特許 6405103 ソバアレルゲン特異的モノクローナル抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6405103

(24)【登録日】2018年9月21日

(45)【発行日】2018年10月17日

(54)【発明の名称】ソバアレルゲン特異的モノクローナル抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/16 20060101AFI20181004BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20181004BHJP

   G01N 33/02 20060101ALI20181004BHJP

   C12N 15/06 20060101ALN20181004BHJP

   C12N 5/20 20060101ALN20181004BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20181004BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/16ZNA

   G01N33/53 D

   G01N33/02

   !C12N15/06 100

   !C12N5/20

   !C12P21/08

【請求項の数】4

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2014-55507(P2014-55507)

(22)【出願日】2014年3月18日

(65)【公開番号】特開2015-178461(P2015-178461A)

(43)【公開日】2015年10月8日

【審査請求日】2016年12月16日

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01791

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01792

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01793

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01794

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01795

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000231637

【氏名又は名称】日本製粉株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100156982

【弁理士】

【氏名又は名称】秋澤 慈

(72)【発明者】

【氏名】綱 美香

(72)【発明者】

【氏名】原田 義孝

(72)【発明者】

【氏名】瀬戸 泰裕

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１６９６２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０１８２７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 KOYANO, Satoru et al.，"Molecular cloning of cDNA, recombinant protein expression and characterization of a buckwheat 16-kDa major allergen"，Int. Arch. Allergy Immunol.，２００６年，Vol. 140，pp. 73-81

【文献】 Definition: BW 16kDa allergen, UniProtKB/Swiss-Prot [online], Accession No. Q56CY3, 31-OCT-2006 uploaded, [retrieved on 2017-10-17]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q56CY3

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９１で特定されるハイブリドーマ、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９２で特定されるハイブリドーマ、受託番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９３で特定されるハイブリドーマ及び受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９４で特定されるハイブリドーマ、受託番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９５で特定されるハイブリドーマからなる群から選択されるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。

【請求項2】

受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９２で特定されるハイブリドーマ、受託番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９３で特定されるハイブリドーマ及び受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９４で特定されるハイブリドーマで特定されるハイブリドーマからなる群から選択されるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を用いた、検体中のソバの検出方法。

【請求項4】

請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を含む、ソバ検出キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はソバアレルゲンＢＷｐ１６特異的モノクローナル抗体に関するものである。

【0002】

本願発明は各種ソバを含む原料及び食品に含まれるソバアレルゲンＢＷｐ１６の検出に適用可能であり、且つソバ以外の種子植物と抗原交差性を示さないソバアレルゲン特異的モノクローナル抗体に関する。

【背景技術】

【0003】

近年、我が国における食物アレルギー患者数は増加傾向にあり、アレルギー物質を含む食品による健康被害を防止するため、平成１３年４月の食品衛生法施行改正により、アレルギー物質を含む食品の表示が制度化された。特に小麦、ソバ、卵、乳、落花生、えび、かにの７品目については「特定原材料」として、一般消費者向けの製品だけでなく、業務用や加工食品の原料についても食品中のアレルギー物質について表示が義務化された。

【0004】

ソバアレルギーはアナフィラキシーを含む重篤なアレルギー症状を引き起こす危険性が高く、摂食には注意を要する。
ソバの主要タンパク質は、貯蔵タンパク質である１３Ｓグロブリンと２Ｓアルブミンであり、アレルゲンとしては、含有量が高い７６ｋＤａアレルゲン（１３Ｓグロブリン）、２４ｋＤａアレルゲン（１３Ｓグロブリンβサブユニット）、２４ｋＤａアレルゲンと比較して消化酵素（ペプシン）に対して高い耐性を示す１６ｋＤａアレルゲン（２Ｓアルブミンの１種、以下ＢＷｐ１６という）等が報告されている。

【0005】

ソバは他花受粉の植物なので、他の品種と交雑しやすく、原種はない。そのため、はっきりした品種が無く、便宜上、栽培される地域の名を頭につけて分類されている（例：キタワセソバ、常陸秋ソバ）。

【0006】

従来のソバアレルゲンの検出方法としては、ソバの粗タンパク質や、含有量が多い７６ｋＤａアレルゲン及び２４ｋＤａアレルゲンを検出対象とするものが主流である。
例えば特許文献１にはソバ成分検出用抗体としてソバの７０〜５００ｋＤaタンパク質画分を抗原とするＩｇＧ画分又はポリクロナール抗体及びそれら抗体を利用した検査用キットが提案されている。
また特許文献２には、未変性ソバ粗タンパク質、加熱変性ソバ粗タンパク質及びソバの主要タンパク質２４ｋＤａアレルゲン並びに７６ｋＤａアレルゲンのタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたソバアレルゲンの検出方法が提案されている。
これらの検出方法を用いたキットは、それぞれイムノアッセイキットして市販されている。

【0007】

しかしながらこれらのソバの粗タンパク質や７６ｋＤａアレルゲン及び２４ｋＤａアレルゲンを検出対象とする検査方法は、食品中の他の種子植物由来のタンパク質と交差反応を示し、偽陽性を呈することがあるという問題点があった。
偽陽性は、サンプル中から確実にソバアレルゲンを検出する必要があるという患者側の要請から従来法では容認されていた。しかし、特定原材料の表示義務化に伴って製造現場におけるソバアレルゲンの混入を検出するという需要が増加するにあたり、製造ロスの発生、製造ラインの洗浄の必要性など、生産効率の低下を防ぐため、偽陽性の発生を低減させたソバアレルゲンに特異性の高い検出方法の開発が望まれており、それを実現するために、ソバ以外の種子植物と抗原交差性を示さないソバアレルゲン特異的モノクローナル抗体が望まれている。

