θ設定部７１で設定された角度から最終試料角度θ設定部７２で設定された角度になるまで、変更角度Δθ設定部７３で設定された角度Δθごとに、角度を変更する。操作画面７０は、垂直設定バー７４と水平設定バー７５と、顕微鏡画像が表示される画面７６を具備する。垂直設定バー７４と水平設定バー７５は、角度θを変更した際に、画像の中心に常に観察される位置を決定する物体を指定するためのものである。垂直設定バー７４と水平設定バー７５の交差する点が自動画像取得基準点７７である。ユーザは、垂直設定バー７４と水平設定バー７５が交差する点である自動画像取得基準点７７が観察したい位置に一致するように、垂直設定バー７４と水平設定バー７５の位置を調整する。

【0086】

なお、自動画像取得基準点７７の設定方法は、ユーザが試料の特定の位置を選択できる手段であればよく、上述した方法に限られない。また、自動画像取得基準点７７は必ずしも画面の中心でなくてもよい。図では、自動画像取得基準点７７が内部物質９０１に一致するように設定されている様子を示している。図の状態に設定されると、試料の傾斜θを変更しても内部物質９０１が常に画像中心にすることができる。さらに、傾斜角度θを変更すると焦点や画像明るさも変動するが、自動画像取得基準点７７で定められた部位を基準に位置、焦点、明るさが自動調整される。前記で示した照射角度θを変更するプロセス及び制御部は試料回転角度φであってもよい。

【0087】

例えば、画面の中心の内部物質９０１の位置は、試料６が傾斜すると図中における左右方向からずれた位置に移動する。そのため、ベクトルパラメータである傾斜角度θまたは試料回転角度φを変更する前後で、基準点として設定された部位が画面の中心からずれないように、ステージ制御部３８経由で駆動機構５１に信号が伝わり、自動で位置を補正するようにしても良い。なお、自動画像取得基準点は必ずしも画像中心に固定されなくてもよい。透過荷電粒子画像における自動画像取得基準点とされた試料位置が変わらないようにステージの位置を補正することが重要である。これら自動調整は図７−１で示した上位制御部３６内部のデータ送受信部４０、データメモリ部４１、演算部４３にて実施する。特に自動位置把握は演算部４３が自動画像取得基準点７７の構造物が傾斜角度θまたは試料回転角度φの変更によってどこに移動したかを特定する画像計算を行うことで実施する。その後、演算部４３によって、自動画像取得基準点７７の位置に焦点が合うように自動で焦点調整が行われ、自動画像取得基準点７７の位置の明るさが試料傾斜前の明るさと一致するように明るさ調整が行われる。これによって、自動画像取得基準点とされた試料位置においては、傾斜角度変更前後で、焦点が常に合った状態となりかつ明るさを一定とすることができる。

【0088】

なお、自動画像取得基準点７７は一点しか図示していないが、複数あってもよいし、面で指示することによって、自動調整精度を高めてもよい。これらの設定が済んだら、自動取得開始ボタン７８を押すことによって、図９で示したステップ６１からステップ６７までを自動的に実施することが可能である。

【0089】

この間に取得された画像はデータメモリ部４１に保管される。データメモリ部４１に保管された連続的に傾斜された画像をモニタ上に順次読みだしたり並べたりすることによって、試料内部の三次元内部構造を装置使用者が識別することが可能となる。以上では、試料傾斜についてだけ述べたが、照射エネルギーＥや荷電粒子線の光軸との照射角度θを変更する場合も同様である。その場合は上述の説明において、「試料角度θ」を「照射エネルギーＥ」、「荷電粒子線の光軸との照射角度θ」、または「ビーム電流量Ｉ」に置き換えて読めばよい。または、試料傾斜角度θではなく試料回転角度φを変更して画像を自動的に取得してもよい。さらに、照射エネルギーＥと試料傾斜θのベクトルパラメータを同時に変更して画像を自動的に取得してもよい。

【0090】

上で述べたように手動または自動で取得された画像をコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）によりトモグラフィ化してもよい。ＣＴ化された画像であればモニタ上で自由に画像を回転させて、三次元内部構造を表示させることができるため操作者は試料の内部状態をよりよく観察することができる。さらに、操作者が所望する断面だけ取り出して表示させることができる。ＣＴ化された画像を構成することで、試料の切片などを作製することなく断面画像または切片画像を取得することが可能となる。また、迅速に細胞などの試料をＣＴ化したい場合は試料を自動で動かしてもよい。この場合は、照射角度θまたは試料回転角度φと荷電粒子線エネルギーＥと荷電粒子線のビーム電流量Ｉをセットにしてリアルタイムに可変すれば、短時間で多くの情報を得ることができる。

【0091】

また、図示しないが、上記保存または表示している２枚の画像を数度だけ傾斜させて立体観察するステレオ観察をしてもよい。ステレオ観察時には、角度を変えて撮像した２枚の画像を並べて立体視してもよいし、青や赤などの２種類の色を変えた画像を重ね合わせた画像を用いてもよいし、３次元観察が可能なモニタなどの表示部に３次元表示させてもよい。また、上記ではコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）によりトモグラフィ化した例がユーザにとって利便性が高いと思われるが、３次元構築する像の形成方法として他の方法を用いることも可能である。

