特許 6385732 免疫応答制御剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6385732

(24)【登録日】2018年8月17日

(45)【発行日】2018年9月5日

(54)【発明の名称】免疫応答制御剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20180827BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20180827BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20180827BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180827BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20180827BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7088

   A61P37/02

   A61K48/00

   A61P43/00 111

   !C12N15/113

【請求項の数】4

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2014-133377(P2014-133377)

(22)【出願日】2014年6月27日

(65)【公開番号】特開2016-11272(P2016-11272A)

(43)【公開日】2016年1月21日

【審査請求日】2017年6月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002480

【氏名又は名称】特許業務法人ＩＰアシスト特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100113332

【弁理士】

【氏名又は名称】一入 章夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160037

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 真紀

(72)【発明者】

【氏名】北村 秀光

(72)【発明者】

【氏名】武冨 紹信

(72)【発明者】

【氏名】大野 陽介

(72)【発明者】

【氏名】大竹 淳矢

(72)【発明者】

【氏名】寺田 聖

【審査官】 横山 敏志

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５０４５４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５０９５１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／０４８４４１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０８１５０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Journal of Hepatology，２０１１年１２月１６日，Vol.56，pp.855-861

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ４８／００

Ａ６１Ｐ１／００−４３／００

Ｃ１２Ｎ１５／１１３

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

表１に示されるマイクロＲＮＡ、前記マイクロＲＮＡと相補的なマイクロＲＮＡ、前記マイクロＲＮＡ及び前記相補的なマイクロＲＮＡに対する阻害性核酸並びにそれらの機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも一種以上の核酸を有効成分とする、樹状細胞の抗原応答機能を制御するための免疫応答制御剤であって、前記機能的等価物は、表１に示されるマイクロＲＮＡをコードする核酸、表１に示されるマイクロＲＮＡの塩基配列の一部が修飾されたヌクレアーゼ分解に対して安定な核酸若しくはこれらのキメラＲＮＡ、又は表１に示されるマイクロＲＮＡに対する阻害性核酸をコードする核酸、表１に示されるマイクロＲＮＡに対する阻害性核酸の塩基配列の一部が修飾されたヌクレアーゼ分解に対して安定な核酸若しくはこれらのキメラＲＮＡであって、かつ樹状細胞の抗原応答機能を制御することができる核酸又はキメラＲＮＡである、前記免疫応答制御剤。

【表1】

【請求項2】

樹状細胞の抗原応答機能が樹状細胞の抗原提示機能又はサイトカイン産生機能である、請求項１に記載の免疫応答制御剤。

【請求項3】

さらに樹状細胞の抗原応答機能の制御を介してＴ細胞のサイトカイン産生機能を制御するための、請求項１又は２に記載の免疫応答制御剤。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫応答制御剤を含有する医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫応答、特に樹状細胞の免疫応答機能を制御することのできる核酸を有効成分とする、免疫応答制御剤に関する。

【背景技術】

【0002】

樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、以下ＤＣと称する）は、自然免疫と獲得免疫との橋渡しをすることで免疫系において非常に重要な役割を果たしている。特にＤＣは、免疫関連細胞を制御するＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βなどのサイトカインを産生し、またＣＤ４陽性Ｔ細胞あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞に対して外来抗原を提示する機能を有する細胞すなわち抗原提示細胞として、免疫系において重要な役割を有する。例えばＤＣは内部に取り込んだ抗原を分解してその断片を自身の表面に発現しているＭＨＣクラスＩ分子あるいはＭＨＣクラスＩＩ分子を介してナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞にそれぞれ提示することで、抗原特異的なキラーＴ細胞やヘルパーＴ細胞などのエフェクターＴ細胞への分化を誘導し、さらにヘルパーＴ細胞の活性化を介して抗体産生細胞の分化を誘導し、抗原特異的な抗体の産生を促すなどして、生体の免疫応答に関与する。またＤＣは、エフェクターＴ細胞への分化誘導に作用するインターロイキン（ＩＬ）−１２などを産生する。

【0003】

本来、排除すべき外来抗原又はがん細胞などの異常な細胞に対しては、ＤＣによる抗原提示及びその後の免疫応答はより活性化されることが好ましい。一方、ＤＣを介した免疫応答が過敏又は過剰になると、本来寛容であるべき外来物質に対する免疫応答が必要以上に誘導されてアレルギー性疾患が誘発されたり、自己免疫疾患が引き起こされたりするおそれがある。そのため、ＤＣの機能を介した免疫応答を適切に調節すること、具体的にはＤＣの免疫応答に関する機能を状況に応じて活性化したり抑制したりすることのできる技術は、免疫系に関連する様々な疾患の治療等において有用であり得る。

【0004】

ＤＣを活性化することのできる物質としては、タイプ１−サイトカインとして知られるＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β、並びにｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）を介して作用する免疫アジュバントなどが知られている。また、ＤＣの機能を抑制することのできる物質としては、ＩＬ−１０、ＩＬ−６及びプロスタグランジンＥ２などが知られている。また、ＩＬ−１７はＩＬ−６の産生を誘導する機能を有していることから、ＩＬ−１７もＤＣの機能を抑制することのできる物質の一つであると考えられる。

【0005】

ＩＬ−６は、ＤＣに作用することで、ＭＨＣクラスＩＩ分子及びＣＤ８６の発現を抑制して抗原提示能を低下させると共に、ナイーブＴ細胞からのエフェクターＴ細胞であるヘルパーＴ細胞への分化誘導能を有するＩＬ−１２の産生も抑制する。近年、がん微小環境下でＩＬ−６が産生誘導されていることが報告されており、がん細胞に対する免疫療法の治療効果が十分に発揮されない原因の一つとして、このがん微小環境におけるＩＬ−６の発現によるＤＣの機能抑制が指摘されている（非特許文献１）。