【0008】

またソバアレルゲン検出方法の汎用性確保の観点から、非加熱の原材料及び食品に含まれるソバアレルゲンと加熱変性後の食品中のソバアレルゲンを同様に検出できるソバアレルゲン特異的モノクローナル抗体が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特許第３７９９２９０号公報

【特許文献2】特許第５０４３０７８号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Molecular cloning of cDNA, recombinant protein expression and characterization of a buckwheat 16-kDa major allergen. Int Arch Allergy Immunol. 2006;140(1):73-81.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、各種ソバの検出に適用可能であり、且つソバ以外の種子植物と抗原交差性を示さないソバアレルゲン特異的モノクローナル抗体を提供することを目的とする。
また本発明は非加熱の原材料及び食品に含まれるソバアレルゲンと加熱変性後の食品中のソバアレルゲンを同様に検出できるソバアレルゲン特異的モノクローナル抗体を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは、ソバアレルゲンＢＷｐ１６に着目し、各種ソバに共通するアミノ酸配列を有し、且つソバ以外の種子植物の２Ｓアルブミンと相同性の低いアミノ酸配列を有する組換えＢＷｐ１６の特定領域を認識するモノクローナル抗体が、各種ソバの検出に適用可能であり、且つソバ以外の種子植物と抗原交差性を示さないことを見いだした。また本発明のモノクローナル抗体はソバアレルゲンＢＷｐ１６の立体構造の違いにかかわらずエピトープを認識することから、非加熱の原材料及び食品に含まれるソバアレルゲンと加熱変性後の食品中のソバアレルゲンを同様に検出することが可能である。

【0013】

すなわち本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１２、
配列番号１３又は
配列番号１４で表されるペプチドを抗原とするモノクローナル抗体であって、
配列番号３０に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識し、
ソバのＢＷｐ１６と結合することを特徴とする、モノクローナル抗体。
（２）配列番号３１に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識することを特徴とする、前記（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）配列番号３２に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識することを特徴とする、前記（２）に記載のモノクローナル抗体。
（４）配列番号３３に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識することを特徴とする、前記（３）に記載のモノクローナル抗体。
（５）配列番号１：Xaa１Glu Ala Leu Xaa2 Arg Xaa3 Glu Gly Glu Gly Cys Lys Ser Glu Glu Ser Cys Met Arg
配列番号２：Met Xaa4 Glu Met Asp Asp Glu Cys Val Cys又は
配列番号３：Met Val Glu Asn Xaa5 Lys Gly Arg Ile
（配列中、Xaa１〜Xaa5は天然に存在する任意のアミノ酸である。）
に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識することを特徴とする、前記（４）に記載のモノクローナル抗体。
（６）配列番号１：Xaa１Glu Ala Leu Xaa2 Arg Xaa3 Glu Gly Glu Gly Cys Lys Ser Glu Glu Ser Cys Met Arg
配列番号２：Met Xaa4 Glu Met Asp Asp Glu Cys Val Cys又は
配列番号３：Met Val Glu Asn Xaa5 Lys Gly Arg Ile
（配列中、Xaa1はAla 又はGlu、Xaa2はSer又はLys、Xaa3はVal又はIle、Xaa4はLys又はArg、Xaa5はGlnである。）
に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識することを特徴とする、前記（５）に記載のモノクローナル抗体。
（７）ソバ以外の種子植物由来タンパク質と交差反応しない前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（８）受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９１で特定されるハイブリドーマ、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９２で特定されるハイブリドーマ、受託番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９３で特定されるハイブリドーマ及び受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９４で特定されるハイブリドーマ、受託番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９５で特定されるハイブリドーマからなる群から選択されるハイブリドーマが産生する抗体である、前記（１）〜（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（９）前記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を用いた、検体中のソバの検出方法。
（１０）前記（１）〜（８）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、ソバ検出キット。

【発明の効果】

【0014】

本発明の、ＢＷｐ１６の特定領域に含まれるアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体により、各種ソバの検出に適用可能であり、且つソバ以外の種子植物と抗原交差性を示さないソバアレルゲン特異的モノクローナル抗体を提供することができる。すなわち本発明のソバアレルゲン特異的モノクローナル抗体を用いることにより、食品中の各種ソバの検出を行うことが出来、且つソバ以外の種子植物の存在による偽陽性を抑制することが出来る。
また本発明はＢＷｐ１６の立体構造の違いに関わらずエピトープを認識することが可能であるので、非加熱の原材料及び食品に含まれるソバアレルゲンと加熱変性後の食品中のソバアレルゲンを同様に検出できる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ＢＷｐ１６アミノ酸配列の相同性を比較検討した結果を示す。

【図2】ＢＷｐ１６の高次構造（３パターン）を示す。

【図3】ＥＬＩＳＡ法による抗ＢＷｐ１６抗血清の抗体価の測定結果を示す。

【図4】ＷＢ法によりモノクローナル抗体の交差反応性を確認した結果を示す。

【図5】組換えＢＷｐ１６の発現マップを示す。

【図6A】ＷＢ法によりモノクローナル抗体の各分割ＢＷｐ１６への反応性を確認した結果を示す。

【図6B】ＷＢ法によりモノクローナル抗体の各分割ＢＷｐ１６への反応性を確認した結果を示す

【図7】分割のＢＷｐ１６の認識領域を図示したものである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

（ソバ）
本願発明において、ソバはタデ科ソバ属に属する食用の穀類である。ソバの原種はなく、他花受粉のため他の品種と交雑しやすい。そのため、遺伝子上明確に区分される品種がなく、通常は便宜上栽培されている地区の名を頭につけて区分される。例えば、中国マンカン、中国北方中粒、アメリカ産マンカン、ブラジル産、キタワセ、常陸秋ソバ等があげられるが、これらに限定されるものではない。