【0092】

＜免疫染色＞
また、金コロイド等の標識を付加した免疫染色を試料に実施してもよい。標識をつけることによって、試料内部の形態構造だけでなく検出したいたんぱく質等が試料内部のどこに局在しているかなどを観察することが可能となる。図１１では試料に標識をつけて観察する場合を考える。この場合の試料は例えば培養細胞や生体から摘出された細胞である。金標識９０９が接合した抗体を付加した材料を細胞内に注入すると、細胞内部のたんぱく質等に特異的に反応して結合する（抗原抗体反応）。荷電粒子線９００は金標識９０９によって大きく散乱をうけるので、投影画像（または検出画像）９１０は図のようになり、金標識９０９が集まって局在化した場所がわかる。この結果、検出したいたんぱく質等の場所が把握できることになる。

【0093】

また、図１１（ａ）から図１１（ｂ）のようにベクトルパラメータを変更（図では試料角度θを変更）して三次元内部構造観察やＣＴ観察などを実施することによって、細胞内部のどこに検出したいたんぱく質等が集積しているかなどを把握することが可能となる。さらに、金標識９０９は数ｎｍから数μｍなど様々な大きさがあるが、集まる量または密度によって荷電粒子線９００の散乱量が異なる。つまり、例えば照射エネルギーＥを調整することで、投影画像９１０の中で色が薄い金標識部９１１（あるいは図示しない色が濃い金標識部）などを検出することが可能となる。この投影画像９１０は特異的に集積しているたんぱく質の位置や密度などが表されたものであるので、ユーザはこの画像を見ることで細胞内部のたんぱく質の位置や密度を把握することが可能となる。前述の金標識部の大きさや色の濃さなどは、装置使用者が観察するだけでもよいし、上位制御部３６の中で大きさ計測や色の濃さ判定を実施してもよい。

【0094】

また、図示しないが荷電粒子線を照射したことによって発生するＸ線等の放射線を取得してもよい。これによって、試料内部の元素や化学状態の分析を行うことができる。

【0095】

＜顕微鏡情報交換の説明＞
前述の通り、試料台上に観察したい試料を搭載し、同一試料台上の試料の光学顕微鏡観察と荷電粒子顕微鏡観察を実施できる。このとき、光学顕微鏡及び荷電粒子顕微鏡で同一部位を正確に観察できることが望ましい。そこで、光学顕微鏡と荷電粒子顕微鏡で同一部位を観察できる装置システムに関して図１２を用いて説明する。光学顕微鏡６０２にはＣＣＤカメラ６０３が具備される。ユーザはまず光学顕微鏡にて試料の画像を取得する。ＣＣＤカメラ６０３と上位制御部３６は配線６０４で接続されている。これにより、光学顕微鏡のデジタル画像情報を図中点線矢印で示したように上位制御部３６に送ることが可能となる。また荷電粒子顕微鏡で取得される画像情報も同様に上位制御部３６に送られるので、同一部位の顕微鏡像の比較が同一モニタ３５上で実施することが可能となる。ユーザはモニタ上で光学顕微鏡によって取得した画像を見ながら、荷電粒子顕微鏡で画像取得する試料位置を探す。これによって光学顕微鏡での観察結果に基づいて所望の試料位置を一次荷電粒子線の照射位置に配置することができる。また、画像マッチングや類似度計算などの演算処理によって光学顕微鏡画像と類似した形状の試料位置を探して、自動的に荷電粒子線の照射位置として設定してもよい。なお、図示しないが、光学顕微鏡と上位制御部との間は、別のコンピュータが介在してもよいし、インターネットなどの通信ラインを経由して画像情報を送信してもよい。

【0096】

また、図１３のように荷電粒子顕微鏡装置６０１の中に、簡易的な光学顕微鏡２０２を配置してもよい。“簡易的”とは例えば、大きさが小さい、価格が安いなどのメリットを有しつつ、必要な光学的な顕微鏡観察が実行できるという意味である。光学顕微鏡２０２は例えば光学レンズなどの簡単な結像系とＣＣＤカメラなどの撮像素子を有するものである。光学顕微鏡２０２からの画像情報は同様に上位制御部３６に配線を経由して接続される。また、荷電粒子顕微鏡の光軸２００と光学顕微鏡２０２の光軸２０１との距離は常に一定であるので、光学顕微鏡にて観察した後に、場所移動をする距離も常に一定である。そのため、この距離をメモリ等に予め記憶しておき、ステージ移動指示が入力されたときにこの距離値をステージ移動量として駆動部５１，５２を制御する構成とすれば、ユーザは非常に簡単な操作で荷電粒子顕微鏡の光軸２００と光学顕微鏡２０２の光軸２０１の間の移動指示をすることができる。したがって、簡易的な光学顕微鏡２０２と荷電粒子顕微鏡６０１とで同一試料部位を観察することは、ユーザの操作が非常に容易となる一方、装置の大きさやコストを抑えることができ効率的である。

【0097】

また他の効果として、光学顕微鏡６０２と光学顕微鏡２０２ではいずれも光を用いた顕微鏡なので、ほぼ同じ見え方の画像が得られるため、光学顕微鏡６０２で観察された試料と同じ部位を荷電粒子顕微鏡６０１にて観察することが非常に容易となる。具体的には、以下のような手順で観察を行う。ユーザはまず荷電粒子顕微鏡装置の外に設置された光学顕微鏡６０２で試料の所望の位置を観察した後、試料が搭載された試料台を荷電粒子顕微鏡装置内部に導入する。次に光学顕微鏡２０２を用いて光学顕微鏡６０２で観察した位置を特定する。この作業はユーザが手動で行ってもよいし、光学顕微鏡６０２で取得した画像に基づきマッチングや類似度計算などの演算処理をすることで自動的に行ってもよい。次に前述の方法で光学顕微鏡２０２から荷電粒子顕微鏡６０１へ試料を移動し、光学顕微鏡２０２で特定した試料位置を一次荷電粒子線の照射位置に配置する。次に荷電粒子顕微鏡により透過荷電粒子画像を取得する。このように光学顕微鏡２０２を、荷電粒子線顕微鏡装置外部の光学顕微鏡と荷電粒子顕微鏡との観察位置合わせのために用いることで、荷電粒子顕微鏡装置外部の光学顕微鏡で観察した試料位置を荷電粒子顕微鏡で観察するのが非常に簡単となる。