【0006】

一方、様々な疾患、とくにがんに関連して、特異的な塩基配列を有する微小なＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、以下、ｍｉＲと表す）が注目されている。ｍｉＲは２０〜２５塩基からなる短い一本鎖ＲＮＡであり、これと相補的な配列を持つｍＲＮＡと相互作用することによって遺伝子発現及び転写調節に関与することが知られている。ｍｉＲはがんにおけるバイオマーカーとしても注目され、がんの治療法の適性や治療効果の判定などへの適用について検討がなされている。

【0007】

しかし、免疫応答を制御する、特にＤＣを介した免疫応答においてＤＣに作用してその機能を活性化したり抑制したりすることのできるｍｉＲについては、注目すべき成果はまだ報告されていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｎａｒｉｔａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１３年、第１９０巻、第８１２−８２０ページ

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、生体の免疫応答、特にＤＣの免疫応答に関する機能を活性化したり抑制したりすることのできる核酸を提供することを目的とするものである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＬＰＳ又はポリＩ：Ｃを含む培地で培養したＤＣ内で特定のｍｉＲの発現量が上昇又は減少すること、及びこれらを利用することで免疫応答を制御することが可能であることを見いだし、下記の各発明を完成させた。

【0011】

（１）表１〜表７に示されるｍｉＲ、前記ｍｉＲと相補的なｍｉＲ、前記ｍｉＲ及び前記相補的なｍｉＲに対する阻害性核酸並びにそれらの機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも一種以上の核酸を有効成分とする、免疫応答制御剤。

【表1】

【0012】

【表2】

【0013】

【表3】

【0014】

【表4】

【0015】

【表5】

【0016】

【表6】

【0017】

【表7】

（２）樹状細胞の抗原応答機能を制御するための、（１）に記載の免疫応答制御剤。
（３）樹状細胞の抗原応答機能がサイトカイン産生機能である、（２）に記載の免疫応答制御剤。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の免疫応答制御剤を含有する医薬。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、特定の核酸を使用して生体又は生体から分離したＤＣの免疫応答を制御することができ、免疫機能の低下による疾患又は免疫機能の異常亢進による疾患の予防、改善又は治療をおこなうことが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６７−３ｐのＩＬ−６刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図2】ｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐのＩＬ−１７刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図3】ｈｓａ−ｍｉＲ−６８４２−５ｐのＩＬ−１７刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図4】ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６のＩＬ−６刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図5】ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２６−５ｐのＩＬ−６刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図6】ｈｓａ−ｍｉＲ−５５８５−３ｐのＩＬ−１７刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図7】ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６のＬＰＳ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図8】ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６７−３ｐのＬＰＳ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図9】ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐのＬＰＳ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図10】ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−３ｐのＬＰＳ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図11】ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２６−５ｐのＬＰＳ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図12】ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐのＬＰＳ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図13】ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−５ｐのＬＰＳ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図14】ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐのＬＰＳ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図15】ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐのポリＩ：Ｃ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図16】ｈｓａ−ｍｉＲ−５１１−５ｐのポリＩ：Ｃ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図17】ｈｓａ−ｍｉＲ−５１１−３ｐのポリＩ：Ｃ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図18】ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐのポリＩ：Ｃ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図19】ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐのポリＩ：Ｃ刺激による相対的発現量の変動を表したグラフである。

【図20】ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６を導入したＤＣにおける、ポリＩ：Ｃ刺激後のＩＦＮ−β及びＩＬ−１２ｐ３５の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図中、左がＩＦＮ−β、右がＩＬ−１２ｐ３５である。

【図21】ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６を導入したＤＣにおける、ＬＰＳ刺激後のＩＦＮ−β及びＩＬ−１２ｐ３５の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図中、左がＩＦＮ−β、右がＩＬ−１２ｐ３５である。

【図22】ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６に対する阻害性核酸を導入したＤＣにおける、ポリＩ：Ｃ刺激後のＩＦＮ−β及びＩＬ−１２ｐ３５の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図中、左がＩＦＮ−β、右がＩＬ−１２ｐ３５である。

【図23】ｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐを導入したＤＣにおける、ポリＩ：Ｃ刺激後のＩＦＮ−β及びＩＬ−１２ｐ３５の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図中、左がＩＦＮ−β、右がＩＬ−１２ｐ３５である。

【図24】ｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐを導入したＤＣにおける、ＬＰＳ刺激後のＩＦＮ−β及びＩＬ−１２ｐ３５の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図中、左がＩＦＮ−β、右がＩＬ−１２ｐ３５である。

【図25】ｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐに対する阻害性核酸を導入したＤＣにおける、ポリＩ：Ｃ刺激後のＩＦＮ−β及びＩＬ−１２ｐ３５の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図中、左がＩＦＮ−β、右がＩＬ−１２ｐ３５である。

【図26】ｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐに対する阻害性核酸を導入したＤＣにおける、ＬＰＳ刺激後のＩＦＮ−β及びＩＬ−１２ｐ３５の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図中、左がＩＦＮ−β、右がＩＬ−１２ｐ３５である。

【図27】ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６６−５ｐを導入したＤＣにおける、ＬＰＳ刺激後のＩＦＮ−βの遺伝子発現量の変化を表すグラフである。

【図28】ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐを導入したＤＣをがん抗原ペプチドを含む培地で培養した培養上清におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の定量結果を示すグラフである。図中、左がＩＦＮ−γ、右がＩＬ−１２である。