【0017】

（ＢＷｐ１６）
本願発明におけるＢＷｐ１６は、ソバに含まれる約１６ｋＤａのアレルゲンタンパク質であり、ペプシン耐性を有する。非特許文献１にはＢＷｐ１６が貯蔵タンパク質２Ｓアルブミンファミリーに属するものであること、日本産ソバから同定されたＢＷｐ１６をコードするｃＤＮＡが報告されている（非特許文献１）。
現在、アレルゲンの登録データベースＡｌｌｅｒｇｏｍｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ａｌｌｅｒｇｏｍｅ.ｏｒｇ.）には、日本産のソバから同定された２つのＢＷｐ１６のアミノ酸配列がそれぞれソバアレルゲンＦａｇ ｅ２（配列番号４）、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１（配列番号５）として登録されている（Ｆａｇ ｅ ２．０１０１は１４９残基のアミノ酸配列である。Ｆａｇ ｅ２はシグナルペプチドを含まず、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１のアミノ酸配列２３−１４９位のアミノ酸配列に対応する１２７残基のアミノ酸配列である。Ｆａｇ ｅ ２．０１０１において１３８位がLeu(Ｌ)であるのに対し、Ｆａｇ ｅ ２ではMet(Ｍ)である。）が、本願発明においてＢＷｐ１６はこのアミノ酸配列に完全に一致するものに限定されるものではなく、天然に存在する各種ソバにおける変異体も含む。

【0018】

（モノクローナル抗体）
本発明のモノクローナル抗体は、組換えＢＷｐ１６である、ＢＷｐ１６−１（配列番号１２）、ＢＷｐ１６−２（配列番号１３）又はＢＷｐ１６−３（配列番号１４）で表されるペプチドを抗原とし、ソバのＢＷｐ１６のアミノ酸配列のうち、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１のアミノ酸配列２３−１４９位のアミノ酸配列に対応し、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１における３４、５０、６２、６６、７０、７２、９２、１１０及び１３１位のアミノ酸が天然に存在する任意のアミノ酸である配列（配列番号３０）に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識し、ソバのＢＷｐ１６と結合することを特徴とする、モノクローナル抗体である。
ソバのＢＷｐ１６のアミノ酸配列のうち、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１のアミノ酸配列６６−１４９位のアミノ酸配列に対応し、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１における６６、７０、７２、９２、１１０及び１３１位のアミノ酸が天然に存在する任意のアミノ酸である配列（配列番号３１）に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識すること、ソバのＢＷｐ１６のアミノ酸配列のうち、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１のアミノ酸配列６６−１３１位のアミノ酸配列に対応し、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１における６６、７０、７２、９２、１１０及び１３１位のアミノ酸が天然に存在する任意のアミノ酸である配列（配列番号３２）に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識すること、ソバのＢＷｐ１６のアミノ酸配列のうち、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１のアミノ酸配列６６−１１４位のアミノ酸配列に対応し、Ｆａｇ ｅ ２．０１０１における６６、７０、７２、９２及び１１０位のアミノ酸が天然に存在する任意のアミノ酸である配列（配列番号３３）に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識することが、この順で好ましい。
さらに好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、
配列番号１：Xaa１Glu Ala Leu Xaa2 Arg Xaa3 Glu Gly Glu Gly Cys Lys Ser Glu Glu Ser Cys Met Arg
配列番号２：Met Xaa4 Glu Met Asp Asp Glu Cys Val Cys又は
配列番号３：Met Val Glu Asn Xaa5 Lys Gly Arg Ile
に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識することを特徴とする。
配列中、Xaa１〜Xaa5は天然に存在する任意のアミノ酸である。Xaa１は好ましくはAla又はGluであり、さらに好ましくはAlaである。Xaa2は好ましくはSer、Lys、Arg又はAsnであり、さらに好ましくはSer又はLysであり、もっとも好ましくはSerである。Xaa3は好ましくはVal又はIleであり、さらに好ましくはValである。Xaa4は好ましくはLys又はArgであり、さらに好ましくはLysである。Xaa5は好ましくはGlnである。
本発明のモノクローナル抗体は、配列番号３０〜３３及び１〜３の各配列に含まれるアミノ酸配列において、好ましくは連続する５個以上、より好ましくは６個以上のアミノ酸からなる配列をエピトープとして認識する。
本発明のモノクローナル抗体のクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが挙げられるが、好ましくは、ＩｇＧである。

【0019】

（免疫方法）
抗体を作製するために使用される動物は特に限定されるものではないが、マウス、ラット、ヒト、兎、鶏等を挙げることができる。作製の簡便性からマウスが好適に使用される。また、本発明のモノクローナル抗体はＢＷｐ１６で免疫した動物から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により調製されるハイブリドーマを、培地内で培養又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、該培養物又は腹水から採取することにより製造することができる。