【0098】

なお、図１４のように光学顕微鏡２０２の場所は、試料台５００の直下に配置できるようにして、荷電粒子顕微鏡の光軸２００と光学顕微鏡２０２の光軸２０１とを同軸にしてもよい。荷電粒子顕微鏡の光軸２００と光学顕微鏡２０２の光軸２０１は同軸であり同一部位を観察することが可能であり、また、光学顕微鏡６０２と光学顕微鏡２０２ではいずれも光を用いた顕微鏡なので同一試料部位を観察するのが非常に簡単となる。この結果として、図１３の構成よりもさらに容易に、光学顕微鏡６０２で観察された試料と同じ部位を荷電粒子顕微鏡６０１にて観察することができる。なお、光学顕微鏡２０２にて観察する場合に、光検出器５０３は取り外してもよいし、光検出器５０３に移動機構を持たせて位置を変更できるようにしてもよい。また、検出素子５００からの光を光学顕微鏡２０２経由で取得して透過荷電粒子顕微鏡画像を形成してもかまわない。

【0099】

また、図１４の場合にも、図１３で説明したのと同様、光学顕微鏡２０２を、荷電粒子線顕微鏡装置外部の光学顕微鏡と荷電粒子顕微鏡との観察位置合わせのために用いることができる。この場合には、光学顕微鏡２０２から荷電粒子顕微鏡６０１へ試料を移動するステップは不要となるというメリットがある。

【0100】

光学顕微鏡で観察した場所を荷電粒子線顕微鏡内ですぐに見つけることが難しい場合がある。そこで、次に光学顕微鏡と荷電粒子顕微鏡間での位置情報共通化する手段に関して以下説明する。顕微鏡間で位置情報を共通化する手段としては、試料台上の印を使って観察したい場所を簡単に見つける方法が考えられる。図１５に、試料６が搭載された検出素子５００を上面からみた図を示す。試料台である検出素子５００は、検出素子５００に対する試料の位置関係を把握することが可能なマーキング９１３を備える。マーキング９１３は試料台の所定の位置に形成されたものであって、例えば定規のように刻み幅が既知な印である。水平方向、垂直方向ともにマーキングがついているので、どこの場所を観察していたか把握することが可能となる。また、検出素子５００上にマーキングすることが難しい場合は、マーキングを備えた土台５０１上に検出素子５００を配置すれば試料台上のどこに試料が配置されているかを把握することが可能となる。また、試料台上のどこかに印となる点を複数点記録して、それを基準点にして観察位置を把握してもよい。例えば、試料自体を基準点としてもよい。マーキングに基づいて試料の位置を記憶する作業は装置使用者が行ってもよいし、上位制御部３６等上で実施することによって試料台上のマップデータを作成し、メモリに記憶されたマップデータをもとに位置探しをしてもよい。

【0101】

以上述べたように、本実施例での荷電粒子線装置、試料観察方法、試料台、観察システムにより光学顕微鏡にて観察された試料の三次元内部構造を荷電粒子顕微鏡にて実施することが可能となる。

【実施例2】

【0102】

＜三次元観察の原理説明＞
図６−２で説明した内容に加え、試料９０４をＸ軸とＹ軸にて傾斜させることで、計測点を増やした三次元観察を行う構成について説明する。さらに、Ｘ軸もしくはＹ軸の少なくとも一方とＺ軸の回転によって、計測点を増やした三次元観察を行う構成について説明する。これにより、高精度な三次元観察を行う事が出来る。

【0103】

また独立した他の効果として、試料における任意の箇所を複数の角度から観察可能にすることで、一方向の観察からでは計測が困難な箇所についても計測を行う事が出来る。

【0104】

また独立した他の効果として、計測点を増加させるため相対角度を大傾斜にして試料を観察することなく、相対的に少ない傾斜角度にて計測点を増やした三次元観察を行うことができる。これにより、試料の大傾斜が不要になり、大傾斜させるための傾斜装置の大規模化や試料室における空間的配置の制約を回避することができる。

【0105】

図１６を用いて、荷電粒子線を用いて試料の三次元観察を実施するための原理について説明する。すなわち図１６（ａ）にて、荷電粒子線９０５が照射される際の試料９０４との相互関係を示す。荷電粒子線９０５が試料９０４に照射され、試料上を走査された結果、検出素子５００によって光信号に変換された信号を顕微鏡画像としてモニタ上に表示させることを考える。

【0106】

図１６（ａ）に図示したように、試料９０４の内部には内部物質９２１，９２２，９２３が存在することとする。試料９０４は細胞等であると考えると、内部物質９２１，９２２，９２３は細胞核等の細胞内小器官やボイドなどに対応する。ここで検出素子５００上のＹ軸のまわりに試料を回転させる。試料を回転させることで荷電粒子線の入射方向と試料との相対角度を変え、相対角度を変えた複数の画像を取得する。この複数の画像に基づいて、試料の外形および内部構造の三次元的位置配置を把握することが可能となる。