【図29】ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ−に対する阻害性核酸を導入したＤＣをがん抗原ペプチドを含む培地で培養した培養上清におけるＩＦＮ−γの定量結果を示すグラフである。

【図30】ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐを導入したＤＣをがん抗原ペプチドを含む培地で培養した培養上清におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の定量結果を示すグラフである。図中、左がＩＦＮ−γ、右がＩＬ−１２である。

【図31】ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐを導入したＤＣをがん抗原ペプチドを含む培地で培養した培養上清におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の定量結果を示すグラフである。図中、左がＩＦＮ−γ、右がＩＬ−１２である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本明細書を通じ、ｍｉＲのＩＤ及びアクセション番号は、ｍｉＲの配列情報等を集めたデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）に定められたものを使用しており、各ｍｉＲの塩基配列も前記データベースに全て登録されている。

【0021】

本発明にいう免疫応答制御とは、免疫応答を抑制する又は活性化することを意味する。なお、免疫応答を抑制するとは、抗原に対する免疫応答、すなわち抗原を排除又は無害化する生体防御反応の進行を阻害する、停止させる、低下させる又は減ずることを意味し、典型的にはＤＣの抗原提示能を阻害する、停止させる、低下させる若しくは減ずる、又はＴ細胞の分化誘導若しくは活性化を促すサイトカイン、例えばＩＦＮ−β若しくはＩＬ−１２の発現若しくは産生を阻害する、低下させる若しくは減ずることをいう。

【0022】

また免疫応答を活性化するとは、抗原に対する免疫応答、すなわち抗原を排除又は無害化する生体防御反応の進行を誘導する、促進する又は亢進することを意味し、典型的にはＤＣの抗原提示能を誘導する、促進する若しくは亢進する、又はＴ細胞の分化誘導若しくは活性化を促すサイトカイン、例えばＩＦＮ−β若しくはＩＬ−１２の発現若しくは産生を誘導する、促進する若しくは亢進することをいう。

【0023】

本明細書にいう相対的発現量とは、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定されるｍｉＲの発現量を比較解析方法によって補正した値を意味する。かかる方法としては、グローバルノーマライゼーション法、ｑｕａｎｔｉｌｅ法、ｌｏｗｅｓｓ法、７５ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ法などを挙げることができる。これらの方法は、いかなる検体であっても複数の遺伝子の発現データを一塊とし、遺伝子発現データ群としてとらえた場合には、発現量に差がないという原理を前提とするものである。本明細書においては、ＤＮＡマイクロアレイ上に搭載した全遺伝子の発現量の中央値を求め、この中央値が２５になるように補正するグローバルノーマライゼーション法（例えば特開２０１４−００７９９５号公報など）で算出された相対的発現量を採用して説明する。

【0024】

本発明は、表１〜表７に示されるｍｉＲ、前記ｍｉＲと相補的なｍｉＲ、前記ｍｉＲ及び前記相補的なｍｉＲに対する阻害性核酸並びにそれらの機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも一種以上の核酸を有効成分とする、免疫応答制御剤に関する。

【0025】

表１及び表２に示されるｍｉＲは、ＩＬ−６又はＩＬ−１７を含む培地で培養したＤＣの内部において、これらサイトカインを含まない培地で培養したＤＣ（コントロール）と比較したときに、ＤＮＡマイクロアレイを用いたグローバルノーマライゼーション法により求められた相対的発現量が有意（１／２以下）に減少するｍｉＲである。表中の変動比は、コントロールにおけるｍｉＲのＤＮＡマイクロアレイを用いたグローバルノーマライゼーション法により求められた相対的発現量を１としたときの各ｍｉＲの減少率を表す。

【0026】

表３及び表４に示されるｍｉＲは、ＩＬ−６又はＩＬ−１７を含む培地で培養したＤＣの内部において、これらサイトカインを含まない培地で培養したＤＣと比較したときに、ＤＮＡマイクロアレイを用いたグローバルノーマライゼーション法により求められた相対的発現量が有意（２倍以上）に上昇するｍｉＲである。表中の変動比は、コントロールにおけるｍｉＲのＤＮＡマイクロアレイを用いたグローバルノーマライゼーション法により求められた相対的発現量を１としたときの各ｍｉＲの上昇率を表す。

【0027】

表５及び表６に示されるｍｉＲは、免疫学的な刺激物質であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）又はポリＩ：Ｃを含む培地で培養したＤＣの内部において、これら刺激物質を含まない培地で培養したＤＣと比較したときに、定量ＰＣＲ法により求められた相対的発現量が上昇するｍｉＲである。

【0028】

表７に示されるｍｉＲは、免疫学的な刺激物質であるポリＩ：Ｃを含む培地で培養したＤＣの内部において、これら刺激物質を含まない培地で培養したＤＣと比較したときに、定量ＰＣＲ法により求められた相対的発現量が減少するｍｉＲである。

【0029】

ＩＬ−６は、ＤＣに対してＭＨＣクラスＩＩ分子及びＣＤ８６の発現を抑制して抗原提示能を低下させると共に、ナイーブＴ細胞からのエフェクターＴ細胞であるヘルパーＴ細胞への分化誘導能を有するＩＬ−１２の産生も抑制する。すなわちＩＬ−６はＤＣを介した免疫応答を抑制するサイトカインである。またＩＬ−１７はかかるＩＬ−６の産生を誘導する機能を有しており、結果的にＩＬ−６と同様にＤＣを介した免疫応答を抑制するサイトカインである。また、ＬＰＳは細菌等の感染と同様の、またポリＩ：Ｃはウイルス感染と同様に免疫応答を活性化する物質である。