【0020】

（ハイブリドーマの作製）
抗ＢＷｐ１６抗体産生ハイブリドーマは、例えば、ＢＷｐ１６を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ＢＷｐ１６モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。上記の抗体産生細胞としては、例えばＢＷｐ１６又はこれを含有する組成物を投与して免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球等を挙げることができる。免疫する動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ウマ等が挙げられる。免疫は、例えばＢＷｐ１６を単独で又は適当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に１〜３回／月、１〜６ケ月間投与することにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免疫から２〜４日後に免疫動物から採取することにより行なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。

【0021】

本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ（ＢＷｐ１６−１Ａ１２、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９１）が産生する抗ＢＷｐ１６タンパク質モノクローナル抗体１Ａ１２ や、ハイブリドーマ（ＢＷｐ１６−３４Ｄ９、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９２）が産生する抗ＢＷｐ１６タンパク質モノクローナル抗体３４Ｄ９や、ハイブリドーマ（ＢＷｐ１６−３４Ｆ９、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９３）が産生する抗ＢＷｐ１６タンパク質モノクローナル抗体３４Ｆ９や、ハイブリドーマ（ＢＷｐ１６−３５Ｅ２、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９４）が産生する抗ＢＷｐ１６タンパク質モノクローナル抗体３５Ｅ２や、ハイブリドーマ（ＢＷｐ１６−４１Ｄ４、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−０１７９５）が産生する抗ＢＷｐ１６タンパク質モノクローナル抗体４１Ｄ４を挙げることができ、これらハイブリドーマは、平成２６（２０１４）年１月２３日（受領日）付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２-０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した。

【0022】

（ソバ以外の種子植物）
本発明において、「ソバ以外の種子植物」とは従来のソバアレルゲン検出方法で交差反応性を示していたすべての種子植物を意味する。例えば、カシューナッツ、クルミ、アーモンド、落花生などのナッツ類、小豆、黒豆、大豆及びささげ豆などの豆類、ゴマ、イネ、小麦、大麦などの穀類、トマトなどの野菜などが挙げられる。

【0023】

（交差反応）
本発明のモノクローナル抗体はソバ以外の種子植物由来タンパク質と交差反応しないことが好ましい。本発明において、「ソバ以外の種子植物由来タンパク質」とは、上記ソバ以外の種子植物に自然に含まれるタンパク質を意味し、「ソバ以外の種子植物由来タンパク質と交差反応しない」とは、本発明のモノクローナル抗体がソバ以外の種子植物由来タンパク質を認識し、反応することがないことを意味する。例えば通常のＷＢ（ウエスタンブロット）法において、タンパク質として１〜１５μｇ/１０μｌのソバ以外の種子植物のタンパク質抽出物をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにて分離し、分離したタンパク質をメンブレンに転写した後、本発明のモノクローナル抗体を１次抗体として反応させ、適切な標識２次抗体を用いて免疫染色した場合に、陽性バンドが検出されないことを意味する。

【0024】

（ソバの検出方法）
本発明のソバの検出方法において、検出対象となる「ソバ」は生の子実及び穀粒の他、それを脱穀、加熱、乾燥、粉砕等加工したものも含む。検体としては、広く食品原料、加熱等の加工前の食品、加熱等の加工後の食品を含み、その生産及び製造の過程で上記「ソバ」を積極的に混合するもののみならず、意図せず混入する可能性があるものも含み、その加工の方法や加工の程度は問わない。
本発明のソバの検出方法は、本発明のモノクローナル抗体を使用する、免疫学的な検出方法であれば特に限定されない。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ、競合法、ＳＰＲ、イムノクロマトなどのバイオセンサーが挙げられる。抗体の使用形態としては抗体全体を使用する場合に限定されず、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂなどの断片も使用することが出来る。

【0025】

（ソバ検出キット）
また、本発明のソバ検出キットは、本発明のモノクローナル抗体を構成成分として含むキットであれば、いずれのキットであってもよい。キットに含まれる抗体は、個別に又は混合物の形態で存在しうるし、或いは固相担体に結合されていてもよいし又は遊離の形態でもよい。さらに、そのようなキットは、標識抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのマーカー(標的)ポリペプチド、使用説明書、等を含むことができる。

【実施例】

【0026】

以下本発明を具体的に説明する為に実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

【0027】

１．各種ソバＢＷｐ１６のアミノ酸配列の確認
（１）各種ソバＤＮＡの調製
玄ソバ（中国マンカン、中国北方中粒、アメリカ産マンカン、ブラジル産、キタワセ、常陸秋ソバ）を０．１％ ＳＤＳ 溶液で洗浄し、−８０℃で一夜凍結後、乳鉢で粉砕した。得られた粉末から、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (Ｑｉａｇｅｎ社)を使用してＤＮＡを抽出した。

【0028】

（２）標的タンパク質ＢＷｐ１６の遺伝子配列
非特許文献１に記載された方法に従って、ＢＷｐ１６の遺伝子を、ＤＮＡからＰＣＲで増幅し、その配列を確認した。

ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ配列
ＢＷｐ１６-R:5'- AATTACACAAAATACCGATTTCCTCTC-3'
ＢＷｐ１６-F:5'-AAAATGAAGCTCTTCATCATCCTAGCA-3'