【0107】

図１６（ａ）に、Ｙ軸のまわりに試料を回転させる前の荷電粒子線９０５を試料９０４に照射する様子を示す。この図１６（ａ）では、回転軸であるＹ軸と同一方向から試料を見た様子を図示する。荷電粒子線９０５の光軸は矢印で示した方向とする。また、Ｘ軸は回転軸であるＹ軸に対して垂直に交わる検出素子５００上の線を示す。

【0108】

この状態で得られる顕微鏡画像を図１６（ａ）下段９２５に示す。この図では、内部物質９２１と内部物質９２２が光軸からみて一部重なっており、傾斜を行わない状態では内部物質９２２の一部を観察することが困難になっている。

【0109】

その理由として、内部物質９２１と内部物質９２２の密度が類似している場合、それぞれの内部物質によって散乱される荷電粒子数は類似することが挙げられる。また、それぞれの内部物質を透過して検出素子５００に到達する荷電粒子数も類似する。その結果、取得される顕微鏡画像では内部物質９２１と内部物質９２２の明暗の差がほとんどなくなるため、これらの上下関係を識別することができない。さらに、内部物質９２１，９２２と内部物質９２３との上下関係も識別することができない。

【0110】

次に、試料９０４の外形や内部物質９２１，９２２，９２３の形態や上下関係を識別するために、荷電粒子線９０５を試料９０４に斜めから照射することを考える。図１６（ｃ）には、Ｘ軸のまわりに回転して試料台５００を角度Φだけ傾斜する様子を示す。このときに得られる顕微鏡画像が図１６（ｃ）の下図(９２７)である。

【0111】

図１６（ａ）の顕微鏡画像の下図(９２５)と比較すると、傾斜したことにより内部物質９２２が内部物質９２１に隠れることなく観察される。また、内部物質９２１，９２２および９２３との間の相対距離が変化する。さらに、試料９０４の顕微鏡画像上での大きさも変化する。つまり、傾斜前の画像と傾斜後の画像を比較して、画像上での試料の変化量を見ることによって、試料および内部物質の三次元構造を観察することが可能となる。さらに、Ｘ軸またはＹ軸における回転を連続的に行って画像を取得することによって、試料の三次元構造をより詳細に把握することが可能となる。このようにして得られた複数の画像をモニタ上に順次表示し、もしくは互いを並べることによって、試料の三次元構造をより正確に識別することが可能となる。

【0112】

たとえば、試料を回転させていない状態を０°として、Ｘ軸を−６０°から＋６０°まで１０°ごとに回転して各回転角度で画像を取得することが考えられる。ここで指定する角度情報は、特にこれらの角度に限定されるわけではない。また、試料の特性や観察したい情報によって、システムに格納されていても良い。

【0113】

このようにして観察した際の、試料と荷電粒子線との相対角度をステレオ投影した図を図１７（ａ）の点の集合２４０で図示する。ここではウルフネットで説明するが、他のステレオ投影した図でも説明可能である。この図では、円周２５０上を試料表面に設定した際の試料に照射される荷電粒子線の相対角度を、連続する点の集合２４０で示している。三次元構造をより詳細に把握するためには、なるべく小さい角度ごとに画像を取得することが望ましい。

【0114】

また、なるべく高角度まで傾斜させて画像を取得することが望ましいが、傾斜角度が大きくなるにつれて荷電粒子線が試料内を通過する距離が長くなるため、試料や内部物質等によって散乱される荷電粒子の数は増加する。その結果、検出素子まで到達する荷電粒子の数が少なくなるため、試料を高角度に傾斜して観察する場合は明瞭な画像が得られないこともある。そのため、図１６の試料９０４のように観察対象が水平面上に広がるような試料の場合は、通常は５０°から７０°程度を傾斜角度の上限として観察を行うと良い。なお、本角度はあくまで一例を示しているに過ぎず、観察する試料によって好ましい角度が異なることも本発明の思想の範囲に含まれる。

【0115】

さらに、取得された画像をコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）によりトモグラフィ化してもよい。画像をトモグラフィ化することにより、モニタ上で自由に画像を回転させて試料の三次元構造を表示させたり、試料のある断面だけ表示させたりすることができる。このようにトモグラフィ化された画像を作ることで、試料を切片にすることなく断面画像または切片画像を取得することが可能となる。また、内部情報を表す方法として他の方法を用いても良い。

【0116】

次に、回転軸を増やして二軸にすることによって、より正確な三次元観察を行う方法について記載する。本願で説明する試料の場合、上記にて述べたように、傾斜角度を大きくした場合は明瞭な画像を得ることが難しいため、明瞭な画像が得られる傾斜角度の上限が５０°から７０°であることが多い。よって、傾斜角度をこの上限の角度から９０°までの範囲にした場合の画像情報を得ることが困難となる。このように、画像が得にくい領域、つまり情報欠損領域が存在する。正確な三次元構造を把握したい場合等は、この情報欠損領域をなるべく小さくすることが必要である。たとえば連続的に傾斜して得られた画像をトモグラフィ化し、試料の体積等の測定をしたい場合、情報欠損領域をなるべく小さくすることが望ましい。