【0030】

表１〜表７に示されるｍｉＲは、ＩＬ−６やＬＰＳなどによる刺激を受けたときにＤＣ内で発現する、免疫応答を抑制する又は活性化する様々な遺伝子をターゲットとして、それらの機能発現を調節していると考えられる。かかるターゲット遺伝子は、ＤＣを介した免疫応答を誘導、促進若しくは亢進したりする、又は阻害若しくは抑制したりするなどの様々な機能が想定される。

【0031】

したがって、表１〜表７に示されるｍｉＲを適切に選択することによって、生体特にＤＣを介した免疫応答を抑制又は活性化することができると期待される。係る意味において、表１〜表７に示されるｍｉＲは、免疫応答制御剤として利用することができる。

【0032】

本発明の免疫応答制御剤の効果は、生体にｍｉＲを直接投与して免疫応答が誘導される又は抑制されることを確認してもよく、また例えばＤＣに免疫応答型制御剤であるｍｉＲを導入して、免疫応答の活性化に関与するＩＦＮ−β若しくはＩＬ−１２又は免疫応答の抑制に関与するＩＬ−１０の発現が誘導、促進、若しくは亢進される又は阻害若しくは抑制されることをもって確認してもよい。

【0033】

また、ｉ）表１〜表７に示されるｍｉＲと相補的なｍｉＲ、すなわちｍｉＲの塩基配列と相補的な塩基配列からなるｍｉＲ、ｉｉ）適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで表１〜表７に示されるｍｉＲと同じ塩基配列からなるＲＮＡを転写誘導することのできる核酸、並びにｉｉｉ）表１〜表７に示されるｍｉＲの機能を阻害することのできる阻害性核酸、例えば表１〜表７に示されるｍｉＲの塩基配列を基に適宜設計することができる塩基配列を有することで表１〜表７に示されるｍｉＲの機能を実質的に阻害することができる核酸、表１〜表７に示されるｍｉＲの塩基配列を認識してその機能を阻害することができるｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉誘導性核酸、又は適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで表１〜表７に示されるｍｉＲの機能を実質的に阻害するＲＮＡ若しくはＲＮＡ干渉誘導性核酸であるＲＮＡを転写誘導することのできる核酸なども、本発明における免疫応答制御剤として利用することができるものと期待される。ｍｉＲとこれに相補的なｍｉＲは、例えばｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−５ｐとｈｓａ−ｍｉＲ−４７０９−３ｐなどのように、ｍｉＲのＩＤにおいて５ｐ及び３ｐと表記されて区別される関係にある。

【0034】

阻害性核酸を設計及び生産する手法は当業者に広く知られている他、このような設計から生産を受託により行う会社等も多数存在する。例えばこの様な受託生産は、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ａｎｄ−ｒｎａｉ／ｍｉｒｎａ／ｍｉｃｒｏｒｎａ−ｍｉｍｉｃｓ．ｈｔｍｌ）、ＱＩＡＧＥＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃａｔａｌｏｇ／ａｓｓａｙ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ｍｉｒｎａ／ｍｉｓｃｒｉｐｔ−ｍｉｒｎａ−ｍｉｍｉｃｓ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂ／ｅｎ／ＵＳ／ａｄｉｒｅｃｔ／ａｂ？ｃｍｄ＝ｃａｔＮａｖｉｇａｔｅ２＆ｃａｔＩＤ＝６０２４００）などが行っている。このような受託先に本明細書に記載の各表中のＩＤ又はアクセッション番号から特定される塩基配列を提供すれば、阻害性核酸を入手することができる。

【0035】

さらに、表１〜表７に示されるｍｉＲを含む上記核酸の塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められた核酸も、本発明における免疫応答制御剤に包含される。ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるための修飾としては、２’Ｏ−メチル化、２’−Ｆ化、４’−チオ化などを挙げることができる。

【0036】

また、表１〜表７に示されるｍｉＲを含むＲＮＡ中のリボヌクレオチドの一部が、対応するデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に置き換えられたキメラＲＮＡもまた、本発明における免疫応答制御剤に包含される。ヌクレオチド類似体としては、例えば、５位修飾ウリジン又はシチジン、例えば５‐（２‐アミノ）プロピルウリジン、５‐ブロモウリジンなど；８位修飾アデノシン又はグアノシン、例えば８‐ブロモグアノシンなど；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシンなど；Ｏ−又はＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなどを挙げることができる。

【0037】

以下、本発明では、適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで表１〜表７に示されるｍｉＲと同じ塩基配列からなるＲＮＡを転写誘導することのできる核酸、表１〜表７に示されるｍｉＲの塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められた核酸及びこれらのキメラＲＮＡを、表１〜表７に示されるｍｉＲと機能的に等価な核酸又はｍｉＲの機能的等価物と表すこととする。

【0038】

同様に、適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで表１〜表７に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸と同じ塩基配列からなるＲＮＡを転写誘導することのできる核酸、表１〜表７に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸の塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められた核酸及びこれらのキメラＲＮＡを、表１〜表７に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸と機能的に等価な核酸又は阻害性核酸の機能的等価物と表すこととする。

【0039】

本発明の免疫応答制御剤の一つの態様は、免疫応答を抑制することのできるｍｉＲ又はそれらの機能的等価物を有効成分とする、免疫抑制剤である。

【0040】

例えば、後の実施例で示すように、表３に示されるＩＬ−６によって発現量が上昇するｈｓａ−ｍｉＲ３６４６をＤＣに導入することによって、ＤＣにおけるＩＦＮ−β遺伝子及びＩＬ−１２ｐ３５遺伝子の発現を低下させることができる。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６は免疫抑制剤として利用可能である。