【0029】

（３）ＢＷｐ１６のアミノ酸配列の特徴
６種の玄ソバの、ＢＷｐ１６のＤＮＡ配列をアミノ酸配列に変換し、アレルゲンの登録データベースＡｌｌｅｒｇｏｍｅ（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ａｌｌｅｒｇｏｍｅ.ｏｒｇ.）にソバアレルゲンとして登録されているＦａｇ ｅ２．０１０１のアミノ酸配列と、入手した玄ソバ６種（中国マンカン（配列番号６）、中国北方中粒（配列番号７）、アメリカ産マンカン（配列番号８）、ブラジル産（配列番号９）、キタワセ（配列番号１０）、常陸秋ソバ（配列番号１１））の相同性を比較した結果、１１箇所（Ｆａｇ ｅ２．０１０１のＮ末端側より９、１０、３４、５０、６２、６６、７０、７２、９２、１１０及び１３１番目）で変異が観察された（図１、白抜き文字のアミノ酸）。図１中、Ｘは、複数種のアミノ酸の混在を示す。
Ｆａｇ ｅ２．０１０１のＮ末端側より６６〜１１４番目における６６、７０、７２、９２及び１１０番目のアミノ酸の組み合わせは、以下の表１−１に示す７パターンが存在した。またＦａｇ ｅ２．０１０１、Ｆａｇ ｅ２及び各ソバのＢＷｐ１６は、表１−２中に○で示すパターンをとった。

【0030】

【表1-1】

【0031】

【表1-2】

【0032】

上記のようにソバに含まれるＢＷｐ１６には様々な変異が存在するため、変異のパターンを多く含み、かつ国内流通の６割以上を占める「中国マンカン」(品種マンカンの中国栽培品)にターゲットを絞って解析した。
その結果、中国マンカン内には５種類のＢＷｐ１６アミノ酸配列が含まれ、ＢＷｐ１６アミノ酸配列の変異は、図１に示された部分に限定され、すべての変異部分のアミノ酸をとりうるアミノ酸で置換した変異体をコンピューター上でシミュレートし、解析ソフト(ＧＥＮＥＴＹＸ)を用いて高次構造を推定したところ、そのタンパク質の予測高次構造は、図２に示す３パターンに集約されることがわかった。

【0033】

（４）ＢＷｐ１６ソバ遺伝子配列の選択
他の植物(落花生等)中のＢＷｐ１６に対応するタンパク質(２Ｓアルブミン)のアミノ酸配列と、相同性が低いものを選択し、ＢＷｐ１６-１、ＢＷｐ１６-２及びＢＷｐ１６-３とした。
以下の表２にＦａｇ ｅ ２．０１０１のアミノ酸配列と比較してどの位置がどのように変異しているかを示す。

【0034】

【表2】

【0035】

２．組換えＢＷｐ１６タンパク質の作製
（１）ＢＷp１６発現用大腸菌ベクターの作製
上記のように選択した３タイプのＢＷｐ１６、すなわちＢＷｐ１６-１、ＢＷｐ１６-２及びＢＷｐ１６-３のアミノ酸配列を、それぞれＨｉｓタグ又はＧＳＴタグ融合タンパク質として発現させるため、各アミノ酸配列をコードする遺伝子配列を相当するタグ配列の付いたベクター、ｐＥＴ−２２ｂ（＋） （Ｎｏｖａｇｅｎ社)又は ｐＧＥＸ−６Ｐ （ＧＥヘルスケアジャパン社)に挿入した。
このプラスミドを大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ２ （Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入して目的コロニーを単離した。

【0036】

（２）大腸菌を用いた組換えＢＷp１６の発現と精製
上記大腸菌を２×ＹＴ培地 （Ｔｒｙｐｔｏｎ，Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，ＮａＣｌ）で３７℃、一晩前培養した。続いて新鮮な同培地に培養液を希釈して３７℃、３０分培養し、ＩＰＴＧ （Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度１ｍＭで添加してタンパク質の発現を誘導し、１６℃、１６時間培養した。菌体を遠心分離法で培養液から回収し、‐８０℃で凍結後、超音波破砕して、遠心上清を得た。組換えＢＷｐ１６-１、ＢＷｐ１６-２及びＢＷｐ１６-３は、タグを指標にニッケルセファロース精製（ＧＥヘルスケアジャパン社）又は グルタチオンセファロース精製（ＳＩＧＭＡ社）をした。
精製した組換えＢＷｐ１６-１、ＢＷｐ１６-２及びＢＷｐ１６-３の各濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により算出した。

【0037】

３．抗ＢＷｐ１６ モノクローナル抗体の作製
（１）ハイブリドーマの作製
３種類のHisタグ融合の組換えＢＷｐ１６-１、ＢＷｐ１６-２及びＢＷｐ１６-３とアジュバント（Ｇｉｂｃｏ社）を混合乳化し、ＢＡＬＢ／ｃマウス(日本ＳＬＣ社)の腹腔内に１０日ごと５回注入した。最終注入の３日後に尾静脈採血し、血清を１０２，４００倍まで希釈し、その抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定した。抗体価の上昇を確認した（１０万倍以上の希釈で発色を確認できたもの、図３参照）マウスの脾臓を摘出し、これをマウスのミエローマ細胞と融合させて、抗体産生ハイブリドーマを作製した。