【0117】

この情報欠損領域を小さくする方法として、回転軸を二軸に増やしてより多くの方向から試料を観察する手法について、以下に説明する。Ｘ軸の回転軸に加えて、Ｘ軸に直交する検出素子５００上のＹ軸で試料を回転させることを考える。試料９０４とＸ軸、およびＹ軸や荷電粒子線９０５等の相互関係は図１６（ｂ）に図示されている。

【0118】

Ｙ軸を回転軸として回転し、試料台５００を傾斜させ荷電粒子線９０５を斜めから照射した様子が図１６（ｂ）である。この状態で得られる顕微鏡画像が図１６（ｂ）の下図９２６である。画像上での内部物質９２１，９２２および９２３の間の距離と試料９０４の外形は、傾斜する前の画像である図１６（ａ）の９２５と比較して変化する。また、Ｘ軸を回転軸として回転して試料を傾斜して得られる画像である図１６（ｃ）の９２７と比較しても、内部物質９２１，９２２および９２３の間の距離や位置関係と試料９０４の外形は変化する。このように、回転軸を一軸から二軸に増やすことにより、より多くの方向から観察することが可能となり、試料の内部物質および外形の三次元構造をより正確に把握することができる。

【0119】

試料を回転していない状態を０°として、−６０°から＋６０°まで１０°ごとにＹ軸を回転して各回転角度で画像を取得した際の、試料と試料に照射される荷電粒子線の相対的な位置関係を示したステレオ投影図を、図１７（ａ）に点の集合２４１で示す。Ｘ軸を回転軸とした場合の、試料９０４と試料に対する相対的な荷電粒子線の照射角度を示す点の集合２４０に加え、Ｙ軸を回転軸とした場合の相対角度を示す点の集合２４１が点の集合２４０に直交する位置関係で分布する。Ｘ軸に加えて、直交するＹ軸を回転軸として追加することで、情報欠損領域を小さくすることができる。これにより、より正確な三次元構造の把握が可能となる。

【0120】

以上では二つの回転軸をそれぞれ独立に回転させることを考えたが、二軸を連動させて動かしてもよい。たとえば、図１７（ｂ）において、まず線分Ｘ軸を回転軸として＋３０°回転させ、次にＹ軸を回転軸として−６０°から＋６０°まで１０°ごとに回転させ、各回転角度で画像を取得することを考える。このようにして取得される画像における試料と荷電粒子線の相対角度は、図１７（ｂ）のステレオ投影図（ウルフネット）上に点の集合２４２として図示される。このように二つの回転軸を連動して回転させることにより、さらに多方向からの観察が可能となる。

【0121】

さらにＸ軸，Ｙ軸をそれぞれ−６０°から＋６０°まで傾斜することを考えると、試料に照射する荷電粒子線の相対角度は、図１７（ｃ）のステレオ投影図（ウルフネット）の斜線部２４５の内部で自由に変化させることができる。斜線部２４５内で様々な方向から試料を観察することができ、試料の三次元構造をより正確に把握することが可能となる。

【0122】

以上では、試料台を傾斜させるように二つの回転軸を導入することを考えたが、試料台に垂直な方向を軸として、試料を試料台平面上で回転することが可能な回転軸を導入し、多方向からの観察を可能にする方法について図１８を用いて説明する。

【0123】

図１８に、試料台５００をＸ軸にて傾斜することが可能な機構と、試料台５００の面に直交し試料を試料台平面上かつＺ軸を中心に回転することが可能な回転機構を示す。なお、Ｘ軸はＺ軸に対し独立に作動するものと考える。つまり、Ｚ軸のまわりに試料を回転させた場合でも、Ｘ軸は傾斜せず、試料９０４または試料台５００のみが回転することとする。逆に、Ｘ軸のまわりに試料を傾斜した場合は、Ｚ軸も試料と同様に傾斜することとする。

【0124】

Ｚ軸を回転させずにＸ軸のみを傾斜させた場合は、上記の回転軸が一軸である場合と同様である。この際、Ｘ軸のまわりに−６０°から＋６０°まで１０°ごとに回転し、各回転角度で画像を取得した場合、試料９０４と荷電粒子線９０５の相対角度は図１８（ａ）のステレオ投影図の点の集合２４０のようになる。ここではシュミットネットで示した。このステレオ投影図では、円周２５０上を試料表面に設定した際の試料に照射される荷電粒子線の相対角度を示す。

【0125】

次に、Ｚ軸のまわりに試料を９０°回転させた後、Ｘ軸まわりに回転させることを考える。この場合は図１８のＹ軸のまわりに回転させた場合と同様になる。この状態で、上記と同様にＸ軸のまわりに−６０°から＋６０°まで１０°ごとに回転し、各回転角度で画像を取得した場合、試料９０４と荷電粒子線９０５の相対角度は点の集合２４１のようになる。

【0126】

さらにＺ軸の回転角度を変更することで、観察方向を増やすこともできる。たとえばＺ軸のまわりに、荷電粒子線が試料に照射される方向から見て時計回りに４５°回転した後、同様にＸ軸のまわりに−６０°から＋６０°まで１０°ごとに回転し、画像を取得することを考える。この際の試料と荷電粒子線の相対角度は点の集合２４３のようになる。

【0127】

また、以上ではＺ軸のまわりに回転した後にＸ軸のまわりに回転することを考えたが、この回転の順序は逆でも構わない。たとえば、Ｘ軸のまわりに４５°回転した後、Ｚ軸を１０°ごとに３６０°回転させ、各回転角度で画像を取得することを考える。このようにして得られる画像の試料と荷電粒子線の相対角度をステレオ投影図上に示すと、円形の点の集合２４４のようになる。