【0041】

本発明の免疫応答制御剤のもう一つの態様は、免疫応答を活性化することのできるｍｉＲ又はそれらの機能的等価物を有効成分とする、免疫活性化剤である。

【0042】

例えば、ＩＬ−１７刺激によって相対的発現量が減少するｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐをＤＣに導入することによって、ＤＣにおけるＩＦＮ−β遺伝子及びＩＬ−１２ｐ３５遺伝子の発現を亢進させることができる。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐは免疫活性化剤として利用可能である。

【0043】

本発明の別の態様は、免疫応答を活性化することのできるｍｉＲに対する阻害性核酸又はその機能的等価物を有効成分とする、免疫抑制剤である。

【0044】

例えば、先に述べた免疫活性化剤であるｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐに対する阻害性核酸をＤＣに導入することによって、ＤＣにおけるＩＦＮ−β遺伝子及びＩＬ−１２ｐ３５遺伝子の発現を低下させることができる。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐに対する阻害性核酸は免疫抑制剤として利用可能である。

【0045】

本発明のさらなる態様は、免疫応答を抑制することのできるｍｉＲに対する阻害性核酸又はその機能的等価物を有効成分とする免疫活性化剤である。

【0046】

例えば、先に述べた免疫抑制剤であるｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６に対する阻害性核酸をＤＣに導入することによって、ＤＣにおけるＩＦＮ−β遺伝子及びＩＬ−１２ｐ３５遺伝子の発現をいずれも亢進させることができる。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６に対する阻害性核酸は免疫活性化剤として利用可能である。

【0047】

本発明において、表１〜表７に示されるｍｉＲから免疫を抑制する又は活性化することのできるｍｉＲを適宜選択することで、それら又はそれらの機能的等価物を免疫抑制剤又は免疫活性化剤として利用することができる。また、表１〜表７に示されるｍｉＲから免疫を抑制する又は活性化することのできるｍｉＲを適宜選択することで、それらに対する阻害性核酸又はこれらの機能的等価物を免疫活性化剤又は免疫抑制剤として利用することができる。

【0048】

本発明における好ましい免疫活性化剤又は免疫抑制剤は、表１及び表２に示される変動比が０．４以下のｍｉＲ、表３及び表４に示される変動比が３倍以上のｍｉＲ、それらの機能的等価物、それらに対する阻害性核酸又はその機能的等価物である。本発明におけるさらに好ましい免疫活性化剤又は免疫抑制剤は、表１及び表２に示される変動比が０．３以下のｍｉＲ、表３及び表４に示される変動比が４倍以上のｍｉＲ、それらの機能的等価物、それらに対する阻害性核酸又はその機能的等価物である。

【0049】

本発明の免疫応答制御剤である核酸は、化学合成技術を利用して人工的に合成することができる。核酸の化学合成方法、また非天然型の塩基の合成手法又はこれを含む核酸の合成手法としては、当業者に知られ又は周知である方法を採用することができる。またいわゆるＤＮＡシンセサイザーなどの機器を用いることで、本発明の免疫応答制御剤を製造してもよい。

【0050】

本発明の免疫応答制御剤である核酸は、生体に直接投与されてもよい。また、生体から分離されたＤＣに適当な方法によって導入されてもよい。また、本発明の免疫応答制御剤である核酸は、そのままＤＣに導入されてもよく、又はＤＣ内で適切に所望のＲＮＡが誘導されるように機能的に組み込まれた発現ベクターの形態でＤＣに導入されてもよい。発現ベクターは、転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばＰｏｌ ＩＩＩプロモーターなどのプロモーター配列、オペレーター配列、エンハンサーなどをさらに含んでいてもよい。これらの機能性塩基配列は、上記核酸と機能的に連結され得る。本発明の核酸を含む発現ベクターなどの核酸構築物もまた、本発明の範囲内にある。なお、本発明において２以上の核酸を用いる場合、これらの核酸は単一の発現ベクターに組み込んでもよく、２以上のベクターに別々に組み込んでもよい。

【0051】

本発明の核酸は、任意の既知の細胞導入手法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、又はマイクロインジェクション法などを用いることによって、ＤＣ内に導入され得る。

【0052】

発現ベクターの構築及びそのＤＣへの導入を行う遺伝子工学的方法としては、当業者に公知又は周知の手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）その他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を挙げることができる。また市販のキットや試薬を使用するときは、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従うことが好ましい。

【0053】

本発明はまた、哺乳動物の免疫応答を制御する方法を提供し、具体的には、哺乳動物に有効量の本発明の免疫応答制御剤を投与して哺乳動物の免疫応答を制御する方法、又は本発明の免疫応答制御剤の存在下で培養した哺乳動物由来のＤＣを投与して哺乳動物の免疫応答を制御する方法を含む。

【0054】

本明細書中で用いられる「哺乳動物」の例としてはヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコ等を挙げることができるが、本発明の方法は特にヒトを対象とする。

【0055】

本明細書中で用いられる「有効量」とは、哺乳動物の免疫応答を活性化又は抑制するのに効果的な免疫応答制御剤の量を意味する。かかる有効量は疾患の種類、症状の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。