【0038】

（２）ハイブリドーマの選別
細胞融合から１０日後以降、９６ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｐｌａｔｅで、ハイブリドーマがウェルの三分の二以上の表面積で増殖したクローンから順に細胞上清液を回収した。
（ａ）ＥＬＩＳＡ法
９６ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅに、ＧＳＴ融合の組換えＢＷＰ１６−１、ＢＷｐ１６−２及びＢＷｐ１６−３の混合物を固相化した。洗浄、ブロッキング（５％スキムミルク-ＰＢＳＴ）の後、ハイブリドーマの細胞上清液を１次抗体として反応させた。洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２次抗体として反応させた。洗浄後、ＴＭＢ基質で発色検出した。吸光度６５０ｎｍで測定した。この結果、測定値２．５以上のクローン１４０種を選択した。
（ｂ）ＷＢ法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｗａｋｏ社）にてＧＳＴ融合の組換えＢＷＰ１６−１、ＢＷｐ１６−２及びＢＷｐ１６−３の混合物をＰＶＤＦメンブレン（ＧＥヘルスケアジャパン社）に転写した。メンブレンをブロッキング（５％スキムミルク−ＴＢＳＴ）した後、選択したハイブリドーマの細胞上清液を１次抗体として反応させた。メンブレンを洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を２次抗体として反応させた。メンブレンを洗浄し、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケアジャパン社）で反応させ、Ｘ線フィルム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ社）で化学発光を検出した。この結果、化学発光の強いクローン２０種を選択した。

【0039】

（３）ハイブリドーマの大量調製と抗ＢＷＰ１６モノクローナル抗体の精製
プリスタンをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注入し、その1週間後に抗体産生ハイブリドーマ浮遊液(２x１０⁶ｃｅｌｌｓ／２００μｌ)をマウスの腹腔内に注入した。腹腔内の膨張を確認後、針付きシリンジにて腹水を回収した。この腹水液から、硫安沈殿及びプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて、モノクローナル抗体を精製した。精製したモノクローナル抗体の濃度を、下記の計算式で算出した。
濃度（ｍｇ/ｍｌ）＝吸光度２８０ｎｍの値／１．３５

【0040】

４．モノクローナル抗体の確認
（１）ＥＬＩＳＡ法による検出感度の測定
９６ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅに、組換えＢＷｐ１６混合物（ＢＷｐ１６-１、ＢＷｐ１６-２及びＢＷｐ１６-３）を１ｍｇ/ｍｌの濃度から２倍希釈系列で固相化した。洗浄後、このｐｌａｔｅにブロッキング（５％スキムミルク−ＰＢＳＴ）を添加した。次に、モノクローナル抗体を１ｍｇ/ｍｌの濃度から２倍希釈系列で１次抗体反応とした。洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体で２次抗体反応とした。洗浄後、ＴＭＢ基質で発色検出した。吸光度６５０ｎｍで測定した。この結果、測定値０．０５以上の陽性反応とし、その組換えＢＷｐ１６混合物の最小のタンパク質濃度を検出限界値（感度）とした（表３）。

【0041】

（２）ＷＢ法による交差性の確認
各種玄ソバ（常陸秋ソバ、中国北方中粒、キタワセ、中国マンカン）及び他の植物の種子（カシューナッツ、クルミ、アーモンド、落花生、ゴマ、イネ、トマト、小豆、黒豆、大豆及びささげ豆）を、０．１％ ＳＤＳ 溶液で洗浄した後、凍結乾燥し、乳鉢で粉砕した。この粉末に抽出液（４％ＳＤＳ、８Ｍ Ｕｒｅａ、２０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を添加し、ローテーター（室温、２時間）で攪拌後、遠心（１０，０００ｘｇ、２０分間、室温）上清を回収し、抽出液を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて抽出液（タンパク質として1μg/10μlを分離し、分離したタンパク質及び組換えＢＷｐ１６混合物（ＢＷｐ１６-１、ＢＷｐ１６-２及びＢＷｐ１６-３）をＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンをブロッキング（５％スキムミルク−ＴＢＳＴ）した後、作製したモノクローナル抗体を反応させた。メンブレンを洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を２次抗体として反応させた。メンブレンを洗浄し、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓで反応させ、Ｘ線フィルムで化学発光を検出した。

【0042】

結果を図４及び表３に示す。「交差反応なし（-）」は、各モノクローナル抗体のクローンが、ソバ以外と反応しなかったことを示す。「交差反応あり（＋）」は、ソバ以外のものと反応したことを示す。
モノクローナル抗体のクローンＮｏ．１〜２、６〜８及び１０のいずれも各種ソバから分離したタンパク質を認識した。
モノクローナル抗体のクローンＮｏ．２は他のモノクローナル抗体のクローンと比較して検出感度が低く、また多くのソバ以外の植物由来のタンパク質（カシューナッツ、アーモンド、落花生、ゴマ、トマト、小豆、黒豆、大豆及びささげ豆）についても交差反応性を示した。
組換えＢＷｐ１６混合物に対して高い反応性を示すモノクローナル抗体のクローンＮｏ．１及びＮｏ．１０は一部のソバ以外の植物由来のタンパク質（Ｎｏ．１：アーモンド、ゴマ及び小豆、Ｎｏ．１０:カシューナッツ）について交差反応を示した。
モノクローナル抗体のクローンＮｏ．６〜８は検討したすべてのソバ以外の植物由来のタンパク質について交差反応性を示さなかった。

【0043】

５．サブクラスの確認
ハイブリドーマの培養上清液を検体とし、Iso Strip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche社)で測定した。この試薬により、マウス抗体のサブクラスを識別した。結果を表３に示す。