【0128】

Ｘ軸を−６０°から＋６０°まで回転し、Ｚ軸を０°から９０°まで回転することを考えると、試料に照射する荷電粒子線の相対角度は、図１９（ｂ）のステレオ投影図（シュミットネット）の斜線部２４５の内部で自由に変化させることができる。斜線部４６内で様々な方向から試料を観察することによって、試料の三次元構造をより正確に把握することが可能となる。また情報欠損領域も大幅に小さくすることができる。
＜試料台の説明＞
上記の三次元観察を可能にする試料台について、以下に説明する。試料を傾斜することができる二つの回転軸を有することで、多方向からの観察を可能にする試料台を図２０に示す。試料ステージ５００上にモータ８１０を備え、モータ回転軸８１１に試料台５００が固定される構成となっている。試料ステージ５００は、傾斜軸８０１のまわりに傾斜することができる傾斜駆動機構(角度制御部)を備えている。モータ８１０はモータ回転軸８１１が試料ステージの傾斜軸８０１に直交するように配置されており、支持部材８０５によって試料ステージ５００に固定される。モータ回転軸８１１には試料保持部材８１２が備えられており、モータ回転軸８１１とともに回転することが可能である。試料保持部材８１２には着脱可能で発光部材を有する試料台５００が取り付けられる。以上の構成によって、試料ステージ８００の傾斜およびモータ８１０の回転による、二つの軸での回転が可能となる。

【0129】

次に、試料を試料ステージ上で回転することができる回転軸と、試料を傾斜することができる傾斜軸を有する試料台を図２１に示す。試料ステージ８００上に回転台８２０を備え、その上に着脱可能で発光部材を有する試料台５００が取り付けられている。試料ステージ８００は傾斜軸８０１のまわりに傾斜することができる傾斜駆動機構(角度制御部)を備えている。回転台８２０は試料ステージ８００に直交する方向を回転軸とする回転駆動機構(角度制御部)を備えている。回転台８２０上に取り付けられた試料台５００は回転台８２０とともに回転することができる。以上の構成によって、試料ステージ８００による傾斜および回転台８２０の回転による、二つの軸での回転が可能となる。また、二つの軸を回転(傾斜)させるためには必ずしも２つの駆動部を有する必要は無く、１つの駆動部から得られる動力を用いて二つの軸を制御することもできる。

【0130】

また、図示はしていないが、モータ８１０と試料台５００との間に回転運動を与える部材や回転運動を他の運動に変える部材を配置することで、モータ８１０の位置に拘らずに上記の構成のいずれかを実現することも可能である。回転運動を与える部材の例として、歯車やチェーン、ベルトなどがあり、回転運動を他の運動に変える部材の例として、カム機構やリンク機構などが挙げられる。

【実施例3】

【0131】

実施例１または実施例２では試料台が発光素子である構成について説明した。本実施例では、試料台は荷電粒子線が照射されると電子と正孔を発生させることが可能な半導体検出素子である場合について説明する。以下では、実施例１と同様の部分については説明を省略する。

【0132】

図２２を用いて原理及び構成に関する説明を行う。荷電粒子線が照射されると電子と正孔を発生させることが可能な試料台５１８上に試料６を備える。試料台５０１は半導体検出素子などであり、内部にはＰ層、Ｎ層及び空乏層などが存在する。この場合にも、実施例１と同様、この試料台５１８は試料の内部を散乱または透過してきた荷電粒子を検出する。試料台兼検出素子は上層部５１２と下層部５１３などの薄層を備える。この薄層は電気を流すことが可能な材料であり例えば金属膜などである。図中の薄層は全面に記載されているが、一部にあってもよい。

【0133】

試料内で密度が高い部位５０８と密度が低い部位５０９がある場合を考える。試料内で密度が高い部位５０８に一次荷電粒子線５１０が照射された場合、荷電粒子線は大多数が後方散乱されるため、検出素子５１８には荷電粒子線は到達しない。一方、試料内で密度が低い部位５０９に一次荷電粒子線５１１が照射された場合、荷電粒子線は検出素子５１８まで透過することが可能となる。検出素子５１８まで到達した荷電粒子線は検出素子５１８内部で電子正孔対５１４を発生する。電子正孔対５１４が発生したことにより、正孔または電子は上層部５１２および下層部５１３に引き寄せられる。上層部５１２と下層部５１３間に、配線５１６などを介して本試料台兼検出素子外にある抵抗５１５が接続されていると、前述の電子正孔対により電流Ｉが流れることが可能となるため結果的に抵抗５１５間に電圧Ｖが発生する。この電圧Ｖを増幅器５１７で増幅することによって信号が増幅できる。これら一連の結果、検出素子５１８からの信号を取得することによって試料内部の密度差を検出することが可能となる。

【0134】

荷電粒子線の固体内平均自由行程は荷電粒子線の加速電圧に依存するが数十ｎｍから数十μｍである。そのため、検出素子５１８の上面の上層部５１２に厚みは同程度の厚みとする必要がある。また、図中試料６は上層部５１２と接触しているが、試料が生体試料などの場合、毒性などの関係から上層部５１２上に試料が搭載できないこともある。そこで、コラーゲンのような生体試料と親和性が高い材料を塗布してもよい。上層部５１２と試料６との間に配置してもよい。

【0135】

また、実施例１で説明したように、試料６が含水試料などの場合は、試料周辺に薄い膜７０２を配置してもよいし、試料内部の水分をイオン液体などの置換物質７０３としてもよい。