【0056】

本発明の治療方法の好ましい実施形態の一つは、本発明の免疫応答制御剤の存在下で培養したヒトのがん患者由来のＤＣを当該がん患者に投与して、がん細胞に対するその患者の免疫応答を活性化する方法である。かかるＤＣの培養は適当ながん抗原又はがんワクチンを含む培地を用いて行われることが好ましい。また、同様の方法によって、細菌、真菌、寄生虫、ウイルスその他の外来生物による感染症に対する患者の免疫応答を活性化させることも可能である。

【0057】

本発明の治療方法の好ましい別の実施形態の一つは、本発明の免疫応答制御剤をヒト患者に投与して、その患者における肝炎、アレルギー疾患又は自己免疫疾患を治療する方法である。本実施形態の治療方法の対象となる疾患としては、肝炎；花粉症、アトピー、重症薬疹などのアレルギー疾患；リュウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、移植病、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群等の自己免疫疾患などを挙げることができる。

【0058】

本発明の免疫応答制御剤は、薬学的に許容される賦形剤、担体その他の成分と共に医薬組成物を形成し又は製剤化して使用することが好ましい。特に、核酸製剤の調製に好適な賦形剤等の利用が好ましい。かかる医薬組成物又は製剤の形態にある免疫応答制御剤も、本発明の免疫応答制御剤の一態様である。

【0059】

薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。また、ＲＮＡ干渉誘導性核酸などを含む製剤で利用されている各種の成分を利用することが好ましい。治療対象となる疾患に応じて、本発明の免疫応答制御剤とその他の医薬とを併用して使用してもよい。

【0060】

本発明の免疫応答制御剤を含む医薬組成物は、通常、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いられる。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった、製剤において通常用いられる水性担体が挙げられる。本発明の免疫応答制御剤を含む医薬組成物はさらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の成分を含んでもよい。

【0061】

また、本発明の免疫応答制御剤を含む医薬組成物は、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、マイクロスフェア及びナノスフェアなどの適切なＤＤＳに封入及び／又は固定することもできる。

【0062】

本発明の免疫応答制御剤を含む医薬組成物の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、腫瘍内又はその近傍への局所投与などを挙げることができる。好ましい態様の一つにおいて、本発明の免疫応答制御剤を含む医薬組成物は、静脈内投与又は腫瘍内若しくはその近傍への局所投与により対象に投与される。

【0063】

ウイルスベクターを利用して哺乳動物の体内で本発明の核酸の発現を誘導する場合、その用量範囲は、例えば、ヒト対象１人あたり、１×１０^３〜１×１０^１４、好ましくは１×１０^５〜１×１０^１２、より好ましくは１×１０^６〜１×１０^１１、最も好ましくは１×１０^７〜１×１０^１０のプラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）であることができる。

【0064】

以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種及び属、コンストラクト並びに試薬に限定されるものではなく、これらは適宜変更することができるものであることは当業者に容易に理解されるものである。

【実施例】

【0065】

＜実験例１＞
１）ＩＬ−６又はＩＬ−１７刺激したＤＣのｍＲＮＡの調製
三人の健常ヒト血液より回収したヒト末梢血単核細胞（２×１０^６個）を１ｍＬのＡＩＭ−Ｖ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁して１時間インキュベートし、細胞を底面に接着させた。接着した細胞を０．０５ｍｇ／ｍＬのＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で７日間培養することで、ヒト単球由来樹状細胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ、ＭｏＤＣ)とした。

【0066】

培養７日目にヒトＩＬ−６（２０μｇ／ｍＬ）又はヒトＩＬ−１７（１００μｇ／ｍＬ）を培地に添加してさらに８時間培養を続けた。その後、細胞をそれぞれＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液を用いて回収し、抗ＣＤ１１ｃ抗体及び７−ＡＡＤで染色後、ＦＡＣＳ Ａｒｉａを用いてＣＤ１１ｃ陽性７−ＡＤＤ陰性細胞を単離した。そのうち５×１０^６個の細胞をそれぞれ３５０μＬのＩＳＯＧＥＮ ＩＩで懸濁した後、ＩＬ−６刺激を行った三人のヒト由来の細胞懸濁液及びＩＬ−１７刺激を行った三人のヒト由来の細胞懸濁液をそれぞれ一つに混合してから、ｍＲＮＡを回収した。また、ＩＬ−６及びＩＬ−１７を添加しなかったＭｏＤＣからもｍＲＮＡを回収し、コントロールとした。

【0067】

２）マイクロアレイ解析
１）のＩＬ−６刺激又はＩＬ−１７刺激を受けたＭｏＤＣ及びコントロールのＭｏＤＣから回収したｍＲＮＡ画分に対して、東レ株式会社に委託してマイクロアレイ解析を行った。

【0068】

マイクロアレイの解析結果から、コントロールと比較してＩＬ−６刺激による減少率が１／２以下で、かつ無刺激のグローバルノーマライゼーションの値が１０以上であるｍｉＲを選択して、表１に纏めた。表１のうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６７−３ｐのＩＬ−６刺激による変動を表したグラフを図１に示す。

【0069】

同様に、コントロールと比較してＩＬ−１７刺激による減少率が１／２以下で、かつ無刺激のグローバルノーマライゼーションの値が１０以上であるｍｉＲを選択し、表２に纏めた。表２のうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−６８４２−５ｐのＩＬ−１７刺激による変動を表したグラフを図２及び図３にそれぞれ示す。

【0070】

また、コントロールと比較してＩＬ−６刺激による上昇率が２倍で、かつ刺激後のグローバルノーマライゼーションの値が１０以上であるｍｉＲを選択して、表３に纏めた。表３のうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１２６−５ｐのＩＬ−６刺激による変動を表したグラフを図４及び図５にそれぞれ示す。