【0044】

【表3】

【0045】

６．モノクローナル抗体の認識領域の確認
（１）分割した組換えＢＷｐ１６発現用大腸菌ベクターの作製
ＢＷｐ１６遺伝子の全配列を、コードするアミノ酸配列が多少重複するように３つの領域を決定（アミノ酸配列として２３ａａ−６５ａａ、５５ａａ−１０７ａａ及び９９ａａ−１４９ａａをコードする位置）し、分割した遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を有する組換えタンパク質をそれぞれＢＷｐ１６−Ａ、ＢＷｐ１６−Ｂ及びＢＷｐ１６−Ｃとした（図５）。各領域のタンパク質をそれぞれＧＳＴタグ融合タンパク質として発現させるため、相当するタグ配列の付いたベクター ｐＧＥＸ−６Ｐ （ＧＥヘルスケアジャパン社）に挿入した。

【0046】

更に、ＢＷｐ１６−Ａをコードする領域とは重複せず、ＢＷｐ１６−Ｂ及びＢＷｐ１６−Ｃをコードする領域と重複する、ＢＷｐ１６遺伝子のアミノ酸配列として６６ａａ−１４９ａａをコードする位置について、コードするアミノ酸配列が多少重複するように５つの領域を決定（アミノ酸配列として６６ａａ−９０ａａ、８６ａａ−１０５ａａ、１０１ａａ−１０９ａａ、１１５ａａ−１３６ａａ、１３２ａａ−１４９ａａをコードする位置）し、分割した遺伝子配列がコードするアミノ酸配列を有する組換えタンパク質をそれぞれＢＷｐ１６−ａ、ＢＷｐ１６−ｂ、ＢＷｐ１６−ｃ、ＢＷｐ１６−ｄ及びＢＷｐ１６−ｅとした（図５）。各領域のタンパク質をそれぞれＧＳＴタグ融合タンパク質として発現させるため、相当するタグ配列の付いたベクター ｐＧＥＸ−６Ｐ （ＧＥヘルスケアジャパン社）に挿入した。

【0047】

なお、ＢＷｐ１６−Ａ、ＢＷｐ１６−Ｂ、ＢＷｐ１６−Ｃ、ＢＷｐ１６−ａ、ＢＷｐ１６−ｂ、ＢＷｐ１６−ｃ、ＢＷｐ１６−ｄ及びＢＷｐ１６−ｅについては、分割した各領域内で、アミノ酸の配列パターンが複数存在した場合、そのパターンごとのタンパク質を作製した。例えば、ＢＷｐ１６−Ａは領域内に変異が存在しないので1通り、ＢＷｐ１６−Ｂは領域内に変異が存在するため２通り、ＢＷｐ１６−Ｃは領域内に変異が存在するため３通りを作製した。
以下の表４に各分割した組換えＢＷｐ１６をＦａｇ ｅ ２．０１０１のアミノ酸配列と比較してどの位置がどのように変異しているかを示す。

【0048】

【表4】

【0049】

これらのプラスミドを大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｒｏｓｅｔｔａ ｇａｍｉ２ （Ｎｏｖａｇｅｎ社)に導入して目的コロニーを単離した。
各分割の組換えＢＷｐ１６をコードする遺伝子配列を得るためのＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ配列は以下の通りである。
（ａ）ＢＷｐ１６−Ａ
ＢＷｐ１６-A-R：5’-GGGGGATCCAGAGATGAAGGCTTCGATTTAGGC-3’
ＢＷｐ１６-A-F：5’-CCCGAATTCGTATTTGTCGTCGAGTATATCCATGGC-3’
（ｂ）ＢＷｐ１６−Ｂ１
ＢＷｐ１６-B1-R：5’-GGGGGATCCATAGCCATGGATATACTCGACGAC-3’
ＢＷｐ１６-B1-F：5’-CCCGAATTCCTCAACCATCATCTTCATCCACTC-3’
（ｃ）ＢＷｐ１６−Ｂ２
ＢＷｐ１６-B2-R：5’- GGGGGATCCATAGCCATGGATATACTCGATGAC-3’
ＢＷｐ１６-B2-F：5’- CCCGAATTCCTCAACCATCATCTTCATCCACTC-3’
（ｄ）ＢＷｐ１６−Ｃ１
ＢＷｐ１６-C1-R：5’- GGGGGATCCGTTTGTGAGTGGATGAAGATGATGG-3’
ＢＷｐ１６-C1-F：5’- CCCGAATTCTTACACAAAATACCGATTTCCTCT-3’
（ｅ）ＢＷｐ１６−Ｃ２
ＢＷｐ１６-C2-R：5’- GGGGGATCCGTTTGTGAGTGGATGAAGATGATGG-3’
ＢＷｐ１６-C2-F：5’- CCCGAATTCTTACACAAAATACCGATTTCCTCT-3’
（ｆ）ＢＷｐ１６−Ｃ３
ＢＷｐ１６-C3-R：5’- GGGGGATCCGTTTGTGAGTGGATGAAGATGATGG-3’
ＢＷｐ１６-C3-F：5’- CCCGAATTCTTACACAAAATACCGATTTCCTCT-3’
（ｇ）ＢＷｐ１６−ａ１
ＢＷｐ１６-a1-R：5’-GGGGGATCCGCAGAAGCTTTGAGTAGGGTTG-3’
ＢＷｐ１６-a1-F：5’-CCCGAATTCCGCCACACAGCATCCTCTCA-3’
（ｈ）ＢＷｐ１６−ａ２
ＢＷｐ１６-a2-R：5’-GGGGGATCCGAAGAAGCTTTGAAGAGGATTGAAGG-3’
ＢＷｐ１６-a2-F：5’-CCCGAATTCCGCCACACAGCATCCTCTCA-3’
（ｉ）ＢＷｐ１６−ｂ１
ＢＷｐ１６-b1-R：5’-GGGGGATCCGGATGCTGTGTGGCGATGAAG-3’
ＢＷｐ１６-b1-F：5’-CCCGAATTCCATCTTCATCCACTCACAAACAC-3’
（ｊ）ＢＷｐ１６−ｂ２
ＢＷｐ１６-b2-R：5’-GGGGGATCCGGATGCTGTGTGGCGATGAGG-3’
ＢＷｐ１６-b2-F：5’-CCCGAATTCCATCTTCATCCACTCACAAACAC-3’
（ｋ）ＢＷｐ１６−ｃ
ＢＷｐ１６-c-R：5’-GGGGGATCCGAGTGGATGAAGATGATGGTTG-3’
ＢＷｐ１６-c-F：5’-CCCGAATTCAATCAACCTTTCACCAATACGCCC-3’
（ｌ）ＢＷｐ１６−ｄ１
ＢＷｐ１６-d1-R：5’-GGGGGATCCGGTGAAAGGTTGATTAAGGAGGG-3’
ＢＷｐ１６-d1-F：5’-CCCGAATTCACTAAGCCCACACTTACTAGG-3’
（ｍ）ＢＷｐ１６−ｄ２
ＢＷｐ１６-d2-R：5’-GGGGGATCCGGTGAAAGGTTGATTAAGGAGGG-3’
ＢＷｐ１６-d2-F：5’-CCCGAATTCACTAAGCCCACACTTACCAGG-3’
（ｎ）ＢＷｐ１６−ｅ１
ＢＷｐ１６-e1-R：5’-GGGGGATCCAAGTGTGGGCTTAGTGAAATGG-3’
ＢＷｐ１６-e1-F：5’-CCCGAATTCCACAAAATACCGATTTCCTCTCG-3’
（ｏ）ＢＷｐ１６−ｅ２
ＢＷｐ１６-e2-R：5’-GGGGGATCCAAGTGTGGGCTTAGTGAATTGG-3’
ＢＷｐ１６-e2-F：5’-CCCGAATTCCACAAAATACCGATTTCCTCTCG-3’