【0136】

図１７に、本実施例の半導体検出素子を用いて三次元内部構造観察を実施するための装置構成を示す。図２３では試料ステージ５上に試料台となる半導体検出素子５１８が配置される。ステージ５に具備された検出素子５１８からは配線５０９経由でプリアンプ基板５０５が接続される。プリアンプ基板５０５は配線５０７などを経由し下位制御部３７に接続される。図では、プリアンプ基板５０５は筐体７内部にあるが筐体７外部にあってもよい（例えば図中のプリアンプ５４部）。試料台５１８を傾斜する際に、試料台５１８が試料ステージ５から落ちることがないようにする必要があるため、試料ステージ５上に試料台５１８を配置する位置を決めることが可能な固定部材５０６が具備されている。この他に試料台５１８と試料ステージ５との間に図示しない固定部材があってもよい。これにより試料台５１８の固定ができ位置ずれ防止をすることができる。試料台を装置内部に導入するまたは装置外部に取り出す際は、配線５０９を接続しまたは取り外して、試料ステージ５に対して試料台５１８を着脱する。

【0137】

また、マイクロチャネルプレート（ＭＣＰ：Micro-Channel Plate）や他の粒子検出器でも本実施例を実現できる。具体的な装置構成は省略するが、光電変換部分や配線が異なる以外は、本実施例に述べた内容と同等の構成で実現できる。

【実施例4】

【0138】

以下の実施例で「大気圧」とは大気雰囲気または所定のガス雰囲気であって、大気圧または若干の負圧状態の圧力環境のことを意味する。具体的には約１０⁵Ｐａ（大気圧）から〜１０³Ｐａ程度である。

【0139】

＜大気圧の荷電粒子線装置観察時の説明＞
次に、図２４を用いて、大気圧下で観察可能な荷電粒子線装置を用いた例を説明する。荷電粒子顕微鏡の基本構成は実施例１(例えば図７の構成)および実施例２にて説明したものと同じなので、本実施例では主に大気圧観察用装置の特徴のみ説明する。

【0140】

図２４に、本実施例の荷電粒子顕微鏡の全体構成を示す。本構成では、荷電粒子光学鏡筒２が筐体２７１にはめ込まれおり、真空封止部材１２３にて真空シールされる。筐体２７１は柱２６９によって支えられている。柱２６９は土台２７０によって支えられている。図中柱２６９は一つだけ図示しているが筐体を支えるために実際は複数本あるのが好ましい。この構成によって、試料６の雰囲気状態が装置外部と同等になるので、試料状態を完全な大気下状態に曝すことが可能となる。

【0141】

荷電粒子光学鏡筒と試料の間には荷電粒子線が透過または通過可能な隔膜１０が設けられている。この隔膜１０は筺体２７１から着脱可能である。筐体２７１には真空ポンプ４が接続されており、筐体２７１の内壁面と隔膜１０によって構成される閉空間（以下、第１の空間とする）を真空排気可能である。これにより、本実施例では、隔膜１０により第１の空間１１が高真空に維持される一方、試料が載置されている空間は大気圧または大気圧とほぼ同等の圧力のガス雰囲気に維持されるので、装置の動作中、荷電粒子光学鏡筒２側を真空状態に維持でき、かつ試料６および前述の試料台を大気圧または所定の圧力の雰囲気に維持することができる。隔膜１０は隔膜保持部材１５５によって保持され、隔膜１０の交換は隔膜保持部材１５５を交換することで可能となる。

【0142】

ガスボンベ１０３からのガス供給は試料６近傍方向を向いたガスノズル２７２によってなされる。ガスノズル２７２は例えば支え２７３によって筐体２７１に接続されている。ガスボンベ１０３とガスノズル２７２とは連結部１０２によって接続される。上記構成は一例であるが、本構成により試料６近傍に所望のガスを噴射することが可能となる。ガス種としては、電子線散乱を低減できるように、大気よりも軽いガスである窒素や水蒸やヘリウムガスや水素ガスなどである。ガスはユーザが自由に交換可能である。また、隔膜１０と試料６との間を真空引きするためにガスボンベ１０３を真空ポンプに替えてもよい。

【0143】

光学顕微鏡２５０は筐体２７１の直下、すなわち荷電粒子光学鏡筒の光軸と同軸に配置される。これにより試料ステージ５上に配置された試料台上の試料６に、隔膜１０を通過した荷電粒子線を照射して荷電粒子線顕微鏡像を取得するとともに、光学顕微鏡２５０による光学顕微鏡像を取得することが可能となる。ただし、光学顕微鏡の配置は前述の実施例のとおりこれに限られるものではない。

【0144】

本荷電粒子線装置の試料ステージ５の上には検出素子５００を具備した試料台を搭載できる。試料ステージの上に前述の試料台を載置した状態において、検出素子５００は試料に対して隔膜の反対側に載置された状態となる。試料ステージ近傍の光検出器５０３などの配置構成などは実施例１，２と同様である。本構成の場合は、真空引き等により発生する水分蒸発などの形状変化を最大限に低減させた透過荷電粒子線信号の取得が可能である。また、試料空間を高真空に真空引きすることが不要であるため非常に高スループットで試料の透過荷電粒子線顕微鏡画像の取得が可能となる。また、本実施例の構成では試料配置空間に制限がないので、試料台の大きさが非常に大きい場合に有用である。