【0071】

さらに、コントロールと比較してＩＬ−１７刺激による上昇率が２倍で、かつ刺激後のグローバルノーマライゼーションの値が１０以上であるｍｉＲを選択して、表４に纏めた。表４のうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５８５−３ｐのＩＬ−１７刺激による変動を表したグラフを図６に示す。

【0072】

＜実験例２＞
１）ＬＰＳ又はポリＩ：Ｃ刺激したＤＣのｍＲＮＡの調製
実験例１の１）と同様にして調製した培養７日目のＭｏＤＣに、ＬＰＳ（０．５μｇ／ｍＬ）又はポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）を培地に添加してさらに８時間培養を続けた。その後、実験例１の１）と同じ処理を行って、ＬＰＳ刺激又はポリＩ：Ｃ刺激を受けたＭｏＤＣ、及びコントロールのＭｏＤＣからそれぞれｍＲＮＡを回収した。

【0073】

２）定量ＰＣＲ解析
１）のＬＰＳ刺激又はポリＩ：Ｃ刺激を受けたＭｏＤＣ及びコントロールのＭｏＤＣから回収したｍＲＮＡ画分に対して、目的のｍｉＲを検出する合成プライマーを用いて定量ＰＣＲ解析を行った。

【0074】

定量ＰＣＲの解析結果から、コントロールと比較してＬＰＳ刺激により発現量が上昇するｍｉＲを選択して、表５に纏めた。さらに、コントロールと比較してポリＩ：Ｃ刺激により発現量が上昇するｍｉＲを選択して、表６に纏めた。

【0075】

表５のうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐのＬＰＳ刺激による変動を表したグラフを図７〜図１４にそれぞれ示す。

【0076】

また、表６のうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１１−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐのポリＩ：Ｃ刺激による変動を表したグラフを図１５〜図１８にそれぞれ示す。

【0077】

また、コントロールと比較してポリＩ：Ｃ刺激により発現量が減少するｍｉＲを選択し、表７に纏めた。

【0078】

表７のうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６５０−５ｐの刺激による変動を表したグラフを図１９に示す。

【0079】

＜実施例１＞
表３（ＩＬ−６刺激で発現量が上昇するｍｉＲ）のｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６及びこれに対する阻害性核酸（ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６−Ｉ）を、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ａｎｄ−ｒｎａｉ／ｍｉｒｎａ／ｍｉｃｒｏｒｎａ−ｍｉｍｉｃｓ．ｈｔｍｌに依頼してそれぞれ化学合成した。

【0080】

実験例１の１）で調製したＭｏＤＣ（１×１０^６／ウェル）１ｍｌに対して、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者のプロトコルに従ってｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６又はｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６−Ｉ（３０ｐｍｏｌ／ウェル）をそれぞれ加えた。

【0081】

ＭｏＤＣを一晩培養後、ＬＰＳを０．５μｇ／ｍＬ又はポリＩ：Ｃを１０μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ加えてさらに３時間培養した。培養後、ＩＳＯＧＥＮ ＩＩを３５０ｍＬ添加して細胞を懸濁し、さらにＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（ＵＰＷ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１４０ｍＬ添加して混和後、５〜１５分間待ち、１２，０００×ｇで１５分間遠心した。遠心上清３５０μＬを新たなチューブに回収し、３５０μＬのイソプロパノールを添加して転倒混和後、１０分静置してから１２，０００×ｇで１０分間遠心する。さらに遠心上清を捨て、５００μＬの７５％エタノールを添加し、８，０００×ｇで２〜３分遠心した。この操作を２回繰り返して得たペレットを１６ｍＬのＵＰＷで融解することによって、ｍＲＮＡ画分を得た。

【0082】

回収されたｍＲＮＡ画分をもとに、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｓ及びＯｋｉｇｏ ｄＴを用いた逆転写反応を行ってｃＤＮＡを調製した。これを鋳型として、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、Ｌｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ）を用いたリアルタイム定量ＰＣＲによって、ＩＦＮ−β及びＩＬ−１２ｐ３５の遺伝子発現量の解析を行った。それぞれの発現量はβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡ量を元にＤＤＣｔ ｍｅｔｈｏｄ（ＤＣｔ＝ＤＣｔｓａｍｐｌｅ−ＤＣｔｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）によって補正し、各実験におけるコントロールの値を１とした。結果を図２０〜図２２に示す。

【0083】

図２０及び図２１に示されるように、ＬＰＳ刺激又はポリＩ：Ｃ刺激を受けるＭｏＤＣにｈｓａ−ｍｉＲ３６４６を導入することにより、ＩＦＮ−β遺伝子及びＩＬ−１２ｐ３５遺伝子の発現はいずれも抑制された。このことから、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６のようなＩＬ−６刺激によって発現量が上昇するｍｉＲの一部は、ＤＣに対してサイトカインの産生を阻害して免疫機能を抑制することのできる免疫抑制剤として利用可能であることが確認された。

【0084】

一方、図２２に示されるように、ポリＩ：Ｃ刺激を受けるＭｏＤＣにｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６−Ｉを導入することにより、ＩＦＮ−β遺伝子及びＩＬ−１２ｐ３５遺伝子の発現はいずれも亢進された。このことから、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６のようなＩＬ−６刺激によって発現量が上昇するｍｉＲの一部に対する阻害性核酸は、ＤＣに対してサイトカインの産生を亢進させて免疫機能を活性化することができる免疫活性化剤として利用可能であることが確認された。