【0050】

（２）大腸菌を用いた分割の組換えＢＷｐ１６の発現と精製
上記大腸菌を２×ＹＴ培地 (Ｔｒｙｐｔｏｎ，Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，ＮａＣｌ)で３７℃、一晩前培養した。続いて新鮮な同培地に培養液を希釈して３７℃、３０分培養し、ＩＰＴＧ (Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β-Ｄ-1-ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ) を終濃度１ｍＭで添加してタンパク質の発現を誘導し、１６℃、１６時間培養した。菌体を遠心分離法で培養液から回収し、―８０℃で凍結後、超音波破砕して、遠心上清を得た。これらの組換え体は、グルタチオンセファロース精製(ＳＩＧＭＡ社)をした。精製した分割の組換えＢＷｐ１６の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ(Ｂｉｏ−Ｒａｄ社)により算出した。

【0051】

（３）ＷＢ法による認識領域の確認
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに、それぞれ分割の組換えＢＷｐ１６を０．５μｇ/１レーンを泳動し、泳動タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンをブロッキング（５％スキムミルク−ＴＢＳＴ）した後、作製したモノクローナル抗体（クローンＮｏ．１、２、６、７、８及び１０）を反応させた。メンブレンを洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を２次抗体として反応させた。メンブレンを洗浄し、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓで反応させ、Ｘ線フィルムで化学発光を検出した。
ＷＢの結果を図６Ａ及び図６Ｂに示す。
図６Ａに示すように、クローンＮｏ．１、２、６、７、８及び１０はいずれも、ＢＷｐ１６-１、ＢＷｐ１６-２及びＢＷｐ１６-３に対して同程度の反応を示した。この結果により、これらクローンが立体構造の違いに関わらずエピトープを認識することが可能であることを示し、非加熱の原材料及び食品に含まれるソバアレルゲンと加熱変性後の食品中のソバアレルゲンを同様に検出できることが示唆された。

【0052】

また各モノクローナル抗体のクローンが認識する各分割の組換えＢＷｐ１６をまとめたものが表５である。

【表5】

（抗体が結合した場合を＋、反応しない場合を−として表示）
これらの結果と分割した組み換えＢＷｐ１６の発現マップを合わせて、各モノクローナル抗体のクローンが認識するＢＷｐ１６の特定領域を図解したものが図７である。
各モノクローナル抗体のクローンが認識するＢＷｐ１６のエピトープは以下の表６に示される特定領域の範囲内にあることが示された。

【0053】

【表6】

【0054】

各モノクローナル抗体のクローンは１１カ所（Ｆａｇ ｅ２．０１０１のＮ末端側より９、１０、３４、５０、６２、６６、７０、７２、９２、１１０及び１３１番目）に変異を有する各種ソバと反応し、また表２に示した計６カ所の変異（Ｆａｇ ｅ２．０１０１のＮ末端側より６６、７０、７２、９２、１３１及び１３８番目）を含む組換えＢＷｐ１６タンパク質のいずれとも反応するものであった。
従って本発明のモノクローナル抗体は６６ａａ、７０ａａ並びに７２ａａに変異を含む特定領域６６ａａ−８５ａａ、９２ａａに変異を含む特定領域９１ａａ−１００ａａ、及び１１０ａａ二変異を含む特定領域１０６ａａ−１１４ａａを認識する抗体であることが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]