【実施例5】

【0145】

次に、図２５を用いて筺体７側面の小さい領域から試料及び試料台を導入するサイドエントリー方式の装置構成に関して説明する。以下では、実施例１から３と同様の部分については説明を省略する。

【0146】

試料ステージ５は筺体７の一部せまい領域から差し込むように装置内部に導入される。各光学レンズを制御するための制御系や、検出信号を検出するための検出系や、筺体７や荷電粒子光学鏡筒２内部を排気するための真空ポンプ等は自明のため省略する。試料６が直接または間接に載置された検出素子５００からの発光は、光伝達路８０１を介して、筺体７内部等に配置された光検出器８００にて検出される。検出素子５００からの発光を検出するための光検出器は筺体７の内部や外部または試料台７や試料ステージ５、または図中光学鏡筒２のどこかに配置されていればよい。光増幅器及び光伝達路の位置や変形例は、本実施例で意図する機能を満たす限り、本実施例の荷電粒子線顕微鏡の範疇に属する。本構成で、例えばベクトルパラメータである試料角度θを傾斜させることが可能な機構が試料ステージ５に具備される。本構成の場合は、試料ステージ５のサイズは、前述の実施例と比較して小さくすることが可能なので、試料ステージ５上の傾斜機構は非常に簡易にすることが可能となる。

【0147】

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、本願の技術的思想を逸脱しない限りにおいて様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。また、上記の各構成、機能、処理部、処理手段等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。また、上記の各構成、機能等は、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリや、ハードディスク、ＳＳＤ（Solid State Drive）等の記録装置、または、ＩＣカード、ＳＤカード、光ディスク等の記録媒体に置くことができる。

【0148】

また、上述した計数処理及び信号演算処理は、それらの機能を実現するソフトウェアのプログラムコードによっても実現できる。この場合、システム或は装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が記憶媒体に格納されたプログラムコードを読み出す。この場合、記憶媒体から読み出されたプログラムコード自体が前述した実施例の機能を実現することになり、そのプログラムコード自体、及びそれを記憶した記憶媒体は本発明を構成することになる。

【0149】

また、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。実際には殆ど全ての構成が相互に接続されていると考えてもよい。

【符号の説明】

【0150】

１：光学レンズ、２：荷電粒子光学鏡筒、３：検出器、４：真空ポンプ、５：試料ステージ、６：試料、７：筐体、８：荷電粒子源、１０：隔膜、１１：第１の空間、１４：リークバルブ、
１６：真空配管、１８：支柱、１９：蓋部材用支持部材、２０：底板、
３４：キーボードやマウスなどのユーザインターフェース、３５：モニタ、
３６：上位制御部、３７：下位制御部、３８：ステージ制御部、３９：通信線、４０：データ送受信部、４１：データメモリ部、４２：外部インターフェース、４３：演算部、４４：操作画面、４５：照射エネルギー変更部、４６：照射角度変更部、４７：試料角度変更部、４８：焦点調整部、４９：明るさ調整部、
５０：コントラスト調整部、５１：照射開始ボタン、５２：照射停止ボタン、
５３：プリアンプ、５４：プリアンプ、５５：画面、５６：画面、５７：画像保存ボタン、５８：画像読み出しボタン、５９：照射エネルギー制御部、６０：試料回転角度制御部、６１、６２、６３、６４、
６５、６６、６７：ステップ、７０：操作画面、７１：初期試料角度θ設定部、７２：最終試料角度θ設定部、７３：変更角度Δθ設定部、７４：垂直設定バー、７５：水平設定
バー、７６：画面、７７：自動画像取得基準点、７８：自動取得開始ボタン、１０２：連結部、１０３：ガスボンベ、
１０７：支持板、１１９：ハーメチックシール、１２０：ハーメチックシール、
１２２：蓋部材、１２３，１２４，１２５，１２６，１２８，１２９：真空封止部材、１５５：隔膜保持部材、２００：荷電粒子顕微鏡の光軸、２０１：光学顕微鏡の光軸、２０２：光学顕微鏡、２５０：光学顕微鏡、２６９：柱、２７０：土台、２７１：筐体、２７２：ガスノズル、５００：試料台または検出素子、５０１：土台、５０２：薄い膜、５０３：光検出器、５０５：プリアンプ基板、５０６：固定部材、５０７：配線、５０８：密度が高い部分、５０９：密度が低い部分、５１０：一次荷電粒子線、５１１：一次荷電粒子線、５１２：上層部、５１３：下層部、５１４：電子正孔対、５１５：抵抗、５１６：配線、５１７：増幅器、５１８：検出素子、６０１：荷電粒子線顕微鏡、６０２：光学顕微鏡、６０３：ＣＣＤカメラ、６０４：配線、７０２：薄い膜、７０３：置換物質、８００：光検出器、８０１：光伝達路、
８１０：モータ、８１１：モータ回転軸、８２０：回転台、
９００：荷電粒子線、９０１：内部構造、９０２：内部構造、９０３：内部構造、９０３ａ：投影された内部構造９０３、９０４：物質、９０５：光軸、９０６：投影画像（または検出画像）、９０７：投影画像（または検出画像）、９０８：投影画像（または検出画像）、９０９：金標識、９１０：投影画像（または検出画像）、９１１：金標識、９１２：投影画像（または検出画像）、９１３：マーキング、９１４：試料内部構造体、９１５：投影画像（または検出画像）、９１６：投影画像（または検出画像）、９１７：投影画像（または検出画像）、９１８：投影画像（または検出画像）、９２１，９２２，９２３：内部物質

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】