【0085】

＜実施例２＞
実施例１のｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６及びｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６−Ｉを、ＩＬ−１７刺激によって発現量が減少するｈｓａ−ｍｉＲ３９３４−５ｐ及びこれに対する阻害性核酸であるｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐ−Ｉ（いずれもＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨに合成を依頼）に換えて、実施例１と同様の実験を行った。その結果を、図２３〜図２６に示す。

【0086】

図２３及び図２４に示されるように、ＬＰＳ刺激又はポリＩ：Ｃ刺激を受けるＭｏＤＣにｈｓａ−ｍｉＲ３９３４−５ｐを導入することにより、ＩＦＮ−β遺伝子及びＩＬ−１２ｐ３５遺伝子の発現はいずれも亢進された。このことから、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐのようなＩＬ−１７刺激によって発現量が減少するｍｉＲの一部は、ＤＣに対してサイトカインの産生を亢進して免疫機能を活性化することのできる免疫活性化剤として利用可能であることが確認された。

【0087】

一方、図２５及び図２６に示されるように、ＬＰＳ刺激又はポリＩ：Ｃ刺激を受けたＭｏＤＣにｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐ−Ｉを導入することによりＩＦＮ−β遺伝子及びＩＬ−１２ｐ３５遺伝子の発現はいずれも阻害された。このことから、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９３４−５ｐのようなＩＬ−１７刺激によって発現量が減少するｍｉＲの一部に対する阻害性核酸は、ＤＣに対してサイトカインの産生を阻害して免疫機能を抑制することができる免疫抑制剤として利用可能であることが確認された。
＜実施例３＞
実施例１のｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６及びｈｓａ−ｍｉＲ−３６４６−Ｉを、ＬＰＳ刺激によって発現量が上昇するｈｓａ−ｍｉＲ−１２６６−５ｐ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨに合成を依頼）に換え、ＤＣへの刺激をＬＰＳのみとした以外は実施例１と同様の実験を行い、ＩＦＮ−βの発現量の変化を測定した。その結果を、図２７に示す。

【0088】

図２７に示されるように、ＬＰＳ刺激を受けたＭｏＤＣにｈｓａ−ｍｉＲ−１２６６−５ｐを導入することにより、ＩＦＮ−β遺伝子の発現は抑制された。このことから、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６６−５ｐのようなＬＰＳ刺激によって発現量が上昇するｍｉＲの一部は、ＤＣに対してサイトカインの産生を阻害して免疫機能を抑制することのできる免疫抑制剤として利用可能であることが確認された。

【0089】

＜実施例４＞
表５（ＬＰＳ刺激で発現量が上昇するｍｉＲ）のｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ及びこれに対する阻害性核酸（ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ−Ｉ）をそれぞれ化学合成した（いずれもＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨに合成を依頼）。

【0090】

実験例１の１）で調製したＭｏＤＣ（５×１０^３個／ウェル）に対して、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者のプロトコルに従ってｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ−Ｉ（３０ｐｍｏｌ／ウェル）をそれぞれ加えた。

【0091】

ＭｏＤＣを一晩培養後、がん抗原ＳＴＥＡＰタンパク由来のペプチドを用いて誘導したＣＤ４陽性Ｔ細胞（５×１０^４個／ウェル）を加えて、ＳＴＥＡＰペプチド（２μＭ／ウェル）存在下で、さらに２４時間培養した。刺激から２４時間後に培養上清を回収し、ｈｕｍａｎ ＩＦＮ−γ ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ｓｅｔ及びｈｕｍａｎ ＩＬ−１２ ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ｓｅｔ（いずれもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２のＥＬＩＳＡによる定量を行った。各実験におけるコントロールの値を１とした結果を図２８及び図２９に示す。

【0092】

図２８に示されるように、ＭｏＤＣにｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐを導入することにより、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の産生はいずれも抑制された。このことから、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐのようなＬＰＳ刺激によって発現量が上昇するｍｉＲの一部は、ＤＣによる抗原提示を受けたＴ細胞及びＤＣからのサイトカインの産生を阻害して免疫機能を抑制することのできる免疫抑制剤として利用可能であることが確認された。

【0093】

一方、図２９に示されるように、ＭｏＤＣにｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐ−Ｉを導入することにより、ＩＦＮ−γの産生は亢進された。このことから、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐのようなＬＰＳ刺激によって発現量が上昇するｍｉＲの一部に対する阻害性核酸は、ＤＣによる抗原提示を受けて抗原特異的に活性化したＴ細胞より刺激を受けたＤＣからのサイトカインの産生を亢進させて免疫機能を活性化することができる免疫活性化剤として利用可能であることが確認された。

【0094】

＜実施例５＞
実施例４のｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−５ｐを、ＬＰＳ刺激又はポリＩ：Ｃ刺激によって発現量が上昇するｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐ（いずれもＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨに合成を依頼）に換えて、実施例４と同様の実験を行った。その結果を、図３０〜図３１に示す。

【0095】

図３０及び図３１に示されるように、ＭｏＤＣにｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐを導入することにより、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の産生はいずれも抑制された。このことから、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４−３ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ−５ｐのようなＬＰＳ刺激又はポリＩ：Ｃ刺激によって発現量が上昇するｍｉＲの一部は、ＤＣによる抗原提示を受けたＴ細胞及びＤＣからのサイトカインの産生を阻害して免疫機能を抑制することのできる免疫抑制剤として利用可能であることが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0096】

本発明は、生体又は生体から単離されたＤＣの免疫応答機能を活性化又は抑制することのできる免疫応答制御剤に関し、かかる発明は免疫機能の低下による疾患又は免疫機能の異常亢進による疾患の予防、改善又は治療に向けた薬剤又は医薬として利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】